专利名称：独一味的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种藏药药材、注射剂中间体及其注射剂的质量控制方法，特别涉及藏药独一味的药材、注射剂中间体以及独一味注射剂的质量控制方法。
背景技术：
目前中药的质量标准很不规范和完善，质量分析和评价的手段还很落后，无法准确的反映现有中药材以及成品的质量状况，成为中药走出国门，走向世界的障碍。中药材以及中成药指纹图谱是借鉴法医学中指纹鉴定的概念，将适当处理后的药材或药品，用一定的分析手段来得到能够反映该药材或药品特征的共有的峰图谱。通过对共有峰图谱的分析来辨别、鉴定药材或药品的质量，确保药品的质量稳定可控。同时结合对药材或药品中的特定指标成分的含量作定量测定，不仅可以对原料药材进行真假鉴别，同时也让中药内在的指标成分量化、标准化。便于对中药材以及中成药的质量进行监控。
发明内容
本发明目的在于公开藏药独一味的药材、注射剂中间体以及独一味注射剂的的质量控制方法，其中包括独一味的药材、注射剂中间体和注射剂的指纹图谱检测方法以及独一味注射剂的含量测定方法。
独一味药材的质量控制方法如下，其中包括独一味药材指纹图谱的检测方法为供试品溶液的制备取药材粉末4-6g，加乙醇40-60ml，回流提取1.5-2.5小时，滤过，回收乙醇至无醇味，残渣加水15-25ml加热溶解，过大孔吸附树脂柱，先用水洗至洗脱液无色，继用8-15％乙醇80-120ml洗脱，再用60-80％乙醇80-120ml洗脱，收集乙醇液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至15-25m1，摇匀，用微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中，其中高效液相色谱仪是指用十八烷基键合硅胶为填充剂；检测波长为254nm；柱温35℃；分析时间1小时；流动相乙腈-0.2％磷酸水溶液；测定记录得独一味药材的指纹图谱；独一味药材供试品指纹图谱的特征峰为以峰面积最大的峰5号共有峰作为参照峰，确定12个共有峰作为药材的特征指纹色谱峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值。
其中供试品溶液的制备为取粉碎后过内径为5mm筛的药材粉末5g，置烧瓶中，加乙醇50ml，回流提取2小时，滤过，回收乙醇至无醇味，残渣加水20ml加热溶解，过D101大孔吸附树脂柱，先用水洗至洗脱液无色，继用10％乙醇100ml洗脱，再用70％乙醇100ml洗脱，收集70％乙醇液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得其中流动相乙腈-0.2％磷酸水溶液随时间的变化而变化，采用梯度洗脱；流速0.5ml/min；流动相随时间的变化情况见表；梯度洗脱
其中独一味药材供试品的指纹图谱的特征峰的相对保留时间为相对保留时间(共有峰号)0.496±0.025(1)，0.740±0.023(2)，0.780±0.017(3)，0.886±0.010(4)，1(S)(5)，1.035±0.003(6)，1.125±0.015(7)，1.168±0.011(8)，1.274±0.018(9)，1.339±0.020(10)，1.402±0.025(11)，1.776±0.020(12)其中独一味药材供试品的指纹图谱的特征峰的峰面积比值为峰面积比值(共有峰号)0.067±0.028(1)，0.303±0.176(2)，0.091±0.072(3)，0.597±0.185(4)，1(S)(5)，1.008±0.419(6)，0.143±0.061(7)，0.164±0.062(8)，0.114±0.018(9)，0.260±0.048(10)，0.087±0.033(11)，0.080±0.051(12)
见附图1独一味药材对照指纹图谱。
本发明所述独一味注射剂中间体的制备方法如下取独一味药材，加水煎煮三次，第一次加15～25倍的水浸泡0.5～1小时，煎煮0.5～1.5小时，第二次、第三次各加10～20倍量水，分别煎煮0.5～1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至药液浓度为1∶1～2的浓缩液；加乙醇使含醇量达60％～80％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液再加乙醇使含醇量达80％～90％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液用30％～50％的氢氧化钠调PH至8～9，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液加10％～30％硫酸调PH至5～6，放置1～3小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入注射用水至溶解，5～8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液加活性炭0.05％～0.20％，煮沸15～30分钟，过滤，得独一味注射剂中间体。
其中体积重量份的比例为ml/g。
注射剂中间体的质量控制方法中包括独一味注射剂中间体的指纹图谱检测方法供试品溶液的制备取注射液中间体15～25ml，过大孔吸附树脂柱，蒸馏水洗至洗脱液无色，继用8-15％乙醇80-120ml洗脱，再用60-80％乙醇80-120ml洗脱，收集乙醇液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至15-25ml，摇匀，用微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中，其中高效液相色谱仪是指用十八烷基键合硅胶为填充剂；检测波长为254nm；柱温35℃；分析时间1小时；流动相乙腈-0.2％磷酸水溶液；测定记录得独一味注射液中间体的指纹图谱；独一味注射液中间体供试品指纹图谱的特征峰为以峰面积最大的峰6号共有峰作为参照峰，确定12个共有峰作为注射液中间体的特征指纹色谱峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积化值。
其中供试品溶液的制备取注射液中间体20ml通过D101大孔树脂柱(Φ20mm，柱长100mm)，水洗脱至流出液无色，用10％乙醇100ml洗脱，再用70％乙醇100ml洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
其中流动相乙腈-0.2％磷酸水溶液随时间的变化而变化，采用梯度洗脱；流速0.5ml/min；流动相随时间的变化情况见表；梯度运行表
其中独一味注射剂中间体供试品的指纹图谱的特征峰的相对保留时间为相对保留时间(共有峰号)0.364±0.058(1)，0.521±0.050(2)，0.754±0.031(3)，0.792±0.024(4)，0.899±0.005(5)，1(S)(6)，1.034±0.009(7)，1.158±0.019(8)，1.256±0.021(9)，1.377±0.031(10)，1.404±0.030(11)，1.754±0.040(12)其中独一味注射剂中间体供试品的指纹图谱的特征峰的峰面积比值为峰面积比值(共有峰号)0.066±0.032(1)，0.106±0.014(2)，0.576±0.070(3)，0.042±0.012(4)，0.143±0.045(5)，1(S)(6)，0.021±0.010(7)，0.133±0.014(8)，0.132±0.017(9)，0.081±0.014(10)，0.053±0.013(11)，0.125±0.018(12)见附图2独一味注射剂中间体对照指纹图谱。
本发明所述独一味注射剂的制备方法如下取独一味药材，加水煎煮三次，第一次加15～25倍的水浸泡0.5～1小时，煎煮0.5～1.5小时，第二次、第三次各加10～20倍量水，分别煎煮0.5～1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至药液浓度为1∶1～2的浓缩液；加乙醇使含醇量达60％～80％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液再加乙醇使含醇量达80％～90％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液用30％～50％的氢氧化钠调PH至8～9，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液加10％～30％硫酸调PH至5～6，放置1～3小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入注射用水至溶解8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液加活性炭0.05％～0.20％，煮沸15～30分钟，过滤，加入注射用水至与药材重量比为1体积重量份，，用0.22μm微孔滤膜滤过，灌装于5ml安瓿中，灭菌，即得。
其中体积重量份的比例为ml/g。
注射剂的质量控制方法，其中含有独一味注射剂的指纹图检测方法如下供试品溶液的制备精密量取注射液15-25ml，过大孔吸附树脂柱，蒸馏水洗至洗脱液无色，继用8-15％乙醇80-120ml洗脱，再用60-80％乙醇80-120ml洗脱，收集乙醇液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至15-25ml，摇匀，用微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中，其中高效液相色谱仪用用十八烷基键合硅胶为填充剂；检测波长为254nm；柱温35℃；分析时间1小时；流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液；测定记录得独一味注射液的指纹图谱；独一味注射剂供试品指纹图谱的特征峰为以峰面积最大的峰6号共有峰作为参照峰，确定12个共有峰作为独一味注射液指纹图谱的稳定的特征峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值。
其中供试品溶液的制备精密量取注射液20ml，通过D101大孔树脂柱，蒸馏水洗脱至流出液无色，用10％乙醇100ml洗脱，再用70％乙醇100ml洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
其中流动相乙腈-0.2％磷酸水溶液随时间的变化而变化，采用梯度洗脱。流速0.5ml/min；流动相随时间的变化情况如下；梯度洗脱
其中独一味注射剂供试品的指纹图谱的特征峰的相对保留时间为
相对保留时间(共有峰号)0.329±0.014(1)，0.482±0.020(2)，0.728±0.018(3)，0.754±0.029(4)，0.894±0.005(5)，1(S)(6)，1.039±0.002(7)，1.175±0.010(8)，1.276±0.011(9)，1.404±0.016(10)，1.428±0.015(11)，0.937±0.030(12)其中独一味注射剂供试品的指纹图谱的特征峰的峰面积比值为峰面积比值(共有峰号)0.048±0.024(1)，0.078±0.022(2)，0.594±0.104(3)，0.143±0.031(4)，0.116±0.055(5)，1(S)(6)，0.019±0.007(7)，0.155±0.020(8)，0.161±0.030(9)，0.096±0.023(10)，0.074±0.024(11)，0.110±0.040(12)。
见附图3独一味注射剂对照指纹图谱。
注射剂的质量控制方法，其中含有独一味注射剂的的含量测定方法如下对照品溶液的制备取木犀草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.012mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备取注射液1-3ml，加入8-12％的盐酸0.5-1.5ml，水浴回流0.5-1.5小时，甲醇溶解定容至15-25ml，摇匀，用微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，其中液相色谱仪用十八烷基键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2％磷酸溶液50-60∶40-50为流动相；检测波长为350nm；理论板数按木犀草素峰计算应不低于2500；测定其中注射液供试品中含独一味以木犀草素计算，每1ml不得少于0.1mg。
其中供试品溶液的制备取注射液2ml，加入10％的盐酸1ml，水浴回流1小时，甲醇溶解定容至20ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
其中流动相甲醇-0.2％磷酸溶液以55∶45为最佳流动相；独一味药材指纹图谱的试验研究中，稳定性试验结果表明在24小时内，相似度没有明显的变化，RSD％均小于0.5％，说明供试品溶液在24小时内是稳定的。精密度试验结果表明5次进样相相似度相没有明显的变化，RSD％均小于0.3％，表明仪器的精密度良好。重现性试验结果显示，5份样品进样后测定的相似度相没有明显的变化，说明该方法的重现性良好。检测波长的选择试验结果在330nm和254nm所测指纹图谱中主要色谱峰的响应值较大特征突出，在254nm下各色谱峰特征更为明显，故确定最大吸收波长为254nm。色谱柱的选择试验最终选用150mm色谱柱。梯度滞后时间测定试验得梯度滞后时间为0.125min。分析时间进样考察2小时后结果表明，在60分钟内，样品中所有峰均可被完全洗脱出，故分析时间确定为1小时。选用木犀草素、槲皮素作为参照物，但这两种成分在药材色谱图中均没有明显的色谱峰出现，因此未能采用；选用在254nm处有吸收的芦丁和葛根素作为内标物，但药材色谱图成分复杂，内标物和色谱峰的分离度差，因此没有采用；比较色谱图，选用色谱图中比较稳定的5号共有峰作为参照峰。
经过独一味注射剂中间体的指纹图谱试验研究，精密度试验结果表明相似度变化不显著，RSD％均小于0.40％，说明精密度良好。稳定性试验结果表明在24小时内，相似度相均大于0.98，RSD％J均小于0.50％，说明供试品溶液在24小时内基本稳定。重现性试验结果显示，5份样品进样后测定的指纹图谱相似度均大于0.98，相似度变化不显著，说明该方法的重现性良好。
独一味注射液指纹图方法学考察精密度试验结果表明相似度变化不显著，RSD％均小于0.40％，说明精密度良好。稳定性试验结果表明在24小时内，相似度相均大于0.98，变化不明显，说明供试品在24小时内是稳定的。重现性试验结果显示，5份样品进样后测定的指纹图谱相似度均大于0.98，RSD％均小于0.60％，说明该方法的重现性良好。
通过注射液与中间体及药材指纹图谱的相关性比较，药材指纹图谱中的各个色谱峰在中间体和制剂指纹图谱中基本都有体现，表明药材和中间体及制剂也有良好的相关性；中间体和制剂的图谱基本相似，中间体的主要色谱分在制剂中色谱中都有体现，表明中间体和制剂有很好的相关性。
独一味注射剂的含量测定的试验研究，最大吸收波长的测定，照分光光度法测定，木犀草素的最大吸收波长为350nm。对照品纯度考察试验结果表明，本对照品的纯度为100％。干扰性试验记录色谱图的试验结果表明，在木犀草素对照品色谱峰相应的位置上无色谱峰出现，表明空白无干扰。线性关系的考察试验，即通过回归方程得到结果表明，在0.076～0.380μg的范围内具有良好的线性。稳定性试验结果表明，供试品溶液经12小时稳定性考察，峰面积积分值变化较小，RSD％为0.47％，说明供试品溶液在12小时内是稳定的。精密度试验结果表明，5次进样的RSD％为0.46％，表明精密度良好。重复性试验结果表明，5次试验测得本批样品中木犀草素的含量平均值为0.127mg/ml，RSD1.17％，表明重复性良好。5次加样回收率试验的平均回收率为99.74％，RSD为2.00％，表明回收率良好。样品的含量测定试验测定结果表明最低含量为0.113mg/ml，下浮10％，确定为本注射剂每ml含独一味以木犀草素(C15O6H10)计，不得少于0.1mg。
下述实验例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1质量测定方法中流动相的选择试验通过以甲醇-0.2％磷酸水溶液和乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相对比进行试验，结果表明，乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相时，色谱峰的峰形好，各峰分离较完全，故选用乙腈-0.2％磷酸水溶液作为流动相。同时分别以恒流以及不同的梯度的流动相作为测定的色谱条件进行对比考察，经多次试验，注射剂的含量测定方法甲醇-0.2％磷酸溶液50-60∶40-50为流动相；其中甲醇-0.2％磷酸溶液的最佳比例为55∶45，；指纹图谱分析的流动相以如下梯度运行样品中各组分均较好的分离，基线平稳，故选用作为流动相。
梯度运行表
流速以0.5ml/min较为适合，在此条件下，各峰分离较好。
实验例2药材供试品溶液的制备方法优选试验经过试验应用高效液相色谱法，同时选择以独一味中黄酮类成分作为检测指标进行试验，建立药材的指纹图谱。药材的供试品来源于产地固定甘肃省武都县，使药材具有足够的代表性。
供试品溶液主要是提取和富积药材中的黄酮类成分，由于D101大孔树脂对黄酮类成分具有很好的富积作用，而且能除去糖，色素类杂质成分，起到纯化样品的作用。通过D101大孔吸附树脂柱与未通过此柱的色谱图比较试验，通过大孔吸附树脂柱的色谱图中各峰分离度较好，特征性强，基线平稳。加入因此选用药材提取后过D101大孔树脂柱进行试验。
实验例3独一味药材图谱特征峰其主要参数确定独一味药材来源
对独一味药材指纹图谱进行分析，比较，确定12个共有峰作为药材的特征指纹色谱峰。因为制剂所用的药材均为甘肃·玛曲产的药材，产地相对固定，因此选固定产地的1～10号供试品指纹图谱分析，确定共有指纹色谱峰，以5号共有峰作为参照峰，计算相对保留时间(共有峰号)、峰面积比值(共有峰号)、平均相对保留时间和平均峰面积比值。
将固定产地十批独一味药材指纹图谱试验数据导入中药指纹图谱相似度软件，经计算，得出独一味药材指纹图谱的共有模式，各批样品的指纹图谱和相似度结果表明同一产地药材指纹图谱相似，相似度结果都在0.9以上；不同产地的药材由于自然气候条件的不同，出现了相应的主成分峰，但各峰的比例不尽相同，相似度差异较大，市售同一产地的药材由于采收季节和贮存等原因，相似度明显低于其它药材，本方法制定的药材指纹图谱，具有一定的专属性，可明显区分不同产的的药材差异，为药材的鉴别提供可靠的依据，同时确保了制剂质量。
实验例4中间体供试品溶液的制备方法选择试验①精密量取中间体溶液2ml置20ml的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
②取中间体溶液2ml，通过D101大孔树脂柱(Φ20mm，柱长100mm)，水洗脱至流出液无色，用10％乙醇100ml洗脱，再用100ml70％乙醇洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
分别吸取上述两种溶液10ul，在上述色谱条件下进样测定，记录色谱图。结果表明方法①制备的供试品色谱图，基线不平，各峰的分离度差，虽然色谱峰比方法②制备的供试品色谱图多，但特征性较小，因此选用方法2制备供试品溶液。
实验例5独一味注射剂中间体的指纹图谱试验研究指纹图谱中没有明显的成分作为参照物，也没有合适的物质作为内标，因此选择相对稳定的共有峰作为参照峰。对十批独一味中间体指纹图谱进行分析，比较确定共有指纹色谱峰。以6号共有峰作为参照峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值，结果独一味中间体指纹图谱分离出20多个色谱峰，经比较从中选定了12个共有峰作为独一味注射剂中间体指纹图谱的稳定的特征峰。将十批独一味中间体试验数据导入计算机，经中药指纹图谱相似度软件计算，得出中间体指纹图谱共有模式，各样品均与共有模式比较，进行全谱相似度计算。结果显示相似度没有显著的变化，表明工艺相对的稳定，可用于制剂的工业化生产。同时表明本方法制定的中间体指纹图谱具有一定的专属性，可用于工艺的监控，保证成品的质量。
实验例6独一味注射剂指纹图谱的试验研究对十批独一味注射液指纹图谱进行分析，比较确定共有指纹色谱峰。以6号共有峰作为参照峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值，结果独一味注射液指纹图谱分离出20多个色谱峰，经比较从中选定了个12个共有峰作为独一味注射液指纹图谱的稳定的特征峰。将十批独一味注射液指纹图谱试验数据导入中药指纹图谱相似度软件，经中药指纹图谱相似度软件计算，得出独一味注射液指纹图谱的共有模式，各样品均与共有模式比较，进行全谱相似度计算。
结果显示本方法制定的独一味注射液指纹图谱具有一定的专属性，可用于成品质量的控制，保证成品的质量。
实验例7独一味注射剂的含量测定的试验研究用十八烷基键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2％磷酸溶液(55∶45)为流动相；检测波长为350nm；流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论板数按木犀草素峰计算为3598，故理论板数按木犀草素峰计算应不得低于3000。
含量测定方法主要是分光光度法，HPLC法以木犀草素为对照品测定含量，但是因为样品中木犀草素主要以苷的形式存在，游离的木犀草素很少，因此试验为设计将样品水解后测定。
I酸加入量的确定酸加入量考察
II水解时间的确定水解时间的考察
因此确定，精密量取样品各2ml，加入10％的盐酸1ml，水解、1.0小时，甲醇定容至置20ml量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。
下面结合附图和实施例进一步说明本发明
附图1独一味药材对照指纹图谱附图2独一味注射剂中间体对照指纹图谱附图3独一味注射剂对照指纹图谱实施例1独一味药材的质量控制方法(1)仪器与试药SeriesIII型高效液相色谱仪；SPD-6A型紫外检测器；N2010色谱工作站，江苏汉邦色谱柱(C18，150mm×4.6mm，5μm)BS110S型分析天平，德国赛多利斯公司生产；计算机辅助相似性评价系统软件(1.290)，中南大学中药现代化中心、香港理工大学；乙腈，色谱纯，进口，MERCK公司；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
(2)供试品的收集取不同批次的十批药材制备供试品.
供试品溶液的制备取粉碎后过内径为5mm筛的药材粉末5g，置烧瓶中，加乙醇50ml，回流提取2小时，滤过，回收乙醇至无醇味，残渣加水20ml加热溶解，过D101大孔吸附树脂柱(Φ20mm，柱长10cm)，先用水洗至洗脱液无色，继用10％乙醇100ml洗脱，再用70％乙醇100ml洗脱，收集70％乙醇液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml容量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得指纹图谱照高效液相色谱法试验。
色谱条件及系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂；检测波长为254nm。柱温35℃。流速0.5ml/min；分析时间1小时。
梯度洗脱
测定法吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪中，测定。记录色谱图。供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机相似度软件计算，相似度大于0.90，符合要求。
独一味药材的供试品指纹图谱的特征峰为以峰面积最大的峰5号共有峰作为参照峰，确定12个共有峰作为药材的特征指纹色谱峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值。
相对保留时间(共有峰号)0.496±0.025(1)，0.740±0.023(2)，0.780±0.017(3)，0.886±0.010(4)，1(S)(5)，1.035±0.003(6)，1.125±0.015(7)，1.168±0.011(8)，1.274±0.018(9)，1.339±0.020(10)，1.402±0.025(11)，1.776±0.020(12)峰面积比值(共有峰号)0.067±0.028(1)，0.303±0.176(2)，0.091±0.072(3)，0.597±0.185(4)，1(S)(5)，1.008±0.419(6)，0.143±0.061(7)，0.164±0.062(8)，0.114±0.018(9)，0.260±0.048(10)，0.087±0.033(11)，0.080±0.051(12)。
实施例2独一味注射剂中间体的制备与质量控制方法独一味注射剂中间体的制法取独一味药材，净选，切成1～2cm小段，称取1000g，加水煎煮三次，第一次加20倍的水，浸泡0.5小时，煎煮1小时，第二次、第三次各加15倍量水，分别煎煮1小时，滤过，合并滤液，浓缩至约500ml，加乙醇使含醇量达70％，于5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液再加乙醇使含量达85％，于5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液用40％的氢氧化钠调PH至8～9，于5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液加20％硫酸调PH5～6，放置1小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入注射用水至800ml，5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液加活性炭0.05％，煮沸15分钟，过滤，即得中间体。
中间体指纹图谱(1)仪器与试药同独一味药材的指纹图谱测定的仪器与试药。
(2)供试品的收集取不同批次的十批中间体制备供试品。
供试品溶液的制备取注射液的中间体20ml，通过D101大孔树脂柱(Φ20mm，柱长100mm)，水洗脱至流出液无色，用10％乙醇100ml洗脱，再用100ml70％乙醇洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
指纹图谱照高效液相色谱法试验。
色谱条件及系统适用性试验采用梯度洗脱，流动相随时间的变化情况见下表。
梯度运行表
流速0.5ml/min；检测波长254nm。
柱温35℃； 分析时间1小时。
测定法吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪中，测定。记录色谱图。供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机相似度软件计算，相似度大于0.90，符合要求。
独一味注射液中间体供试品指纹图谱的特征峰为以峰面积最大的峰6号共有峰作为参照峰，确定12个共有峰作为药材的特征指纹色谱峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值。
独一味中间体指纹图谱特征峰为相对保留时间(共有峰号)0.364±0.058(1)，0.521±0.050(2)，0.754±0.031(3)，0.792±0.024(4)，0.899±0.005(5)，1(S)(6)，1.034±0.009(7)，1.158±0.019(8)，1.256±0.021(9)，1.377±0.031(10)，1.404±0.030(11)，1.754±0.040(12)峰面积比值(共有峰号)0.066±0.032(1)，0.106±0.014(2)，0.576±0.070(3)，0.042±0.012(4)，0.143±0.045(5)，1(S)(6)，0.021±0.010(7)，0.133±0.014(8)，0.132±0.017(9)，0.081±0.014(10)，0.053±0.013(11)，0.125±0.018(12)实施例3独一味注射剂的制备与质量控制方法独一味注射剂制法取独一味药材，净选，切成1～2cm小段，称取1000g，加水煎煮三次，第一次加20倍的水，浸泡0.5小时，煎煮1小时，第二次、第三次各加15倍量水，分别煎煮1小时，滤过，合并滤液，浓缩至约500ml，加乙醇使含醇量达70％，于5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液再加乙醇使含量达85％，于5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液用40％的氢氧化钠调PH至8～9，于5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液加20％硫酸调PH5～6，放置1小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入注射用水至800ml，5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液加活性炭0.05％，煮沸15分钟，过滤，加入注射用水至1000ml，用0.22μm微孔滤膜滤过，灌装于5ml安瓿中，灭菌，即得。
(1)仪器与试药同独一味药材的指纹图谱测定的仪器与试药。
(2)供试品的收集取不同批次的十批注射剂制备供试品.
供试品溶液的制备取注射液20ml，通过D101大孔树脂柱(Φ20mm，10cm)，蒸馏水洗脱至流出液无色，用10％乙醇100ml洗脱，再用70％乙醇100ml洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml容量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
指纹图谱照高效液相色谱法试验。
色谱条件及系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂；检测波长为254nm。柱温35℃。流速0.5ml/min；分析时间1小时。
梯度洗脱
测定法吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪中，测定。以色谱图中峰面积最大的峰为参照峰。
供试品指纹图谱与对照指纹图谱经计算机相似度软件计算，相似度大于0.90，符合要求。
独一味注射液供试品指纹图谱的特征峰为以峰面积最大的峰6号共有峰作为参照峰，确定12个共有峰作为药材的特征指纹色谱峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值。
相对保留时间(共有峰号)0.329±0.014(1)，0.482±0.020(2)，0.728±0.018(3)，0.754±0.029(4)，0.894±0.005(5)，1(S)(6)，1.039±0.002(7)，1.175±0.010(8)，1.276±0.011(9)，1.404±0.016(10)，1.428±0.015(11)，0.937±0.030(12)峰面积比值(共有峰号)0.048±0.024(1)，0.078±0.022(2)，0.594±0.104(3)，0.143±0.031(4)，0.116±0.055(5)，1(S)(6)，0.019±0.007(7)，0.155±0.020(8)，0.161±0.030(9)，0.096±0.023(10)，0.074±0.024(11)，0.110±0.040(12)实施例4独一味注射剂的质量控制方法含量测定照高效液相色谱法试验。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2％磷酸溶液(55∶45)为流动相；检测波长为350nm；理论板数按木犀草素峰计算应不低于2500。
对照品溶液的制备 取木犀草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.012mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备 取本品2ml，加入10％的盐酸1ml，水浴回流1小时，甲醇溶解定容至20ml量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，按外标法计算。
本品含独一味以木犀草素计算，每1ml不得少于0.1mg。
权利要求
1.一种独一味药材的质量控制方法，其特征在于该方法中包括指纹图谱的测定方法为供试品溶液的制备 取药材粉末4-6g，加乙醇40-60ml，回流提取1.5-2.5小时，滤过，回收乙醇至无醇味，残渣加水15-25ml加热溶解，过大孔吸附树脂柱，先用水洗至洗脱液无色，继用8-15％乙醇80-120ml洗脱，再用60-80％乙醇80-120ml洗脱，收集乙醇液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至15-25ml，摇匀，用0.25～0.65μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中，其中高效液相色谱仪用十八烷基键合硅胶为填充剂；检测波长为254nm；柱温35℃；分析时间1小时；流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液；测定记录得独一味药材的指纹图谱；独一味药材的指纹图谱的特征峰为以峰面积最大的峰5号共有峰作为参照峰，确定12个共有峰作为药材的特征指纹色谱峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值。
2.如权利要求1所述的独一味药材的质量控制方法，其特征在于其中供试品溶液的制备方法为取粉碎后过内径为5mm筛的药材粉末5g，置烧瓶中，加乙醇50ml，回流提取2小时，滤过，回收乙醇至无醇味，残渣加水20ml加热溶解，过D101大孔吸附树脂柱，先用水洗至洗脱液无色，继用10％乙醇100ml洗脱，再用70％乙醇100ml洗脱，收集70％乙醇液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
3.如权利要求1或2所述的独一味药材的质量控制方法，其特征在于其中流动相乙腈-0.2％磷酸水溶液随时间的变化而变化，采用梯度洗脱；流速0.5ml/min；流动相随时间的变化情况如下0到10分钟时按85％的0.2％磷酸水溶液加15％的乙腈溶液的比例关系进行洗脱，从10到40分钟，按0.2％磷酸水溶液由85％降为70％，乙腈由15％升到30％的比例关系进行洗脱；从40到50分钟，按0.2％磷酸水溶液由70％降为60％，乙腈由30％升到40％的比例关系进行洗脱；50到60分钟时按60％的0.2％磷酸水溶液加40％的乙腈溶液的比例关系进行洗脱。
4.如权利要求1或2所述的独一味药材的质量控制方法，其特征在于独一味药材的指纹图谱的特征峰的相对保留时间为1号峰0.496±0.025，2号峰0.740±0.023，3号峰0.780±0.017，4号峰0.886±0.010，5号峰1(S)，6号峰1.035±0.003，7号峰1.125±0.015，8号峰1.168±0.011，9号峰1.274±0.018，10号峰1.339±0.020，11号峰1.402±0.025，12号峰1.776±0.020。
5.如权利要求1或2所述的独一味药材的质量控制方法，其特征在于独一味药材的指纹图谱的特征峰的峰面积比值为1号峰0.067±0.028，2号峰0.303±0.176，3号峰0.091±0.072，4号峰0.597±0.185，5S号峰1，6号峰1.008±0.419，7号峰0.143±0.061，8号峰0.164±0.062，9号峰0.114±0.018，10号峰0.260±0.048，11号峰0.087±0.033，12号峰0.080±0.051。
6.如权利要求3所述的一种独一味药材的指纹图谱，其特征在于独一味药材的指纹图谱的特征峰的相对保留时间为1号峰0.496±0.025，2号峰0.740±0.023，3号峰0.780±0.017，4号峰0.886±0.010，5S号峰1，6号峰1.035±0.003，7号峰1.125±0.015，8号峰1.168±0.011，9号峰1.274±0.018，10号峰1.339±0.020，11号峰1.402±0.025，12号峰1.776±0.020。
7.如权利要求3所述的一种独一味药材的指纹图谱，其特征在于独一味药材的指纹图谱的特征峰的的峰面积比值为1号峰0.067±0.028(1)，2号峰0.303±0.176(2)，3号峰0.091±0.072，4号峰0.597±0.185，5号峰1(S)，6号峰1.008±0.419，7号峰0.143±0.061，8号峰0.164±0.062，9号峰0.114±0.018，10号峰0.260±0.048，11号峰0.087±0.033，12号峰0.080±0.051。
8.一种独一味注射剂的中间体的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤取独一味药材，加水煎煮三次，第一次加15～25倍的水浸泡0.5～1小时，煎煮0.5～1.5小时，第二次、第三次各加10～20倍量水，分别煎煮0.5～1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至药液浓度为1∶1～2的浓缩液；加乙醇使含醇量达60％～80％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液再加乙醇使含量达80％～90％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液用30％～50％的氢氧化钠调PH至8～9，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液加10％～30％硫酸调PH至5～6，放置1～3小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入注射用水至溶解，5～8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液加活性炭0.05％～0.20％，煮沸15～30分钟，过滤，得独一味注射剂的中间体。
9.如权利要求8所述的独一味注射剂的中间体的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤取独一味药材，加水煎煮三次，第一次加20倍的水浸泡0.5小时，煎煮1小时，第二次、第三次各加15倍量水浸泡0.5小时，分别煎煮1小时，滤过，合并滤液，浓缩至药液浓度为1∶2的浓缩液，加乙醇使含醇量达70％，于5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液再加乙醇使含量达85％，于5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液用40％的氢氧化钠调PH至8～9，于5～8℃冷藏12小时，滤过，滤液加20％硫酸调PH5～6，放置1小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入注射用水至溶解8℃冷藏12小时，滤过，滤液加活性炭0.05％，煮沸15分钟，过滤，得独一味注射剂的中间体。
10.一种独一味注射剂的中间体的质量控制方法，其特征在于该方法中包括指纹图谱的测定方法为供试品溶液的制备精密量取注射液中间体溶液15～25ml过大孔吸附树脂柱，蒸馏水洗至洗脱液无色，继用8-15％乙醇80-120ml洗脱，再用60-80％乙醇80-120ml洗脱，收集乙醇液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至15-25ml，摇匀，用微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中，其中高效液相色谱仪是指用十八烷基键合硅胶为填充剂；检测波长为254nm；柱温35℃；分析时间1小时；流动相乙腈-0.2％磷酸水溶液；测定记录得独一味注射剂中间体的指纹图谱；独一味注射液中间体供试品指纹图谱的特征峰为以峰面积最大的峰6号共有峰作为参照峰，确定12个共有峰作为注射剂中间体的特征指纹色谱峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值。
11.如权利要求10所述的独一味注射剂的中间体的质量控制方法，其特征在于其中供试品溶液的制备方法为精密量取注射液中间体溶液20ml，通过D101大孔树脂柱，水洗脱至流出液无色，用10％乙醇100ml洗脱，再用100ml70％乙醇洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
12.如权利要求10或11所述的独一味注射剂的中间体的质量控制方法，其特征在于其中流动相乙腈-0.2％磷酸水溶液随时间的变化而变化，采用梯度洗脱；流速0.5ml/min；流动相随时间的变化情况如下0到10分钟时按85％的0.2％磷酸水溶液加15％的乙腈溶液的比例关系进行洗脱，从10到40分钟，按0.2％磷酸水溶液由85％降为70％，乙腈由15％升到30％的比例关系进行洗脱；从40到50分钟，按0.2％磷酸水溶液由70％降为60％，乙腈由30％升到40％的比例关系进行洗脱；50到60分钟时按60％的0.2％磷酸水溶液加40％的乙腈溶液的比例关系进行洗脱。
13.如权利要求10或11所述的独一味注射剂的中间体的质量控制方法，其特征在于独一味注射剂的中间体的指纹图谱的特征峰的相对保留时间为1号峰0.364±0.058，2号峰0.521±0.050，3号峰0.754±0.031，4号峰0.792±0.024，5号峰0.899±0.005，6号峰1(S)，7号峰1.034±0.009，8号峰1.158±0.019，9号峰1.256±0.021，10号峰1.377±0.031，11号峰1.404±0.030，12号峰1.754±0.040。
14.如权利要求10或11所述的独一味注射剂的中间体的质量控制方法，其特征在于独一味注射剂的中间体的指纹图谱的特征峰的峰面积比值为1号峰0.066±0.032，2号峰0.106±0.014，3号峰0.576±0.070，4号峰0.042±0.012，5号峰0.143±0.045，6号峰1(S)，7号峰0.021±0.010，8号峰0.133±0.014，9号峰0.132±0.017，10号峰0.081±0.014，11号峰0.053±0.013，12号峰0.125±0.018。
15.如权利要求12所述的一种独一味注射剂的中间体的指纹图谱，其特征在于独一味注射剂的中间体的指纹图谱的特征峰的相对保留时间为1号峰0.364±0.058，2号峰0.521±0.050，3号峰0.754±0.031，4号峰0.792±0.024，5号峰0.899±0.005，6号峰1(S)，7号峰1.034±0.009，8号峰1.158±0.019，9号峰1.256±0.021，10号峰1.377±0.031，11号峰1.404±0.030，12号峰1.754±0.040。
16.如权利要求12所述的一种独一味注射剂的中间体的指纹图谱，其特征在于独一味注射剂的中间体的指纹图谱的特征峰的的峰面积比值为1号峰0.066±0.032，2号峰0.106±0.014，3号峰0.576±0.070，4号峰0.042±0.012，5号峰0.143±0.045，6号峰1(S)，7号峰0.021±0.010，8号峰0.133±0.014，9号峰0.132±0.017，10号峰0.081±0.014，11号峰0.053±0.013，12号峰0.125±0.018。
17.一种独一味注射剂的质量控制方法，其特征在于其中包括独一味注射剂指纹图谱的检测方法为供试品溶液的制备精密量取注射液溶液15～25ml，过大孔吸附树脂柱，蒸馏水洗至洗脱液无色，继用8-15％乙醇80-120ml洗脱，再用60-80％乙醇80-120ml洗脱，收集乙醇液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至15-25ml，摇匀，用0.25～0.65μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法 吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中，其中高效液相色谱仪用十八烷基键合硅胶为填充剂；检测波长为254nm；柱温35℃；分析时间1小时；流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液；测定记录得独一味药材的指纹图谱；独一味注射剂指纹图谱的特征峰为以峰面积最大的峰6号共有峰作为参照峰，确定12个共有峰作为独一味注射液指纹图谱的稳定的特征峰，计算相对保留时间、峰面积比值、平均相对保留时间和平均峰面积比值。
18.如权利要求17所述的注射剂的质量控制方法，其特征在其中供试品溶液的制备方法为精密量取注射液溶液20ml，通过D101大孔树脂柱，蒸馏水洗脱至流出液无色，用10％乙醇100ml洗脱，再用70％乙醇100ml洗脱，收集70％的乙醇洗脱液，水浴蒸干，甲醇溶解定容至20ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
19.如权利要求17或18所述的独一味注射剂的质量控制方法，其特征在于其中流动相乙腈-0.2％磷酸水溶液随时间的变化而变化，采用梯度洗脱；流速0.5ml/min；流动相随时间的变化情况如下0到10分钟时按85％的0.2％磷酸水溶液加15％的乙腈溶液的比例关系进行洗脱，从10到40分钟，按0.2％磷酸水溶液由85％降为70％，乙腈由15％升到30％的比例关系进行洗脱；从40到50分钟，按0.2％磷酸水溶液由70％降为60％，乙腈由30％升到40％的比例关系进行洗脱；50到60分钟时按60％的0.2％磷酸水溶液加40％的乙腈溶液的比例关系进行洗脱。
20.如权利要求17或18所述的独一味注射剂的质量控制方法，其特征在于独一味注射剂的指纹图谱的特征峰的相对保留时间为1号峰0.329±0.014，2号峰0.482±0.020，3号峰0.576±0.070，4号峰0.754±0.029，5号峰0.894±0.005，6号峰1(S)，7号峰1.039±0.002，8号峰1.175±0.010，9号峰1.276±0.011，10号峰1.404±0.016，11号峰1.428±0.015，12号峰0.937±0.030。
21.如权利要求17或18所述的独一味注射剂的质量控制方法，其特征在于独一味注射剂的指纹图谱的特征峰的峰面积比值为1号峰0.048±0.024，2号峰0.078±0.022，3号峰0.594±0.104，4号峰0.143±0.031，5号峰0.116±0.055，6号峰1(S)，7号峰0.019±0.007，8号峰0.155±0.020，9号峰0.161±0.030，10号峰0.096±0.023，11号峰0.074±0.024，12号峰0.110±0.040。
22.如权利要求19所述的独一味注射剂的质量控制方法，其特征在于独一味注射剂的指纹图谱的特征峰的相对保留时间为1号峰0.329±0.014，2号峰0.482±0.020，3号峰0.576±0.070，4号峰0.754±0.029，5号峰0.894±0.005，6号峰1(S)，7号峰1.039±0.002，8号峰1.175±0.010，9号峰1.276±0.011，10号峰1.404±0.016，11号峰1.428±0.015，12号峰0.937±0.030。
23.如权利要求19所述的独一味注射剂的质量控制方法，其特征在于独一味注射剂的指纹图谱的特征峰的峰面积比值为1号峰0.048±0.024，2号峰0.078±0.022，3号峰0.594±0.104，4号峰0.143±0.031，5号峰0.116±0.055，6号峰1(S)，7号峰0.019±0.007，8号峰0.155±0.020，9号峰0.161±0.030，10号峰0.096±0.023，11号峰0.074±0.024，12号峰0.110±0.040。
24.一种独一味注射剂的质量控制方法，其特征在于其中包括独一味注射剂含量测定方法为对照品溶液的制备 取木犀草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.012mg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备 取注射液1-3ml，加入8-12％的盐酸0.5-1.5ml，水浴回流0.5-1.5小时，甲醇溶解定容至15-25ml，摇匀，用0.25～0.65μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，其中液相色谱仪用十八烷基键合硅胶为填充剂；甲醇-0.2％磷酸溶液50-6040-50为流动相；检测波长为350nm；理论板数按木犀草素峰计算应不低于2500；测定注射液供试品中含独一味以木犀草素计算，每1ml不得少于0.1mg。
25.如权利要求24所述的独一味注射剂的质量控制方法，其特征在于其中供试品溶液的制备方法为取注射液2ml，加入10％的盐酸1ml，水浴回流1小时，甲醇溶解定容至20ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
26.如权利要求24或25所述的独一味注射剂的质量控制方法，其特征在于其中以55∶45的甲醇-0.2％磷酸溶液作为流动相。
全文摘要
本发明公开独一味的药材、注射剂中间体以及注射剂的质量控制方法。独一味药材的质量控制中包括药材指纹图谱的检测方法主要步骤为制备供试品溶液、测定、记录图谱、确定参照峰和共有峰；独一味注射剂中间体的质量控制中包括注射剂中间体指纹图谱的检测方法主要步骤为制备供试品溶液、测定、记录图谱、确定参照峰和共有峰；独一味注射剂的质量控制中包括注射剂指纹图谱的检测方法主要步骤为制备供试品溶液、测定、记录图谱、确定参照峰和共有峰；注射剂的质量控制中还包括注射剂含量测定方法主要步骤为制备对照品溶液和供试品溶液、测定、供试品中含独一味以木犀草素计算，每1ml不得少于0.1mg。
文档编号G01N30/02GK1760667SQ200410083678
公开日2006年4月19日 申请日期2004年10月15日 优先权日2004年10月15日
发明者阙文彬 申请人:成都优他制药有限责任公司