专利名称：多通道trail受体检测系统及其检测方法
背景技术：
细胞凋亡是生物体最重要的生理和病理现象之一。TRAIL(TNF-relatedapoptosisindecingligand)是新的肿瘤坏死因子TNF(Tumomecrosisfactor)家族成员，其最大的生物学特点是选择性细胞毒作用，即仅诱导肿瘤细胞、转化细胞或病毒感染细胞的凋亡，而不引起正常的细胞凋亡。这一特点在肿瘤治疗中具有潜在而广泛的应用前景。
现阶段检测TRAIL四种受体的方法有两种。一是用流式细胞仪的方法在实验室进行检测。每个病人的样品需要进行四种抗体的单独标记、单独操作，操作过程复杂，容易造成试剂及消耗品的浪费。流式细胞仪的方法仅适用于实验室少量标本的研究而不利于临床大量标本的批量检测。二是酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。这种方法虽然简单易行，但仅适于液体介质中可溶性成分的检测，不适合检测用于细胞表面的跨膜蛋白，TRAIL属于II型跨导蛋白的一种，即ELISA方法不适于TRAIL四种受体的检测。
迄今为止，对TRAIL的研究主要集中在其生物学特性方面的研究，尚未建立TRAIL高通量的快速检测系统。生物与电子技术结合产生的生物传感器，可以对蛋白质等大分子进行检测，为解决现有检测手段的困难提供了可能。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种多通道TRAIL受体检测系统及其检测方法，利用抗原抗体反应原理研制出免疫场效应型TRAIL生物传感器，可实现对肿瘤细胞凋亡因子TRAIL四种受体的检测。
本发明的目的还在于提供一种TRAIL抗体生物敏感膜，以及制造方法。
本发明的目的还在于提供一种免疫场效应型TRAIL生物传感器，以及检测肿瘤细胞凋亡因子TRAIL四种受体的方法。
为实现上述目的，本发明提供的一种TRAIL抗体生物敏感膜制备的制造方法，其特征在于，其步骤如下A、采用P型硅材料，用半导体制备工艺制成MOS型场效应晶体管，该场效应晶体管包括源极、漏极、非金属的绝缘材料氮化硅栅极；B、氮化硅作为敏感栅，将其做硅烷化处理；C、用吸附方法将蛋白A固定在氮化硅表面，室温干燥，牛血清蛋白(BSA)做封闭处理，磷酸缓冲溶液(PBS)清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的复合敏感膜；D、将TRAIL受体的抗体用吸附方法固定在蛋白A上，待室温干燥，磷酸缓冲溶液(PBS)清洗置干备用；至此制备成氮化硅—蛋白A-TRAIL受体的抗体这样有叠型结构的生物敏感膜。
本发明还提供一种TRAIL抗体生物敏感膜，其特征在于，包括一固定在氮化硅上的蛋白A，两者共同组成氮化硅—蛋白A的复合敏感膜；还包括一层吸附在其上的TRAIL受体的抗体。
本发明还提供一种免疫场效应型TRAIL生物传感器，其特征在于，包括以下结构一采用P型硅材料用半导体制备工艺制成MOS型场效应晶体管；还包括一在该场效应晶体管上制得的如上所述的TRAIL抗体生物敏感膜；该传感器分别提供单参数TRAIL和多参数TRAIL肿瘤细胞的检测。即单参数检测TRAIL采用离子敏场效应管、多参数检测TRAIL采用光寻址电位传感器LAPS。
本发明还提供一种检测TRAIL受体的方法，其特征在于，步骤如下
a、将定量TRAIL抗体固定在离子敏场效应管(ISFET)敏感栅氮化硅表面构成如前所述的生物功能性TRAIL抗体生物敏感膜；b、抗体识别待测液中不同细胞上表达的TRAIL受体抗原量，形成稳定的复合体，抗原抗体的结合产生的荷电状态，引起离子敏场效应管膜电位变化；c、测量膜电位的电压变化值得到待检TRAIL受体抗原量的数量，完成对肿瘤细胞凋亡因子TRAIL的检测。
其中步骤a，细分为如下步骤a1、将敏感栅上的氮化硅做硅烷化处理；a2、用吸附方法将蛋白A固定在氮化硅表面，室温干燥，牛血清蛋白(BSA)做封闭处理，磷酸缓冲溶液(PBS)清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的复合敏感膜；a3、将TRAIL受体的抗体用吸附方法固定在蛋白A上，待室温干燥，磷酸缓冲溶液(PBS)清洗置干备用；本发明还提供一种多通道TRAIL受体检测系统，其特征在于，包括若干个如前所述的免疫场效应型TRAIL生物传感器，用于将待检TRAIL受体抗原量转换为膜电位的电压值；多路开关，用于依次选通各传感器通道，把参比电极上的控制电位VG输入到模数转换器；反馈前级电路，用于保持漏源电流Ids恒定，使得参比电极上的控制电位VG与待测物质活度ai的对数呈线性关系；数模转换器，用于将参比电极上的控制电位VG由模拟量转换为数字量；单片机，用于控制采样，换算，显示，存储，通讯和按键操作；存储器，用于存储采样结果；显示器，用于显示参比电极上的控制电位VG；所述的单片机，控制多路开关，依次选通各通道，模数转换器，将参比电极上的控制电位，由模拟量转换为数字量，间隔定期进行数据采样，并且将采样结果存入存储器，优选为电可擦写存储器，采样的结果由显示器，优选为液晶显示器。
上述多通道TRAIL受体检测系统，还包括PC机，与单片机连接，用于处理采样数据。
由上可见，本发明采用微电子技术可以实现传感器芯片的阵列化，使肿瘤细胞凋亡因子TRAIL的大批量临床检测成为可能。传感器方法检测肿瘤细胞凋亡因子TRAIL四种受体，其特点是简单、快速、成本低、价格低廉、特异性好、无需标记、所需样本量少，微升量级、可同时对多人多批次进行检测。利用多通道TRAIL受体快速检测系统对肿瘤病人进行检测，可以为医生提供半定量的数据信息。避免盲目用药给病人造成的经济负担。
免疫场效应型TRAIL生物传感器及其多通道快速检测系统可以完成对肿瘤细胞凋亡因子TRAIL四种受体的定量或半定量检测。比如用固定量的抗体检测等量的不同肿瘤细胞上表达的TRAIL受体抗原的量，通过电压数据变化表明之间有差别。
TRAIL多通道快速检测系统可与普通PC机相兼容，通过与PC机的通讯实现复杂的数据分析与管理。这一点与现有的用流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡因子TRAIL四种受体的方法完全不同。流式细胞仪是检测用荧光素标记后细胞的专用仪器，能分别对标记的四种荧光素细胞进行计数，主要的检测与分析软件名为″Cellquest″，能用各种图形进行分析，并读取数值，但其主机只能与苹果机兼容，只能用苹果机读取和分析数据。
图1是有叠型结构生物敏感膜场效应型传感器示意图；图2是场效应型生物传感器用于检测TRAIL受体的示意图；图3是本发明实施例TRAIL多通道快速检测系统结构示意图。
具体实施例方式
如图1所示为有叠型结构生物敏感膜场效应型传感器示意图。采用P型硅材料3，用半导体制备工艺制成MOS型场效应晶体管。该场效应晶体管包括源极1、漏极2、非金属的绝缘材料氮化硅4栅极。将敏感栅氮化硅4做硅烷化处理，用吸附方法将蛋白A5固定在氮化硅4表面，室温干燥，牛血清蛋白(BSA)做封闭处理，磷酸缓冲溶液(PBS)清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的复合敏感膜。再将TRAIL受体的抗体6用吸附方法固定在蛋白A5上，待室温干燥，磷酸缓冲溶液(PBS)清洗置干备用。至此制备成氮化硅—蛋白A-TRAIL受体的抗体这样有叠型结构的生物敏感膜。
场效应型生物传感器用于检测TRAIL受体的实施方式如图2所示。
免疫场效应型TRAIL生物传感器是利用抗原和抗体免疫反应的特异性结合构成的，具有高度专一性。定量TRAIL抗体2被固定在离子敏场效应管(ISFET)敏感栅氮化硅表面构成生物功能性敏感膜1，抗体识别待测液中不同肿瘤细胞4上表达的TRAIL受体3抗原量，形成稳定的复合体。抗原抗体的结合产生的荷电状态，会引起离子敏场效应管膜电位变化，其膜电位改变和待测溶液中的离子活度遵循Nernst原理。将传感器与多通道快速检测系统连接，测量膜电位的电压变化值即能得到待检TRAIL受体3抗原量的多少。利用这种现象可以实现生物信号与电子信号的转换，即用微结构场效应型生物传感器的方法完成对细胞凋亡因子TRAIL四种受体的检测。
便携式多通道快速检测系统的实施方式如图3框图所示。
多通道快速检测系统是基于MOS器件基本原理设计完成的，可以用来检测因待测物质浓度变化而引起的膜电位变化。多通道快速检测系统采用ATMEL公司的89c52单片机，通过它来控制采样，换算，显示，存储，通讯和按键操作。通过应用89c52单片机，有效的减少了外围电路，增加了仪器的灵活性和可靠性。可以根据用户的要求，通过改变仪器或者上位机的软件，为该检测系统扩展一系列新功能。
图3中，根据离子敏场效应管ISFET原理，采用运算放大器Lm258构成反馈补偿前级电路33，保持漏源电流Ids恒定，则参比电极上的控制电位VG与待测物质活度ai的对数呈线性关系。单片机35，型号为AT89c52；控制多路开关32，型号为AD7501；依次选通各通道，模数转换器34，型号为Max187；将参比电极上的控制电位VG由模拟量转换为数字量，以4秒(S)的间隔通过传感器采样31，数量为1～n，进行数据采样，并且将采样结果存入电可擦写存储器36，型号为x25043。采样的结果由液晶驱动电路Icm7211驱动4位液晶显示器显示38。采样数据量较大时，可通过连接电缆连接到计算机37，使用配套的软件进行数据分析与管理。
多通道快速检测系统特点可以与PC机进行数据通讯，实现复杂的数据分析与管理。
软件界面友好，操作简单，无需专业人员。
用途广泛，可以测量多种参数，易于实现功能扩展。
检测速度快，响应时间小于4S。
检测量大，有多个通道，可同时检测多个样品。
仪器使用9V直流电源，可在室内、野外使用。
LED数字显示。
体积小、重量轻、便于携带、稳定可靠。
多通道快速检测仪表技术参数最大样品数量n(1～35)个检测范围0～1000mV标准温度 25℃标准反应时间 4S工作电源 9V直流电源使用环境 室内/室外使用环境温度 0～40℃使用湿度 ＜90％(40℃时)密封性不易渗水、腐蚀显示电压精度 1mV仪器尺寸 134×70×20mm仪器重量约 100g
权利要求
1.一种TRAIL抗体生物敏感膜制备的制造方法，其特征在于，其步骤如下A、采用P型硅材料，用半导体制备工艺制成MOS型场效应晶体管，该场效应晶体管包括源极、漏极、非金属的绝缘材料氮化硅栅极；B、氮化硅作为敏感栅，将其做硅烷化处理；C、用吸附方法将蛋白A固定在氮化硅表面，室温干燥，牛血清蛋白做封闭处理，磷酸缓冲溶液清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的复合敏感膜；D、将TRAIL受体的抗体用吸附方法固定在蛋白A上，待室温干燥，磷酸缓冲溶液清洗置干备用；至此制备成氮化硅—蛋白A-TRAIL受体的抗体这样有叠型结构的生物敏感膜。
2.一种TRAIL抗体生物敏感膜，其特征在于，包括一固定在氮化硅上的蛋白A，两者共同组成氮化硅—蛋白A的复合敏感膜；还包括一层吸附在其上的TAIL受体的抗体。
3.一种免疫场效应型TRAIL生物传感器，其特征在于，包括以下结构一采用P型硅材料用半导体制备工艺制成MOS型场效应晶体管；还包括一在该场效应晶体管上制得的如权利要求2所述的TRAIL抗体生物敏感膜；该传感器分别提供单参数TRAIL和多参数TRAIL肿瘤细胞的检测，该单参数检测TRAIL采用离子敏场效应管、多参数检测TRAIL采用光寻址电位传感器LAPS。
4.一种检测肿瘤细胞凋亡因子TRAIL四种受体的方法，其特征在于，步骤如下a、将定量TRAIL抗体被固定在离子敏场效应管敏感栅氮化硅表面构成如权利要求2所述的生物功能性TRAIL抗体敏感膜；b、抗体识别待测液中不同细胞上表达的TRAIL受体抗原量，形成稳定的复合体，抗原抗体的结合产生的荷电状态，引起离子敏场效应管膜电位变化；c、测量膜电位的电压变化值得到待检TRAIL受体抗原量的数量，完成对肿瘤细胞凋亡因子TRAIL的检测。
5.根据权利要求4所述的检测肿瘤细胞凋亡因子TRAIL四种受体的方法，其特征在于，其中步骤a，细分为如下步骤a1、将敏感栅上的氮化硅做硅烷化处理；a2、用吸附方法将蛋白A固定在氮化硅表面，室温干燥，牛血清蛋白做封闭处理，磷酸缓冲溶液清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的复合敏感膜；a3、将TRAIL受体的抗体用吸附方法固定在蛋白A上，待室温干燥，磷酸缓冲溶液清洗置干备用；
6.一种多通道TRAIL受体检测系统，其特征在于，包括若干个如权利要求3所述的免疫场效应型TRAIL生物传感器，用于将待检TRAIL受体抗原量转换为膜电位的电压值；多路开关，用于依次选通各传感器通道，把参比电极上的控制电位VG输入到模数转换器；反馈前级电路，用于保持漏源电流Ids恒定，使得参比电极上的控制电位VG与待测物质活度ai的对数呈线性关系；数模转换器，用于将参比电极上的控制电位VG由模拟量转换为数字量；单片机，用于控制采样，换算，显示，存储，通讯和按键操作；存储器，用于存储采样结果；显示器，用于显示参比电极上的控制电位VG；所述的单片机，控制多路开关，依次选通各通道，模数转换器，将参比电极上的控制电位，由模拟量转换为数字量，间隔定期进行数据采样，并且将采样结果存入存储器，采样的结果由显示器显示。
7.根据权利要求6所述的多通道TRAIL受体检测系统，其特征在于，还包括PC机，与单片机连接，用于处理采样数据。
全文摘要
本发明公开一种TRAIL抗体生物敏感膜制备的制造方法，其步骤如下A.采用P型硅材料，用半导体制备工艺制成MOS型场效应晶体管，该场效应晶体管包括源极、漏极、非金属的绝缘材料氮化硅栅极；B.氮化硅作为敏感栅，将其做硅烷化处理；C.用吸附方法将蛋白A固定在氮化硅表面，室温干燥，牛血清蛋白做封闭处理，磷酸缓冲溶液清洗待干燥，由此形成氮化硅－蛋白A的复合敏感膜；D.将TRAIL受体的抗体用吸附方法固定在蛋白A上，待室温干燥，磷酸缓冲溶液清洗置干备用；至此制备成氮化硅－蛋白A－TRAIL受体的抗体这样有叠型结构的生物敏感膜。本发明还涉及应用上述TRAIL抗体生物敏感膜的多通道TRAIL受体检测系统及检测肿瘤细胞凋亡因子TRAIL四种受体方法。
文档编号G01N27/30GK1782709SQ20041000993
公开日2006年6月7日 申请日期2004年12月2日 优先权日2004年12月2日
发明者张虹, 巩祥鹏, 韩泾鸿, 黄俊琪 申请人:中国科学院电子学研究所, 中山大学