一种天然药物高速逆流指纹谱的方法及应用的制作方法

专利名称：一种天然药物高速逆流指纹谱的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然药物指纹谱的建立方法及应用，特别是涉及一种天然药物高速逆流(HSCCC)指纹谱的方法及应用。
背景技术：
来自天然的药材，包括中药，多为人工分散采收、加工，受天气、地域差别及人为影响因素很大，原料和半成品及最终产品质量的规范化、标准化管理差距较大，为保证产品质量的均一和稳定，需要建立严格的质量监控标准和良好的监控方法。一般的分析技术只能表征部分化学信息，例如包括已知的活性成分、已知的非活性成分、一部分未知成分。现已知道，天然药物的药效不是来自任何单一的活性成分，而是由多种活性成分，甚至与“非活性成分”的协同作用或“生克作用”相关，所以天然药物的化学信息具有一定的模糊性。
常用天然药物的质量评价一直是研究与应用中的难点与重点问题，天然药物的价值虽然已有上千年实际应用的实践证明，但在现代科学技术飞速发展的今天，如何有效地评价药材的质量，如何保证天然药物的疗效，是一个越来越需要迫切解决的问题。随着中国进入WTO，作为医药界为数不多的具有自主知识产权的天然药物或中药产品，如何被世界所认同和接受，如何评价药材的质量才能保证疗效，才能做到与国际水平接轨，已经成为医药产业面临的重要课题。国外对天然药物或中药的认识基本上是基于其所含有的化学成分，也是质量控制的依据。近年来，国外研究人员采用TLC和HPLC等手段，制订出不同来源的药材的TLC和HPLC指纹图谱，为品质评价提供了切实可行的科学依据。建立天然药物指纹谱的方法种类繁多，色谱学方法为主流，尤其是TLC、HPLC和GC色谱技术。天然药物指纹图谱不仅具备个体的绝对的唯一性，也具备物种特征的唯一性与同种个体之间的相似性，使药物的质量控制指标从原有的对某几个成份含量的测定上升为对整个天然药物内在品质的检测，可以最大限度地展示天然药物的内在品质，尽管对于药材的某一具体成分是什么我们可能仍不清楚，但却可以以此作为控制及衡量药材质量标准的重要内容，并使天然药物或中药研究更符合中医学的整体观念，提高了对天然药物真伪优劣鉴别的标准。
最为常用的色谱技术包括(1)薄层层析法(TLC)操作简便，无论天然药化合物有无紫外吸收或挥发性，均可以用TLC进行定性，但此法精密度、准确度和重现性较差；(2)高效液相色谱法(HPLC)适用于不同性质的天然药化合物，可分析/分离生物碱、甙类、蒽醌、有机酸、酚类、内酯等化合物且精密度高，重现性好；但是该方法无法分析粘度较高的以及易造成固定相吸附样品，并且仪器及耗材昂贵，不利于推广；(3)气相色谱(GC)分析效能非常高，但适用范围有限，仅用于挥发性成分及衍生化后的生物碱、脂肪、内酯、酚、糖、动物类药物。
高速逆流色谱(HSCCC)是一种没有固相载体的液—液分配色谱，避免了柱吸附和柱<p>表2 单位残留率(％)

实施例3通过甘氨酸与甘氨酰甘氨酸合并使用对胆固醇脱氢酶稳定化进行探讨。
配制添加有2U/mL胆固醇脱氢酶、14mM十二烷基麦芽糖、0.5M甘氨酰甘氨酸以及各浓度甘氨酸的负荷液(pH8.8)，探讨在37℃保存一定时期后的胆固醇脱氢酶的残余率。以实施例1所示方法进行胆固醇脱氢酶残留活性的测定。
刚配制好的负荷液的酶活性为100％，保存后的残留活性量为相对值表示的结果显示在表3中。如表3所示，确认了甘氨酸添加进一步提高了稳定的效果。
表3单位残留率(％)


发明内容
本发明要解决的技术问题是克服已有方法在天然药物指纹谱建立时，不同批次样品的量化比较直观性差的缺陷，提供一种适用于高粘度和易吸附物质的高速逆流(HSCCC)指纹谱的方法。
本发明的技术方案包括如下步骤步骤1，供试品的制备制备3个以上批次天然药材的粗提物，因为样品的个体差异，能有更多的批号则更佳，采用常规技术提取，得到粗提物；步骤2，确定主要化合物类型通过薄层色谱法、显色反应等检测得到的粗提物，确定药材粗提物所包含的主要化合物类型；步骤3，选取溶剂体系根据确定的主要化合物类型，选取适用于HSCCC的有机相/有机相或有机相/水相溶剂体系；步骤4，使用高速逆流色谱仪分离纯化各批次粗提物将选定的溶剂在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出作为固定相的那一层溶剂，将其泵入高速逆流色谱仪的管柱；剩余的一相作为流动相；在10～40℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转或反转，主机转速为750～950rpm，并以1.0～2.5mL/min的流速将流动相泵入分离柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入某一批次药材粗提物，根据溶解度常数，在不破坏体系平衡的情况下，调节溶剂体系中各溶剂的比例，选取分配系数适宜的体系，上述体系中任一相为固定相，另一相为流动相，各组分按其在两相中的分配系数一次分离纯化；步骤5，使用紫外检测器在线检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；得到3批次药材的色谱图；步骤6，确定共有指纹峰；步骤7，计算高速逆流色谱数字化指纹谱的方法误差；制定各批次药材的数字化色谱指纹谱，以标准药材为准，计算差异率，使各批次药材与标准药材之间的差异量化。共包括4个小步骤(1)选取参照峰采用内参照峰法，须符合下列条件与相邻色谱峰分离良好，峰位居中；是各待鉴样品的共有色谱峰；是该品种的重要指标成分。如果分析时间较长且峰数目较多，可选择双参照峰，即在前半部分色谱峰中选一内标峰，再在后半部分色谱峰中选一内标峰，形成两个相对保留值系列作为比较的依据。相对保留时间是用将色谱峰的保留时间与内参照峰保留时间之比来量化的。相对峰面积采用参照峰比值法以内参照峰的峰面积作为基准，其他各色谱峰的峰面积与它作比较，由此得到一系列的面积比值。
(2)方法误差的建立首先确定方法的重现性，对同一批样品进行重复性试验，来确定方法的误差，重复试验的次数n应根据数理统计方法来确定。方法误差包括作为定性依据的相对保留时间的相对偏差和相对标准偏差，以及作为定量依据的相对峰面积的相对偏差和相对标准偏差。若在方法误差范围内，可判定该组峰为同一峰(组分)；若超出方法误差则可视为不同组分(表3)。
表3 HSCCC数字化指纹谱的方法误差

(3)构建HSCCC数字指纹谱数字化指纹谱(表4)是建立在色谱指纹图谱的实验结果基础上。构建数字化指纹谱时，首先选定参照峰i，一般遵循以下原则一是选取整个色谱图中间位置的较强的峰，二是与前后两峰的分离度较好，三是该峰尽可能为已知化合物，且为重要有效成分。
表4中相对保留时间的计算是以峰i的保留时间为1，将其它峰的保留时间与之相比，因此其他峰的保留时间均大于或小于1。表4中平均值是指对应性峰的相对保留时间tR的平均值。相对保留时间tR的相对标准偏差和相对标准偏差根据如下公式计算。
表4中相对峰面积A采用归一化面积值，即以参照峰i的面积为1，将其他色谱峰面积与之相比，得到一系列面积比值，对于不同批次样品同一峰的差异率计算，若确定某一批次为标准，可与其进行比较计算，若所有批次均未确定标准可以与平均值比较确定。
特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标将相对保留时间在方法误差范围内的组分放在一个窗口，即认为在方法误差范围内的是同一组分，超出的认为是不同组分。
差异率是指每个指纹峰与其相应标准指纹峰两者间的差异程度。总差异率则是将一个样品中每个指纹峰的差异率求和。总差异率越大，表示比较双方相差越大，同时归纳了定性鉴定和量化描述两方面信息的综合性参数。
特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标 在HSCCC数字化指纹谱中不但同时包括了不同样品的相对保留时间、相对峰面积，还以相对偏差、相对标准偏差和差异率来量化描述了不同样品中对应组分的差异程度。
(表4)HSCCC数字化指纹谱

(4)特征指纹共有峰代表了一类天然药物样品的共性，也是该品种的特性，是与其他品种区别之处，从而构成了该生物体所特有的指纹，称其为特征指纹。特征指纹是由一系列的特征指纹峰所组成的峰群，特征指纹可以用于含有相同有效成分的不同天然药物间的鉴别，主要用于品种鉴别。指纹峰的量值差异反映了同一品种生物、不同产地、不同采收期质量的差异，因而又可用作原料与成药的质控依据。
特征指纹峰必须是同一品种样品所共有的峰，以及已被认定为这种药材效成分或特殊成分的峰。特征指纹峰应占色谱峰总数的60％以上。
特征指纹曲线是由特征指纹和各指纹峰相应的面积归一化值所构成，以曲线图的方式说明某天然药物特征指纹的情况。它是一种直观图，以曲线的形式同时将每个特征指纹峰的质和量显示出来。可在同一坐标系统内将待鉴饮片与相应标准的特征指纹峰同时显示出来，可清楚地看到两者的相似程度。
本发明提供了一种天然药物指纹谱的方法，从各种工艺途径制备的不同含量天然药物，采用高速逆流色谱仪(HSCCC)能直接进大量粗提样品或合成混合物，分离结果能达到相当高的纯度。高速逆流色谱法可避免柱吸附和柱污染，特别适用于高粘度及易造成固定相吸附的样品的分析，其性价比高，有利于在原药材产地及经济欠发达地区推广应用，是对现有指纹图谱方法的重要补充。
本发明提供了一种天然药物指纹谱的应用，数字化指纹谱不但用相对值的概念，解决了图象形式的指纹图谱受操作因素影响、难以进行多批次的量化比较的问题。而且明确在方法误差的基础上，建立一系列参数和相应的一整套比较规则和计算公式，在数字指纹谱中直接引入了相对保留时间的相对偏差和相对标准偏差，以及相对峰面积的差异率，以直观地、定量地表现出不同样品中各对应组分的差异程度，实现了任意2个样品之间的直观地量化比较。可提高对药材真伪优劣鉴别的标准，作为控制及衡量天然药物质量标准的重要内容。


图1-1是河北产丹参的HSCCC图谱图1-2是山东产丹参的HSCCC图谱图1-3是江苏产丹参的HSCCC图谱图2是丹参醌类化合物的特征指曲线图3是丹参酚酸类化合物的特征指曲线图4是雪莲黄酮类化合物的特征指曲线图5是蚯蚓生物碱类化合物的特征指曲线具体实施方式
实施例1制定丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱1.仪器与试剂(1)仪器1)TBE-300半制备型高速逆流色谱仪(深圳同田生化技术有限公司，中国)。聚四氟乙烯管缠绕在3个水平轴上形成螺旋管(管直径2.6mm，分离体积300mL)，进样圈20mL。高速逆流色谱配备了柱塞式泵(S系列，北京圣益通技术开发有限责任公司，中国)，紫外检测仪(8823A，北京新技术应用研究所，中国)，记录仪(3057型，四川记录仪器厂，中国)。
2)高效液相色谱(10Avp系列，岛津，日本)双泵系统(LC-10ATvp)，紫外检测仪(SPD-10Avp)，柱温箱(CTO-10ASvp)，系统控制器(SCL-10Avp)，控制软件(Class-vp)，20μl进样圈；色谱柱反向C18柱(150mm×4.6mm I.D.，5μm)。
(2)试剂1)高速逆流色谱试剂采用分析纯(天津化学试剂一厂)。水是通过反渗透Mili-Q(18MΩ，Milipore，USA)制备。
2)高效液相色谱试剂采用一级色谱纯(Fisher Scientific Co.Ltd.，UK)。将反渗透处理过的水(18MΩ，Milipore，USA)通过0.45μm滤膜减压过滤后使用。标准对照品用高速逆流色谱的流动相配制成1mg/mL，经0.45μm滤膜过滤使用。
(3)丹参饮片来自3个产地河北、山东、江苏。
(4)标准对照品国家药品监督管理局，中国药品与生物制品检定所提供。
2.数字化指纹谱建立步骤1，制备各批次药材的粗提物将3个批次丹参均采用如下方法粗分离将丹参根或根茎粉碎成粉；20g丹参粉溶于50mL溶剂(正己烷∶乙醇＝1∶1，V/V)，充分搅拌45min，沉降后取上清；沉淀再溶于25mL溶剂(正己烷∶乙醇＝1∶1，V/V)，充分搅拌45min，沉降后取上清；合并两次的上清液，离心10000g×10min，弃沉淀，留上清，定容；加入2倍体积的水，在分液漏摇匀，静置过夜；分出上相(有机相)，定容，用2倍于有机相体斗中积的30wt％乙醇洗涤下相(水相)，直至下相(水相)近乎无色，浓缩上相，在真空干燥器内充分干燥，得到丹参的粗提物干粉，粗提收率为2wt％；步骤2，确定主要化合物类型通过薄层色谱法检测得到的粗提物，确定药材粗提物所包含的主要化合物类型为蒽醌类化合物；步骤3，选取溶剂体系根据确定的主要化合物类型，配制高速逆流色谱流动相溶剂体系甲为正己烷-乙醇-水＝10-5.5-4.5(V/V)，溶剂体系乙为正己烷-乙醇-水＝10-7-3(V/V)；步骤4，用高速逆流色谱仪分离纯化丹参的粗提物将配制的溶剂体系甲在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出上相作为固定相的那一层溶剂，将其加入高速逆流色谱仪的分离柱；下相作为流动相；在10～30℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转，主机转速为900rpm，并以2mL/min的流速将流动相泵入管柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入步骤1)制得的某一批次药材粗提物，0-470min以体系甲的下相为流动相，470min后更换为体系乙的下相为流动相，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；步骤5，使用紫外检测器在线检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；每个批次丹参样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱峰12个；在洗脱过程中，同时分别收集各组份，再通过其在HPLC上的保留时间和在UV-Vis光谱图上的峰值及形状确定各批次中药材粗提物的各组份的对应性；图1所示为3个产地的丹参的HSCCC图谱。由图可见，经HSCCC纯化，3个产地的丹参各得到12个洗脱峰，峰的数目一致。对各洗脱峰进行分析测定各洗脱峰在反相高效液相色谱(HPLC)上的保留时间；在紫外-可见分光光度计900-200nm范围对各洗脱峰进行全波长扫描，得到吸收光谱。从HPLC保留时间和紫外吸收光谱可以判定，3个产地丹参洗脱曲线中的第n(n为3-12)个洗脱峰为同一组分。也就是说，3个产地丹参的HSCCC洗脱图谱，不但洗脱峰个数一致，而且对应洗脱峰为同一组分。
步骤6，判断共有指纹峰3张洗脱图谱中的12个洗脱峰所包含的12个组分分别对应，没有非共有指纹峰；步骤7，计算丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱的方法误差，并构建数字化色谱指纹谱(1)选取洗脱峰7为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积，避免因仪器操作等因素造成的数据波动。
(2)计算HSCCC数字化指纹谱的方法误差丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱的方法误差

方法误差包括两方面(1)相对保留时间的误差范围相对保留时间的相对标准偏差小于3％；(2)相对峰面积的误差范围相对峰面积的相对标准偏差小于8％。即相对保留时间的RSD＜3％认为是同一组分；相对峰面积的RSD＜8％认为含量相同。
在此基础上，将相对保留时间在方法误差范围内的放在一个窗口下，比较不同样品中各对应组分的差异程度。
(3)构建丹参饮片HSCCC数字化指纹谱丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱

(4)绘制特征指纹曲线丹参脂溶性化合物的HSCCC指纹谱中不存在非共有峰，峰1#～12#均是这三个样品共有，可将这12个峰作为特征指纹峰，构成HSCCC的特征指纹，绘制特征指纹曲线(图2)。
实施例2
制定丹参酚酸类化合物的HSCCC数字化指纹谱①仪器器与试剂TBE-300半制备型高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司，中国)。聚四氟乙烯管缠绕在3个水平轴上形成螺旋管(管直径2.6mm，分离体积300mL)，进样圈20mL。分离半径(即支持轴与中央轴之间的距离，R)为5cm，β值从0.5～0.8(β＝r/R，r是指螺旋管到支持轴的距离)。高速逆流色谱配备了恒流泵(S系列，北京圣益通技术开发有限责任公司，中国)，紫外检测仪(8823A，北京新技术应用研究所，中国)，记录仪(3057型，四川记录仪器厂，中国)及数据采集系统(N2000，浙江大学智能技术研究所)。正己烷、乙酸乙酯、甲醇均采用分析纯。不同批次丹参酚酸类粗制样品购自西安鸿生公司，以流动相溶解后直接上样。
②方法正己烷-甲醇-水＝1.5∶1.5∶5的体系，以下相为流动相，pH2.5～2.6，850r/min，2mL/min，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入某一批次药材粗提物，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；3个批次样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱11个。
③指纹谱制备方法根据方法误差对保留时间的RSD＜3％认为是同一组分；相对峰面积的RSD＜8％认为含量相同，将相对保留时间在方法误差范围内的放在一个窗口下，比较不同样品中各对应组分的差异程度。将不同批次样品各组分的保留时间和峰面积列入表中，并计算相对偏差、相对标准偏差和差异率构成HSCCC数字化指纹谱的主体。
丹参酚酸类化合物的HSCCC数字化指纹谱

在此基础上建立HSCCC的特征指纹曲线，因其指纹谱中不存在非共有峰，峰1#～11#均是这三个样品共有，可将这11个峰作为特征指纹峰，构成丹参酚酸类HSCCC的特征指纹，绘制特征指纹曲线(图3)。
实施例3
制订雪莲黄酮类高速逆流色谱数字化指纹谱①仪器与试剂TBE-300半制备型高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司，)。聚四氟乙烯管缠绕在3个水平轴上形成螺旋管(管直径2.6mm，分离体积300mL)，进样圈20mL。分离半径(即支持轴与中央轴之间的距离，R)为5cm，β值从0.5～0.8(β＝r/R，r是指螺旋管到支持轴的距离)。高速逆流色谱配备了恒流泵(S系列，北京圣益通技术开发有限责任公司，中国)，紫外检测仪(8823A，北京新技术应用研究所，中国)，记录仪(3057型，四川记录仪器厂，中国)及数据采集系统(N2000，浙江大学智能技术研究所)。氯仿、甲醇均为分析纯。天山雪莲购自新疆自治区。
②方法雪莲黄酮类化合物的粗制备方法如下干燥的雪莲花去除杂质称量20g，用300mL的70％乙醇室温浸提7天；减压浓缩浸提液；加等体积水，振摇均匀，静置1h；离心去除沉淀1000g×6min；取上清减压浓缩成浸膏；HSCCC分离中取80μL溶解于3mL流动相后上样。HSCCC分离条件选用氯仿-甲醇-水为9-12-8的溶剂系统，以下相为流动相；主机转速800r/min，流动相流速1.7mL/min，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入某一批次药材粗提物，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；使用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；3个批次雪莲黄酮化合物样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱峰7个。
③指纹谱制备方法根据方法误差对保留时间的RSD＜3％认为是同一组分；相对峰面积的RSD＜8％认为含量相同，将相对保留时间在方法误差范围内的放在一个窗口下，比较不同样品中各对应组分的差异程度。
将不同批次样品各组分的保留时间和峰面积列入表中，并计算相对偏差、相对标准偏差和差异率构成HSCCC数字化指纹谱的主体。
雪莲黄酮类化合物的HSCCC数字化指纹谱

在此基础上建立HSCCC的特征指纹曲线，因其指纹谱中不存在非共有峰，峰1#～7#均是这三个样品共有，可将这7个峰作为特征指纹峰，构成HSCCC的特征指纹，绘制特征指纹曲线(图4)。
实施例4蚯蚓生物碱类化合物的HSCCC数字化指纹谱①仪器与试剂TBE-300半制备型高速逆流色谱仪(上海同田生化技术有限公司，中国)。聚四氟乙烯管缠绕在3个水平轴上形成螺旋管(管直径2.6mm，分离体积300mL)，进样圈20mL。分离半径(即支持轴与中央轴之间的距离，R)为5cm，β值从0.5～0.8(β＝r/R，r是指螺旋管到支持轴的距离)。高速逆流色谱配备了恒流泵(S系列，北京圣益通技术开发有限责任公司，中国)，紫外检测仪(8823A，北京新技术应用研究所，中国)，记录仪(3057型，四川记录仪器厂，中国)及数据采集系统(N2000，浙江大学智能技术研究所)。各有机溶剂均采用分析纯。
②方法地龙浸出液的制备方法如下采集活地龙10g；用蒸馏水洗净体表污物；置蒸馏水中存放3h，让其自行排泄，经数次处理，使消化腔排净；将洁净虫各5g置于玻璃器皿内，加入蔗糖5g将体内液体脱出。HSCCC分离条件氯仿-甲醇-水＝4-3-2体系，以下相为流动相；HSCCC主机转速850r/min，流动相流速2mL/min整个体系建立动态平衡，从进样阀注入某一批次药材粗提物，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；用紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；3个批次地龙生物碱类化合物样品经分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱峰8个。
③指纹谱制备方法根据方法误差对保留时间的RSD＜3％认为是同一组分；相对峰面积的RSD＜8％认为含量相同，将相对保留时间在方法误差范围内的放在一个窗口下，比较不同样品中各对应组分的差异程度。
将不同批次样品各组分的保留时间和峰面积列入表中，并计算相对偏差、相对标准偏差和差异率构成HSCCC数字化指纹谱的主体。
蚯蚓生物碱类化合物的HSCCC数字化指纹谱

在此基础上建立HSCCC的特征指纹曲线，因其指纹谱中不存在非共有峰，峰1#～8#均是这三个样品共有，可将这8个峰作为特征指纹峰，构成HSCCC的特征指纹，绘制特征指纹曲线(图5)。
权利要求
1.一种天然药物高速逆流指纹谱的方法，其特征在于包括下列步骤(1)供试品的制备采用常规技术，制备3个以上批次天然药材的粗提物；(2)确定主要化合物类型，选取溶剂体系，调节溶剂体系中各溶剂的比例，选取分配系数适宜的体系；上述体系中任一相为固定相，另一相为流动相，各组分按其在两相中的分配系数一次分离纯化；(3)紫外检测器在线检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；得到各批次药材的色谱图，选取共有指纹峰；计算高速逆流色谱数字化指纹谱的方法误差(表3)；制定各批次药材的数字化指纹谱(表4)，以标准药材为准，计算差异率；(表3)HSCCC数字化指纹谱的方法误差
(表4)HSCCC数字化指纹谱
2.根据权利要求1所述的一种天然药物高速逆流指纹谱的方法，其特征在于在10～40℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转或反转，主机转速为750～950rpm，并以1.0～2.5mL/min的流速将流动相泵入分离柱内，整个体系建立动态平衡。
3.根据权利要求2所述的一种天然药物高速逆流指纹谱的方法，其特征在于丹参饮片三个组分构成的溶剂体系甲是正己烷—乙醇—水，体积比10∶5.5∶4.5，溶剂体系乙正己烷—乙醇—水体积比10∶7∶3。
4.根据权利要求2所述的一种天然药物高速逆流指纹谱的方法，其特征在于丹参酚酸类溶剂体系是正己烷—甲醇—水，体积比1.5∶1.5∶5。
5.根据权利要求2所述的一种天然药物高速逆流指纹谱的方法，其特征在于雪莲黄酮类溶剂体系是氯仿—甲醇—水，体积比9∶12∶8。
6.根据权利要求2所述的一种天然药物高速逆流指纹谱的方法，其特征在于地龙浸出液溶剂体系是氯仿—甲醇—水，体积比4∶3∶2。
7.根据权利要求1所述的一种天然药物高速逆流指纹谱的方法，其特征在于计算高速逆流色谱数字化指纹谱的方法误差，制定各批次药材的数字化指纹谱是由以下4步组成；(1)选取参照峰采用内参照峰法，须符合下列条件与相邻色谱峰分离良好，峰位居中；是各待鉴样品的共有色谱峰；是该品种的重要指标成分，如果分析时间较长且峰数目较多，可选择双参照峰，即在前半部分色谱峰中选一内标峰，再在后半部分色谱峰中选一内标峰，形成两个相对保留值系列作为比较的依据。相对保留时间是用将色谱峰的保留时间与内参照峰保留时间之比来量化的；相对峰面积采用参照峰比值法以内参照峰的峰面积作为基准，其他各色谱峰的峰面积与它作比较，由此得到一系列的面积比值；(2)方法误差的建立首先要确定方法的重现性，类似于作标准曲线，对同一批样品进行重复性试验，来确定方法的误差，重复试验的次数n应根据数理统计方法来确定；方法误差包括作为定性依据的相对保留时间的相对偏差和相对标准偏差，以及作为定量依据的相对峰面积的相对偏差和相对标准偏差；若在方法误差范围内，可判定该组峰为同一峰(组分)；若超出方法误差则可视为不同组分；(3)构建HSCCC数字指纹谱数字化指纹谱(表4)是建立在色谱指纹图谱的实验结果基础上，构建数字化指纹谱时，首先选定参照峰i，一般遵循以下原则一是选取整个色谱图中间位置的较强的峰，二是与前后两峰的分离度较好，三是该峰尽可能为已知化合物，且为重要有效成分；表4中相对保留时间的计算是以峰i的保留时间为1，将其它峰的保留时间与之相比，因此其他峰的保留时间均大于或小于1，表4中平均值是指对应性峰的相对保留时间tR的平均值，相对保留时间tR的相对标准偏差和相对标准偏差根据如下公式计算；表4中相对峰面积A采用归一化面积值，即以参照峰i的面积为1，将其他色谱峰面积与之相比，得到一系列面积比值，对于不同批次样品同一峰的差异率计算，若确定某一批次为标准，可与其进行比较计算，若所有批次均未确定标准可以与平均值比较确定； 特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标将相对保留时间在方法误差范围内的组分放在一个窗口，即认为在方法误差范围内的是同一组分，超出的认为是不同组分；差异率是指每个指纹峰与其相应标准指纹峰两者间的差异程度。总差异率则是将一个样品中每个指纹峰的差异率求和。总差异率越大，表示比较双方相差越大，同时归纳了定性鉴定和量化描述两方面信息的综合性参数；特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标
(4)特征指纹共有峰代表了一类天然药物样品的共性，也是该品种的特性，是与其他品种区别之处，从而构成了该生物体所特有的指纹，特征指纹是由一系列的特征指纹峰所组成的峰群，特征指纹可以用于含有相同有效成分的不同天然药物间的鉴别，主要用于品种鉴别，指纹峰的量值差异反映了同一品种生物、不同产地、不同采收期质量的差异，因而又可用作原料与成药的质控依据；特征指纹峰必须是同一品种样品所共有的峰，以及已被认定为这种药材(饮片)有效成分或特殊成分的峰。特征指纹峰应占色谱峰总数的60％以上。特征指纹曲线是由特征指纹和各指纹峰相应的面积归一化值所构成，以曲线图的方式说明某天然药物特征指纹的情况；它是一种直观图，以曲线的形式同时将每个特征指纹峰的质和量显示出来，可在同一坐标系统内将待鉴饮片与相应标准的特征指纹峰同时显示出来，可清楚地看到两者的相似程度。
8.根据权利要求1所述的一种天然药物高速逆流指纹谱的方法，其特征在于丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱的方法误差
方法误差包括两方面(1)相对保留时间的误差范围相对保留时间的相对标准偏差小于3％；(2)相对峰面积的误差范围相对峰面积的相对标准偏差小于8％；即相对保留时间的RSD＜3％认为是同一组分；相对峰面积的RSD＜8％认为含量相同；比较不同样品中各对应组分的差异程度；丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱
丹参脂溶性化合物的HSCCC指纹谱中不存在非共有峰，峰1#～12#均是这三个样品共有，可将这12个峰作为特征指纹峰，构成HSCCC的特征指纹，绘制特征指纹曲线。
9.根据权利要求1所述的一种天然药物高速逆流指纹谱的方法在天然药物品种鉴别、药材区分及天然药物组合物活性成分的鉴定中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种天然药物高速逆流指纹谱的方法及应用。它包括采用高速逆流(HSCCC)分离纯化天然药物，建立HSCCC数字化指纹谱的方法误差，确定HSCCC数字化指纹谱的方法，以相对保留时间和相对峰面积为主要参数，以相对偏差、相对标准偏差和差异率，直观量化不同样品中各对应组分的的差异程度。可提高对药材真伪优劣鉴别的标准，适用于高粘度及易造成固定相吸附的样品的分析，其性价比高，有利于在原药材产地及经济欠发达地区推广应用。
文档编号G01N30/86GK1621832SQ200410089500
公开日2005年6月1日 申请日期2004年12月14日 优先权日2004年12月14日
发明者顾铭, 邓秋云, 欧阳藩 申请人:上海同田生化技术有限公司, 中国科学院过程工程研究所