专利名称：定量的快速水平侧流方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种定性和定量的快速水平侧流方法及系统，适用于分析生物标本中(尤其是含全血、或红细胞、或白细胞或其它细胞的生物标本)的待检物质，以得到定性或定量的分析结果。
背景技术：
定量、快速、灵敏的诊断方法是当今日益普及的“床前及时诊断”(Point of care test，POCT)的发展方向。而真正的“快速”要求对待检标本不做任何处理直接检测。然而，生物学标本中多含细胞，比如血液含有大量的红细胞、白细胞及其它类型的细胞，在实施检测前往往要求耗时的分离步聚，以去除待检标本中的细胞。而且，由于个体之间红细胞比积的差异，使相同体积的全血可因不同的红细胞比积得到不同体积的血浆/血清体积，即可能使结果因加样量不同有所差异。另一方面，自80年代问世的，基于毛细管层析原理(水平侧流)的快速免疫检测方法(快速检测试纸条)逐渐普及，被广泛应用于早孕、吸毒、传染病的早期诊断。这些检测试纸多用于已去除了细胞的生物标本，只做定性检测。
要求任何水平侧流系统与方法真正可以应用于快速定量检测，必须满足以下条件1、可以自动地分离待检标本中的细胞；2、可在短时间内(5～60分钟)实现在液态才能完成的生化反应；3、检测结果满足特定的用不含细胞的样本(如血浆和血清)同样的灵敏度和特异性要求；4、检测方法相对地不受标本中红细胞比积的影响，即相对体积非依赖性。
5、可以规模性生产。
已有许多尝试建立可用于全血检测的快速水平侧流方法(例如美国专利US 6,136,610；美国专利US6,528,323，WO03/3008933，美国专利US 5,766,552等)，但都因不能同时满足以上条件而失败。它们或者不能有效地阻隔细胞，使红细胞漏出或溶血，造成背景(本底)过高不能满足灵敏度/特异性要求；或者因液体标本的过滤效率过低，使其体积过少而不足以完成所需生化反应；或者因过滤速度过慢而不能在短时间内完成快速检测；或者因其检测方法本身要求严格的体积依赖性，而不能克服个体全血标本中红细胞比积差异的困难；或者并未探讨/阐述其工作原理，使其结果的可重复性及其结构的可规模性生产性受到质疑。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的主要目的在于提供一种可以用于全血的，或其它含细胞生物标本的定量/定性的快速水平侧流方法。
本发明的另一个目的在于提供一种可以用于全血的，或其它含细胞生物标本的定量的快速水平侧流系统。
为了实现上述目的，本发明提供一种定量的快速水平侧流方法，用生化反应的平台，实施对不限于人类待检的液态生物标本作各种待检项目，用过滤结构阻隔液态标本中所含的细胞，得到完成其生化反应所需的液体体积；并通过该平台结构，形成有效的毛细管层析压差，使已过滤的液体及溶解于其中的待检物质在该平台上经毛细管层析作用定向流动；并根据生化反应中待检物质和对照物质所产生的可被检测的光密度判断检测结果。
本发明方法的生化反应的平台由测试条和测试盒外壳组成，测试条的结构具有两端并以保证有效的细胞过滤、毛细管层析和生化反应；以测试盒外壳保证液态生物标本的加样结果的观察和测试条物理结构的固定；其生物标本可加在测试盒外壳上两端加样口的任一端或两端。
本发明方法的测试条的细胞过滤结构由单层或多层不同孔径的过滤膜组成，其直接与样本中细胞接触的过滤膜孔径小于待阻隔的细胞直径。
本发明方法的测试条的细胞过滤结构使用了双面胶，促使滤过液体朝预设方向呈优势流动。
本发明方法的测试条的细胞过滤结构与毛细管层析压差要求保持一致，以保证有效的液体滤过及层析过程中的液体流速。
本发明方法的细胞过滤结构，与毛细管层析压差要求一致，由具有不同孔径、毛细引力的膜材料，组建细胞过滤——层析试纸条，使含细胞的液态待检生物标本在过滤中体积损失最少，并在被物理过滤后，液体在被收集原点处毛细管层析压差小于生化反应区，从而使过滤后的液体受毛细引力驱动在测试层析条上定向移动。
本发明方法的细胞过滤结构，可用使待过滤细胞聚集的化学试剂预处理过滤膜，使待过滤物因聚集而体积增大，而提高过滤膜对细胞的阻隔效果。
本发明方法使待过滤细胞聚集的化学试剂采用抗红细胞抗体或植物蛋白凝集素，抗红细胞抗体针对红细胞膜表面暴露的抗原决定簇可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明方法用抗红细胞抗体预处理过滤膜是包括用表面活性剂Tween-20处理膜以增加抗体对过滤膜的吸附。
本发明方法的测试条的毛细管层析压差来自于组装测试条的材料及其组装结构；根据生化检测项目要求，含细胞的液态生物标本可加样在测试盒的任一端或两端；不同的加样方式有不同的细胞过滤-层析-生化反应结构。
本发明方法的待检液态生物标本是含细胞的全血，但不限于全血标本；含细胞的待检液态生物标本可含抗凝剂或不含抗凝剂，在经过反应平台的过滤结构后得到的液体体积满足生化反应所需。
本发明方法的生化反应过程利用了双向水平侧流降低生化反应中的背景；并以生化反应中待检物与对照物所产生的光密度值之比的相对光密度值RI分析检测结果，而提高检测的灵敏度，减少盒间差，使检测结果为相对地非体积依赖性。
本发明方法的生化反应利用胶体金颗粒或银颗粒、或荧光染料、或其它产生可被光反射原理检测的光密度的材料作为标记物，使生化反应的结果可通过待检物和对照物产生的光密度之比被测定。
本发明方法的生化反应是基于免疫学原理的，但不限于免疫学原理的大分子间结合关系的检测，用于检测人类，但不限于人类液态标本中的大分子，如抗原、抗体、多糖、核酸、多肽、病原微生物等。
本发明还提供一种定量/定性的快速水平侧流系统，用生化反应的平台，实施对不限于人类待检的液态生物标本作各种待检项目，生化反应的平台由测试条和测试盒外壳组成，测试条的结构具有两端并以保证有效的细胞过滤、毛细管层析和生化反应；生物标本可加在外壳上两端加样口的任一端或两端。
本发明系统的细胞过滤-层析-生化反应结构，各组之间按序部分或全部重叠；其重叠部分为0.1～20毫米。
本发明系统的细胞过滤-层析-生化反应结构，细胞过滤膜为疏水性的玻璃纤维(但不限於玻璃纤维)或亲水的混合纤维。
本发明系统的液态生物标本经过滤后的液体收集膜为疏水性玻璃纤维(但不限於玻璃纤维)或亲水的混合纤维，并具有不小于细胞过滤膜的孔径。
本发明系统的液态生物标本经过滤后的液体收集膜孔径与过滤膜孔径之比＞1。
本发明系统的生化反应所需的标记物如胶体金被预包被并干燥于疏水的玻璃纤维(但不限於玻璃纤维)上，位于层析条的一端；胶体金在层析条上所处位置的层析压差在胶体金被溶解释放时低于生化反应的反应区，故胶体金可以包被原点向生化反应区定向移动。
本发明系统的生化反应区由亲水性的硝基纤维素膜(但不限於硝基纤维素膜)组成，并具有在双向水平测流的第一次液体流动时，在本结构中最高的毛细引力，使液体从加样区或液体收集区向其反应区定向移动。
本发明系统的层析条的另一端，相对应于化学偶合物垫的位置安装有亲水性的吸水垫片，其作用是在硝基纤维素膜已被浸湿，吸水能力下降胶体金溶解后，以其高度吸水能力提供促使液体从胶体金端向吸水垫片端定向移动所需的毛细管层析压差。
当含细胞的液态生物标本加样在吸水垫片一端时，其细胞过滤膜与硝基纤维素膜直接接触但不与吸水垫片接触；当含细胞的液态生物标本加样在胶体金一端时，其细胞过滤膜与液体收集膜部分与全部接触，但不与化学偶合物垫直接接触；当含细胞液态生物标本同时或分别加样于两端加样口时，其细胞过滤结构为分别加样时的结合。
本发明系统的液态生物标本经过滤后的液体收集膜使同一种试纸条结构既可用于免疫间接法检测，又可用于免疫夹心法检测。
本发明定量的快速水平侧流方法与系统与现有技术相比，通过生化反应平台上的过滤结构阻隔液态标本中所含有的细胞以得到所需的体积，并形成有效的毛细管层析压差，使待测物质经毛细管层析作用定向流动；并根据待检物质和对照物质所产生的可被检测的光密度判断检测结果，从而本发明可用于对全血的，或其它含细胞生物标本进行定量/定性、快速的检测，且实现检测结果的相对体积非依赖性，保证了检测结果的准确性。
附图简要说明下面结合附图，通过对本发明的较佳实施例的详细描述，将使本发明的技术方案及其它有益效果显而易见。
附图中，
图1是本发明的测试盒上盖的俯视图。
图2是本发明的测试盒下盖的立体图。
图3是本发明的测试条与测试盒工作原理俯视图。
图4是本发明的双向水平侧流测试条工作原理图。
图5是本发明的测试盒的端口1加样时测试条结构的侧视图。
图6是本发明的测试盒的端口2加样时测试条结构侧视图。
图7是本发明的测试盒的端口1和端口2两端加样时测试条结构侧视图。
图8是本发明的测试盒的端口2加样时测试条的毛细管压差。
图9是本发明过滤结构设计图(含有双面胶)。
图10是本发明过滤结构设计图(不含有双面胶)。
具体实施例方式
下文，将详细描述本发明。
本发明对待检标本中的红细胞(或其它细胞)的分离是通过以下技术方案来实现的采用特殊结构水平侧流的测试盒作为生化平台，实施对不限于人类待检的液态生物标本(例如不限于人类液态标本中的大分子的抗原、抗体、多糖、核酸、多肽、病原微生物等)作各种待检项目。该测试盒由测试条和外壳组成，如图1至图2所示，测试盒外壳由上盖和下盖组成，上盖提供样本/缓冲液加样端口1和端口2以及用于观察检测结果的观测窗3，其中端口1在双向免疫层析检测中用作样本的加样端口，端口2在双向免疫层析检测中用作样本或缓冲液的加样端口；下盖提供测试条的承载平台，以保证测试条物理结构的固定及毛细管层析过程。测试盒的上、下盖及内部结构的设计可通过对塑胶模具设计来实现，并用于规模生产。
本发明的测试条提供细胞过滤、毛细管层析及检测所需的生化反应的平台。如图3～4所示，该测试条的端口1处设有吸水垫片16；测试条的端口2处设有化学偶合物垫12，该化学偶合物垫12含有胶体金偶合的抗体或抗原，也可采用银颗粒、或荧光染料、或其它产生可被光反射原理检测的光密度的材料作为标记物；测试条的中间处设有两条对照带4，两条对照带4中间设有一测试带5，对照带4和测试带5的位置对应于测试盒外壳的观察窗3，以方便使用者观察。
根据待检项目的不同要求，含细胞的样本(如全血)可加在加样端口1或端口2，或按序加在端口1和端口2两端，通过测试条的特殊过滤结构，如图5～7所示，使细胞(如红细胞)因体积大于过滤孔径而被阻挡在生化反应区之外，利用具有特殊的过滤孔径的膜(请见参考资料1和3)和可使细胞聚集(如抗红细胞抗体)的化学物质(请见参考资料2)，使待过滤细胞被有效地阻隔在加样原点，而样本中的小于该孔径的物质(如血浆或血清以及溶解在其中的待检物质)可被有效滤过。
本发明对快速的(5～60分钟)、在液态状态完成的生化反应是通过以下技术方案来实现的生化反应在测试条上进行。根据检测项目的要求，样本可加在端口1或端口2的一端或端口1和端口2两端。测试条的材料及特定结构提供了有效的毛细管层析所需的压差，使液态样本可以在测试条上定向流动。在本系统中当含有细胞的样本(如全血)加入端口1后，因过滤作用使细胞留在加样原点，仅液体滤过。此时，如图5所示，测试条的底部为支撑垫片14(5×60毫米)，其为一种塑料垫片，用以物理支撑测试条各层次之间的结构；支撑垫片14上设有作为反应平台的硝基纤维素膜13(5×48毫米)，其为亲水性，其上包被有对照试剂(即对照带4)，以及与液态生物标本中待检物质反应的试剂(即测试带5)，构成测试条的生化反应区；硝基纤维素膜13在端口2处设有化学偶合物垫12(5×13毫米)，其为疏水性玻璃纤维，胶体金包被其上，并与硝基纤维素膜13重叠3mm；化学偶合物垫12上设有缓冲液垫11(5×12毫米)，其为亲水性混合纤维，用以吸收加入端口2的样本或缓冲液；硝基纤维素膜13在端口1处设有吸水垫片16，其为亲水性混合纤维，用于构建双向水平侧流中第二次侧流所需的毛细管层析压差，并吸收多余的液体；硝基纤维素膜13上靠近吸水垫片16处用双面胶17粘贴有过滤膜15(5×7.5毫米)，还可由单层或多层不同孔径的过滤膜组成过滤结构，过滤膜15由亲水性混合纤维或亲水性混合纤维制得，取代样本垫，经0.25毫克/毫升兔抗人红细胞抗体或0.5毫克/毫升鼠抗人红细胞抗体预处理，用于阻隔加样于端口1的全血样品中的红细胞并过滤血浆/血清；双面胶17(5×5毫米)，不具有通透性，在全血检测中可促使滤过的血浆样本向端口2流动。其中，各结构之间以按序部分/全部重叠的方式结合，其重叠部分为0.1～20毫米，并可以手工或机械化的过程实现。
由于将端口2的毛细管层析压差设置为高于端口1，并且过滤膜15与做为反应平台的硝基纤维素膜13之间的双面胶17部分破坏与之接触的硝基纤维素膜13，因双面胶17不具有通透性，当粘贴到硝基纤维素膜13时，使硝基纤维素膜13与之接触部位毛细管部分被破坏，从而使接触部分的虹吸功能部分丧失，导致从硝基纤维素膜13与双面胶17接触部位开始，硝基纤维素膜13的端口2端的虹吸力大于硝基纤维素膜13的吸水垫片16端的虹吸力，促使样本更快、更多地向端口2端移动。同时，双面胶17的右端(靠吸水垫片16端)与过滤膜15的右端(靠吸水垫片16端)平齐，这样阻断了过滤膜15滤过的样本直接流向吸水垫片16端，也促使滤过样本向端口2端移动。如图4所示，液体样本从端口1向端口2流动；途经预先包被在测试带5上的可与待检物质产生生化反应的抗原或抗体，形成免疫复合物(第一次水平侧流A)。所述的测试条的端口2包被有以胶体金偶联的，可与待检物质，或已在测试带5上形成的免疫复合物产生生化反应的抗原或抗体；以及已偶联的，可与观测窗3区预包被的对照物质反应的抗原或抗体。此时测试条已被第一次水平侧流A的液体浸湿，安置在端口1的吸水垫片16使端口1的毛细管层析压差高于端口2，当液态样本或缓冲液加入端口2，溶解化学偶合物12，通过毛细管压差从端口2向端口1流动(第二次水平侧流B)，途经观察窗3；已溶解的端口2化学偶合物12中可与预包被的对照物质和/或已形成的免疫复合物产生生化反应而沉积在反应原点。第二次水平侧流B中生化反应产生的沉积物中含有胶体金，胶体金的红色在沉积入形成可见的条带或区域；测试条的端口1的吸水垫片16吸收第二次水平侧流B反应中多余的液体。以上过程称为双向水平侧流。
如图6所示，当含有细胞的样本(如全血)加入端口2时，因过滤作用使细胞留在加样原点，仅液体及溶于液体的待检物质可以滤过。与图5不同的是，化学偶合物垫12上设有具有过滤功能的液体收集垫18(5×10毫米)，该液体收集垫18上还设有过滤膜15。该液体收集垫18为疏水性玻璃纤维，但未包被胶体金标记的试剂，经0.25毫克/毫升兔抗人红细胞抗体或0.5毫克/毫升鼠抗人红细胞抗体预处理，用于收集加样于端口2的经过滤膜15过滤后的血浆/血清，且该液体收集垫18与化学偶合物垫12重迭3毫米。可在加样前以缓冲液加入端口1，以浸湿测试条。如前所述，端口2含有已预先包被并干燥的化学偶合物12，需要足够量体积的液体对其进行溶解。为减少样本体积的损失，选择疏水性膜材料进行过滤(见参考资料3)。由于毛细管工作层析要求一定的压差，故需保证过滤后液体集中处化学偶合物垫12与测试带5上化学反应处的硝基纤维素膜13之间的毛细管工作层析压差化学偶合物垫＞硝基纤维素膜，才能使液体从端口2向端口1流动，因此选用毛细管层析能力(Capillary Rise)低于硝基纤维素膜13的材料(见参考资料3)构成端口2过滤结构。如前所述，此时测试条已被缓冲液浸湿，端口1的吸水垫片16使端口1的毛细管层析压差高于硝基纤维素膜13，从而形成测试条上毛细管工作层析压差液体收集垫＞化学偶合物垫＞硝基纤维素膜的结构，如图8所示。又由于检测要求在短时间内完成，故需要液体高效地从端口2→端口1的流动速率，故选用孔径大于细胞过滤膜的材料作为液体收集垫以保证液体在过滤后有效地从化学偶合物垫12向硝基纤维素膜13方向滤过(见参考资料3)，因此，液体收集垫的膜孔径与过滤膜孔径之比要求＞1。
如图7所示，当含细胞的样本(如全血)同时或相继加入端口1和端口2时，其与图5不同的是，化学偶合物垫12上设有具有过滤功能的液体收集垫18，且液体收集垫18上还设有过滤膜15。该结构同时满足当含细胞样本分离加入端口1和端口2时的条件有效过滤细胞；最少量的液体体积损失；有效的毛细管层析压差；有效的液体流速。
本发明对保证特定检测项目得到用不含细胞的样本(如血清或血浆)同样的灵敏度和特异性的要求是通过以下方案来实现的灵敏度指某特定检测项目的可被检定的阳性最低限阈值，代表出现漏诊(假阴性)的可能性；特异性指某特定检测项目按预设的阴性最高限阈值判断，出现误诊(假阳性)的机率。因此，可靠的检测是在保证最低的漏诊率(假阴性)条件下避免出现误诊(假阳性)，即确定阳性最低限阈值是关键。阳性最低阈值的确定除了检测技术本身的之外，最大的影响因素是检测系统中的背景(本底)；在本系统毛细管层析的水平侧流测试条上，则为样本在检测区形成的背景着色。在本系统中，采用了双向水平侧流方法，使样本加在端口1时，流经硝基纤维素膜13区形成的背景着色(例如红细胞漏出或溶血造成的红色)可被第二次水平侧流时加入端口2的缓冲液洗涤而降低本底(见附图4)。当含细胞样本(如全血)加样在端口2，或同时或相继加在端口1和端口2两端时(见附图6、7)，由于缺少了缓冲液洗涤步骤，需加强细胞过滤效率，以保证红细胞(或其它细胞)不被滤过而流经硝基纤维素膜13区。即当含细胞样本(如全血)加样在端口2或端口1和端口2两端时，需要①双层过滤膜；②用促细胞聚集因子(如抗红细胞抗体或植物蛋白凝集素)预处理过滤膜，使待过滤物(如红细胞)体积增大以提高过滤效率。抗红细胞抗体(针对红细胞膜表面暴露的抗原决定簇可以是单克隆抗体或多克隆抗体)与红细胞表面的膜结构蛋白结合，形成免疫复合物，使红细胞聚集而使过滤效率提高。由于过滤膜15的表面疏水性质，使抗红细胞抗体很难吸附在过滤膜15上，故需将所使用的疏水性过滤膜15经表面活性剂(如Tween-20)预处理，使之具有部分亲水性，以便抗红细胞抗体可以吸附在过滤膜15表面(见参考资料2)。
如前所述，红细胞比积的差异将造成同体积的全血得到不同体积的血浆/血清样本，使检测中所加的样本体积出现差异。为保证检测结果的准确性，必须保证检测结果的相对体积非依赖性。本发明对检测结果的相对体积非依赖性是通过以下方案来实现的检测的最低体积要求是为了满足以下条件①浸透测试条以形成液态的生化反应条件；②溶解端口2预包被并干燥的化学偶合物。即要求在满足浸透膜和溶解化学偶合物的液体体积条件下，在一定的样本体积变化范围内，其检测结果应无明显差异。在本系统中先用不含细胞的样本(如血浆或血清)，确定某一特定检测项目的最低样本(血清或血浆)用量；在保证有效的细胞过滤和液体流速(如上所述)前提下，可以通过计算待检的含细胞样本(如全血)可被过滤的液体(如血浆或血清)体积，判断含细胞样本的最低用量，以保证过滤后参与生化反应的样本体积不低于检测所需最低量。另一方面，由于本系统采用待检条带与对照带光密度的比值(相对光密度值，RI)来判断检测结果(US专利6,136,610)，即检测过程中生化条件的误差(如样本体积)对待检条带和对照带绝对光密度值(Dr)的影响将呈同比趋势，但不影响RI的结果，从而降低了检测对样本体积的依赖性，使样本中细胞的含量对检测结果不造成明显的影响。
例
即在因样本体积变化，造成绝对光密度值误差时，仍可根据同比趋势原理，得到准确的RI的判断结果。
实施例1全血样本端口1过滤膜的筛选及过滤结构(附表1、2、3、4)。
材料1、过滤膜Ahlstron Filtration(美国)Grade 111玻璃纤维Grade 141和Grade 142玻璃纤维Grade 1660，Grade 1661，Grade 1662和Grade 16632、兔抗人红细胞抗体(中国瑞泰特思)3、使用抗人红细胞抗体预处理的过滤膜(参照程序)4、HIV(-)全血和血浆样本5、HIV(+)全血和血浆样本6、HIV测试盒按附图5结构组装HIV抗体检测试纸盒。
比较1、用抗人红细胞抗体处理不同过滤膜后分离红细胞的效果。
2、滤出的血浆在NC膜上的迁移速度。
3、全血和血浆样本检测HIV(+)之S/CO的差异。
结果见附表1、2、3和4。
结论1、仅用过滤膜不足以有效过滤红细胞，需要加入抗人红细胞抗体预处理过滤膜。
2、端口1应用经抗人红细胞抗体处理过的不同种类的过滤膜，均可以很好的分离红细胞。
3、人工合成纤维(Cytosep)1663膜因孔径过小(2微米)浸湿速度过低(35毫升/分钟)不能有效过滤血清。
4、通过HIV试纸盒检测，加样本端口1的全血和血浆样本，其检测结果(信噪比，S/CO)相同。
附表1 未经抗人红细胞抗体处理全血过滤膜滤过红细胞的效果
附表2 经抗人红细胞抗体预处理后的过滤膜对红细胞过滤的效果
附表3 不同过滤膜滤除红细胞的效果比较
附表4 端口1加样全血和血浆的测试结果比较
实施例2端口1处加与不加双面胶对滤过样本流向的影响目的1、观察不同类型硝基纤维素膜(NC膜)端口1处加与不加双面胶对血浆样本流向的影响2、观察不同类型NC膜端口1处加与不加双面胶对全血滤过样本流向的影响材料1、5毫米宽×100毫米长的HF135NC膜 美国MILLIPORE2、5毫米宽×100毫米长的HF90NC膜 美国MILLIPORE3、5毫米×5毫米双面胶 中国4、用有0.2毫克/毫升鼠抗人红细胞抗体处理过的141全血样本过滤垫(5毫米宽×7.5毫米长)5、30cm长钢尺中国6、正常人全血和血浆样本 临床献血员样本设计加样50ul------记时------测量过滤结构设计图见图9、图10所示。
步骤1、在样本垫上加50微升血浆，10分钟后观察结果并用钢尺测量样本流动距离2、在样本垫上加50微升全血，10分钟后观察结果并用钢尺测量样本流动距离实验结果见表5
实验分析1、样本垫下加双面胶后会促使样本向左端优势流动2、加全血样本比加血浆样本向左端优势流动更明显实施例3全血样本端口2加样时的过滤膜的选择及过滤结构(附表6A、6B、6C)。
目的建立全血适用于加样於端口2的最佳全血过滤结构，以便且血可以用于双向水平侧流检测。
材料1、全血分离膜Ahlstrom Filtering，美国GRADE CYTOSEP 目录号1661批号2050401GRADE CYTOSEP 目录号1660批号2050401GRADE CYTOSEP 目录号142 批号2050401GRADE CYTOSEP 目录号141 批号2050401GRADE CYTOSEP 目录号111 批号20504012、化学偶合垫(没有包被胶体金)Millipore中国有限公司3、硝基纤维素膜Millipore中国有限公司4、鼠抗人红细胞抗体(中国厦门波生)。
5、使用抗人红细胞抗体预处理的过滤膜(参考资料2)。
6、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)测试盒盖(需加样在端口2进行夹心法检测)。
7、正常人全血。
按附图6组装测试盒实验步骤
1、在HBsAg的测试盒上，用一层全血滤膜(未经抗人红细胞抗体处理)替换掉原缓冲液吸收垫，加全血样本，测试全血滤膜的滤血效果。
2、若单层膜不能达到有关键所在的红细胞和血浆的分离，则进一步筛选用两层未经抗人红细胞抗体处理的全血滤膜以期提高分率效率。
3、若上述两步都不能达到有效分离红细胞的目的，则上述材料中滤血效果相对最好的滤膜，经抗人红细胞抗体对膜进行预处理后，比较其过滤红细胞的效果。
结果；见附表6A、6B、6C。
附表6A 使用单一过滤膜的红细胞过滤效果
注“-”是指没有血浆滤出或滤出的血浆不足以迁移到硝基纤维素膜。
附表6B使用双层过滤膜的红细胞过滤效果
分析从附表6A和6B可以看出(1)仅仅依靠膜孔径的物理过滤不能有效地滤去红细胞，双层过滤膜也不能提高过滤效果；(2)#111和1660因膜孔径过小(1～3μm)，不能满足液体有效流速而被淘汰；(3)141+141或141+142的组合因低血浆迁移而被沟汰；(4)在同时满足过滤红细胞和有效的血浆流速条件下，141#和142#全血过滤膜显示较好过滤红细胞及较高的迁移速率，因此，选择141#和142#全血过滤膜，经红细胞抗体进行预处理后(见参考资料2)，进一步比较不同的双层膜组合中红细胞的过滤及血浆迁移效率，结果如表6C所示。
附表6C 不同过滤膜组合红细胞过滤及血浆迁移速率比较
注“*”表示用0.5毫克/毫升的鼠抗人红细胞抗体预处理。
“-”表示30分钟内无红细胞滤出CP化学偶合物垫分析当全血样品用于夹心法端口2加样口时，从附表6A～6C可以看出1.仅靠过滤膜的孔径难以达到有关键所在地阻隔红细胞的目的。
2.经抗人红细胞抗体对过滤膜的预处理能提高滤膜分离红细胞的效果。
3.最佳的双层滤膜结构是142#膜下置疏水性的化学偶合物垫作为有过滤功能的液体收集垫，两者均经抗红细胞抗体预处理。
4.有效的红细胞过滤和有效的血浆滤出率并向端口1迁徙是满足端口2加样的前提条件，故有过滤功能的液体收集垫18的孔径不能太小，且过滤结构EA与化学偶合物垫12硝基纤维素膜13之间需形成有效的毛细管工作层析压差，如图8所示，在硝基纤维素膜13上靠近端口1端设有液体吸收垫19(5×18毫米)，该液体吸收垫19为亲水性混合纤维，用于吸收加样于端口2的液体。
实施例4抗凝剂对红细胞过滤效果的影响(附表7A、7B)。
目的了解抗人红细胞抗体全血过滤膜应用于双向水平侧流的免疫层析检测时，抗凝剂对血浆的过滤效率及过滤出的血浆在硝基纤维素膜上迁移速率是否有影响。
材料1、全血滤膜#142(Ahlstrom Filtration，USA)，0.25毫克/毫升鼠抗从红细胞抗体预处理(见参考资料2)；2、经不同抗凝剂处理过的142膜；3、加入不同的抗凝剂的全血样品。
按附图6组装测试盒。
结果见附表7A和7B。
附表7A 未经抗凝剂处理的#142膜过滤不同全血结果比较
附表7B 经抗凝剂处理的#142膜过滤不同全血比较
由表7A和7B可以看出1、经抗凝剂处理与否，对於相同体积的样本#142膜对全血的过滤效果无明显差异；即抗凝剂不影响当当血浆经142膜的过滤效率；2、全血中是否加入抗凝剂，在相同体积和相同的过滤膜条件下，血浆的滤过效果无明显差异。
提示非抗凝全血可用於本检测系统。
实施例5红细胞比积对定量检测的影响(附表8A、8B)目的了解在双向水平侧流层析中，红细胞比积是否影响定量检测的结果。
材料1、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性抗凝全血标本，经温氏法测定其红细胞比积为44％，将其以1毫升/管分装，取2ml全血离心(3000转/分钟，15分钟)得到血浆。设44％的红细胞比积为1，在此基础上增加或减少全血中血浆的含量，则得到不同红细胞比积的全血。
2、甲状腺病患者抗凝全血，放射免疫法测得其TSH(促甲状腺激素)值为28微国际单位/毫升。同1所述方法制备不同红细胞比积的全血。
3、经0.25毫克/毫升抗人红细胞抗体处理的#142过滤膜(Ahlstrom Filtration)。
4、HBsAg测试盒，按附图7组装。
5、TSH测试盒，按附图7组装。
结果HBsAg测试结果见附表8A；TSH测试结果见附表8B。
从表8A和8B可以看出1、改变红细胞比积后，对HBsAg的定量检测结果显示含不同红细胞比积的全血与血浆检测结果之间差异＜15％，为本系统可容盒间差范围，提示对定量HBsAg检测，红细胞比积+30％或-40％范围内无明显的体积依赖性。
2、改变红细胞比积后对TSH的定量检测结果显示含不同红细胞比积的全血和血浆检测结果之间差异＜15％，为本系统可容许盒间差范围。提示对定量的TSH检测在红细胞比积+30％或-40％范围内无明显的体积依赖性。
附表8B红细胞比积在HBsAg定量检测中的影响
附表8B 红细胞比积在TSH定量检测中的影响
实施例6 红细胞比积对定性检测的影响(附表9)。
目的了解双向水平侧流层析检测中，红细胞比积对定性检测结果的影响。
材料1、同一例HIV抗体阳性抗凝全血，红细胞比积为45.3％，分装成8管，每管1毫升，4,000转/分钟，离心5分钟，通过弃去或增加血浆改变红细胞的比积。
2、经0.25毫克/毫升的兔抗人红细胞抗体处理的142过滤膜(美国Ahlstrom Filtration)。
3、HIV抗体测试盒，按附图5组装。
结果详见附表9中变异系数S/CO和CV％。
注定性检测以信噪比(S/CO)判断检测结果，以S/CO＞1为阳性。
从附表9可以看出用抗HIV测试盒检测同样体积的全血和血浆样本，全血红细胞比积在+30％和-40％变化范围内，HIV定性检测的结果无明显的体积依赖性，样本间S/CO值误差在9.43％，属本系统容许盒间差范围。
附表9 红细胞比积对HIV定性检测的影响
实施例7全血加样体积对定量或定性检测结果的影响(附表10A、10B)目的了解全血加样体积对双向水平侧流免疫层析检测结果的影响。
材料1、经0.25毫克/毫升的兔抗人红细胞抗体预处理的142过滤膜(Ahlstrom Filtration，美国)2、HIV抗体阳性抗凝全血(红细胞比积为45.3％)3、HBsAg阳性抗凝全血(红细胞比积为44％)4、按图5组装HIV抗体测试盒5、按图6组装HBsAg测试盒结果1、附表10A，为不同全血加样体积对HIV抗体定性检测结果2、附表10B，为不同全血加样体积对HBsAg定量检测结果注1、HIV定性检测以信噪比(S/CO)判断结果，以S/CO＞1为阳性。
2、HBsAg定量检测以浓度单位判断结果，即毫克/毫升。
结论1、适用于HIV检测的最小全血加亲友体积为40微升。全血加样量在40～70μl时，检测结果的变异系数(CV)值在5～20％范围。
2、适用于HBsAg检测的最佳全血加样体积为200～250微升。检测时间为30分钟时，检测结果的变异系数(CV)＜10％。
表10A 不同加样体积全血样本的HIV检测结果比较
附表10B 不同加样体积全血样本的HBsAg检测结果比较
参考资料目录参考资料-1 原材料供应商清单1、硝基纤维素膜(亲水性硝基化纤维，Millipore中国有限公司)，用以包被捕获区和控制区的试剂，提供生化反应的场所。
2、化学偶合垫(玻璃纤维，疏水性，Millipore中国有限公司)，用于包被胶体金偶合的试剂。
3、缓冲液吸收垫(亲水性混合纤维，Cytosep，美国AhlstromFiltration公司)，吸收缓冲液或样本。
4、样本垫(亲水性混合纤维，Cytosep，美国Ahlstrom Filtration公司)，吸收样本。
5、液体吸收垫(亲水性混合纤维，美国Whatman公司)，吸收层析的液体。
6、支撑垫(疏水性塑胶膜，美国G&L公司)，测试条的固体支撑结构。
7、全血过滤膜(疏水性玻璃纤维或亲水性混合纤维，美国Ahlstrom Filtration公司)，分离全血的红细胞。
8、兔多克隆抗人红细胞抗体(中国瑞泰特思)，用来预处理全血过滤膜和化学偶合垫。
9、鼠单克隆抗人红细胞抗体(中国厦门波生)，用来预处理全血过滤膜和液体收集垫。
10、塑料测试盒(中国盛进生物)，用作ReLIA免疫层析的构架，提供免疫反应的场所。
11、其它过滤膜CytoSep Grade 1660，1661，1662和1663(亲水性，混合天然和人工合成纤维，美国Ahlstrom Filtration公司)；纤维素Grade111(100％纯棉纸，亲水性，美国Ahlstrom Filtration公司)。
参考资料-2 抗红细胞抗体预处理过滤膜工艺流程A、配制10％的Tween-20溶液；B、配制终浓度为0.25～5毫克/毫升的兔(鼠)抗人红细胞抗体溶液缓冲液三羟甲基氨基甲烷 50毫摩尔 (终浓度)EDTANa24.1毫摩尔 (终浓度)PH 8.5±1Tween-20 0.8％ (终浓度)C、用已配制的含抗红细胞抗体的溶液处理过滤膜1、将一张过滤膜放入托盘。量取52毫升抗红细胞处理溶液，倒入托盘。使溶液均匀渗入整个过滤膜。
2、用辊子在膜上流滚动数次，以去除汽泡。
3、重复步骤1和2直至溶液均匀渗透整个膜。
4、将膜放置在纱网上，室温条件下用电风扇吹过夜。
5、将半干的已处理膜放入干燥器中干燥至少5小时。
6、将处理好的全血过滤膜放入含有干燥剂的铝箔袋中，密封室温保存。
参考资料-3 过滤膜理化特性
备注1、硝基纤维素膜的孔径为不均匀分布，但其它过滤膜的孔径是标准一致的，统称为“孔径分布“。
2、硝基纤维素膜的液体流速用XX秒/毫升/平方厘米表示，其它均用ml/min表示。
3、硝基纤维素膜的毛细引力随不同产品的液体而不同，用XX秒/4厘米表示，液体流速在很大程度上取决于孔径，孔径分布，膜的厚度。这些因素决定了硝基纤维素膜的多孔性状(膜中包含有一定体积的空气)，在所有膜的检测当中，硝基纤维素膜具有最大的毛细引力。
有关膜的流速和毛细流速的进一步详细理论描述，请参见“免疫层析试纸条简短指南”(Millipore)，P.7。
权利要求
1.一种定量的快速水平侧流方法，用生化反应的平台，实施对不限于人类待检的液态生物标本作各种待检项目，其特征在于用过滤结构阻隔液态标本中所含的细胞，得到完成其生化反应所需的液体体积；并通过该平台结构，形成有效的毛细管层析压差，使已过滤的液体及溶解于其中的待检物质在该平台上经毛细管层析作用定向流动；并根据生化反应中待检物质和对照物质所产生的可被检测的光密度判断检测结果。
2.根据权利要求1所述的定量的快速水平侧流方法，其特征在于所述的生化反应的平台由测试条和测试盒外壳组成，测试条的结构具有两端并以保证有效的细胞过滤、毛细管层析和生化反应；以测试盒外壳保证液态生物标本的加样结果的观察和测试条物理结构的固定；其生物标本可加在测试盒外壳上两端加样口的任一端或两端。
3.根据权利要求2所述的定量的快速水平侧流方法，其特征在于测试条的细胞过滤结构由单层或多层不同孔径的过滤膜组成，其直接与样本中细胞接触的过滤膜孔径小于待阻隔的细胞直径。
4.根据权利要求1或2所述的定量的快速水平侧流方法，其特征是所述的测试条的细胞过滤结构使用了双面胶，促使滤过液体朝预设方向呈优势流动。
5.根据权利要求1或2所述的定量的快速水平侧流方法，其特征是在于所述测试条的细胞过滤结构与毛细管层析压差要求保持一致，以保证有效的液体滤过及层析过程中的液体流速。
6.根据权利要求5所述的定量的快速水平侧流方法，其特征是所述的细胞过滤结构，与毛细管层析压差要求一致，由具有不同孔径、毛细引力的膜材料，组建细胞过滤——层析试纸条，使含细胞的液态待检生物标本在过滤中体积损失最少，并在被物理过滤后，液体在被收集原点处毛细管层析压差小于生化反应区，从而使过滤后的液体受毛细引力驱动在测试层析条上定向移动。
7.根据权利要求6所述的定量的快速水平侧流方法，其特征是所述的细胞过滤结构，可用使待过滤细胞聚集的化学试剂预处理过滤膜，使待过滤物因聚集而体积增大，而提高过滤膜对细胞的阻隔效果。
8.根据权利要求7所述的定量的快速水平侧流方法，其特征是所述的使待过滤细胞聚集的化学试剂采用抗红细胞抗体或植物蛋白凝集素，抗红细胞抗体针对红细胞膜表面暴露的抗原决定簇可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的定量的快速水平侧流方法，其特征是所述用抗红细胞抗体预处理过滤膜是包括用表面活性剂Tween-20处理膜以增加抗体对过滤膜的吸附。
10.根据权利要求1或2所述的定量的快速水平侧流方法，其特征在于所述测试条的毛细管层析压差来自于组装测试条的材料及其组装结构；根据生化检测项目要求，含细胞的液态生物标本可加样在测试盒的任一端或两端；不同的加样方式有不同的细胞过滤-层析-生化反应结构。
11.根据权利要求10所述的定量的快速水平侧流方法，其特征在于测试条的毛细管层析压差来自于组装测试条的材料及其组装结构；根据生化检测项目要求，含细胞的液态生物标本可加样在测试盒的任一端或两端；不同的加样方式有不同的细胞过滤-层析-生化反应结构。
12.根据权利要求1所述的定量的快速水平侧流方法，其特征在于待检液态生物标本是含细胞的全血，但不限于全血标本；含细胞的待检液态生物标本可含抗凝剂或不含抗凝剂，在经过反应平台的过滤结构后得到的液体体积满足生化反应所需。
13.根据权利要求1或2所述的定量的快速水平侧流方法，其特征是其生化反应过程利用了双向水平侧流降低生化反应中的背景；并以生化反应中待检物与对照物所产生的光密度值之比的相对光密度值RI分析检测结果，而提高检测的灵敏度，减少盒间差，使检测结果为相对地非体积依赖性。
14.根据权利要求13所述的定量的快速水平侧流方法，其特征在于所述的生化反应利用胶体金颗粒或银颗粒、或荧光染料、或其它产生可被光反射原理检测的光密度的材料作为标记物，使生化反应的结果可通过待检物和对照物产生的光密度之比被测定。
15.根据权利要求1所述的定量的快速水平侧流方法，其特征在于其生化反应是基于免疫学原理的，但不限于免疫学原理的大分子间结合关系的检测，用于检测人类，但不限于人类液态标本中的大分子，如抗原、抗体、多糖、核酸、多肽、病原微生物等。
16.一种定量的快速水平侧流系统，用生化反应的平台，实施对不限于人类待检的液态生物标本作各种待检项目，其特征在于生化反应的平台由测试条和测试盒外壳组成，测试条的结构具有两端并以保证有效的细胞过滤、毛细管层析和生化反应；生物标本可加在外壳上两端加样口的任一端或两端。
17.根据权利要求16所述的定量的快速水平侧流系统，其特征在于细胞过滤-层析-生化反应结构，各组之间按序部分或全部重叠；其重叠部分为0.1～20毫米。
18.根据权利要求17所述的定量的快速水平侧流系统，其特征在于所述的细胞过滤-层析-生化反应结构，细胞过滤膜为疏水性的玻璃纤维但不限於玻璃纤维，或亲水的混合纤维。
19.根据权利要求18所述的定量的快速水平侧流系统，其特征在于其液态生物标本经过滤后的液体收集膜为疏水性玻璃纤维但不限於玻璃纤维，或亲水的混合纤维，并具有不小于细胞过滤膜的孔径。
20.根据权利要求19所述的定量的快速水平侧流系统，其特征在于其液态生物标本经过滤后的液体收集膜孔径与过滤膜孔径之比＞1。
21.根据权利要求20所述的定量的快速水平侧流系统，其特征在于生化反应所需的标记物如胶体金被预包被并干燥于疏水的玻璃纤维上但不限於玻璃纤维，位于层析条的一端；胶体金在层析条上所处位置的层析压差在胶体金被溶解释放时低于生化反应的反应区，故胶体金可以包被原点向生化反应区定向移动。
22.根据权利要求21所述的定量的快速水平侧流系统，其特征在于生化反应区由亲水性的硝基纤维素膜但不限於硝基纤维素膜组成，并具有在双向水平测流的第一次液体流动时，在本结构中最高的毛细引力，使液体从加样区或液体收集区向其反应区定向移动。
23.根据权利要求22所述的定量的快速水平侧流系统，其特征是在层析条的另一端，相对应于化学偶合物垫的位置安装有亲水性的吸水垫片，其作用是在硝基纤维素膜已被浸湿，吸水能力下降胶体金溶解后，以其高度吸水能力提供促使液体从胶体金端向吸水垫片端定向移动所需的毛细管层析压差。
24.根据权利要求23所述的定量的快速水平侧流系统，其特征在于当含细胞的液态生物标本加样在吸水垫片一端时，其细胞过滤膜与硝基纤维素膜直接接触但不与吸水垫片接触；当含细胞的液态生物标本加样在胶体金一端时，其细胞过滤膜与液体收集膜部分与全部接触，但不与化学偶合物垫直接接触；当含细胞液态生物标本同时或分别加样于两端加样口时，其细胞过滤结构为分别加样时的结合。
25.根据权利要求24所述的定量的快速水平侧流系统，其特征在于其液态生物标本经过滤后的液体收集膜使同一种试纸条结构既可用于免疫间接法检测，又可用于免疫夹心法检测。
全文摘要
本发明涉及一种定量的快速水平侧流方法及系统，用生化反应的平台，实施对不限于人类待检的液态生物标本作各种待检项目，用过滤结构阻隔液态标本中所含的细胞，得到完成其生化反应所需的液体体积；生化反应的平台由测试条和测试盒外壳组成，生物标本可加在外壳上两端加样口的任一端或两端；并通过该平台结构，形成有效的毛细管层析压差，使已过滤的液体及溶解于其中的待检物质在该平台上经毛细管层析作用定向流动；并根据生化反应中待检物质和对照物质所产生的可被检测的光密度判断检测结果。借此，本发明可用于对全血的，或其它含细胞生物标本进行定量、快速的检测，且实现检测结果的相对体积非依赖性，保证了检测结果的准确性。
文档编号G01N33/543GK1786712SQ20041007736
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月7日 优先权日2004年12月7日
发明者周思亮, 刘宁, 威廉·吉·罗特 申请人:盛进生物工程(深圳)有限公司