专利名称：生物标记物－蚯蚓体内p450含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及细胞色素P-450，具体地说是生物标记物-蚯蚓体内p450含量的测定方法。
背景技术：
细胞色素P-450(CYP)是广泛存在于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类具有重要生理功能的代谢酶系，在临床医学、医药学等领域广泛应用。如细胞色素P-450(CYP)酶系可催化大量亲脂性外源物质，承担大量肝胀药物的代谢解毒作用(文献2.沈钧，徐佩佩，金锡鹏.1997.肝脏中细胞色素P450测定方法的改进。工业卫生与职业病，23(4)236～238；文献3.冷欣夫，邱星辉.2001.细胞色素P450酶系的结构、功能与应用前景.科学出版社.P2；文献5.徐承敏，涨增利，童建.2003.环磷酰胺对小鼠肝细胞色素P450含量的影响.苏州大学学报(医学版)，23(2)135-6，141)。除此之外，细胞色素P-450酶系还有另外一种功能，即可被外源污染物诱导或抑制而使CYP活性显著增加或降低，污染物浓度与CYP含量或活性之间具有显著相关性。利用生物代谢过程中CYP含量或活性与污染物毒性之间的响应关系，可将细胞色素P-450作为生物标记物，进行环境污染的早期诊断。对此，很多学者进行了尝试。如在多环芳烃(PAHs)诱导下测定鲤鱼肝微粒体P-450作为生物指标，进行水体污染早期诊断研究(文献9.王咏王春霞徐静波2000.多环芳烃化合物对鲤鱼肝微粒体EROD的体外诱导.环境科学学报.20(增刊)176-180)。
有关土壤污染早期诊断的生物标记物研究也有报道。但多数是从医学角度，以传统医学生物试验为基础进行的相关探讨。如Roos等人以小鼠口服多环芳烃(PAHs)污染土壤的方式对其染毒，发现污染土壤可使鼠肝微粒体P450活性产生7～28倍的高诱导响应，诱导强度与土壤污染程度相关(文献6.P.H.Roos，M.Van Afferden，D.Strotkamp，D.Tappe，F.Pfeifer，W.G.1996.Liver microsomal levels of cytochrome P450IA1 as biomarker for exposure andbioavalability of soil-bound polycyclic aromatic hydrocarbons.EnvironmentalContamination and Toxicology.30107～113；文献7.Peter.H.Roos.2002.Differential induction of CYP1A1 in duodenum，liver and kidney of rats afteroral intake of soil containing polycyclic aromatic hydrocarbons.EnvironmentalContamination and Toxicology.33127～132)。但以非土壤生物小鼠口服的方法只能进行实验室条件下的高剂量-响应关系研究，对土壤污染的诊断存在很大局限性(文献8.M.O.Fouchecourt，P.Berny，J.L.Riviere，1998.Bio-availability of PCBs to male laboratory rats maintained on littere ofcontaminated soils L PCBs burden and induction of alkooxyresorufino-Dealkylase activities in liver and lung.Environmental Contamination andToxicology.35680～687)。以土壤动物进行相关实验，是土壤污染诊断最直接和有效的方法。
蚯蚓(赤子爱胜)是国际标准方法组织推荐的土壤生态毒理供试动物。然而，目前以蚯蚓为试验生物进行细胞色素P450活性诱导，进行土壤污染诊断的生物标记物研究尚未见成功报道(文献4.R.K.Achazi，C.Flenner，D.R.Livingstone，L.D.Peters，K.Schaub and E.Scheiwe.1998.Cytochrome P450 anddependent activities in unexposed and PAH-exposed terrestrial annelids.Comp.Biochem.Physiol.C，121，339-350)。其中最重要的原因是实验方法上没有得到突破。由于土壤动物蚯蚓的整体形态、结构、组织等在很大程度上不同于啮齿类动物小鼠，直接照搬小鼠肝微粒体P450的实验方法，无法实现土壤动物蚯蚓P450的测定。具体存在以下难点1)蚯蚓不具有P450分布集中的肝脾等脏器，测定只能采用整体动物，由此产生的干扰远远大于肝脏组织；2)蚯蚓整体形态、结构组织等的特殊性，导致干扰物质种类增加，不仅包括血红蛋白，还包括黄色素，蚯蚓(赤子爱胜)特有的深红色色素几丁质层表皮红色素也严重干扰P450的测定，这些干扰物质去除的难度比啮齿类动物小鼠肝脏血红蛋白去除的困难大得多。有研究者试图实现蚯蚓(赤子爱胜)P450含量的测定，由于缺少有效的去干扰方法，实验研究没有取得成功。例如，Achazi等人(文献4)利用差速离心法制得蚯蚓微粒体后，经分子筛再经过电泳试方法进一步分离血红素，试图实现干扰物质与细胞色素P450的分离，但实验最终失败。其他尝试也未见成功报道(文献3)。目前，国际上也仍未见成熟方法的报道。
发明内容
为了推进土壤污染生态毒理学诊断研究不断向分子生物学水平发展，在国家自然科学基金资助(20277041，20337010)下，申请人开展了土壤污染诊断生物标记物细胞色素P450研究。根据P450含量测定的方法原理，借鉴鼠类肝脏细胞色素P450提取的试验，针对蚯蚓(赤子爱胜)整体动物的特点，经过以去除干扰物质为主要目标的各种实验摸索，最终建立了蚯蚓(赤子爱胜)P450含量定量测定方法，实现了蚯蚓整体动物P450含量的测定。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为生物标记物-蚯蚓体内p450含量的测定方法，操作步骤如下1)将排净体内物质后的活体蚯蚓在甘油溶液中浸泡后，转移至盐溶液中，将整条蚯蚓分割破碎后，过滤清洗至无色；2)将破碎物转移到匀浆缓冲液中，以内切式组织匀浆器以6000～8000转/分匀浆30～50秒钟后，将匀浆物在低温3～5℃超速离心机上12000～15000g离心20～30min，将上清液再次以120000～150000g超速离心90～120min，弃掉上清液后，将装沉淀的微粒体放置于冰水中，使沉淀残留的血红素进一步与微粒体分离后，将红色物质剥离；3)将微粒体溶解在保存缓冲液中混匀后，取出1～2ml待测蛋白含量；其余部分于紫外分光光度计测定P450总量。
在进行p450含量测定前，将实验用活体蚯蚓用蒸馏水中洗净后用滤纸吸干、称重；于室温下在湿润的滤纸中放置24h～48h，使其排净体内的物质后待用；将排净体内物质后的活体蚯蚓在10-20％甘油溶液中2～4℃浸泡30min～1h后，转移入0.10～0.15M KCl或NaCl溶液中，将整条蚯蚓分割破碎后，放置在过滤装置中用0.10～0.15M KCl或NaCl溶液清洗体内血液，直至清洗液呈无色为止。微粒体溶解的保存缓冲液组成为250mmol/l蔗糖，50mmol/l Tris pH7.5，1mmol/l DTT，1mmol/l EDTA；所述细胞色素P450总量的测定是采用紫外双光束法；即微粒体蛋白悬液6ml～10ml，加入适量的连二亚硫酸钠(10～15mg)将其还原。混匀后，分装于两个比色杯(2～3ml)中，一个作为样品杯，另一个作为参比杯。在样品杯中通入一氧化碳(浓硫酸和甲酸各5ml制备CO气体)约2～3min后，放置2～3min，然后在紫外双光束分光光度计上400～500nm处扫描光谱，分别记录450nm和490nm处的吸光值。根据公式计算P450含量(文献1.TsuneoOmura and Ryo Sato.1964.The Carbon Monoxide-binding Pigment of liverMicrosomes.Journal of Biological Chemistry，239(7)2370～2378)。
本发明方法参照文献中鼠肝微粒体细胞色素P450等试验方法，同时，进行了大量创新和改进，最终实现了蚯蚓P450含量的定性、定量测定；目前国内外尚无蚯蚓P450含量测定的成功报道；该方法的主要优点概括为简单、快速、低耗、准确定性定量。
1)强化了预处理过程。以KCL溶液替代磷酸缓冲液作为清洗液，去除蚯蚓体内大量血液和黄色素干扰，不但降低了实验药剂的成本，而且保证了干扰物质的有效去除。
2)改变了离心力。在离心分离微粒体过程中加时加速，将一次离心的离心力由10000g，20min增至15000g，30min，将二次离心的离心力由100000g，60min增至150000g，90min，提高了干扰物质与微粒体进一步有效分离的效率。
3)物理剥离技术。根据一定温度下，干扰物质与微粒体的形态差异，使二者有效剥离，从而制备纯化的微粒体样品，定量蚯蚓P450。
4)动态反应法。改变了以往样品测定过程中P450与CO定时反应，导致反应因不完全的不良结果，采用CO与样品动态反应的方式，使反应进行完全，从而保证P450测定。
具体实施例方式
实施例11)预处理将实验用活体蚯蚓用蒸馏水中洗净后用滤纸吸干、称重；于室温下在湿润的滤纸中放置24h，使其排净体内的物质后待用。
2)制备微粒体将排净体内的物质后的活体蚯蚓在20％甘油溶液中4℃浸泡1h后，转移入0.15M KCl溶液中，将整条蚯蚓分割破碎后，放置在过滤装置中用0.15M KCl溶液清洗体内血液，直至清洗液呈无色为止，再转移到装有6ml匀浆缓冲液的25ml离心管中，以内切式组织匀浆器以8000转/分匀浆50秒钟后，将匀浆物装入10ml的离心管中，在低温(4℃)超速离心机上15000g离心30min，将上清液再次转移到10ml离心管，于超速离心机上以150000g超速离心90min，弃掉上清液后，将装沉淀的微粒体放置于冰水中稍许，使沉淀残留的是血红素进一步与微粒体分离后，将红色物质剥离。然后，将微粒体溶解在7ml保存缓冲液中用玻璃匀浆器混匀后；取出1ml待测蛋白含量。其余部分待于紫外分光光度计测定P450总量。
3)紫外双光束法测定细胞色素P450总量即微粒体蛋白悬液6ml，加入适量的连二亚硫酸钠(10mg)将其还原。混匀后，分装于两个3ml的比色杯中，一个作为样品杯，另一个作为参比杯，在样品杯中通入一氧化碳(制备浓硫酸和甲酸各5ml于气体发生装置中)约2min至样品杯中后，放置2-3分钟，然后在紫外双光束分光光度计上400～500nm处扫描光谱，分别记录450nm和490nm处的吸光值。根据以下公式计算P450含量。
实验用仪器日立低温超速离心机CP 80MX；岛津紫外双光束分光光度计UV-2550；宁波新芝内切式组织匀浆器；手动玻璃匀浆器；药品的配制20％甘油溶液；0.15M KCl溶液；其中匀浆缓冲液组成，250mmol/l蔗糖，50mmol/l Tris pH7.5，1mmol/lDTT，1mmol/l EDTA；匀浆缓冲溶液作用；1)在一定范围内控制溶液pH值；2)P450巯基保护剂，减少P450酶失活(成分DTT和甘油)；匀浆缓冲溶液还可选用磷酸缓冲液(磷酸二氢钠+磷酸氢二钾；pH7.5)，其目的也是控制PH的变动在一定范围内，防止酶失活；保存缓冲液组成，250mmol/l蔗糖，50mmol/l Tris pH7.5，1mmol/l DTT，1mmol/l EDTA，体积浓度20％甘油；测定通气前加入适量或过量的连二亚硫酸钠；保存缓冲溶液成分与作用基本同于匀浆缓冲液，在保存缓冲溶液中加入20％的甘油目的在于防止P450失活。
实施例2与实施例1不同之处在于蚯蚓体在滤纸中放置24h；于0.10M的KCl溶液中匀浆时间30秒，超速离心机低温3℃条件下操作，一次离心力12000g，一次离心时间30min，二次离心力120000g，二次离心时间120min；通入一氧化碳2min，放置2min；结果参见表1，其样品编号为，样品12和样品13，对照组11，其中对照组的操作条件与样品组相同，对照组是指在无污染土壤的条件下培养的蚯蚓，样品组是指在污染土壤中培养的蚯蚓。
实施例3与实施例1不同之处在于蚯蚓体在滤纸中放置36h；于0.12M的KCl溶液中匀浆时间40秒，超速离心机低温3℃条件下操作，一次离心力14000g，一次离心时间25min，二次离心力140000g，二次离心时间100min；通入一氧化碳2min，放置3min；结果参见表1，其样品编号为，样品22和样品23，对照组21，其中对照组的操作条件与样品组相同，对照组是指在无污染土壤的条件下培养的蚯蚓，样品组是指在污染土壤中培养的蚯蚓。
实施例4与实施例1不同之处在于蚯蚓体在滤纸中放置48h；于0.15M的KCl溶液中匀浆时间50秒，超速离心机低温5℃条件下操作，一次离心力15000g，一次离心时间20min，二次离心力150000g，二次离心时间90min；通入一氧化碳3min，放置2min；结果参见表1，其样品编号为，样品32和样品33，对照组31，其中对照组的操作条件与样品组相同，对照组是指在无污染土壤的条件下培养的蚯蚓，样品组是指在污染土壤中培养的蚯蚓。
表1不同条件下蚯蚓P450总含量测定值
对比例制备鼠肝微粒体细胞色素P450的方法(操作均在0～4℃进行)鼠肝微粒体的制备法1(文献2.沈钧，徐佩佩，金锡鹏.1997.肝脏中细胞色素P450测定方法的改进。工业卫生与职业病，23(4)236～238)大鼠称重后用颈椎脱臼法处死，解剖迅速取肝脏，用0～4℃的磷酸缓冲液(pH7.5，0.1mol/l)反复冲洗，除净血污，用滤纸吸干，称重。
称2g左右肝，加20ml匀浆缓冲液(含甘油10％；1mmol/L PTU；1mmol/LPMSF；1mmol/L EDTA；0.1mmol/L DTT；0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH值7.5)，将肝脏剪成细小碎块，直接用匀浆器制成匀浆。然后用一层已被磷酸盐缓冲液湿润过的纱布过滤。将匀浆液转入预冷离心管中，于2℃高速离心机中，10000g离心20min，上清液用两层已被磷酸盐缓冲液湿润过的纱布过滤，去除脂类物质，即为S9。将S9在2℃，于100000g离心60min，所得沉淀即为微粒体。微粒体用悬浮缓冲液(含甘油20％；1mmol/L PMSF；1mmol/L EDTA；0.1mmol/L DTT；0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH值7.5)稀释至蛋白浓度1mg/ml，并用滴管吹打制成悬液。
测量CYP450含量于6ml小试管中加入适量连二亚硫酸钠，倒入微粒体样品悬液，混匀后分别转移到两个比色皿中，将其中的一个比色皿中充入CO(浓H2SO4+HCOOH的气体发生装置)60秒，将没有充入CO的比色皿作为样品空白，在紫外双光束分光光度计上400-500nm范围扫描光谱。分别记录450nm和490nm处的吸光值。根据以下公式计算P450含量。
CYP450的含量(nmol/mg)＝(ΔA(450-490)nm*稀释倍数)/(0.091*蛋白含量)其中0.091为CYP450的消光系数，稀释倍数指蛋白测定时稀释的倍数蛋白含量为微粒体混悬液的蛋白浓度(mg/ml)；蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法测定。
权利要求
1.生物标记物-蚯蚓体内p450含量的测定方法，其特征在于1)将排净体内物质后的活体蚯蚓在甘油溶液中浸泡后，转移至盐溶液中，将整条蚯蚓分割破碎后，过滤清洗至无色；2)将破碎物转移到匀浆缓冲液中，以内切式组织匀浆器以6000～8000转/分匀浆30～50秒后，将匀浆物在低温3～5℃超速离心机上12000～15000g离心20～30min，将上清液再次以120000～150000g超速离心90～120min，弃掉上清液后，将装沉淀的微粒体放置于冰水中，使沉淀残留的血红素进一步与微粒体分离后，将红色物质剥离；3)将微粒体溶解在保存缓冲液中混匀后，取出1～2ml待测蛋白含量；其余部分于紫外分光光度计测定P450总量。
2.按照权利要求1所述的生物标记物-蚯蚓体内p450含量测定方法，其特征在于将排净体内物质后的活体蚯蚓在10-20％甘油溶液中2～4℃浸泡30min～1h后，转移入0.10～0.15M KCl或NaCl溶液中，将整条蚯蚓分割破碎后，放置在过滤装置中用0.10～0.15M KCl或NaCl溶液清洗体内血液，直至清洗液呈无色为止。
3.按照权利要求1所述的生物标记物-蚯蚓体内p450含量测定方法，其特征在于微粒体溶解的保存缓冲液组成为250mmol/l蔗糖，50mmol/lTris pH7.5，1mmol/l DTT，1mmol/l EDTA。
4.按照权利要求1所述的生物标记物-蚯蚓体内p450含量测定方法，其特征在于在进行p450含量测定前，将实验用活体蚯蚓用蒸馏水中洗净后用滤纸吸干、称重；于室温下在湿润的滤纸中放置24h～48h，使其排净体内的物质后待用。
5.按照权利要求1所述的生物标记物-蚯蚓体内p450含量测定方法，其特征在于所述细胞色素P450总量的测定是采用紫外双光束法。
全文摘要
本发明涉及细胞色素P－450，具体地说是生物标记物－蚯蚓体内P450含量的测定方法；1)将活体蚯蚓在甘油溶液中浸泡后，转移至盐溶液中分割破碎，过滤清洗；2)将破碎物转移到匀浆缓冲液中，以6000～8000转/分匀浆30～50秒后，将匀浆物在低温3～5℃超速离心机上12000～15000g离心20～30min，将上清液再次以120000～150000g超速离心90～120min，弃掉上清液后，将微粒体置于冰水中，将红色物质剥离；3)将微粒体溶解在保存缓冲液中混匀后，取出1～2ml待测蛋白含量；其余部分测定P450总量。本发明的主要优点为简单、快速、低耗、准确定性定量。
文档编号G01N1/28GK1746661SQ20041005039
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月10日 优先权日2004年9月10日
发明者宋玉芳, 张薇, 刘淼 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所