专利名称：Ywk－ii蛋白/aplp2作为mis的新受体及其介导的信号传导通路的制作方法
技术领域：
本发明为发现精子膜蛋白YWK-II蛋白/APLP2作为穆勒氏管抑制性物质(MIS)的新受体及其介导的信号传导通路，涉及蛋白质的新功能的研究与应用领域。
背景技术：
YWK-II蛋白是一种I型精子膜蛋白，最初是本组采用一株抗人精子蛋白的单克隆抗体(YWK-II)对大鼠睾丸λgt11cDNA文库进行筛选获得。定位于人精子头部的赤道区。序列分析发现YWK-II蛋白与Alzheimer’s病(老年性痴呆)A4蛋白前体(APP)存在广泛的同源性和区域保守性，胞内区和跨膜区有70.6％的同源性。其后自人胎盘中筛选的该蛋白被命名为淀粉样蛋白前体同源蛋白(APPH)，并发现与大鼠淀粉样蛋白前体样蛋白2(APLP2)非常相似，为同一蛋白在不同种属中的不同形式。人YWK-II蛋白与APLP2基因序列一致，染色体定位于11q24-25，并在多组织中均有表达，其cDNA命名为HSD-2(GenBankNumber AF168956)，长3654bp，编码763个氨基酸。研究发现YWK-II蛋白APLP2参与精卵相互作用。YWK-II抗体能够导致人和大鼠精子的凝集并抑制受精过程。以YWK-II蛋白/APLP2的片段(594-610/763)免疫小鼠，可有效地降低雄性和雌性小鼠的生殖能力。基因敲除实验显示，YWK-II蛋白/APLP2与APP单独敲除，小鼠仍具有生殖能力，而两者联合敲除则导致动物不育。这一实验表明，YWK-II蛋白/APLP2在生殖细胞中发挥重要的生理功能。
体外研究发现，重组表达的YWK-II蛋白/APLP2胞内段能够被PKC和cdc2激酶磷酸化，并可以和GTP结合蛋白Go蛋白相互作用，表明YWK-II蛋白/APLP2可能是一种与Go蛋白耦联的受体。采用酵母双杂交系统，发现YWK-II蛋白/APLP2与穆勒氏管抑制性物质(MIS)存在相互作用。MIS是一种由Sertoli细胞和granular细胞表达分泌的糖蛋白，能够诱导穆勒氏管的退化，在性别决定中发挥重要作用。两者的相互作用经GST Pull-down实验和表面等离子共振实验(SPR)在体外进行了验证。MIS的功能是多方面的，已发现其可在体外促进人精子的存活力和活动力。研究表明，MIS在成熟精子上存在结合位点，但没有证据显示，精子中有MIS的II型受体的表达。我们推测，YWK-II蛋白/APLP2可能作为MIS的一种新的受体，介导MIS促进精子存活力和活动力的功能。
现有文献主要集中于探讨MIS与其II型受体相互作用经NFκB通路抑制细胞的增殖。至今尚无有关YWK-II蛋白/APLP2为MIS的新受体的报道。
发明目的通过研究YWK-II蛋白/APLP2与MIS的受体-配体关系，了解两者相互作用后的信号传导通路，可为YWK-II蛋白/APLP2与MIS的功能的多态性提供新的线索，为阐明MIS对精子的促进存活力和活动力的分子机制提供依据，进而为在精子冷冻技术采用MIS作为精子的保护剂提供依据。
内容与要求应用分子克隆、蛋白质表达与纯化技术、抗血清制备、Western blot检测、MTT检测、细胞培养技术、细胞转染技术以及细胞免疫荧光和激光共聚焦显微技术等，克隆编码YWK-II蛋白/APLP2和MIS的片段的cDNA，纯化原核表达的目标蛋白质，进而通过共纯化的方法验证两者的体外结合；构建融合表达小鼠IgGκ信号肽和绿色荧光蛋白的YWK-II蛋白/APLP2的真核表达质粒，并观察重组蛋白的细胞定位；筛选稳定表达重组EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞系；MTT法检测MIS对表达YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞增殖的影响；采用真核细胞转染和Western blot检测初步确定MIS与YWK-II蛋白/APLP2相互作用后的信号传导通路。
该基因/蛋白质达到的技术指标为1.原核细胞表达的YWK-II蛋白/APLP2的395-675氨基酸(HSD281)以及大鼠MIS的249-390氨基酸(rMIS142)在Resouce Q离子交换柱上分别由9％和3％NaCl洗脱。两者以1∶2摩尔比于4℃孵育30min后，两种蛋白质的混合物在Resouce Q离子交换柱上以5％NaCl共洗脱(见图1-1)。经SDS-PAGE分析显示，共洗脱物由YWK-II蛋白/APLP2和MIS共同组成(见图1-2)。说明两种蛋白质在体外可相互结合。
2.YWK-II蛋白/APLP2的胞外近膜区226个氨基酸(HSD226)于大肠杆菌中获得明显表达，经亲和层析纯化后的产物免疫新西兰大白兔，制备了高滴度抗HSD226的抗体。
3.构建融合表达小鼠IgG κ信号肽和绿色荧光蛋白的YWK-II蛋白/APLP2的真核表达质粒(pEGFP-N1-SYP)，转染CHO细胞，融合表达的YWK-II蛋白/APLP2定位于细胞膜上(见图2、3)。
4.重组YWK-II蛋白/APLP2基因的真核细胞表达质粒(pEGFP-N1-SYP)转染CHO细胞，经G418筛选获得稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的细胞系(见图4)。
5.MIS促进表达YWK-II蛋白/APLP2的细胞的增殖(见图5)。
6.MIS激活表达YWK-II蛋白/APLP2的细胞的ERK1/2(见图6-1)。这一功能具有时间和剂量依赖性(见图6-2、6-3)。MIS与YWK-II蛋白/APLP2相互作用首先激活Go(见图6-4、6-5)，导致Goα和Goβγ的分离，并主要通过Goβγ产生作用(见图6-6)。Ras和PKC在MIS对ERK1/2的激活中独立地发挥作用(见图6-7、6-8、6-9)。
7.YWK-II蛋白/APLP2作为一种新受体参与介导MIS的功能。
图1.HSD281和rMIS142的共洗脱结果1.HSD281和rMIS142的混合物经Resouce Q离子交换柱纯化的层析图2.共洗脱物成分分析(SDS-PAGE)1蛋白质Marker，2共洗脱物(HSD281和rMIS142)结果显示HSD281和rMIS142以适当比例混合后，能够以单一蛋白的形式在Resouce Q离子交换柱上被洗脱。共洗脱物经变性后通过SDS-PAGE分析显示由HSD-281和rMIS142组成。
图2.重组蛋白EGFP-YWK-II蛋白/APLP2结构的示意图A.小鼠IgG κ信号肽B.HSD226(YWK-II蛋白/APLP2胞外近膜区的226氨基酸)C.YWK-II蛋白/APLP2的跨膜区D.YWK-II蛋白/APLP2的胞内区E.绿色荧光蛋白(EGFP)图3.重组蛋白EGFP-YWK-II蛋白/APLP2在细胞膜上的定位直接荧光观察pEGFP-N1-SYP转染CHO细胞，固定，透化，PI标记细胞核1.CHO细胞表达的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2(绿色)2.PI标记的CHO细胞核(红色)3.A图和B图的迭加免疫荧光观察pEGFP-N1-SYP转染CHO细胞，固定4.CHO细胞表达的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2(绿色)5.以兔抗HSD226的抗体为一抗，Rodamine标记的山羊抗兔IgG为二抗，标记CHO细胞表达的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2(红色)6.D图和E图的迭加(黄色)图4.稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2和EGFP的CHO细胞系的鉴定采用Wertern Blot方法分别检测CHO细胞、表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞和表达EGFP的CHO细胞
1.一抗为HSD226抗体2.一抗为GFP抗体结果显示稳定转染pEGFP-N1-SYP的CHO细胞过量表达重组的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2，对照组均为阴性。
图5.rMIS74对表达YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞的增殖的作用结果显示0.035nM rMIS74即可促进稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞的增殖，且增殖作用与rMIS74浓度呈剂量依赖关系，与对照组相比有显著差异。过量表达的YWK-II蛋白/APLP2放大了rMIS74的作用。
图6.rMIS74对表达YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞中ERK1/2的激活作用及其信号传导途径1.rMIS74对表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞、表达EGFP的CHO细胞和CHO细胞中ERK1/2的影响。结果显示只有过量表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞中ERK1/2可被rMIS74明显激活。
2.rMIS74(0.35nM)激活表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞中ERK1/2与作用时间的关系。结果显示ERK1/2的激活在rMIS74作用5min时最强，之后逐渐减弱，直至下降至对照水平。
3.不同剂量rMIS74对表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞中ERK1/2的激活作用的影响。结果显示0.0175nM的rMIS74作用5min即可激活ERK1/2，作用强度随浓度增加而增强，呈现剂量依赖性。
4.Gi和Go的抑制剂百日咳毒素(PTX)(1000ng/mL)对rMIS74(0.35nM)激活表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞中ERK1/2的影响。结果显示PTX可抑制由YWK-II蛋白/APLP2介导的rMIS74对ERK1/2的激活作用。
5.G蛋白C端干扰实验对rMIS74(0.35nM)激活表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞的ERK1/2的影响。结果显示Go1和Go2的C端11肽具有抑制rMIS74激活ERK1/2的作用，而Gi1/2的C端11肽无作用。
6.Goβγ的干扰蛋白βARK1对rMIS74(0.35nM)激活表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞中ERK1/2的影响。结果显示βARK1具有抑制rMIS74激活ERK1/2的作用。
7.Ras的持续抑制型和持续激活型突变体pCMV-RasN17和pCMV-RasV12对rMIS74(0.35nM)激活表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞的ERK1/2的影响。结果显示pCMV-RasN17和pCMV-RasV12分别抑制和增强rMIS74激活ERK1/2的作用。
8.PKC抑制剂GF109203X(3.5μM)对rMIS74(0.35nM)激活表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞中ERK1/2的影响。结果显示GF109203X也同样可抑制rMIS74激活ERK1/2的作用。
9.Ras的持续抑制型突变体pCMV-RasN17和PKC抑制剂GF109203X共同作用对rMIS74(0.35nM)激活表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞中ERK1/2的影响。结果显示两者共同作用对rMIS74激活ERK1/2的抑制作用具有叠加效应。
以上结果显示rMIS74通过与YWK-II蛋白/APLP2相互作用激活细胞ERK1/2，这一作用是通过激活Go信号传导通路实现的，其中主要经Goβγ介导，进而分别激活Ras和PKC，最终导致ERK1/2的激活。
具体实施例方式1.大鼠卵巢RNA的提取，RT产物的制备和MIS(249-390氨基酸)cDNA的扩增取雌性大鼠一只。引颈处死后，快速切取卵巢，迅速液氮冷冻。然后用钝器砸碎，称取100μg组织加入有1ml Trizol试剂(Life Technologies)的微量组织匀浆器中。按照Trizol试剂说明所述提取总RNA。进而按照逆转录试剂盒说明制备RT产物。采用引物GGATCCCCACCCACCGGGCCGAC和CTCGAGTTGGGAGGTCCCGCAGC以PCR的方法扩增出MIS(249-390氨基酸)cDNA。
2.HSD281和rMIS142原核表达质粒的构建，蛋白的表达，共纯化和成分分析将编码HSD281(YWK-II蛋白395-675氨基酸)和rMIS142(大鼠MIS249-390氨基酸)的cDNA分别克隆到pET28a(+)和pET30a(+)，命名为pET28a(+)-HSD281和pET30a(+)-MIS142。
质粒转化E.coli strain BL21(DE3)，转化产物涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上筛选出阳性克隆。首先小量培养鉴定蛋白表达水平及该蛋白在细胞内的表达形式，然后进行大量表达，自经过鉴定的质粒保存板中挑单菌落入100mL新鲜LB的锥形瓶(含卡那霉素50μg/mL)。37℃，剧烈摇动，培养过夜。将过夜菌液按1/100比例接种到一个含500mL LB(含卡那霉素)的2000mL锥形瓶中，37℃，剧烈摇动，培养1-1.5h，使菌液的A600nm值达0.4-0.6。加入终浓度为0.5mmol/L IPTG于16℃诱导表达5h。收集培养液，5000rpm离心10min，弃上清。PBS洗菌体沉淀，菌体按照10mL/g重悬于裂解液中(20mM Tris-HClpH8.0，500mM NaCl，10mM imidazole，1mM PMSF，1mM β-mercaptoethanol)，冰浴下以工作4s/冷却6s/300W/120次超声破碎菌体。12000rpm离心20min，分别取少量上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测，分析蛋白质在胞内表达形式。其余于-70℃冻存备用。
采用Novagen公司的His.Bind metal chelation resin产品进行重组蛋白质的初步纯化。经鉴定表达蛋白质以可溶性形式表达，以0.45μm滤膜过滤上清。轻混Ni-NTA树脂，使其与保存液混匀呈完全悬浮状态。吸取2.5mL树脂悬液加到聚丙烯柱内，使树脂在重力作用下沉积。分别以3倍柱床体积去离子水、5倍体积Charging buffe r(50mM NiSO4)及3倍体积Binding buffer(5mM咪唑，0.SM NaCl，20mM Tris·HCl，pH7.9)洗柱。当Binding Buffer下降到柱床上缘时，加入已经准备好的待纯化样品。调节流速约为10滴/min。分别以10倍体积的Binding Buffer、6倍体积的Washing Buffer(40mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris·HCl，pH7.9)洗柱。以6倍柱床体积或更少的Elution Buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris·HCl，pH7.9)，洗脱柱子。收集洗脱液。取少量行SDS-PAGE，鉴定蛋白质纯度为90％以上。
采用AKTA Prime System(Amersham Pharmacia)对上述收集的蛋白质进行再纯化。通过G-25 column，将蛋白质的缓冲液由洗脱液转换成为buffer A(50mM Tris-HCl pH8.0，80mM NaCl，1mMβ-mercaptoethanol)，经Resouce Q离子交换柱纯化(洗脱缓冲液50mM Tris-HCl pH8.0，500mM NaCl，1mMβ-mercaptoethanol)。将洗脱液浓缩，BCA法测定蛋白质浓度，以摩尔比1∶2的比例混合HSD-281和rMIS142，于4℃孵育30min，将混合物于Resouce Q离子交换柱纯化，混合物以单一蛋白质的形式洗脱(图1A)，共洗脱物变性后行SDS-PAGE，显示由两个蛋白质组成即HSD-281和rMIS142(图1B)。
3.YWK-II蛋白/APLP2胞外近膜段(HSD226)抗血清的制备将pET30a(+)-HSD226转化E.coli strain BL21(DE3)，如实施例2中方法诱导表达及纯化His6-HSD226(1mmol/L IPTG于37℃诱导表达3h)。
取三只2kg重的新西兰大白兔(两只作为实验组，一只为对照组)。分别于免疫前从耳缘静脉取0.5mL正常血清做阴性对照。将纯化的His6-HSD226与福氏完全佐剂混合，采用背部皮内多点注射，约20-30点。对照组取溶解His6-HSD226用的缓冲液与佐剂混合。初始免疫后2、4、8周采用抗原和福氏不完全佐剂混合进行加强免疫。酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体滴度，Western Blot检测抗体的反应性和特异性。
将免疫用样品行12％SDS-PAGE电泳(反应性检测His6-HSD226每泳道上样量为1μg；特异性检测转化pET30a(+)-HSD226并诱导后的细菌裂解液，每泳道上样量为50μg)。SDS-PAGE结束后，将塑料支架平放，依次放置海绵垫、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、海绵垫，赶走各层间气泡，夹好支架，在冰浴中进行电转，230mA，1.5h(PVDF膜需经100％甲醇浸透5min，电转液平衡15min后方可使用)。电转结束后，将膜置于去离子水中漂洗5min。切下边侧的蛋白质分子量Marker条带，浸入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脱色至可见蛋白质条带，蒸馏水漂洗观察转移效果，并密封保存留待以后作为分析结果时分子量的参照。转移的滤膜勿干，准备用于杂交。将做好标记的滤膜经TBS漂洗后，加入适量封闭液(含5％脱脂奶粉、1％正常羊血清的TBS-T溶液)中，室温轻摇2h。将滤膜放入杂交袋内，按照0.1mL/cm2加入一抗(反应性检测将抗血清1∶500、1∶1000、1∶2000；1∶5000稀释；特异性检测1∶1000稀释抗血清)。除尽气泡，封口。于4℃轻摇过夜。取出滤膜，用TBS-T洗三次，每次10min。将膜放入塑料袋内，按照0.1mL/cm2加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG抗体。赶除气泡，封口。室温轻摇2h。取出滤膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用显色缓冲液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl pH9.5)平衡膜5min。将滤膜浸入含100μL ReagentA与100μL Reagent B(Bio-Rad)的10mL显色缓冲液中，于室温下轻轻摇晃使蛋白质条带显现，蒸馏水中漂洗，4℃避光保存并扫描。
4.与小鼠IgGκ信号肽和绿色荧光蛋白融合表达的YWK-II蛋白/APLP2的重组质粒的构建，CHO细胞转染，以及重组蛋白细胞定位的观察合成小鼠IgGκ信号肽基因序列的5’端GTCGACACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTC和3，端的互补序列，GAATTCGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCA，于1×PCR buffer，dNTPs和Taq DNA polymerase的体系中，退火温度44℃条件下，进行overlap。经PAGE检测序列长度正确的反应产物，采用压碎浸泡法回收后，连接入pEGFP-N1载体。采用引物GAATTCATGGTTAAAGCTTTAGAG和GGATCCCGAATCTGCATCTGCTCCAG，PCR扩增YWK-II蛋白/APLP2的序列，并克隆入pEGFP-N1载体小鼠IgGκ信号肽基因序列之后。
将盖玻片分次置于浓酸中浸泡2h，用去离子水洗净后室温干燥。将经酸处理的盖玻片置于10倍稀释的多聚赖氨酸溶液中，室温放置5min后取出，置于60℃干燥1h或室温过夜。用前将盖玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
实验前两天将处理过的盖玻片放置于6孔培养板板中，将处于对数生长期的CHO细胞接种于6孔板中，每孔3×105个细胞，37℃，5％CO2培养至70％饱和度。用50μL无抗生素无血清DMEM分别稀释3μg质粒和3.5μL Lipofectamine 2000。室温放置2min后将稀释的质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温放置20min。将上述混合物滴加到6孔培养板中，37℃，5％CO2孵箱中继续培养24-48h。
细胞荧光直接观察1)细胞固定用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)去离子水漂洗，2×5min。4)封片取10μL封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，周围用指甲油封住。5)用激光共聚焦显微镜观察(图3ABC)。
细胞免疫荧光染色1)细胞固定用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)细胞透化室温下，0.5％Triton/PBS透化处理10min。4)PBS漂洗，3×5min。5)细胞封闭以3％BSA/PBS封闭，37℃，30min或4℃过夜。6)一抗孵育anti-HSD226抗体按1∶100稀释，37℃，30min。7)PBS漂洗，3×5min。8)二抗孵育Rodamin标记的山羊抗兔IgG抗体按1∶50稀释37℃，30min。9)PBS漂洗，3×5min。10)去离子水漂洗，2×5min。11)封片取10μL封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，周围用指甲油封住。12)用激光共聚焦显微镜观察(图3DEF)。
5.稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2和EGFP的CHO细胞系的筛选采用Lipofectamine 2000将pEGFP-N1-SYP和pEGFP-N1转染CHO细胞48h后，在培养基中加入geneticin(G418)(500ng/mL)，每3-4天换液一次，加入同样浓度的G418。2-3周后，挑选同时具有抗生素抗性和绿色荧光的细胞克隆，使之扩增为细胞系，通过荧光观察和Western Blot进行鉴定。离心收集细胞，加入细胞裂解液(1％NP-40，150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA pH8.0，1mM DTT，1mM PMSF，1μg/mL Aprotinin and 1μg/mL Leupeptin)，冰上裂解3h后，4℃，12000rpm，离心10min，取上清，BCA法测定蛋白质浓度，并在蛋白溶液中加入1×SDS-sample buffer和5％2-Mercaptoethanol，于100℃变性10min，储存于-70℃。每组细胞以50μg总蛋白行12％SDS-PAGE。SDS-PAGE结束后，将塑料支架平放，依次放置海绵垫、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、海绵垫，赶走各层间气泡，夹好支架，在冰浴中进行电转，230mA，1.5h(PVDF膜需经100％甲醇浸透5min，电转液平衡15min后方可使用)。电转结束后，将膜置于去离子水中漂洗5min。切下边侧的蛋白质分子量Marker条带，浸入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脱色至可见蛋白质条带，蒸馏水漂洗观察转移效果，并密封保存留待以后作为分析结果时分子量的参照。转移的滤膜勿干，准备用于杂交。将做好标记的滤膜经TBS漂洗后，加入适量封闭液(含5％脱脂奶粉、1％正常羊血清的TBS-T溶液)中，室温轻摇2h。将滤膜放入杂交袋内，按照0.1mL/cm2加入1∶1000的一抗(抗HSD226抗体，兔IgG；抗GFP抗体，兔IgG)。除尽气泡，封口。于4℃轻摇过夜。取出滤膜，用TBS-T洗三次，每次10min。将膜放入塑料袋内，按照0.1mL/cm2加入碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG抗体。赶除气泡，封口。室温轻摇2h。取出滤膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用显色缓冲液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl pH9.5)平衡膜5min。将滤膜浸入含100μL ReagentA与100μL ReagentB(Bio-Rad)的10mL显色缓冲液中，于室温下轻轻摇晃使蛋白质条带显现，蒸馏水中漂洗，4℃避光保存并扫描(图4)。
6.MTT法检测MIS促进表达YWK-II蛋白的细胞的增殖将CHO细胞、稳定表达EGFP的CHO细胞和稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞以5000/孔的密度种植于96孔培养板中。血清饥饿24h后，在培养基中加入不同浓度的rMIS74(0nM，0.035nM，0.35nM，3.5nM和35nM)。继续培养1天后，在200μL培养基中加入20μL 5mg/mL thiazolyl blue tetrazoliumbromide(MTT)，于37℃反应4h。弃去培养基，加入100μL DMSO裂解细胞，使用酶标仪检测570nm的OD值。每个实验点设3个孔，实验重复3次。每种细胞的对照组设为100％，各实验组则以与之相比所得的百分数表示(图5)。
7.Western Blot检测MIS对表达YWK-II蛋白/APLP2的细胞ERK1/2的激活及其相应的信号传导通路分别合成编码Gαi1/2，Gαo1，Gαo2C末端11个氨基酸残基的cDNA及其互补序列，并加入了核糖体结合通用序列(5’-GCCGCCACC-3’)，转录起始密码子(ATG)，一个在转录时保护核糖体结合位点和在翻译时保护新合成的肽免于被蛋白酶降解的编码甘氨酸的三核苷酸(GGA)，以及一个终止密码子(TGA)。序列的5’和3’端酶切位点分别为BamHI和XhoI。互补序列在体外于1×PCR缓冲液中退火后，克隆入pcDNA 3.1(+)，分别命名为pcDNA 3.1(+)-Gαi1/2，pcDNA 3.1(+)-Gαo1，pcDNA 3.1(+)-Gαo2。以CHO细胞的RT产物为模板，设计引物GAATTCGCCGCCACCATGGGAATCAAGTTACTGGAC和GGATCCTCAGAGGCCGTTGGCACT，PCR扩增CHO细胞的βARK1片段，克隆入pCMV。命名为pCMV-CHOβARK1。
将CHO细胞、稳定表达EGFP的CHO细胞和稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞接种于60mm培养板中，血清饥饿24h后，进行分组实验。在CHO细胞、稳定表达EGFP的CHO细胞和稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞培养基中加入不同浓度的(0，0.035nM，0.35nM)rMIS74，于37℃作用5min。在稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞培养基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5，10，15，20，25，30min。在稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞培养基中加入不同浓度的(0，0.0175nM，0.035nM，0.35nM，3.5nM，35nM)rMIS74，于37℃作用5min。以1μg/mL PTX预处理稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞24h，在细胞培养基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。将pcDNA3.1(+)-Gαi1/2，pcDNA3.1(+)-Gαo1，pcDNA 3.1(+)-Gαo2转染稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞24h，在细胞培养基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。将pCMV-CHOβARK1转染稳定表达EGFP-YWK-II protein/APLP2的CHO细胞24h，在细胞培养基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。以3.5μM GF109203X预处理稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞2h，在细胞培养基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。将pCMV-RasN17和pCMV-RasV12转染稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞24h，在细胞培养基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。将pCMV-RasN17转染稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2的CHO细胞24h，继而以3.5μM GF109203X预处理细胞2h，在细胞培养基中加入0.35nM rMIS74，于37℃作用5min。
弃细胞培养基，以用冰预冷的PBS洗涤细胞两次，刮取细胞，离心收集细胞，加入细胞裂解液(1％NP-40，150mM NaCl，10mM Tris-HCl pH8.0，10mM NaF，1mM Na2VO3，2mM EDTA pH8.0，1mM DTT，1mM PMSF，1μg/mL Aprotinin and 1μg/mL Leupeptin)，在冰上裂解3h。4℃，12000rpm，离心10min，取上清，BCA法测定蛋白质浓度，并在蛋白溶液中加入1×SDS-Sample buffer和5％2-Mercaptoethanol，于100℃变性10min，储存于-70℃。
Western Blot检测细胞磷酸化ERK1/2和总ERK1/2的含量，分析相关的信号传导通路。每组细胞以100μg总蛋白行10％SDS-PAG电泳。SDS-PAGE结束后，将塑料支架平放，依次放置海绵垫、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、海绵垫，赶走各层间气泡，夹好支架，在冰浴中进行电转，230mA，1.5h(PVDF膜需经100％甲醇浸透5min，电转液平衡15min后方可使用)。电转结束后，将膜置于去离子水中漂洗5min。切下边侧的蛋白质分子量Marker条带，浸入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脱色至可见蛋白质条带，蒸馏水漂洗观察转移效果，并密封保存留待以后作为分析结果时分子量的参照。转移的PVDF膜勿干，准备用于杂交。将做好标记的PVDF膜经TBS漂洗后，加入适量封闭液(含5％脱脂奶粉、1％正常羊血清的TBS-T溶液)中，室温轻摇2h。将PVDF膜放入杂交袋内，按照0.1mL/cm2加入1∶1000的一抗(抗pERK1/2抗体，小鼠IgG)。除尽气泡，封口。于4℃轻摇过夜。取出PVDF膜，用TBS-T洗三次，每次10min。将膜放入塑料袋内，按照0.1mL/cm2加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体。赶除气泡，封口。室温轻摇2h。取出PVDF膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用TBS平衡膜5min。采用ECL法检测，按照0.1ml/cm2将A和B液等体积混合液滴加在PVDF膜上，室温作用1min，使用X光片曝光，显影后定影。pERK1/2检测完毕后，洗涤PVDF膜(147mM NaCl and 10mM This-HCl pH2.3)。使用抗ERK1/2抗体(兔IgG)再杂交，并以ECL法检测，作为对照。
权利要求
1.本发明为发现精子膜蛋白YWK-II蛋白/APLP2作为穆勒氏管抑制性物质(MIS)的新受体及其介导的信号传导通路。
2.根据权利要求1所述发明，其特征在于原核细胞表达的YWK-II蛋白/APLP2的395-675氨基酸以及MIS的249-390氨基酸在Resouce Q离子交换柱上分别由9％和3％NaCl洗脱。两者以1∶2摩尔比于4℃孵育30min后，两种蛋白质的混合物在Resouce Q离子交换柱上由5％NaCl共洗脱。经SDS-PAGE分析显示，共洗脱物由YWK-II蛋白/APLP2和MIS共同组成。说明两种蛋白质在体外可相互结合。
3.根据权利要求1、2所述发明，其特征在于重组表达的EGFP-YWK-II蛋白/APLP2定位于细胞膜上。
4.根据权利要求1、2、3、所述发明，其特征在于筛选获得稳定表达EGFP-YWK-II蛋白/APLP2和EGFP的CHO细胞系。
5.根据权利要求1、2、3、4所述发明，其特征在于MIS促进表达YWK-II蛋白/APLP2的细胞的增殖。
6.根据权利要求1、2、3、4、5所述发明，其特征在于MIS对表达YWK-II蛋白/APLP2细胞的ERK1/2具有激活作用。这一功能具有时间和剂量依赖性。MIS与YWK-II蛋白/APLP2相互作用首先激活Go，导致Goα和Goβγ的分离，并主要通过Goβγ产生作用。Ras和PKC在MIS对ERK1/2的激活中独立地发挥作用。
7.根据权利要求1、2、3、4、5、6所述发明，其特征在于YWK-II蛋白/APLP2作为一种新受体参与介导MIS的功能，对于了解MIS促进精子存活力和活动力的功能的分子机制以及YWK-II蛋白/APLP2与MIS的功能的多态性具有重要的意义，为在精子冷冻技术采用MIS作为精子的保护剂提供实验依据。
全文摘要
本发明为发现YWK－II蛋白/APLP2作为MIS的新受体及其介导的信号传导通路，涉及蛋白质新功能的研究与应用领域。内容包括体外共洗脱实验验证了两种蛋白质的相互作用；构建表达EGFP－YWK－II蛋白/APLP2的真核表达质粒，转染CHO细胞，荧光和免疫荧光观察显示，表达的重组蛋白定位于细胞膜上；筛选稳定表达EGFP－YWK－II蛋白/APLP2的CHO细胞系，发现MIS促进该细胞系的增殖；MIS通过与YWK－II蛋白/APLP2相互作用激活细胞ERK1/2，这一作用是通过G
文档编号G01N33/566GK1667415SQ20041000479
公开日2005年9月14日 申请日期2004年3月11日 优先权日2004年3月11日
发明者尹雪茜, 杨茂君, 缪时英, 王琳芳 申请人:中国医学科学院基础医学研究所