专利名称：血氨含量测定方法及血氨诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定血氨含量的方法，同时本发明还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。
扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％--13％；离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％--4.8％，回收率高。结合我国的具体实际，应以酶法测定为实用。
检索中国专利，仅查出87105593.7号专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的血氨含量的测定方法，同时给出用以实现本发明方法的血氨诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行血氨含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定血氨含量的步骤如下
1)、将样品与主要由腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出血氨的含量。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出血氨的含量。
以上样品与试剂的混合比例为按体积1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
本发明应用谷氨酰胺合成酶偶联偶联丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶反应比色法。谷氨酰胺合成酶利用氨、谷氨酸、腺苷三磷酸合成谷氨酰胺，反应的副产物磷酸根再和丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用下生成二氧化碳，然后和磷酸烯醇式丙酮酸及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再作用最后产生草酰乙酸，再通过偶联苹果酸脱氢酶的作用，氧化NAD(P)H成为NAD(P)+，从而得以测定NAD(P)H在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算氨含量的多少。虽然磷酸单盐在系统中被重复使用，但是最终的反应速率还是取决于最初的氨含量的大小所产生的初始磷酸单盐浓度决定。
用于实现本发明方法的血氨诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--20mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1--20mmol/l还原型辅酶 0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--60000U/l丙酮酸氧化酶1000--60000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000--60000U/l苹果酸脱氢酶2000--80000U/l稳定剂 10--80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂试剂I缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--20mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1--20mmol/l还原型辅酶 0.2--0.3mmol/l
丙酮酸氧化酶1000--60000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000--60000U/l苹果酸脱氢酶2000--80000U/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂II缓冲液 40--200mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--60000U/l稳定剂 10--80％(总体积)双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶等可以放在试剂II，试剂II其中的成分，谷氨酰胺合成酶也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂试剂I缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--20mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1--20mmol/l还原型辅酶 0.2--0.3mmol/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂II缓冲液 40--200mmol/l丙酮酸氧化酶1000--60000U/l
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000--60000U/l苹果酸脱氢酶2000--80000U/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂III缓冲液 40--200mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--60000U/l稳定剂 10--80％(总体积)三剂的配方不仅限于上述配方；其中的试剂I的成分，腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等可以放在试剂II或试剂III中。试剂II其中的成分，丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶等也可以放在试剂I或试剂III中。试剂III中的成分，谷氨酰胺合成酶也可以放在试剂I或试剂II中。如此可以形成多种配方，不一一详述。
缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等。
以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10-80％或者10-50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明血氨诊断试剂盒较为理想缓冲液 80--120mmol/l腺苷三磷酸 2--12mmol/l谷氨酸 6--10mmol/l丙酮酸 5--15mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸2--8mmol/l还原型辅酶 0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶 6000--12000U/l丙酮酸氧化酶6000--12000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 4000--10000U/l苹果酸脱氢酶8000--16000U/l稳定剂 20--50％(总体积)由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的血氨诊断试剂盒包括缓冲液 80mmol/l腺苷三磷酸 2mmol/l谷氨酸 6mmol/l
丙酮酸 5mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸2mmol/l还原型辅酶 0.2mmol/l谷氨酰胺合成酶 6000U/l丙酮酸氧化酶6000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 4000U/l苹果酸脱氢酶8000U/l稳定剂 50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出血氨的含量。
本实施例应用谷氨酰胺合成酶偶联偶联丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶反应比色法。谷氨酰胺合成酶利用氨、谷氨酸、腺苷三磷酸合成谷氨酰胺，反应的副产物磷酸根再和丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用下生成二氧化碳，然后和磷酸烯醇式丙酮酸及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再作用最后产生草酰乙酸，再通过偶联苹果酸脱氢酶的作用，氧化NAD(P)H成为NAD(P)+，从而得以测定NAD(P)H在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算氨含量的多少。虽然磷酸单盐在系统中被重复使用，但是最终的反应速率还是取决于最初的氨含量的大小所产生的初始磷酸单盐浓度决定。
实施例二(双剂)本实施例的血氨诊断试剂有试剂I缓冲液 100mmol/l腺苷三磷酸 7mmol/l谷氨酸 8mmol/l丙酮酸 10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸5mmol/l还原型辅酶 0.25mmol/l丙酮酸氧化酶9000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 7000U/l苹果酸脱氢酶12000U/l稳定剂 50％(总体积)试剂II缓冲液 100mmol/l谷氨酰胺合成酶 9000U/l稳定剂 50％(总体积)测定血氨含量时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
具体测定步骤为氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出血氨的含量。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的血氨诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液 120mmol/l腺苷三磷酸 12mmol/l谷氨酸 10mmol/l丙酮酸 15mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸8mmol/l还原型辅酶 0.3mmol/l稳定剂 20mmol/l试剂II
缓冲液 120mmol/l丙酮酸氧化酶12000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000U/l苹果酸脱氢酶16000U/l稳定剂 50％(总体积)试剂III缓冲液 120mmol/l谷氨酰胺合成酶 12000U/l稳定剂 50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
具体测定步骤为氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出血氨的含量。
各反应步骤的反应时间控制在20分钟。
实施例四本实施例的血氨诊断试剂有试剂I缓冲液 100mmol/l腺苷三磷酸 4mmol/l谷氨酸 5mmol/l丙酮酸 6mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸4mmol/l还原型辅酶 0.3mmol/l稳定剂 30mmol/l试剂II缓冲液 100mmol/l腺苷三磷酸 4mmol/l谷氨酸 5mmol/l丙酮酸 6mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸4mmol/l还原型辅酶 0.3mmol/l稳定剂 50％(总体积)在生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的幅度，从而测算出血氨的含量。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好。
权利要求
1.一种测定血氨含量的方法，步骤如下1)、将样品与主要由腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成盒酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+还原型辅酶苹果酸脱氢酶苹果酸+氧化型辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出血氨的含量。
2.根据权利要求1所述测定血氨含量的方法，其特征在于所述步骤2)为将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，测试主波长340nm吸光度下降的幅度，测算出血氨的含量。
3.根据权利要求1或2所述测定血氨含量的方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述测定血氨含量的方法，其特征在于被测血氨样品与试剂的比例控制在1/10到1/100。
5.一种血氨诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--20mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--20mmol/l还原型辅酶 0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--60000U/l丙酮酸氧化酶 1000--60000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000--60000U/l苹果酸脱氢酶 2000--80000U/1稳定剂 10--80％(总体积)
6.根据权利要求5所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂为三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
9.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶为NADPH、NADH、thio-NADH还原型烟酰胺辅酶或其衍生物中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种测定血氨含量的方法，同时本发明还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出血氨的含量。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号G01N21/33GK1749754SQ20041004196
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月14日 优先权日2004年9月14日
发明者王尔中 申请人:王尔中