专利名称：含马兜铃酸及其内酰胺类成分血液样品预处理方法
技术领域：
本发明涉及血浆或血清生物样品的预处理方法，更具体地说涉及含马兜铃酸(马兜铃酸I、II)及其内酰胺类成分(马兜铃内酰胺I、II)的血浆或血清样品酸化后采用乙酸乙酯进行萃取处理的血浆或血清样品预处理方法。
背景技术：
马兜铃酸类成分是马兜铃属植物的主要活性成分，同时也是导致服用此类中草药及其成方制剂造成肾功能损伤的直接原因。马兜铃内酰胺类成分为马兜铃酸类成分的衍生物，广泛分布于临床使用的中药材中，文献报道了马兜铃内酰胺I对肾小管上皮细胞具有损伤作用(李彪等，马兜铃内酰胺I对肾小管上皮细胞的损伤作用.中国中药杂志，2004，29(1)78-83)。体内代谢产物研究结果表明马兜铃内酰胺I(Alt I)、II(Alt II)为马兜铃酸I(AAI)、II(AAII)的代谢产物(G Krumbiegel，et al，Studies on the metabolism of aristolochicacids I and II.Xenobiotica，1987，17(8)981)；基因致癌物马兜铃酸的DNA加合物结构式中马兜铃酸以其相应的内酰胺形式存在(Joelle L.Nortier et al，Urothelial carcinoma associated with the use of a Chinese herb(Aristolochia fangchi).The New England Journal ofMedicine.Boston，2000，342(23)1686)。
马兜铃酸类成分与其相应的内酰胺类成分结构相似，二者在生物体内的转化关系与及基因致癌物马兜铃酸的DNA加合物的形成机制目前均还不清楚；另外，能够导致马兜铃酸肾病的致病成分也还不清楚。因此患者体内马兜铃酸及其酰胺类成分的检测，对于监测服用含马兜铃酸及其内酰胺类成分药物造成的肾损伤情况具有重要意义。而目前此方面的分析报道甚少，适用于高效液相色谱法(HPLC)测定的含马兜铃酸及其内酰胺类成分人血浆或血清样品预处理方法尚未见报道。仅一篇文献中报道了含马兜铃酸I的兔血浆生物样品预处理方法(Tsai，Tung Hu.etal，Determination of aristolochic acid in rabbit plasma by high-performance liquid chromatography with photodiode-arrayultraviolet detection and its pharmacokinetics application.J.Liq Chromatogr.1993.16(5)，1173-82)，所采用的血浆预处理方法为乙腈沉淀法。目前血浆样品预处理常用的方法为蛋白沉淀法和溶剂萃取法。
发明内容
本发明的目的是提供一种含马兜铃酸及其内酰胺类成分血液(血浆或血清)样品预处理方法。
本发明采用含马兜铃酸及其内酰胺类成分的血浆样品酸化后以乙酸乙酯进行萃取处理的预处理方法。针对影响马兜铃酸及其内酰胺类成分提取回收率的影响因素，如萃取溶剂用量、加入盐酸浓度等进行了筛选；同时还设计了正交试验和验证实验对其它操作条件进行了优化，最终获得了对含马兜铃酸及其内酰胺类成分的血浆或血清样品均有较高提取回收率(均大于95％)的预处理方法。本发明包括以下四方面内容1.色谱条件C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)流动相A∶B＝1％醋酸/30m mol/L三乙胺∶乙腈(35％B→100％B)柱温15℃进样体积20μL检测波长260nm(Alt I、Alt II)；250nm(AA I、AA II)
人血浆分离色谱图，见说明书附
图1。
2.萃取溶剂用量的确定-20℃保存空白血浆，37℃水浴解冻，分别取1mL血浆，加入60μL混和对照品溶液(其中AltII、AAII、AltI、AAI的浓度分别为9.80、10.1、10.3、6.60μg/mL)，涡旋混匀1min，加入5mol·L-1盐酸溶液10μL，涡旋混匀1min，40℃水浴30min，放冷至室温，分别采用乙酸乙酯3mL萃取一次；5mL萃取一次；6mL分二次加入(3mL，3mL)萃取后合并上清液；7mL分三次加入(3mL，3mL，1mL)萃取后合并上清液。萃取后的上清液分别在40℃水浴下氮气挥干(约40～60min)，残渣加150μL甲醇溶解，过滤(0.45μm)至100μL进样小瓶中。4℃保存。进样体积20μL。实验结果表明分别采用3mL、5mL萃取一次血浆中四种成分提取回收率均低于90％，6mL(3mL，3mL)分二次萃取后合并上清液得到的血浆中四种成分提取回收率均较高且接近100％。因此萃取溶剂用量确定为1mL血浆加入6mL乙酸乙酯，分二次加入(3mL，3mL)萃取后合并上清液。
3.盐酸浓度的确定-20℃保存空白血浆，37℃水浴解冻，分别取1mL血浆加到7mL塑料离心管中，分别加入60μL混和对照品溶液(其中AltII、AAII、AltI、AAI的浓度分别为9.80、10.1、10.3、6.60μg/mL)，涡旋混匀1min后分别加入1mol·L-1、3mol·L-1、5mol·L-1、7mol·L-1、10mol·L-1盐酸溶液10μL，涡旋混匀1min，40℃水浴30min，放冷至室温，6mL乙酸乙酯分二次加入(3mL，3mL)萃取，分别涡旋混合1min，合并上清液。萃取后的上清液在40℃水浴下氮气挥干溶剂(约40～60min)，残渣加150μL甲醇溶解，过滤(0.45μm)至100μL进样小瓶中。4℃保存。进样体积20μL。实验结果表明加入盐酸浓度较低为1mol·L-1时，AAI、AAII的提取回收率均低于50％；加入盐酸浓度较高为10mol·L-1时，AAI、AAII的提取回收率低于90％；加入5mol·L-1盐酸酸化后，血浆中四种目标成分的提取回收率最高且接近100％。因此血浆或血清样品酸化时加入盐酸的浓度确定为1mL血浆或血清加入5mol·L-1盐酸溶液10μL。
4.其它操作条件的优化为了考察样品处理过程中的水浴温度、水浴时间、挥干温度等其它操作条件对加入盐酸酸化后的血浆样品中四种目标成分提取回收率的影响，我们设计了L9(34)正交表(见表1)对血浆样品处理条件进行了进一步的优化。样品预处理方法为取1mL血浆，分别加入60μL混和对照品溶液，萃取溶剂用量为6mL，分二次(3mL，3mL)萃取后合并上清液的样品预处理方法，按正交表设计正交试验方案(见表2)处理样品并进行四种目标成分的HPLC峰面积测定。以血浆中四种目标成分的总平均提取回收率作为衡量指标。
表1 L9(34)正交表因素A B C D水平 盐酸浓度水浴温度水浴时间挥干温度1 0mol·L-120℃ 15min 20℃2 5mol·L-140℃ 30min 40℃3 10mol·L-150℃ 45min 60℃
表2正交试验方案及结果实验号 ABCD 平均回收率11111 43.521222 43.731333 43.242123 86.152231 88.362312 80.473132 91.283213 79.293321 74.0k1 130.4220.8203.1205.8 629.5k2 254.7211.2203.8215.3 CTk3 244.5197.6222.7208.4 44034.44k1平均 43.5 73.6 67.7 68.6k2平均 84.9 70.4 67.9 71.8k3平均 81.5 65.9 74.2 69.5R 41.4 7.7 6.5 3.2k1^216995.22 48744.03 41233.55 42335.32k2^264878.44 44600.04 41521.78 46371.59k3^259757.46 39031.47 49596.25 43445.34Q 47210.37 44125.18 44117.20 44050.75Q-CT3175.93 90.7482.7516.30从极差分析结果(R值)可以直观地看出，血浆中马兜铃酸及其内酰胺类成分提取回收率的影响因素A＞B＞C＞D；各因素的最优水平组合为A2B1C3D2。对上述结果进行方差分析(见表3)表3正交试验方差分析方差来源 离差平方和自由度 均方F值 P值因素A 3175.932 1587.97 194.84 ＜0.01因素B 90.74 2 45.37 5.57＞0.05因素C 82.75 2 41.38 5.08＞0.05因素D 16.30 2 8.15总和 3365.72从方差分析表结果可以看出，A(盐酸浓度)为影响血浆中四种目标成分提取回收率的主要因素(P＜0.01)，其余因素为次要因素，从而进一步说明含马兜铃酸及其内酰胺类成分血浆或血清样品处理过程中加入盐酸酸化的必要性。随后对正交试验结果进行验证实验(见表4)，设计了A2B1C3D2、A3B1C3D2、A2B2C2D2并对其结果进行了比较(表5)。
表4正交验证实验设计样品处理条件A B C D优化条件15mol·L-1(A2) 20□(B1) 45min(C3) 40□(D2)优化条件210mol·L-1(A3) 20℃(B1) 45min(C3) 40□(D2)组合条件35mol·L-1(A2) 40□(B2) 30min(C2) 40□(D2)
表5正交验证实验结果平均提取回收率(％)平均样品处理条件 AltII AAII AltI AAI 回收率(％)优化条件1 94.998.9 99.7 100.2 98.4优化条件2 97.2±1.7 105.3±2.4 98.4±0.1 104.6±3.0101.4组合条件3 94.3±2.9 100.2±4.1 94.0±4.2 102.0±4.997.6注释正交验证实验中制备两份样品；优化条件1中的一份样品操作时出现误差，因此平均值仅为一份样品的计算值。
在正交验证的三种组合条件下，血浆中四种目标成分的提取回收率均大于95％，说明此三种方法均可用作血浆或血清样品的预处理方法。同时，考虑到盐酸浓度太大对样品的稳定性具有一定的影响，因此根据正交试验及正交验证实验结果将血浆或血清样品预处理方法中的其它操作条件优化为取1mL血浆，加入5mol·L-1盐酸溶液10μL，20℃水浴45min，40℃水浴氮气挥干。
具体实施例方式
由于患者血浆或血清中马兜铃酸及其内酰胺类成分的情况未知，不能保证马兜铃酸及其内酰胺类成分同时存在于人血浆或血清样品中，因此我们采用关木通水煎液(浓度分别为6g/mL、4g/mL)灌喂SD雄性大鼠获得含药血浆，再采用本发明方法对给药血浆进行预处理和HPLC检测，同时将本发明方法与常用的蛋白沉淀法进行比较。实施本发明的具体步骤包括1.色谱条件色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)流动相A∶B＝1％醋酸/30m mol/L三乙胺∶乙腈(35％B→100％B)柱温15℃进样体积20μL检测波长260nm(AltI、AltII)；250nm(AAI、AAII)。
2.样品处理方法(1)本发明方法取灌喂关木通水煎液(浓度为6g/mL、4g/mL)的给药大鼠血浆1mL至于7mL塑料离心管中，加入5mol·L-1盐酸溶液10μL，涡旋混合，40℃水浴30min，放冷至室温，6mL乙酸乙酯分两次加入(3mL，3mL)萃取，分别涡旋混合，合并上清液；萃取后的上清液40℃水浴下氮气挥干，残渣加150μL甲醇溶解，过滤，取滤液20μL进行HPLC检测。
(2)蛋白沉淀法 取灌喂关木通水煎液(浓度为6g/mL、4g/mL)取给药大鼠血浆1mL至于7mL塑料离心管中，加入3mL乙腈/无水乙醇/二甲基甲酰胺(DMF)混合液(30∶10∶5)，涡旋混合1min，12000转/分，离心5min，取上清液，60℃水浴下氮气挥干溶剂，残渣加150μL甲醇溶解，过滤，取滤液20μL进行HPLC检测。
3.色谱峰峰面积的HPLC测定从说明书附图2中可以看到本发明方法与蛋白沉淀法相比，色谱图中极性较大的内源性色谱峰较少且强度较弱，说明本发明方法能够减小血浆中极性较大的内源性物质对色谱柱造成的污染；另外，本发明方法制备得到的血浆色谱图中四个目标成分的色谱峰均完全分离且峰形较好。从表6的HPLC色谱峰面积测定结果可以看出本发明方法制备得到的血浆中四种目标成分的峰面积值均高于蛋白沉淀法，尤其是药材中所含比例较低的马兜铃内酰胺I和II的峰面积值有较大增加。
表6本发明方法与蛋白沉淀法制备的给药大鼠血浆HPLC测定结果比较给药剂量给药后 处理方法色谱峰面积(mAU)SD大鼠(关木通水煎液) 取血 AltII AAII AltI AAI 体重时间 (雄性)6g/mL×3mL×3d 24h蛋白沉淀法9.720695.415.3 1482.8 197～208g6g/mL×3mL×3d 24h本发明方法21.7 22196.833.1 1573.34g/mL×3mL×3d 24h蛋白沉淀法4.810157.09.2201.6197～208g4g/mL×3mL×3d 24h本发明方法19.2 11586.918.5 218.权利要求
1.一种含马兜铃酸及其内酰胺类成分血浆或血清样品预处理方法，其特征在于取1mL血浆或血清样品，加入盐酸(使每毫升血浆或血清中盐酸浓度范围在3.0×10-5～1.0×10-4mol.mL-1内)后涡旋混匀，室温放置30～60min；采用乙酸乙酯萃取1～2次，每次3～5mL，涡旋混合萃取，收集上清液；萃取所得上清液在60℃以下水浴中氮气挥干溶剂，残渣加150μL甲醇溶解，过滤，取20μL滤液进行高效液相色谱法检测。方法中所述的血浆或血清包括人、大鼠、小鼠、家兔等。
2.根据权利要求1所述含马兜铃酸及其内酰胺类成分血浆或血清样品预处理方法，其特征在于血浆或血清为人血浆或人血清。
3.根据权利要求1所述含马兜铃酸及其内酰胺类成分血浆或血清样品预处理方法，其特征在于加入5mol·L-1盐酸，此时每毫升血浆或血清中盐酸浓度为5×10-5mol.mL-1。
4.根据权利要求1所述含马兜铃酸及其内酰胺类成分血浆或血清样品预处理方法，其特征在于室温温度为20℃时放置45min。
5.根据权利要求1所述含马兜铃酸及其内酰胺类成分血浆或血清样品预处理方法，其特征在于采用乙酸乙酯萃取2次，每次3mL，合并上清液。
6.根据权利要求1所述含马兜铃酸及其内酰胺类成分血浆或血清样品预处理方法，其特征在于40℃水浴下氮气挥干溶剂。
7.根据权利要求1～6所述含马兜铃酸及其内酰胺类成分血浆或血清样品预处理方法，其特征在于可从血浆或血清样品中同时提取马兜铃酸及其内酰胺类成分，并进行高效液相色谱法检测。
全文摘要
本发明涉及含马兜铃酸及其内酰胺类成分血浆或血清样品预处理方法，其特点为含马兜铃酸及其内酰胺类成分的血浆或血清样品用盐酸酸化后采用乙酸乙酯进行萃取处理。血浆或血清样品加入盐酸(使每毫升血浆或血清中的盐酸浓度范围在3.0×10
文档编号G01N1/28GK1690686SQ20041003384
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月19日 优先权日2004年4月19日
发明者高小丽, 王璇, 蔡少青 申请人:北京大学