专利名称：表面受体复合物作为生物标记的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及生物标记，具体来说，涉及使用细胞表面受体复合物，如二聚体或者寡聚体来作为生物标记发明背景生物标记是一种能够客观地测量并计算的特征物，作为正常的生物学过程、致病过程、或者针对治疗介入手段的药理学反应的指示物，Atkinson等，Clin.Pharmacol.Ther.，6989-95(2001)。生物标记在性质、测量难易程度、以及与目标物生理状态的关系上有很大的不同，例如Frank等，Nature ReviewsDrug Discovery，2566-580(2003)。人们普遍相信，开发新型有效的生物标记既可以显著减少保健和药物开发的成本，又可以大大改善对多种疾病和身体状况的治疗。为此，人们作了大量的努力，旨在利用新技术来发现新类型的生物标记，例如，Petricoin等，Nature Reviews Drug Discovery，1683-695(2002)；Sidransky，Nature Reviews Cancer，2210-219(2002)。
细胞表面膜成分的相互作用在正常生理学状态和疾病状态中对于将胞外信号传送给细胞起着重要的作用。特别是，许多类型的细胞表面受体经过了二聚化、寡聚化、或簇集作用，这些作用与胞外活动或信号，如配体-受体结合的转导有关联，形成细胞的反应，例如增殖、增加或减少基因的表达等等，如George等，Nature Reviews Drug Discovery，1808-820(2002)；Mellado等，Ann.Rev.Immunol.，19397-421(2001)；Schlessinger，Cell，103211-225(2000)；Yarden，Eur.J.Cancer，37S3-S8(2001)。这种信号转导活动在疾病如癌症中的作用已成为人们密切研究的对象，并导致开发了数种新药和候选药物，例如Herbst和Shin，Cancer，941593-1611(2002)；Yarden和Sliwkowski，Nature Reviews Molecular Cell Biology，2127-137(2001)；McCormick，Trends in Cell Biology，953-56(1999)；Blume-Jensen和Hunter，Nature，411355-365(2001)。
单个细胞表面受体的表达水平已经被成功地用作为生物标记，例如Slamon等的美国专利4968603(Her2表达)。然而，单独的单个受体表达水平对疾病状态或身体状况并不总是可靠的指示物，例如Chow等，Clin.Cancer Res.，71957-1962(2001)(EGFR或Her1的表达)。尽管受体二聚化作用在细胞和疾病过程中起着重要的作用，但受体二聚体的表达还未被采用作生物标记，部分是由于当前测量技术的不方便和缺乏灵敏度，并且无法或不能实际使用这种技术来对福尔马林固定的和/或对于分析来说量太小的患者样品进行测量，例如Price等，Methods in Molecular Biology，218255-267(2003)；Stagljar，Science STKE 2003，pe56(2003)；Koll等，国际专利公开WO 2004/008099；Golemis，editor，Protein-Protein Interactions(Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，2002)；Sorkin等，Curr.Biol.，101395-1398(2000)；McVey等，J.Biol.Chem.，1714092-14099(2001)；Salim等，J.Biol.Chem.，27715482-15485(2002)；Angers等，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，42409-435(2002)；Szollosi等，Reviews in MolecularBiotechnology，82251-266(2002)；Matko等，Meth.in Enzymol.，278444-462(1997)；Reed-Gitomer的美国专利5192660。
鉴于上述原因，根据涉及关键胞内过程，如信号转导过程的细胞表面受体二聚体或复合物的存在、不存在、和/或特征或比例，在患者样品中提供了新种类的生物标记，其对于诊断、预后、患者分级以及药物开发提供了新式的工具，从而将促进医学领域的发展。
发明概述本发明涉及一类新的含有受体复合物的生物标记，其存在于在患者细胞或组织样品，包括通过常规方法如冷冻或固定法所保存的样品，的细胞表面膜中。一方面，本发明包括一种测定疾病状态或健康状况的方法，其中将这类状况与大量的来自于个体细胞或组织样品的细胞表面膜中的一种或多种受体复合物相关联。另一方面，本发明包括一种测定来自个体的样本中癌症状态的方法，其中将样本中大量的一种或多种表面受体复合物的测量值同这种状况相关联。本发明另外还提供了一种预测二聚体作用药物效果的方法，例如，在癌症治疗中，该方法将药物反应性的二聚体的数量和种类与功效或者患者应答的可能性相关联。
在一种方式中，本发明可以测定患者的疾病状态，所述患者所患疾病的特征是，一种或多种细胞表面受体复合物的异常表达，步骤如下(i)测定患者样品中一种或多种细胞表面受体复合物中每种的量；(ii)将上述每种量与其在标准样品中的相应量相比较；以及(iii)将患者样品中的量与标准样品中分别相对应的量之差与患者的疾病状态相关联。患者样品可以是固定或者冷冻的；然而优选地，患者样品为采用常规方法固定的。
在另一种特别的方式中，本发明提供了一种根据患者样品，尤其是固定样品的测量值，来预测用于治疗异常纤维化状态的二聚体作用药物的有效性、或者患者对其的反应性，所述二聚体作用药物作用于PDGF受体复合物，包括但不限于，一种或多种PDGFRα同型二聚体、PDGFRβ同型二聚体、PDGFRα-PDGFRβ异型二聚体、PDGFR-SHC、PDGFR-PI3K、Her1-PDGFR受体二聚体、Her2-PDGFR受体二聚体、Her3-PDGFR受体二聚体以及PDGFR-IGF-1R受体二聚体。在另一种实施方式中，这种PDGF受体复合物选自PDGFRα同型二聚体、PDGFRβ同型二聚体和PDGFRα-PDGFRβ异型二聚体构成的组。
在另一种特别的方式中，本发明提供了一种根据患者样品，尤其是固定样品的测量值，来预测用于治疗异常血管生成，尤其是固体肿瘤中的二聚体作用药物的有效性、或者患者对其的反应性，所述二聚体作用药物作用于VEGF受体复合物，包括但不限于，一种或多种VEGFR1同型二聚体、VEGFR2同型二聚体、VEGFR1-VEGFR2异型二聚体、VEGFR2-VEGFR3异型二聚体、VEGFR2-SHC复合物、以及VEGFR3-SHC复合物。
在另一种方式中，本发明提供了一种通过测定一种或多种细胞表面膜受体的量，或者在这些患者的细胞或组织样品中多个细胞表面膜受体二聚体的相关量，从而确定患者疾病状态的方法。在一个实施方式中，采用了至少两种试剂，这里称作试剂对来测量这些二聚体，这两种试剂对于每种二聚体的不同成分具有特异性一种试剂，这里称作裂解探针，具有裂解引发部分，其可以被引发以在其直接近程内裂解敏感键；以及另一种试剂，这里称作结合化合物，具有一种或多种分子标签，通过可由所述裂解引发部分裂解的连接物连接。根据该实施方式，这些不同成分无论何时形成二聚体，都在该裂解引发部分的有效裂解近程内引入了可裂解连接物，使得分子标签被释放。接着将释放的分子标签从反应混和物中分离并定量以测定二聚体的形成。
在本发明的另一个方面，参比测定了患者样品中的受体二聚体；即，二聚体的量是该二聚体中存在的一种成分的测量值与该二聚体的其它成分的总量测量值的比例，无论其是否存在于该二聚体中还是以单体的形式存在。在一个实施方式中，典型的测量值包括与特定分子标签相关的电泳图谱中锋值的峰高度或者峰面积。
在这种方式的一个特别的实施例中，本发明提供了一种通过同时测定来自于患者的固定组织样品中的多个Her受体二聚体的量，从而测定在该患者中癌症状态的方法。这些二聚体可以利用至少两种对每种二聚体的不同成分具有特异性的试剂来测定一种试剂，这里称作裂解探针，具有裂解引发部分，其可以被引发以在其直接近程内裂解敏感键；以及另一种试剂，这里称作结合化合物，具有一种或多种分子标签，通过可由所述裂解引发部分裂解的连接物连接。根据该实施方式，Her受体二聚体无论何时形成，都在该裂解引发部分的有效裂解近程内引入了结合化合物的可裂解连接物，使得分子标签被释放。接着将释放的分子标签从反应混合物中分离并定量以测定Her受体二聚体的数量。在这种方式的另一个实施方式中，测定了多个Her受体二聚体的有关量，并与患者的癌症状态相联系。癌症实例包括但不限于，乳腺癌、卵巢癌、以及前列腺癌。
本发明提供的生物标记包括对患者样品中受体复合物的测定值。特别地，可将受体复合物数量的图形与患者的疾病状态相关，并且在一些实施方式中，可将其与预后、二聚体作用药物的功效、以及患者对治疗的反应可能性相关联。根据本发明，通过直接测定患者样品中的受体复合物，可以克服现有技术中的缺点，无需培养或以其它方式处理细胞或组织样品，例如异种移植，那样会增加成本和工作量并且会给最终测定读数带来噪声和可能的假象。本发明还提供了一种对胞内受体的磷酸化，或其它的在样品制备过程中容易破坏的修饰物的替代性测量方法。该替代性测量方法是基于对复合物的测定，例如PI3K或SHC-受体复合物等等，它取决于对其形成的上述修饰，并且较少地受到样品制备过程的影响。
附图简述
图1A-1F表示使用可释放的分子标签来测定受体二聚体数量的图解。
图1G-1H表示使用可释放的分子标签来测定固定的组织样本中细胞表面受体复合物的图解。
图2A-2E表示本发明方法的实施例图解，其描绘了多个受体类型二聚体的相关量的图形。
图3A-3C表示将分子标签连接在抗体上的方法图解。
图4A-4E表示利用本发明的方法测定的SKBR-3和BT-20细胞裂解物的受体异型二聚体数据。
图5A-5C表示利用本发明的方法测定的人类正常和肿瘤乳腺组织样品的受体异型二聚体的数据。
图6A和6B表示本发明用于检测BT-20细胞裂解物中同型二聚体和Her1磷酸化的测定数据。
图7表示本发明测定MCF-7和SKBR-3细胞系的Her2同型二聚体数量的数据。
图8A-8B表示本发明检测对升高浓度的heregulin(HRG)发生应答的细胞上Her1和Her3异型二聚体的测定数据。
图9A和9B表示了在表皮生长因子(EGF)浓度升高的情况下，分别在22Rv1和A549细胞上的Her1-Her3异型二聚体的数量增加数据。
图10A-10C表示了人类乳腺组织的冷冻样品中IGF-1R和各种Her受体的异型二聚体的表达数据。
图11A-11D表示用于检测PI3激酶-Her3受体活化复合物的测定设计和试验结果。
图12A-12D表示用于检测Shc/Her受体-适配体复合物的测定设计和试验结果。
图13表示肿瘤细胞中Her2-Her3异型二聚体和PI3K/Her3复合物表达之间的相关性数据。
图14A-14B表示从正常乳腺组织样品和乳腺肿瘤组织样品中获得的Her1-Her2和Her2-Her3受体二聚体数量的测定值。
图15A-15G表示了在癌细胞系的固定球切片中的Her1-Her1和Her2-Her2同型二聚体以及Her1-Her2和Her2-Her3异型二聚体的测定值。
定义“抗体”是指能与另一个分子的特定空间和极性结构特异性地结合，并因此定义为与之互补的免疫球蛋白。抗体可以是单克隆或多克隆的，并能够用本领域熟知的技术制备，如免疫宿主并采集血清(多克隆)，或通过制备连续杂交的细胞系并收集分泌蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变型，所述核苷酸序列至少编码与天然抗体特异性结合所需的氨基酸序列。抗体可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各种类型和亚型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。抗体片段可包括Fab、Fv、F(ab’)2、Fab’等等。此外，适当时可以使用免疫球蛋白的聚集体、聚合物和偶联物或其片段，只要维持了对特定多肽的结合亲和力。免疫测定，包括采用可释放分子标签(如下所述)的这类测定，中使用的抗体的制造和选择指导性技术可以很容易地在教科书和手册中找到，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1988)；Howard和Bethell，Basic Methods in Antibody Production and Characterization(CRC Press，2001)；Wild主编，The Immunoassay Handbook(Stockton Press，New York，1994)，等等。
“抗体结合组合物”是指包括一个或多个抗体、或其片段的分子或分子复合物，并且其结合特异性来自于该抗体或抗体片段。抗体结合组合物包括但不限于，(i)抗体对，其中第一个抗体与靶分子特异性结合，第二个抗体与第一个抗体的恒定区特异性结合；生物素化抗体，其通过生物素部分(moiety)特异性结合于靶分子和链亲和素蛋白，其中该链亲和素的蛋白由诸如分子标签或光敏剂等等的部分衍化成；(ii)对靶分子特异并且与聚合物，如葡聚糖偶联的抗体，其中该聚合物是由诸如分子标签或光敏剂的部分衍化而成，其直接通过共价键连接或者间接通过链亲和素-生物素联接；(iii)对靶分子特异并与珠、微珠、或其它固相支持物偶联的抗体，其中该支持物直接或间接地由诸如分子标签或光敏剂的部分衍化而成，或者是含有后者的聚合物。
“抗原决定簇”，或“表位”是指分子，通常是蛋白质分子，表面上的位点，该位点能与单个的抗体分子结合；通常蛋白质具有几个或多个不同的抗原决定簇并能与多种不同的特异性抗体反应。优选的抗原决定簇为蛋白质的磷酸化位点。
“结合部分”是指能够特异性地与分析物结合、并且分子标签能够直接或间接地附着于其上的任何分子。结合部分包括但不限于，抗体、抗体结合组合物、肽、蛋白质、核酸，以及分子量达到1000道尔顿并且由选自以下物质构成的组中的原子所构成的有机分子氢、碳、氧、氮、硫和磷。优选地，结合部分为抗体或抗体结合组合物。
“癌症”和“癌的”涉及或描述了哺乳动物中典型地以无规则细胞生长为特征的生理状态。癌症实例包括但不限于，癌科、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、和白血病。这些癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠道癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头部和颈部癌症。
“复合物”在这里指的是直接或间接彼此接触的分子的集合体或聚集体。在一种方式中，“接触”或者更具体地说，“直接接触”涉及分子的复合物，或者涉及特异性或特异的结合，指的是两个或多个分子足够接近使得非共价的吸引作用，如范德华力、氢键、离子和疏水相互作用等等，为分子作用力的主导作用。在这种方式中，由于在测定条件下该复合物在热力学上比其组成分子的非聚集或非复合状态更为有利，因此该分子复合物较稳定。这里所使用的“复合物”通常涉及两种或多种蛋白质的稳定聚集体，还被等价地称为“蛋白-蛋白复合物”。最为典型的是，“复合物”涉及两种蛋白质的稳定聚集体。
“二聚体”涉及细胞表面膜受体，指两种或多种相同或不同的膜结合受体蛋白的复合物。相同受体的二聚体称为“同型二聚体”，不同受体的二聚体称为“异型二聚体”。二聚体通常由两种彼此接触的受体组成。二聚体可通过被动的过程，如范德华作用等等，如上在“复合物”的定义中所述，形成于细胞表面膜上，或者二聚体也可以通过主动的过程形成，例如通过配体引发的二聚化作用，共价连接，与胞内成分的相互作用等等，例如Schlessinger，Cell，103211-225(2000)。如这里所使用的术语“二聚体”应理解成指“细胞表面膜受体二聚体”，除非根据上下文有其它的理解。
“疾病状态”包括但不限于以下的特征染上疾病的可能性，疾病的存在与否，疾病严重性的预后，以及通过受体复合物作用的特殊治疗试剂引起的患者对治疗的反应可能性。至于癌症，“疾病状态”进一步包括对癌症前期或癌细胞或组织的检测，对病人的选择，其通过一种或多种受体复合物，如一种或多种受体二聚体，作用的治疗剂的治疗后的可能反应，以及这种治疗剂的改进治疗效果。在一种方式中，疾病状态涉及Her受体复合物，指癌症患者通过Her的二聚体作用药物，对治疗的反应可能性。优选地，这种癌症患者为乳腺癌或者卵巢癌患者，而这种Her二聚体作用药物包括OmnitargTM(2C4)，Herceptin，ZD-1839(Iressa)，以及OSI-774(Tarceva)。在另一个方面，涉及PDGFR受体复合物的疾病状态是指患上以不适当纤维化为特征的疾病的患者对于PDGFR二聚体作用药物治疗的反应可能性。优选的，这类疾病包括癌症和肾纤维化。在另一种方式中，涉及VEGF受体复合物的疾病状态是指患上以不适当血管生成，如固体肿瘤为特征的疾病的患者对于VEGF二聚体作用药物治疗的反应可能性。
“ErbB受体”或“Her受体”是属于ErbB受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(“Her1”)、ErbB2(“Her2”)、ErbB3(“Her3”)以及ErbB4(“Her4”)受体。ErbB受体通常包括可以连接ErbB配体的胞外区域；亲脂性跨膜区域；保守胞内酪氨酸激酶域；以及驻藏了数种可磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号域。ErbB受体可以是天然序列的ErbB受体或者是其氨基酸序列的变异体。优选该ErbB受体为人类ErbB受体的天然序列。在一种方式中，ErbB受体包括Her受体的截短形式，包括但不限于，EGFRvIII和p95Her2，在Chu等，Biochem.J.，324855-861(1997)；Xia等，Oncogene，23646-653(2004)；等等中有所公开。
术语“ErbB1”，“表皮生长因子受体”和“EGFR”以及“Her1”在这里可以互相替换使用，指天然序列EGFR，例如在Carpenter等，Ann.Rev.Biochem.56881-914(1987)中所公开，包括其变异体(例如，EGFR的缺失突变体，如Humphrey等，PNAS(USA)874207-4211(1990))。erbB1指编码EGFR蛋白产物的的基因。能结合EGFR的抗体实例包括MAb 579(ATCC CRL RB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCCCRL 8509)(参见美国专利No.4943533，Mendelsohn等)以及其变异体，例如chimerized 225(C225)以及重塑人类抗体225(H225)(参见WO 96/40210，Imclone Systems Inc)。
“Her2”、“ErbB2”、“c-Erb-B2”可以互相替换使用。除非另有说明，这里使用术语“ErbB2”、“c-Erb-B2”和“Her2”时是指人类蛋白质。该人类ErbB2基因和ErbB2蛋白质有例如，Semba等，PNAS(USA)826497-650(1985)和Yamanoto等，Nature 319230-234(1986)(Genebank登录号X03363)。与Her2特异性结合的抗体实例在美国专利5677171；5772997；Fendly等，CancerRes.，501550-1558(1990)等中有所公开。
“ErbB3”和“Her3”指受体多肽，例如在美国专利No.5183884和5480968以及Kraus等PNAS(USA)869193-9197(1989)中所公开，包括其变异体。能结合Her3的抗体实例在美国专利No.5968511中有所描述，例如8B8抗体(ATCC HB 12070)。
术语“ErbB4”和“Her4”这里指受体多肽，例如在欧洲专利申请No.599274；Plowman等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)；以及Plowman等，Nature，366473-475(1993)中所述，包括其变异体，如WO 99/19488中所公开的Her4异构型。
“胰岛素样生长因子-1受体”或“IGF-1R”指人类受体酪氨酸激酶，其大致与Ulrich等EMBO J.，52503-2512(1986)或Steele-Perkins等，J.Biol.Chem.，26311486-11492(1988)中所披露的那些相同。
“分离的”涉及多肽或蛋白质，是指基本上从其天然环境的成分中分离出。优选地，分离的多肽或蛋白质是一种与其天然环境成分相比由至少百分之八十重量的相同序列多肽或蛋白质构成的组合物；更优选地，该组合物与其天然环境成分相比由至少百分之九十五重量的相同序列的多肽或蛋白质构成，并且更优选地，该组合物与其天然环境成分相比由至少百分之九十九重量的相同序列的多肽或蛋白质构成。最优选地，该分离的多肽或蛋白质为均匀组合物，通过基于分子量和等电点的二维凝胶电泳的常规分离之后，其能够被分辨成单个的点。通过常规的二维凝胶电泳来进行这种分析的方案对本领域普通技术人员来说是公知的，例如，Hames和Rickwood主编，Gel Electrophoresis of ProteinsAPractical Approach(IRL Press，Oxford，1981)；Scope，Protein Purfication(Springer-Verlag，New York，1982)；Rabilloud主编，Proteome ResearchTwo-Dimensioned Gel Electrophoresis and Identification Methods(Springer-Verlag，Berlin，2000)。
“试剂盒”指的是运送用来实施本发明方法的材料或试剂的任何输送系统。就反应测定而言，这种输送系统包括可以从一个地点到另一个地点进行储藏、运送或交付反应试剂(例如，在适当容器中的探针、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲液，对实现测定的书面说明等)的系统。例如，试剂盒包括一个或多个装有相关反应试剂和/或支持材料的外包装(如盒子)。这些内容物可以一起或分别地交给预定的接受者。例如，第一个容器可含有测定中所用的酶，而第二个容器包含探针。
“百分比相同的”或类似术语在此涉及参照序列与另一序列(即“候选”序列)的比对，指在两个序列之间的最佳比对中，候选序列与相等标注百分含量的参照序列在许多亚单位位点上相同，所述亚单位对于多核苷酸的比对来说是核苷酸，对于多肽的比对来说是氨基酸。这里所使用的术语比对序列的“最佳比对”是指亚单元之间的最大匹配程度和构建比对中所采用间隙数量的最小化。百分相同比可以采用市场上可购得的算法工具来测定，该算法在Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443-453(1970)(Wisconsin Sequence Analysis Package“GAP”程序，Genetics Computer Group，Madison，WI)中有所描述。本领域中用于构建比对和计算百分相同比或其它相似性测量的其它软件包包括“BestFit”程序，基于Smith和Waterman的算法，Advances in AppliedMathematics，2482-489(1981)(Wisconsin Sequence Analysis Package，Genetics Computer Group，Madison，WI)。换句话说，例如，为获得具有与参照氨基酸序列至少95％相同氨基酸序列的多肽，该参照序列中有多达5％的氨基酸残基可以缺失或被另一氨基酸所取代，或者占参照序列总氨基酸残基数目5％的氨基酸可以插入该参照序列中。参照序列的这些变换可能发生在该参照氨基酸序列的氨基或者羧基端位点处或者那些端点位置之间的任何位置，或者单个地散布在作为整体的参照序列的残基中间，或者以较邻近基团的形式散布在该参照序列中。应当明白，在与本发明的参照序列进行比对时，候选序列可以为较大多肽或多核苷酸的组分或片段，并且为计算百分相同比目的进行的这种比对涉及相关的组分或片段。
“磷脂酰肌醇3激酶蛋白”或者等同的“PI3K蛋白”指人类蛋白质组中的一种人类胞内蛋白，NCBI登录号NP_852664、NP_852556和NP_852665，以及氨基酸序列基本与之相同的蛋白质。
“血小板衍生生长因子受体”或者“PDGFR”指与PDGFRα或PDGFRβ或其变异体基本上相同的人类受体酪氨酸激酶蛋白，在Heldin等，PhysiologicalReviews，791283-1316(1999)中有所描述。在一种方式中，本发明包括通过测定以下组中的一种或多种二聚体来确定癌症状态，癌症早期状态，纤维化或硬化状态PDGFRα同型二聚体、PDGFRβ同型二聚体以及PDGFRα-PDGFRβ异型二聚体。特别是，纤维化条件包括肺或肾纤维化，硬化状态包括动脉硬化症。癌症包括但不限于，乳腺癌、直肠癌、成胶质细胞瘤以及卵巢癌。单独涉及“PDGFR”时应理解成指“PDGFRα”或“PDGFRβ”。
“多肽”是指由氨基酸残基组成的一类化合物，氨基酸残基通过酰氨键去除了一个氨基酸羧基和另一个氨基酸氨基之间的水的而化学连接在一起。多肽是氨基酸残基的聚合体，它可以含有大量的这种残基。通常，除了由较少数量的氨基酸所组成以外，肽与多肽类似。肽有时被称作寡肽。多肽和肽之间没有明确的区分。为了方便起见，在此公开说明和权利要求中，术语“多肽”一般将用于指肽和多肽。氨基酸残基可以是天然的或合成的。
“蛋白质”指多肽，通常由生物细胞合成，折叠成固定的三维结构。蛋白质的分子量通常在大约5,000至大约5,000,000或以上，更常见在大约5,000至大约1,000,000的分子量，并且可包括翻译后的修饰，如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰氨化、共价连接核黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、法尼基化(farnesylation)、脱甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸化合物、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚、羧基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、selenoylation、硫酸化，以及泛醌化，如Wold，F.的Post-translationalProtein ModificationsPerspectives and Prospects，1-12页，B.C.Johnson主编，Academic Press，New York，1983。蛋白质包括，例如而并非限制，细胞因子或白介素，酶如激酶、蛋白酶、半乳糖苷酶等等，鱼精蛋白，组蛋白，白蛋白，免疫球蛋白，硬蛋白，磷蛋白，粘蛋白，色蛋白，脂蛋白，核蛋白，糖蛋白，T-细胞受体、蛋白多糖等等。
“标准样品”指代表正常或非疾病状态的一种或多种细胞、异种移植物、或组织样品，将患者样品的测量值与其对照以确定受体复合物的存在是否过量或者在患者样品中的存在量减少。标准样品的性质对于特定的测定来说是设计选择的问题，可以从患者自己的正常组织中获得或测得，或者从健康个体的人群的组织中获得。优选地，标准样品中涉及受体复合物量的值是在与被测患者样品中相应值基本上相同的实验条件下获得的。标准样品可以来自与患者样品同种的组织，或者可以来自不同的组织类型，并且用以获得该标准样品组织的人群可以选择与患者具有相符合的特征，例如年龄、性别、种族等等。典型地，在本发明的测定中，将患者样品中受体复合物的量与标准样品中相应的值相比较，该标准样品预先制成表格并提供平均范围、平均值和标准偏差，或类似表示方式。
“受体复合物”指包括至少一种细胞表面膜受体的复合物。受体复合物可包括细胞表面膜受体的二聚体，或者一种或多种胞内蛋白，例如适配体蛋白，其在各种信号通路中形成连接。属于受体复合物的一部分的胞内蛋白实例包括但不限于，PI3K蛋白、Grb2蛋白、Grb7蛋白、Shc蛋白以及Sos蛋白、Src蛋白、Cbl蛋白、PLCγ蛋白、Shp2蛋白、GAP蛋白、Nck蛋白、Vav蛋白、以及Crk蛋白。在一种方式中，受体复合物包括PI3K或者Shc蛋白。
“受体酪氨酸激酶”或者“RTK”指具有胞内激酶活性并且选自蛋白质RTK家族的人类受体蛋白，如Schlessinger，Cell，103211-225(2000)；和Blume-Jensen与Hunter(引用见上)中所述。“受体酪氨酸激酶二聚体”指细胞表面膜中包括两种受体酪氨酸激酶蛋白的复合物。在一些方式中，受体酪氨酸激酶二聚体可包括两种共价连接的受体酪氨酸激酶蛋白。RTK二聚体的实例列于表I中。特别受到关注的RTK二聚体有Her受体二聚体和VGEFR二聚体。
“样品”或“组织样品”或“患者样品”或“患者细胞或组织样品”或“样本”都是指从受试者或患者的组织中获得的相似细胞集合。组织样品的来源可以是固体组织，如来自于新鲜、冷冻和/或防腐的器官或组织样品或活检或吸入气；血液或任何血液成分；体液例如脑脊液、羊水、腹水、或者组织液；或者是来自于受试者怀孕或成长中任何时期的细胞。组织样品可包含与该组织非自然混合的化合物，其本质是例如防腐剂、抗凝血剂、缓冲液、固定剂、营养物、抗生素等等。在本发明的一种方式中，组织样品或患者样品为固定的，特别是常规的福尔马林固定的石蜡包埋样品。这些样品典型地用在对固定组织的薄切片形式的受体复合物测定中，例如3-10μm厚，其中该固定组织设置在显微镜载玻片，或等同物的表面上。这些样品还典型地经过常规的再水合过程，并且可选择地，进行了抗原修复过程作为测定试验预处理过程的一部分。
“分离图像”(separation profile)涉及分子标签的分离，是指表、图、曲线、柱形图，或者其它表示信号强度数据与有关分子标签的参数例如停留时间、质量等之间关系的方法，它提供了测定试验中产生的各种类型分子标签的数量读数或测量值。分离图像可以是电泳图谱、色谱图、电色谱图、质谱图，或类似的根据所采用的分离技术的数据图形表示。涉及分离图像的“峰”或“带”或“区”是指分离化合物所集中的区域。一个测定试验可能有多个分离图表，例如，当不同的分子标签具有独特发射光谱的不同荧光标记，并且在多个波长下采集和记录数据时。在一种方式中，所释放的分子标签由于电泳迁移率的差异而形成电泳图谱从而被分离，其中不同的分子标签对应于电泳图谱上不同的峰。电泳图谱中对不同或者较少重叠的相邻峰值的测量值即为“电泳分辨率”，它可被视为相邻峰值最大值之间的距离除以该峰值的两个标准偏差中较大值的4倍。优选地，相邻峰值的分辨率至少为1.0，更优选至少为1.5，最优选至少为2.0。在给定的分离和检测系统中，所需的分辨率可通过选择多个分子标签来获得，这些分子标签成分的电泳迁移率至少有分辨峰数量的区别，该数量依赖于几个本领域普通技术人员公知的因素，包括信号检测系统，荧光部分的性质，标签的扩散系数，筛选基质的存在与否，电泳设备的特性，例如有无通道、分离通道的长度等等。利用分析程序可以分析电泳图谱，从而与分子标签的存在、不存在或者数量的数据特征相关联，该程序例如在William等人的美国专利公开2003/0170734A1中所披露。
“SHC”(代表“Src同源2/α-胶原蛋白有关的”)指与Pelicci等在Cell，7093-104(1992)中所述基本相同的、RTK信号通道中的适配体蛋白家族(66，52和46kDalton)中的任何一个。在一种方式中，SHC指这种适配体蛋白的人类形式。
“信号通道”或者“信号传导通道”指一系列的分子活动，其开始通常是细胞表面受体与胞外配体的相互作用或者胞内分子与细胞表面受体的磷酸化位点相结合，其触发了一系列的分子相互作用，其中这一系列的分子相互作用导致了对细胞核中基因表达的调控。“Ras-MAPK通道”指的是一种信号通道，其包括在形成Ras-GTP复合物之后对MAPK蛋白的磷酸化。“PI3K-Akt通道”指的是一种信号通道，其包括通过PI3K蛋白对Akt蛋白的磷酸化。
“特异”或“特异性”涉及一个分子与另一个分子的结合，例如对靶分析物或复合物的结合化合物或探针，指的是探针与靶之间的识别、接触并形成稳定的复合物，同时该探针与其它的分子基本上较少地识别、接触或形成复合物。在一种方式中，“特异”涉及第一分子与第二分子相结合，是指第一分子与反应或样品中的另一分子进行识别并形成复合物的程度，其能与该第二分子形成最大数量的复合物。在一种方式中，该最大数量至少占第一分子所形成全部这种复合物的50％。一般来说，涉及特异性结合过程的分子在其表面或空穴中有一些区域，能在彼此结合的分子之间产生特异的识别。特异性结合的实例包括抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸中形成双重体或三重体、受体-配体相互作用等等。
“光谱分辨的”涉及多个荧光标记，指该标记的荧光发射波段足够明显，即足以不发生重叠，使得各标记物连接的分子标签可以根据相应标记物所产生的荧光信号通过标准光电检测系统来区分，例如，采用带通滤波器和光电倍增管等等，如示例性地描述于美国专利No.4230558；4811218等等，或者Wheeless等，21-76页，in Flow CytometryInstrumentation and Data Analysis(AcademicPress，New York，1985)。
“基本相同”涉及被比对的蛋白质或者相关蛋白质家族中的蛋白质氨基酸序列，指的是或者一种蛋白质的氨基酸序列有至少百分之五十与另一种蛋白质相同，或者一种蛋白质是另一种蛋白质相同基因的异构型或剪接变异体。在一种方式中，基本上相同指一种蛋白质，或其氨基酸序列，与另一种蛋白质或其氨基酸序列有至少百分之八十相同。
这里所使用的“VEGF受体”或“VEGFR”涉及血管内皮生长因子(VEGF)的细胞受体，是一种存在于血管内皮细胞上，以及保持有结合人类VEGF能力的其变异体上的常见的细胞表面受体。VEGF受体包括VEGFR1(也叫作Flt1)、VEGFR2(也叫作Flk1或KDR)和VEGFR3(也叫作Flt4)。这些受体描述于DeVries等，Science 255989(1992)；Shibuya等，Oncogene 5519(1990)；Matthews等，Proc.Nat.Acad.Sci.889026(1991)；Terman等，Oncogene61677(1991)；Terman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1871579(1992)。VEGF受体二聚体公开于Shibuya，Cell Structure and Function，2625-35(2001)；和Ferrara等，Nature Medicine，9669-676(2003)。在一种方式中，本发明包括评价异常的血管生成，或者以异常血管生成为特征的疾病，其中测量了一种或多种以下组中的二聚体VEGFR1同型二聚体，VEGFR2同型二聚体、VEGFR1-VEGFR2异型二聚体，和VEGFR2-VEGFR3异型二聚体。
发明详述本发明提供了一种用细胞表面受体复合物作为生物有机体特别是人类中疾病状态或其它生理状态的生物标记的方法。在一种方式中，直接测定来自于患者样品的受体复合物；也就是说，进行测量而不作培养，形成异种移植物，或类似的技术，这需要额外劳动和费用并且可能在测量中引入假象和/或噪声。在本发明的一个特别方面，直接在冷冻患者样品的组织裂解物或者固定患者样品的切片上测定一种或多种受体复合物。在优选实施例中，在福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)样品切片中测定一种或多种受体复合物。
在另一种方式中，本发明提供了一种间接测量受体磷酸化的方法，通过测定其形成依赖于这种翻译后修饰的复合物而实现。
在一种方式中，在同一测定反应混合物中同时测定了多个ErbB受体复合物，例如受体二聚体。优选地，采用连接着一个或多个可释放分子标签的结合化合物来测定该复合物，这样在结合了复合物中的蛋白质之后，该分子标签可以从反应或测定混合物中释放和分离出来用以检测和/或定量。
在一种方式中，本发明提供了一种测定患者疾病状态的方法，包括以下步骤测定一种或多种受体二聚体在患者样品中每种的量；将该每种的量与其标准样品中的相应量相比较；以及将患者样品中的量与标准样品中的各相应量之差与患者疾病状态的存在或严重性相关联。在优选实施例中，测定步骤包括(i)提供一种或多种结合化合物，其对一种或多种受体二聚体的每种中的蛋白质具有特异性，使得每种结合化合物具有一种或多种分子标签，分别通过可裂解连接物连接于其上，并且使该一种或多种分子标签连接着具有不同分离特性的不同结合化合物，这样通过将分子标签从不同的结合化合物上分离，而形成了分离图像上的独特峰；(ii)将该结合化合物与一种或多种复合物混合，使得结合化合物特异性地结合于其相应的受体二聚体从而形成可检测的复合物；(iii)裂解形成可检测的复合物的每种结合化合物的可裂解连接物，以及(iv)分离和鉴定所释放的分子标签以测定该一种或多种受体二聚体的存在与否或者含量。
在另一种方式中，测定一种或多种类型的受体二聚体的量的方法包括以下步骤i)向一种或多种类型的受体二聚体的每种提供裂解探针，其对所述一种或多种受体二聚体的每种的第一受体具有特异性，各裂解探针具有有效近程的裂解引发部分；(ii)提供一种或多种结合化合物，其对所述一种或多种受体二聚体的每种的第二受体具有特异性，使每种结合化合物具有一种或多种分子标签，分别通过可裂解连接物连接与其上，并且使所述一种或多种分子标签连接着具有不同分离特性的不同结合化合物，这样通过将分子标签从不同的结合化合物上分离，而形成了分离图像上的独特峰；(iii)将裂解探针、结合化合物与所述一种或多种类型的受体二聚体混合，使得裂解探针特异性地结合于受体二聚体的第一受体，而结合化合物特异性地结合于受体二聚体的第二受体，这样结合化合物的可裂解连接物处于裂解探针裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及(iv)分离和鉴定所释放的分子标签以测定该一种或多种类型的受体二聚体的存在与否或者含量。优选地，受体二聚体和第一与第二受体选自表I中列的受体二聚体。
在本发明的另一种方式中，从患者获得生物样品，其中包括怀疑含有稀少目标细胞的混合细胞群体。接着通过将该生物样本与偶联生物特异性配体的磁性颗粒混合来制备样品，所述生物特异性配体能与所述稀少细胞上不同于或不存在于血细胞上的抗原特异性反应(这里称为“捕获抗原”)，这样可以基本去除其它的样品成分。使样品处于磁场中，该磁场可有效地分离磁性颗粒标记的细胞，包括所述稀少的目标细胞，如果其存在于样本中的话。然后采用对生物标记特异的结合部分所偶联的分子标签来分析上述分离的细胞群体，以检测稀少细胞的存在与否和/或数量。在优选实施方式中，该方法中使用的磁性颗粒为胶体磁性纳米颗粒。优选地，该稀少细胞群体为循环上皮细胞，其可以利用上皮特异性捕获抗原从患者血液中分离，该抗原例如以下文献中所公开Hayes等，Internation J.of Oncology，211111-1117(2002)；Soria等，Clinical Cancer Research，5971-975(1999)；Ady等，British J.Cancer，90443-448(2004)；其均引入作为参考。特别地，可采用单克隆抗体BerEP4(Dynal A.S.，Oslo，Norway)通过磁性颗粒来捕获人类表皮细胞。
在另一种方式中，本发明提供了一种测定患者癌症状态的方法，包括以下步骤(i)通过将患者血液样品与一种或多种抗体组合物接触来免疫磁分离含有循环上皮细胞的患者样品，每种抗体组合物对捕获抗原具有特异性并连接着磁性颗粒；(ii)测定患者样品中一种或多种受体复合物每种的量；将每种这些量与其对应的标准样品中的量相比较；并将患者样品中的量与标准样品中的各相应量之差与患者癌症状况的存在性或严重性相关联。在优选的实施例中，测量方法包括步骤(i)提供一种或多种结合化合物，其对一种或多种受体复合物的每种中的蛋白质具有特异性，使得每种结合化合物具有一种或多种分子标签，分别通过可裂解连接物连接于其上，并且使该一种或多种分子标签连接着具有不同分离特性的不同结合化合物，这样通过将分子标签从不同的结合化合物上分离，而形成了分离图像上的独特峰；(ii)将该结合化合物与一种或多种受体复合物混合，使得该结合化合物特异性地结合于该一种或多种受体复合物中的相应蛋白从而形成可检测的复合物；(iii)裂解形成可检测的复合物的每种结合化合物的可裂解连接物，以及(iv)分离和鉴定所释放的分子标签以测定该一种或多种受体复合物的存在与否或者含量。
在另一种方式中，测定一种或多种受体复合物量的方法包括以下步骤i)向一种或多种受体复合物的每种提供裂解探针，其对所述一种或多种受体复合物的每种的第一蛋白具有特异性，各裂解探针具有有效近程的裂解引发部分；(ii)提供一种或多种结合化合物，其对所述一种或多种受体复合物的每种的第二受体具有特异性，使每种结合化合物具有一种或多种分子标签，分别通过可裂解连接物连接与其上，并且使所述一种或多种分子标签连接着具有不同分离特性的不同结合化合物，这样通过将分子标签从不同的结合化合物上分离，而形成了分离图像上的独特峰；(iii)将裂解探针、结合化合物与一种或多复合物混合，使得裂解探针特异性地结合受体复合物的第一蛋白，而结合化合物特异性地结合受体复合物的第二蛋白，这样该结合化合物的可裂解连接物处于裂解探针裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及(iv)分离和鉴定所释放的分子标签以测定该一种或多种受体复合物的存在与否或者含量。
受体二聚体生物标记和二聚体作用药物实例本发明的生物标记包括以下受体的二聚体和寡聚体。
表I.
细胞表面膜的受体复合物实例二聚体 二聚体
投入使用或正在开发的许多药物的作用机理需要抑制受体二聚体的一种或多种功能，例如受体成分结合成二聚体结构，或者基于二聚化作用的功能，如酶活性，例如激酶活性，或自体磷酸化。这种药物在此被称为“二聚体作用”药物，或者“二聚作用”药物。正在治疗或完成治疗的患者细胞中的受体二聚体的数量、类型、形成、和/或分解与使用特定的二聚体作用药物的效果或适用性有关。下面的受体二聚体是与所示药物有关的生物标记。在一种方式中，本发明为监控二聚体作用药物对疾病状态的效果提供了生物标记。
表II.
与细胞表面膜的二聚体有关的药物二聚体 药物
以下文献中描述了表II中所列的二聚体作用药物Traxler，Expert Opin.Ther.Targets，7215-234(2002)；Baselga主编，OncologyBiotherapeutics，21-36(2002)；Nam等，Current Drug Targets，4159-179(2003)；Seymour，Current Drug Targets，2117-133(2001)；等等。
表IIIPI3K相关的受体复合物二聚体 二聚体
样品制备含有分子复合物的样品可以广泛地来自于适用于本发明的各种来源，从而使受体复合物的数量与疾病状态或健康状态相关，包括细胞培养物、动物或植物组织、患者活组织切片等等。优选地，样品为人类患者样品。可利用常规的技术来制备样品用于本发明的测定，所用技术可根据取得样品的来源确定。
A.固体组织样品。对于活检和医学样本来说，以下参考文献中提供了技术指导Bancroft JD & Stevens A主编，Theory and Practice of HistologicalTechniques(Churchill Livingstone，Edinburgh，1977)；Pearse，Histochemistry.Theory and applied.第四版(Churchill Livingstone，Edinburgh，1980)。
在癌症状态区域中，可以采用的患者组织样品实例包括但不限于，乳腺、前列腺、卵巢、结肠、肺、子宫内膜、胃、唾液腺、或胰腺。所述组织样品可通过多种方法获得，包括但不限于，外科切除、抽吸或活组织切片。组织可以是新鲜的或者是冷冻的。在一个实施例中，本发明的测定是在固定并用石蜡或类似物包埋的组织样品上实施的；因此，在该实施例中，要进行脱去石蜡的步骤。组织样品可以通过常规的方法固定(即防腐)[参见例如，“Manual of HistologicalStaining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，第3版(1960)，Lee G.Luna，HT(ASCP)主编，The Blakston Division McGraw-HillBook Company，New York；The Armed Forces Institute of Pathology AdvancedLabotatory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Miked主编，Armed Forces Institute of Pathology，American Registry ofPathology，Washington，D.C.。本领域技术人员应当明白，固定剂的选择是根据被组织染色或作其它分析所用的组织的用途来决定的。本领域技术人员还应当明白，固定的长度取决于组织样品的尺寸和所使用的固定剂。实例中，可用中性缓冲液福尔马林、布安氏液或多聚甲醛来固定组织样品。
一般来说，首先固定组织样品，然后通过递增系列的乙醇脱水，用石蜡或其它切片介质渗透和包埋，使该组织样品形成切片。或者，可以将组织进行切片并固定所获得的切片。实例中，可用常规的方法在石蜡中包埋和处理该组织样品(参见例如，“Manual of Histological Staining Method of the Armed ForcesInstitute of Pathology”，supra)。可使用的石蜡实例包括但不限于，Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦组织样品被包埋后，该样品就可通过显微切片机或类似仪器进行切片(参见例如，“Manual of HistologicalStaining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，supra)。该方法实例中，切片厚度可在大约三微米至大约十二微米的范围内，优选地，厚度在大约5微米至大约10微米的范围内。在一种方式中，切片面积可以从大约10mm2至大约1cm2。一旦切片之后，可通过一些标准的方法将该切片加到载玻片上。载玻片粘合剂的实例包括但不限于硅烷、凝胶、聚-L-赖氨酸等等。实例中，可将该石蜡包埋的组织粘贴到带正电的载玻片上和/或涂附有聚-L-赖氨酸的载玻片上。
如果使用了石蜡作为包埋材料，该组织切片一般来说要脱去石蜡并与水进行再水合。该组织切片可通过几种常规的标准方法来脱去石蜡。例如，可采用二甲苯和逐渐递减系列的乙醇(Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology”，supra)。或者，可采用市场上可购买到的脱石蜡无机试剂，如Hemo-De(CMS，Houston Tex.)。
对于哺乳动物的组织培养细胞、新鲜组织或类似来源来说，可以通过常规的细胞裂解技术来制备样品(例如0.14M NaCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris-Cl(pH 8.6)，0.5％Nonidet P-40以及所需的蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂)。对于新鲜的哺乳动物组织来说，样品的制备还可以包括组织解聚步骤，例如破碎、剁碎、研磨、超声处理等等。
B.细胞的磁性分离。在一些应用中，例如在测定来自于患者血液的稀少转移性细胞上的二聚体时，可以在进行表面受体二聚体数量测定之前实施一个富集的步骤。可以利用各种本领域已知的技术和材料来进行免疫磁性分离或者富集过程，如以下代表性参考文献中所公开，引入其作为参考Terstappen等的美国专利6365362；Terstappen等的美国专利5646001；Rohr等的美国专利5998224；Kausch等的美国专利5665582；Kresse等的美国专利6048515；Kausch等的美国专利5508164；Miltenyi等的美国专利5691208；Molday的美国专利4452773；Kronick的美国专利4375407；Radbruch等，Methods in CellBiology，Vol 42中第23章，(Academic Press，New York，1994)；Uhlen等，Advances in Biomagnetic Separation(Eaton Publishing，Natick，1994)；Safarik等，J.Chromatography B，72233-53(1999)；Miltenyi等，Cytometry，11231-238(1990)；Nakamura等，Biotechnol.Prog.，171145-1155(2001)；Moreno等，Urology，58386-392(2001)；Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.，954589-4594(1998)；Zigeuner等，J.Urology，169701-705(2003)；Ghossein等，Seminars in Surgical Oncology，20304-311(2001)。
优选用于实施本发明的磁性颗粒是性质如胶体的颗粒。这种颗粒的特征在于其亚微密级的颗粒尺寸，通常小于大约200纳米(nm)(0.20微米)，并且其稳定性对于溶液中的重力分离能持续较长时间。除了许多其它的优点之外，该尺寸范围还使其对于细胞分析中常用的分析技术来说基本上不可见。预计在90-150nm范围内并且磁质量在70-90％之间的颗粒适用于本发明。适合的磁性颗粒由周围围绕着分子的超顺磁性材料晶核构成，该分子例如通过物理吸附或共价连接而结合到磁性核心上并赋予其稳定的胶体特性。涂覆材料优选的施加量应有效地防止生物样品中的生物大分子与磁性核心之间的非特异性相互作用。这种生物大分子可包括非目标细胞表面上的唾液酸残基、外源凝集素、糖蛋白以及其它的膜成分。此外，该材料应当包含尽可能多的磁质量/纳米颗粒。包括核心的磁性晶体尺寸应足够小使其不含有完整的磁畴。纳米颗粒的尺寸足够小使得其布朗能量超过了其磁矩。结果，这些胶体磁性颗粒几乎不出现北极、南极的对齐以及之后的相互吸引/排斥作用，甚至于在适度强大的磁场下也是，这有助于其溶液的稳定性。最后，该磁性颗粒应当可在高磁场梯度的外部场分离器中被分离。该特征有利于样品处理，并且具有比加载铁磁性珠或钢丝绒的较复杂内部梯度柱更经济的优点。具有上述特性的磁性颗粒可以通过美国专利No.4795698、5597531、5698271中所述的基本材料来制备，引入这些专利作为参考。
采用可释放分子标签的测定试验采用可释放分子标签来测定二聚体的数量具有许多优点，包括(1)从测定混合物中分离所释放的分子标签可以大大降低本底和显著提高灵敏度；以及(2)使用为简化分离和检测过程而特别设计的分子标签提供了便利的多元化性能，这样很容易在同一测定中同时测得多个受体复合物成分。采用了这种标签的测定可具有多种形式并在以下参考文献中所公开Singh等的美国专利6627400；Singh等的美国专利公开2002/0013126；以及2003/0170915，和Williams等的2002/0146726；和Chan-Hui等的国际专利公开WO2004/011900，所有文献在此引入作为参考。例如，可采用根据被分离分子之间的物理、化学或光学特性差异来区分分子的多种分离技术，所述特性包括但不限于电泳迁移率、分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、荷/质比、极性等等。在一种方式中，多个或一组分子标签在电泳迁移率和光学检测特性上有所不同，因而通过电泳来分离。在另一种方式中，多个或一组分子标签可以在分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性上有所不同，因而通过正相或反相HPLC、离子交换HPLC、毛细管电泳、质谱法、气相色谱法等等技术来分离。
提供成组的分子标签，在其从结合化合物上释放之后通过分离技术分离成不同的带或峰。鉴定并定量这些峰可提供对受体二聚体种类和量的测定值或图像。一组分子标签可具有不同的化学性质；然而，为方便起见，成组的分子标签通常化学性质相关。例如，其可以都为肽，或者其可以由相同碱基构建区或单体的不同组合构成，或者其可以采用具有不同取代基的相同碱基骨架来合成以赋予不同的分离特性，如下面所详细描述。多个分子标签的数量根据一些因素可以有所不同，包括采用的分离模式，分子标签上使用的检测标记物，结合部分的灵敏度，裂解可裂解连接物的效率等等。在一种方式中，用于测定受体二聚体数量的多个分子标签的数量在2到10的范围内。在其它方式中，多个分子标签的数量可在2到8，2到6，2到4，或2到3的范围内。
可以在均匀相或非均匀，即多相的测定试验中检测受体二聚体。在均匀相中，不需要任何步骤来将特异性结合于靶复合物的结合化合物从未结合的结合化合物中分离。在优选实施例中，均匀相采用的试剂对包括(i)具有可释放分子标签的一种或多种结合化合物和(ii)能够产生活性物质的至少一个裂解探针，该活性物质可与分子标签反应并在该裂解探针的有效近程内释放分子标签。
受体二聚体还可以通过采用多相形式的测定试验来测定。多相技术通常涉及分离步骤，其中将具有特异性结合的结合化合物的胞内复合物从未结合的结合化合物中分离，并且可选择地从其它样品成分，如蛋白质、膜碎片等中分离出来。可以通过各种方式实现分离过程，例如采用结合着固相支持物的试剂，其可以区分出结合的复合物和未结合的结合化合物。固相支持物可以是容器壁，例如微滴定孔板的孔、毛细管、平板、载玻片、微珠，包括磁珠，脂质体等等。该固体支持物的主要特征是(1)可以分离结合与未结合的结合化合物，以及(2)不干扰结合化合物的形成，或者在测定受体二聚体时的其它操作。通常，在固定样品中，未结合的结合化合物通过洗涤可容易地去除掉。
在多相形式中利用分子标签检测时，在洗涤之后，可将样品与溶剂混合，在其中释放分子标签。根据可裂解键的性质和裂解方法，该溶剂中可含有用于裂解的任何附加试剂。在不需要裂解试剂的情况下，该溶剂可以方便地作为分离缓冲液，例如，电泳分离介质。例如，通过光敏剂产生的活性物质，该可裂解连接物具有光敏感性的或易分解性时，可以用适当波长的光照射该介质以将该分子标签释放到缓冲液中。
无论哪种形式下，如果测定反应的条件干扰了所采用的分离技术，则可能需要在裂解和分离分子标签之前去除或交换该测定反应缓冲液。例如，在一些实施例中，测定条件包括盐浓度(例如特异性结合所需的)，当分子标签在电泳迁移率基础上进行分离时，该盐浓度其会使分离的性能降低。在该实施例中，释放和分离分子标签之前，要用分离缓冲液或介质来替代测定缓冲液。
采用了可释放分子标签和裂解探针的测定试验根据被检测或测定的复合物可以制成多种不同的形式和构造。根据本公开说明书，对于本领域普通技术人员来说选择特定的结合化合物和裂解探针的数量和特异性是一种设计选择。
在本发明的一种方式中，图1A和1B表示了使用可释放分子标签来测定细胞表面膜二聚体的图解。将具有分子标签“mT1”和“mT2”的结合化合物(100)和具有光敏剂“PS”的裂解探针(102)与生物细胞(104)混合。具有分子标签“mT1”的结合化合物对细胞表面受体R1(106)具有特异性，具有分子标签“mT2”的结合化合物对细胞表面受体R2(108)具有特异性。细胞表面受体R1和R2在细胞表面膜(112)中作为单体，如(106)和(108)，和二聚体(110)存在。将这些测定成份在适当的结合缓冲液中温育之后，使得结合化合物与其相应的受体靶之间以及裂解探针与其受体靶之间形成了(114)稳定的复合物。如图所示，优选结合化合物和裂解探针分别包含抗体结合组分，其使得分子标签和裂解引发部分特异地靶向膜成分。在一种方式中，这种抗体结合组分为单克隆抗体。在这些实施例中，连接缓冲液可包含常规ELISA技术中使用的缓冲液，或类似物。结合化合物和裂解探针成为稳定的复合物(116)之后，照射(118)该测定混合物以引发光敏剂(120)产生单线态氧。单线态氧迅速地与测定混合物成分反应，这样其用于裂解分子标签的可裂解连接物的有效近程(122)受到空间上的限制，使得只有恰好在该有效近程内的分子标签被释放(124)。如图所示，只有那些与R1-R2二聚体和裂解探针形成稳定复合物的结合化合物上的分子标签被释放。将释放的分子标签(126)从测定混合物中去除并根据分离特性而分离(128)，这样在分离图像(132)中形成独特的峰(130)。根据本发明，该去除和分离可以是同一步骤。可选择地，在照射之前可以去掉该结合缓冲液并用更适合分离的缓冲液，即分离缓冲液代替。例如，结合缓冲液通常具有的盐浓度会降低一些分离技术，例如毛细管电泳，的性能从而影响分离分子标签以形成明显的峰值。在一些实施例中，这种缓冲液的交换可以通过膜过滤实现。
图1C表示了一个参比测定异型二聚体的实施例，其中采用了额外的结合化合物来测定样品中蛋白(1104)的总量。本发明的反应试剂(1122)包括(i)裂解探针(1108)、第一结合化合物(1106)和第二结合化合物(1107)，其中第一结合化合物(1106)对蛋白(1102)具有特异性，第二结合化合物(1107)对蛋白(1104)在与裂解探针(1108)特异性不同的抗原决定簇处具有特异性。在结合反应试剂之后，裂解探针(1108)被活化产生活性物质，其可以在光敏剂的有效近程内裂解该分子标签的可裂解连接物。在该实例中，分子标签从同时连接着反应试剂(1107)和(1108)蛋白(1104)的单体上，以及连接着试剂(1108)并单独或同时连接着试剂(1106)和(1107)的异型二聚体上释放出来。将释放的分子标签(1123)分离，分离图像(1126)中的峰(1118和1124)与所释放分子标签的量相关。在该实施例中，相关峰的高度或面积可以反映(i)第一和第二结合化合物对其相应抗原决定簇的亲和性差异，和/或(ii)对结合化合物具有特异性的抗原决定簇的存在与否。无论何时将结合化合物用于监测蛋白质的翻译后状态，如磷酸化状态，后一种情况都很重要。
对同型二聚体的测定可以如图1D中所示。如上所述，测定可包括三种反应试剂(1128)裂解探针(1134)、第一结合化合物(1130)和第二结合化合物(1132)。第一结合化合物(1130)和裂解探针(1134)被构建成对样品中以同型二聚体(1136)或单体(1138)形式存在(1140)的蛋白(1138)上相同的抗原决定簇(1135)具有特异性。在能促进反应试剂和其相应靶之间形成稳定复合物的条件下，反应试剂(1128)与样品混合之后，测定混合物中形成了多种复合物(1142至1150)。由于裂解探针(1134)和结合化合物(1130)特异于相同的抗原决定簇(1135)，反应试剂的四种不同组合(1144至1150)可形成具有同型二聚体的复合物。在测定混合物中的复合物中，只有那些(1143)同时具有裂解探针(1134)和至少一个结合化合物的复合物能够贡献出释放的分子标签(1151)用以分离和检测(1154)。在该实施例中，峰(1153)的大小与测定混合物中同型二聚体的量成正比，而峰(1152)的大小与测定混合物中蛋白(1138)的总量成正比，其既有单体形式(1142)又有同型二聚体形式(1146和1148)。图1E表示类似的测定用于在细胞表面膜(1161)中形成异型二聚体的细胞表面受体。本领域技术人员应当明白，二聚体可以在细胞或组织的裂解物中测定，或者可以在通过固定过程渗透或去除了细胞膜的固定样品中进行。在这种情况下，结合化合物可以对细胞表面膜受体的胞外或胞内区域具有特异性。
如图1E和1F中所示，可释放的分子标签还可以用于同时检测或测定细胞样品中的多种二聚体和胞内复合物。将细胞(160)，其可来自于体外培养或者来自于患者组织样本，裂解(172)以提供可接近的分子复合物，其连接着细胞膜和/或膜分子的细胞质区域内的翻译后修饰位点，如磷酸化位点。裂解之后，得到的裂解物(174)与包含多个裂解探针(175)和多个结合化合物(177)的测定试剂(176)混合。选择(178)测定条件使得试剂(176)与其相应的靶特异性结合，这样经过活化后，裂解引发部分的有效近程(180)内的可裂解连接物被裂解，并释放出(182)分子标签。如上所述，裂解之后，将释放的分子标签分离(184)并在分离图像(186)如电泳图谱中进行鉴定，并根据所测得的分子标签数和量来获得样品细胞中选定分子复合物的图像。
图1G和1H表示了本发明测定固定或冷冻的组织样品中受体复合物的实施例。将固定的组织样品(1000)，例如福尔马林固定的石蜡包埋样品，利用显微切片机或类似仪器切割获得切片(1004)，放置在表面(1006)如显微载玻片上之后，进行脱蜡和再水化以便加入测定试剂。放大图(1007)表示了部分(1014)显微载玻片(1006)上的部分(1008)切片(1004)。所示的受体二聚体分子(1018)被包埋在固定样品的残余膜结构(1016)中。根据本发明的这种方式，裂解探针和结合化合物与固定样品一起温育，使得它们与其靶分子结合。例如，裂解探针(1012)(图中表示为连接着光敏剂(“PS”)的抗体)与第一结合化合物(1010)(表示为连接着分子标签“mT1”的抗体)特异性地结合着通用于所有所示二聚体的受体(1011)，第二结合化合物(1017)(具有“mT2”)特异性地结合着受体(1015)，以及第三结合化合物(1019)(具有“mT3”)特异性地结合着受体(1013)。洗涤以去除未特异性结合其相应靶分子的结合化合物和裂解探针之后，加入缓冲液(1024)(图中称为“照射缓冲液”)。为方便起见，可通过在载玻片(1006)上形成疏水性载体，例如用蜡笔，将缓冲液(1024)包含在切片(1004)或其一部分上。照射光敏剂并释放分子标签(1026)之后，将当前含有释放的分子标签(1025)的缓冲液转移到分离装置中，例如毛细管电泳仪，用以在例如电泳图谱(1030)中分离(1028)和鉴别所释放的分子标签。
对直接在组织样品上进行的测定，尤其如图1G和1H所示，可以进行标准化处理，其包括测定对样品中总细胞数和/或样品中特性亚型的细胞具有代表性的靶细胞或组织。优选甚至必须进行额外的测定，因为患者样品，尤其是肿瘤样品中的细胞和组织具有不均匀性，其可能包含正常细胞的基本片段。例如，图1H中，受体(1011)的总量值可作为以下两个测量值的比例给出分子标签(“mT1”)的峰(1032)面积和与样品中所有细胞共有的细胞或组织成分，如微管蛋白，有关的分子标签的相应峰面积。在一些情况下，样品中所有细胞都是上皮细胞时，可以采用细胞角蛋白。因此，基于可释放分子标签的方法可以包括额外的步骤，即提供特异于标准化蛋白如微管蛋白的结合化合物(具有独特的分子标签)。
图2A-2E表示了本发明的另一个实施例，用于描绘多个受体类型之间的二聚化过程。图2A概括了该测定试验的基本步骤。用于细胞表面受体二聚体检测的细胞膜(200)与几组结合化合物(202)和(204)以及裂解探针(206)混合。膜碎片(200)在其细胞膜中含有三种不同类型的单体受体分子(“1”、“2”和“3”)，其结合形成三种不同的异型二聚体1-2、1-3和2-3。三种抗体试剂(202)和(204)与膜碎片(200)结合，每种抗体试剂对三种受体分子中的一种具有结合特异性，其中抗体(206)特异于受体分子1，抗体(204)特异于受体分子2，而抗体(202)特异于受体分子3。第一受体分子的抗体共价偶联于光敏剂分子，标记为PS。第二和第三受体分子的抗体连接着两种不同的标签，分别标记为T2和T3，通过可被光敏剂部分产生的活性物质裂解的连接物连接。
混合之后，使抗体结合(208)膜表面上的分子。光敏剂被活化(210)，裂解敏化剂分子起作用距离内的标签和抗体之间的连接物，从而将标签释放到测定介质中。然后将反应中的物质分离(212)，例如通过毛细管电泳，如图所示。如图2A底部所示，标签T2和T3被释放，通过电泳分离将出现两条与这些标签相应的带。由于设计的这些标签具有已知的电泳迁移率，因而每条带能够唯一地代表测定中所使用的一种标签。
如图2A所示，细胞膜中存在的三种异型二聚体中只有两种会同时结合含光敏剂的抗体和含标签的抗体，因此只有这两种物质会产生释放的标签。然而，需要多次试验来测定不同二聚体的相关量。图2B中列表提供了五种不同的测定组合。图2C表示每种测定组合物的结果。测定I表示全部测定的结果，如图2A所示。在测定II中，没有连接着光敏剂的受体分子1特异性抗体。该测定没有产生信号，表明测定I中获得的T2和T3信号需要光敏试剂。类似地，测定V表明标签信号需要存在膜。测定III和IV表明每种被标签的试剂不需要存在另一种被裂解。合在一起考虑这些结果时，可以推导出膜中存在的受体异型二聚体的存在和组合的结论，如图2C中所给出，即同时存在1-2和1-3异型二聚体。而且，通过每种标签的相对信号强度可以估计出每种异型二聚体的相对数量。
然而，根据该测定中使用的试剂组合不能得出2-3异型二聚体存在的结论。不会获得表示这种复合物的信号，无论该复合物是否存在，因为没有光敏试剂结合于其上。为了推导出三种单体每种可能的二聚体组合，要么必须使用能够定位到由单体1，2和/或3构成的每种可能的寡聚体上的第四种试剂，要么该试验中使用的三种结合试剂必须以不同的组合偶联到标签和敏化剂分子上。后一种方案如图2D和2E中所示。图2D左边的表格中列出了三种抗体试剂当中光敏剂和标签分布的三种可能的组合。第一种组合包括偶联到单体1特异性抗体上的光敏剂，其与图2A-2C所示使用的组合相同，并与图2C中的二聚体数量相图。第二种组合包括偶联到单体2特异抗体上的光敏剂，其数量图像得到与异型二聚体1-2加异型二聚体2-3相同的数目。第三种组合包括偶联到单体3特异抗体上的光敏剂，其数量图像得到与异型二聚体1-3和2-3相同的数目，如前两个组合所获得。可以结合这些结果以得到所有的异型二聚体数量图像，如图2E中所给出。
图2F表示用于测定含有共有成分受体的受体二聚体的相关量优选实施例。在该测定设计中，可根据该共有成分参比测量两种不同的受体二聚体(“1-2”(240)和“2-3”(250))，其中每种都含有共有成分“2”。所示的测定设计是用于测定包含受体“1”(222)和受体“2”(220)的受体异型二聚体(240)，以及包含受体“2”(220)和受体“3”(224)的受体异型二聚体(250)。该实施例的一个关键特征是裂解探针(227)对异型二聚体对的共有受体具有特异性。特异于受体“2”的结合化合物(228)提供了与测定中受体“2”总量相关的信号(234)，而特异于受体“1”的结合化合物(226)和特异于受体“3”的结合化合物(230)提供的信号(分别是232和236)分别与受体“1”和受体“3”的量相关，并且所述受体“1”和受体“3”仅仅存在于与受体“2”形成的异型二聚体中。图2F的设计可以推广到含有共有成分的两种以上的受体复合物中，仅需要加入特异于额外复合物成分的结合化合物。
A.结合化合物如上所述，提供含有多种不同结合化合物的混合物，其中每种不同的结合化合物具有一种或多种通过可裂解连接物连接的分子标签。结合化合物、可裂解连接物以及分子标签的性质可以在很大范围内变化。结合化合物可含有抗体连接组分、抗体、肽、针对细胞表面受体的肽或非肽配体、蛋白、寡核苷酸、寡核苷酸类似物如肽核酸，外源凝集素，或者其它的能够特异性结合或者与目标分析物形成稳定复合物，如蛋白质复合物，的分子实体。在一种方式中，结合化合物可用以下通式表示，包括一种或多种连接着结合部分的分子标签。
B-(L-E)k其中B为连接部分；L为可裂解连接物；E为分子标签。在均相测定中，可裂解连接物L可以为易氧化的连接物，更优选是能够被单线态氧裂解的连接物。部分“-(L-E)k”表示单个结合化合物可具有多个分子标签，通过可裂解连接物连接。在一种方式中，k是大于或等于一的整数，而在另一些实施例中，k可以大于几百，例如100至500，或者k大于几百并多达几千，例如500至5000。通常多个不同类型的结合化合物的每个都具有不同的分子标签E。可裂解连接物，例如易氧化连接物，与分子标签E通过常规的化学方法连接到B上。
优选地，B为特异性结合于靶，如靶蛋白的预定抗原决定簇，如细胞表面受体，的抗体结合组合物。这种组合物很容易由市场上可购买的抗体制得，其可以是单克隆和多克隆的，对目标蛋白质具有特异性。特别地，以下专利中公开了对表皮生长因子受体具有特异性的抗体，引入其作为参考5677171；5772997；5968511；5480968；5811098。美国专利6488390，这里引入作为参考，其公开了对G蛋白偶联受体CCR4具有特异性的抗体。美国专利5599681，这里引入作为参考，其公开了对蛋白质的磷酸化位点具有特异性的抗体。供应商如CellSignaling Technology(Beverly，MA)；Biosource International(Camarillo，CA)，和Upstate(Charlottesville，VA)，也提供对多种受体具有特异性的单克隆和多克隆抗体。
可裂解连接物L，实质上可以是任何化学连接基团，其可以在不降解所释放分子标签E的结构或影响其检测特性的条件下发生裂解。无论何时将裂解探针用于均向测定，可裂解连接物L都会被该裂解探针产生的裂解剂裂解，其中裂解探针在短距离中起作用使得仅在该裂解探针的直接近程中的可裂解连接物会发生裂解。典型地，这种试剂必须通过反应混合物发生物理或化学变化才能被活化，使得该试剂产生短暂的活性物质扩散到可裂解连接物处进行裂解作用。在均匀相中，裂解剂优选连接着结合部分，如抗体，其在活化之前使裂解试剂靶向特定的位点，该位点位于具有可释放分子标签的结合化合物的近程内。在该实施例中，裂解剂在此被称为“裂解引发部分”，其将在下面更为详细的论述。
在非均匀相中，由于特异性结合的结合化合物从未结合的结合化合物中分离出来，所以可以更广泛地选择使用可裂解连接物和连接试剂。可裂解连接物不仅包括容易与局部作用反应物质，如过氧化氢、单线态氧等起反应的连接物，也包括对整个反应混合物中的试剂不稳定的连接物，例如对碱不稳定的连接物、可光裂解的连接物、可由还原反应裂解的连接物、由氧化反应裂解的连接物、对酸不稳定的连接物、可由特异性蛋白酶裂解的肽键等等。参考文献中描述了许多这类连接物，包括Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第二版(John Wiley & Wons，New York，1991)；Hermanson，BioconjugateTechniques(Academic Press，New York，1996)；以及Still等的美国专利5565324。
在一种方式中，本发明可以采用市场上可购买的可裂解反应物体系。例如，可在抗体结合组合物与分子标签之间利用杂官能试剂引入二硫键连接物，这些试剂如N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、succinimidyloxycarbonyl-α-甲基-α(2-吡啶二硫代)甲苯(SMPT)等等，购自供应商如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)。以还原剂处理可以破坏通过这种连接物引入的二硫键，所述还原剂例如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、2-巯基乙醇、硼氢化钠等等。能有效裂解二硫键的还原剂的典型浓度在10到100mM的范围内。利用同双功能的NHS酯交联剂，二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)(购自Pierce)，其中含有容易被高碘酸钠裂解的顺-二醇(例如15mM高碘酸在生理pH下4小时)，可在抗体结合组合物与分子标签之间引入对氧化剂不稳定的连接物。含有酯化间隔物成分的连接物可以用强亲核试剂裂解，例如羟胺，例如0.1N羟胺，pH 8.5，37℃下3-6小时。通过同双功能的交联剂如购自Pierce(Rockford，IL)的乙二醇二(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)可以引入这种间隔物。例用砜基可引入对碱不稳定的连接物。可用于向可裂解连接物中引入砜基的同双功能的交联剂包括二[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]砜(BSOCOES)，和4，4-二氟-3，3-二硝基苯砜(DFDNPS)。裂解的碱性条件实例包括0.1M磷酸钠、加入Tris碱调节至pH 11.6，含有6M尿素、0.1％SDS，以及2mM DTT，37℃下温育2小时。可光裂解连接物包括Rothschild等的美国专利5986076中所公开的那些物质。
当L易被氧化时，L可以是硫醚或其硒类似物；或含有碳-碳双键的烯烃，其中双键裂解成含氧基团，释放出分子标签E。Singh等的美国专利6627400，Singh等的美国专利公开2002/0013126和2003/0170915，以及Willner等人的美国专利5622929中公开了易氧化连接物的例子，所有文献在此引入作为参考。
当通过气相色谱法或质谱法对多个分子标签进行分离时，分子标签E，在本发明中可包括电泳标记，如以下文献中所描述Zhang等，Biocon jugate Chem.，131002-1012(2002)；Giese，Anal.Chem.，2165-168(1983)；以及美国专利4650750；5360819，5516931，5602273等等。
分子标签E优选为对活性物质尤其是单线态氧稳定的，并且包含检测或报告基团的水溶性有机化合物。另外，E的大小和结构可以在很大范围内变化。在一种方式中，E的分子量在大约50至大约2500道尔顿范围内，更优选地，在大约50至大约1500道尔顿。E的优选结构在下面有更为详细的描述。E可包括检测基团用以产生电化学、荧光、或显色信号。在利用质量检测的实施例中，E可以不含用于检测目的的分离部分。优选地，检测基团产生荧光信号。
在许多量中选择分子标签应使得每个对于同一量中的其它成员来说都具有独特的分离特性和/或独特的光学特性。在一种方式中，色谱或电泳分离特性是在本领域常规的一套标准分离条件下的停留时间，所述条件例如压力、柱压、柱类型、移动相、电泳分离介质等等。在另一种方式中，光学特性为荧光特性，例如发射光谱、荧光寿命、给定波长或波段的荧光强度等等。优选地，荧光特性为荧光强度。例如，许多量中的每种分子标签可具有相同的荧光发光特性，但每种由于独特的保持时间而与其它的相区别开。另一方面，或者许多量中的两种或更多种的分子标签可具有相同的迁移率或停留时间，但它们具有独特的荧光特性，例如光谱分辨的发射光谱，这样许多量中的所有成员通过分子分离和荧光测定的组合而可以被区分开。
优选地，释放的分子标签可通过电泳分离以及检测基团的荧光而测得。在这些实施例中，具有基本相同荧光特性的分子标签具有不同的电泳迁移率，这样在分离条件下电泳图谱上会形成不同的峰。优选地，本发明的多个分子标签通过常规的毛细管电泳设备来分离，在存在或不存在常规的筛选基质的情况下进行。毛细管电泳设备的实例包括Applied Biosysterms(Foster City，CA)310、3100和3700型；Beckman(Fullerton，CA)P/ACE MDQ型；Amersham Biosciences(Sunnyvale，CA)MegaBACE 1000或4000；SpectruMedix genetic analysissystem，等等。电泳迁移率与q/M2/3成正比，其中q为分子上的电荷数，M是分子质量。理想地，在测定条件下最接近的电泳标记物之间的迁移率之差至少大约为0.001，通常为0.002，更通常为至少大约0.01，并且可以为0.02以上。优选地，在这种常规设备中，许多量中的分子标签的电泳迁移率至少有百分之一的差别，更优选范围在至少百分之1至10。通过分析分离图像可鉴别和定量分子标签，或者更具体地，电泳图谱和这些值可与样品中存在的受体二聚体的量和种类相关联。例如，在电泳分离过程中或之后，通过记录被分离化合物的荧光信号和迁移时间(或迁移距离)，或者通过构建分子标签的相对荧光和迁移顺序图(例如作为电泳图谱)，可检测或鉴定分子标签。优选地，分子标签的存在与否和/或量可采用一种或多种标准来测定，如Williams等人的美国专利公开2003/0170734A1中所公开，在此引入作为参考。
还可以将多个分子标签设计成通过基于一种或多种物理特性的色谱法来分离，其中包括单不限于分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、极性等等，如美国专利公开2003/0235832中所公开，在此引入作为参考。色谱分离技术根据参数来选择，例如柱类型、固定相、流动相等等，之后再选择可在单次操作中分离形成不同峰或带的多个分子标签。一些因素决定了应选择哪种HPLC技术用于本发明，包括被检测分子标签的数目(即所述许多量的量)，测定中可能生成的每种分子标签的估计量，合成用于多元测定中的一组候选分子标签的可能性和容易程度，采用的检测形式，以及HPLC仪器、柱和溶剂的的可获得性、耐用程度、成本和操作容易程度。一般来说，优选那些适合于分析有限量样品并能提供最高分辨率的分离的柱和技术。对进行该选择的技术指导可以在以下文献中找到例如Snyder等，Practical HPLC Method Development，(Johe Wiley &Sons，New York，1988)；Millner，“High Resolution ChromatographyA Practical Approach”，Oxford University Press，New York(1999)，Chi-San Wu，“Column Handbook for Size Exclusion Chromatography”，Academic Press，San Diego(1999)和Oliver，“HPLC of MacromoleculesA Practical Approach，Oxford University Press”，Oxford，England(1989)。特别地，可采取措施对色谱分离的给定条件，如柱类型，固定相等进行系统开发和优化，例如，Haber等，J.Chromatogr.Sci.，38386-392(2000)；Outinen等，Eur.J.Pharm.Sci.，6197-205(1998)；Lewis等，J.Chromatogr.，592183-195和197-208(1992)等等。适用于本发明的HPLC仪表系统的实例有Agilent 1100系列HPLC系统(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)。
在一种方式中，分子标签E为(M，D)，其中M是移动改变部分，D是检测部分。符号“(M，D)”用于表明M和D部分的顺序是这样的，其中每部分都可以邻近于可裂解连接物L。也就是说，“B-L-(M，D)”表示了结合化合物的两种形式中的任何一种“B-L-M-D”或“B-L-D-M”。
检测部分D可以是荧光标记或染料，显色标记或染料，电化学标记等等。优选地，D为荧光染料。用于本发明的荧光染料的实例包括水溶性罗丹明染料、荧光素、4，7-二氯荧光黄、苯并氧杂蒽染料、以及能量转移染料，如以下参考文献中所公开Handbook of Molecular Probes and Research，第八版，(Molecular Probes，Eugene，2002)；Lee等的美国专利6191278；Lee等的美国专利6372907；Menchen等的美国专利6096723；Lee等的美国专利5945526；Lee等，Nucleic Acids Research，252816-2822(1997)；Hobb，Jr.的美国专利4997928；Khanna等的美国专利4318846；等等。优选地，D为荧光素或荧光素衍生物。
在图3A所示的实施例中，结合化合物包括作为结合部分的生物素化抗体(300)。分子标签通过亲和素或链亲和素桥(306)连接着结合部分(300)。优选地，在操作中，结合部分(300)首先与靶复合物反应，之后加入(304)亲和素或链亲和素以形成抗体-生物素-亲和素复合物(305)。向该复合物(305)加入(308)生物素化分子标签(310)以形成结合化合物(312)。
在图3B所示的另一个实施例中，结合化合物包括由多官能部分(316)衍生的抗体(314)，该多官能部分含有多官能团(318)，其能与分子标签前体反应(320)得到连接着多个分子标签(322)的最终结合化合物。多官能部分的实例包括氨基葡聚糖以及类似物质。
一旦每种结合化合物通过不同的分子标签分别衍生后，其即与其它的结合化合物汇合形成多个结合化合物。通常，每个不同种类的结合化合物以相同的比例存在于组合物中；然而，作为设计选择比例可以改变，使得根据特定实施例或测定的期望或需要，特定结合化合物的一类或小类以较高或较低的比例存在。可能影响该设计选择的因素包括但不限于，对特定靶的抗体亲和性和亲和力，靶的相对优势度，分子标签检测部分的荧光特性等等。
B.产生活性物质的裂解引发部分裂解引发部分或裂解剂是一种能产生活性物质的基团，所述活性物质能够裂解可裂解连接物，优选通过氧化的方式。优选地，该活性物质为表现出短时活性的化学物质，这样其裂解引发效果仅仅在其产生位点的近程内起作用。要么该活性物质本身寿命短，这样由于超出了其产生近程将不会产生明显的本底，要么采用能有效清除该活性物质的清除剂，使得其不会与其产生位点短距离之外的可裂解连接物反应。示例性的活性物质包括单线态氧，过氧化氢，NADH，和氢氧根，苯氧基，超氧化物等等。对于产生氧化反应的活性物质的猝灭剂实例包括聚烯类、类胡萝卜素、维生素E、维生素C、酪氨酸的氨基酸-吡咯N-偶联物，组氨酸、和谷胱甘肽等等，例如Beuther等，Meth.Enzymol.，319226-241(2000)。
在设计采用裂解引发部分和可裂解连接物的测定试验中，一个重要考虑是当结合于受体复合物时它们彼此去除的距离不能太远，以至于该由裂解引发部分产生的活性物质不能有效地裂解该可裂解连接物。在一种方式中，可裂解连接物优选在所结合的裂解引发部分的1000nm之内，并优选在20-200nm之内。更优选地，对于生成单线态氧的光敏剂裂解引发部分来说，可裂解连接物位于受体复合物中的光敏剂的大约20-100nm之内。裂解引发部分能够有效裂解可裂解连接物(即，裂解足够的分子标签以生成可检测的信号)的范围在此称为其“有效近程”。本领域普通技术人员应明白，特定敏化剂的有效近程取决于特定测定设计的细节并可通过常规的实验来测定和改变。
敏化剂是一种能够被引导产生反应中间物或物质，通常位单线态氧的化合物。优选地，根据本发明使用的敏化剂是光敏剂。包括在本发明范围内的其它敏化剂有通过热、光、电离辐射，或化学活化而激活后，将释放单线态氧分子的化合物。该类化合物中最熟知的成员包括内过氧化物，例如1，4-biscarboxyethyl-1，4-萘内过氧化物，9，10-联苯蒽-9，10-内过氧化物以及5，6，11，12-四苯基萘5，12-内过氧化物。这些化合物加热或直接吸收光从而释放出单线态氧。以下文献中公开了另一些敏化剂Di Mascio等，FEBS Lett.，355287(1994)(过氧化物酶和加氧酶)；Kanofsky，J.Biol.Chem.2585991-5993(1983)(乳过氧物酶)；Pierlot等，Meth.Enzymol.，3193-20(2000)(内过氧化物的热裂解)等等。结合剂连接到裂解引发部分的方式可以是直接或间接的，共价或非共价的，并可通过公知的技术实现，其在许多文献中可以获得。参见例如，“Immobilized Enzymes”，Ichiro Chibata，Halsted Press，NewYork(1978)；Cuatrecasas，J.Biol.Chem.，2453059(1970)。
如上所述，根据本发明优选的裂解引发部分是能产生单线态氧的光敏剂。这里所使用的“光敏剂”涉及光吸收分子，其在光活化时将分子氧转换成单线态氧。光敏剂可由共价或非共价的连接物直接或间接地连接到类特异性反应物的结合剂上。对于构建这种组合物，尤其是作为结合剂的抗体的技术指导可在文献中获得，例如在光动力性疗法、免疫诊断等等领域。以下是示例性的参考文献Ullman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5426-5430(1994)；Strong等，Ann.New York Acad.Sci.，745297-320(1994)；Yarmush等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst.，10197-252(1993)；Pease等的美国专利5709994；Ullman等的美国专利5340716；Ullman等的美国专利6251581；McCapra的美国专利5516636等等。
已存在大量的光源用以光活化光敏剂以产生单线态氧。多色和单色光源都可以采用，只要该光源在实际的持续时间内有足够的强度产生足够的单线态氧。照射波长取决于光敏剂的性质，可裂解连接物的性质，照射源的功率，以及其到样品的距离等等。一般来说，照射时间可以是小于大约一微秒至长达10分钟，通常在大约一毫秒至大约60秒的范围内。照射的强度和波长应足够激发至少大约0.1％的光敏剂分子，通常至少大约30％的光敏剂分子，优选几乎所有的光敏剂分子。光源实例包括，举例而并非限制性地说，激光器，如氦-氖激光器、氩激光器、YAG激光器、He/Cd激光器、以及红宝石激光器，光电二极管，汞、钠和氙蒸汽灯，白炽灯例如钨和钨/卤素，闪光灯等等。实施例中，采用了Bjornson等的国际专利公开WO 03/051669中披露的光活化装置。简而言之，光活化装置是一种安装在外壳中的发光二极管(LED)的阵列，其可以同时照亮96孔板中的所有的板孔。适用于本发明的LED有高功率GaAIAs IR发射器，例如由OPTO DIODECORP.(Newbury Park，CA)生产的OD-880W型。
可用于本发明的光敏剂实例应具有上述特性，列举在以下文献中Singh和Ullman的美国专利5536834；Li等的美国专利5763602；Martin等，MethodsEnzymol.，186635-645(1990)；Yarmush等，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier Syst.，10197-252(1993)；Pease等的美国专利5709994；Ullman等的美国专利5340716；Ullman等的美国专利6251581；McCapra的美国专利5516636；Thetford的欧洲专利公开0484027；Sessler等，SPIE，1426318-329(1991)；Magda等的美国专利5565552，Roelant的美国专利6001673等等。
在一些实施例中，如同敏化剂一样，光敏剂可与固相支持物结合，共价或非共价地结合到支持物的表面上或者加入支持物主体中。一般来说，与支持物结合的光敏剂的量必须能获得所需量的单线态氧。一般来说，光敏剂的量根据经验确定。
在一个实施例中，将光敏剂加入乳胶颗粒中以形成光敏剂胶珠，例如Pease等的美国专利5709994，Pollner的美国专利6346384，和Pease等的PCT公开WO 01/84157中有所披露。或者，制备光敏剂胶珠可通过乳胶珠上的氯甲基将光敏剂，如玫瑰红连接到0.5微米的乳胶珠上，从而提供酯连接基团，如J.Amer.Chem.Soc.，973741(1975)中所述。这种光敏剂胶珠的使用如图3所示。如图1C中所描述的用于异源双链核酸分子的检测中，试剂(1122)与样品混合之后形成了复合物(330)。实施该反应可以在例如常规的96孔或384孔微滴定板等等中进行，其中具有形成板孔的一个壁，如底部，的过滤膜，使得反应试剂能够通过施加负压而去除。如果用于结合化合物特异性结合所需的缓冲液不同于单线态氧生成或分离所需的缓冲液的话，上述技术可以方便地变换缓冲液。例如，在基于抗体的结合化合物的情况下，需要高盐的缓冲液。如果对释放标记采用电泳分离，将该缓冲液换成适用于电泳的、具有较低盐浓度的缓冲液则可获得更好的性能。在该实施例中，为代替直接将光敏剂连接到结合化合物如抗体上，裂解探针可包括两种成分用捕获部分衍生出的抗体(332)，例如生物素(图3C中标为“bio”)，和光敏剂胶珠(338)，该胶珠的表面用与捕获部分如亲和素或链亲和素特异性结合的试剂(334)衍生得到。接着将复合物(330)通过光敏剂胶珠的捕获部分，如生物素(336)来捕获(335)。方便的是，如果选择过滤膜的孔径使得光敏剂胶珠(338)不能通过的话，则缓冲液交换还起到去除未结合的结合化合物的作用，这样得到改进的信号。如果需要的话，加入适当的用于分离的缓冲液，之后照射光敏剂胶珠(338)使得生成(342)单线态氧并释放(344)分子标签。然后分离这种释放的分子标签(346)形成分离图像(352)，并根据峰(348)和(350)来参比定量二聚体。光敏剂胶珠可用于均匀或非均匀的测定相中。
优选地，当检测分析物，如细胞表面受体或固定样品中的抗原时，裂解探针可包含初级半抗原化抗体和用多个光敏剂分子衍生得到的二级抗半抗原结合蛋白。优选的初级半抗原化抗体为生物素化抗体，优选的次级抗半抗原结合蛋白可以是抗生物素抗体或链亲和素。这种初级和次级反应物的其它组合是本领域公知的，例如Hauland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Reagents，第九版(Molecular Probes，Eugene，OR，2002)。这种反应物的组合实例如图3E所示。具有可释放标记(图中是“mT1”和“mT2”)结合化合物(366和368)，以及由生物素(369)衍生的一抗(368)特异性地结合于膜(360)中受体二聚体(362)的不同表位上。生物素特异性结合蛋白(370)，例如链亲和素，连接到生物素(369)上，将多个光敏剂(372)引入结合化合物(366和368)的有效近程内。生物素特异性结合蛋白(370)还可以为抗生物素抗体，并且通过常规的偶联化学方法，如Hermanson(引用如上)，可将光敏剂通过蛋白质上的游离氨基基团连接。这种用途的光敏剂实例有，按Shimadzu等的欧洲专利公开0510688中所披露的方法制备的亚甲基蓝的NHS酯。
测定条件下面对方法、特定条件和材料的大致论述出于示例目的而非限制。本领域普通技术人员应明白如何使这里所述的方法适用于其它的应用，特别是采用不同样品、细胞类型和靶复合物的应用。
在实施本发明的方法中，混合测定成分，包括被测样品、结合化合物、以及可选择的裂解探针。一般来说，测定成分可以以任何顺序混合。然而在一些应用中，加入的顺序会有关系。例如，有人希望监测竞争性结合，例如在定量测定中。或者有人希望监测所组成的复合物的稳定性。在这些应用中，可以分步进行反应，并且在全部混合物组合好之前，或者在启动裂解反应之前可能需要温育过程。
每种反应试剂的量通常根据经验来确定。测定中所用的样品量由存在的靶复合物的预测数量以及用于监测测定信号的分离和检测方法所决定。一般来说，所提供的结合化合物和裂解探针量的摩尔数应相对大于样品中靶分子的预计量，通常摩尔数应过量至少1.5倍，更优选过量10倍或更多。在特定应用中，使用的浓度可较高或较低，根据结合剂的亲和性和单个细胞上存在的靶分子预计数目而定。在测定化学化合物对形成寡聚细胞表面复合物的作用的情况下，该化合物可以在加入探针之前，同时或之后加入，根据被监测的作用而定。
在用于将探针连接到细胞表面分子的条件下，混合并温育测定混合物，通常是在水溶液介质中，一般在生理pH(类似培养细胞的pH)下，通过浓度在大约10至200mM范围内的缓冲液来保持。可采用常见的缓冲液，以及所需的其它常见添加剂，例如盐类、培养基、稳定剂等。通常采用生理和恒定的温度。温育温度的正常范围在大约4°至70℃，一般在大约15°至45℃，更常见的在25°至37℃。
测定混合物组成并进行温育使探针结合到细胞表面分子上之后，处理该混合物以活化裂解剂，从而将裂解剂有效近程内的标签从结合化合物上裂解下来，将相应的标记从细胞表面释放到溶液中。该处理的性质取决于裂解剂的作用机制。例如，在采用光敏剂作为裂解剂的情况下，裂解活化包括在适用于所使用的特定敏化剂的波长光下照射该混合物。
裂解之后，接着分析样品以测定被释放的标记身份。在采用多个结合化合物的情况下，其检测之前通常要对所释放的标记进行分离。分离和检测的方法在设计用于该测定的标记的过程中已确定。优选的分离方式是采用电泳法，即根据其电泳迁移率的已知差异来分离各种标记。
如上所述，在一些实施例中，如果测定反应的条件可能干扰所采用分离技术，就需要在裂解和分离分子标签之前去除或改变测定反应缓冲液。例如，测定条件可包括盐浓度(例如特异性结合所需的)，当在电泳迁移率基础上分离分子标签时其会降低分离性能。因此，可去除这种高盐缓冲液，例如在裂解分子标签之前，并通过过滤、抽吸、稀释或其它的手段用另一种适合电泳分离的缓冲液替换。
实施例实施例中所使用的材料来源对Her受体具有特异性的抗体、适配体分子、以及标准化的标准可从市场供应商处购得，包括Labvision，Cell Signaling Technology和BDBiosciences。细胞系从ATCC处购得。所有的人类速冻组织样品购自WilliamBaibridhe Genome Foundation(Seattle，WA)或者Bio Research Support(Boca Raton，FL)，并通过了供应商处的Institutional Reseach Board(IRB)认可。
以下所使用的分子标签-抗体偶联物由分子标签的NHS酯与指示抗体上的游离氨基通过常规的步骤反应而形成。分子标签，以下标记为名称“Pro_N”，在以下参考文献中有所披露Singh等的美国专利公开2003/017915和2002/0013126，引入其作为参考。简而言之，下面的结合化合物是由分子标签的NHS酯与抗体的游离氨基通过常规反应形成的分子标签-单克隆抗体偶联物。
实施例1对细胞裂解物的Her-2异型二聚化和受体磷酸化的分析在该实施例中，测定了来自于几个细胞系的细胞裂解物中的Her1-Her2和Her2-Her3异型二聚体和磷酸化状态，该细胞系用多种浓度的表皮生长因子(EGF)和heregulin(HRG)进行了处理。采用了三种结合化合物和裂解探针进行测量，如下所述。
样品分离1.血清饥饿的乳腺癌细胞系在使用前培养过夜。
2. 37℃下在培养基中用EGF和/或HRG刺激细胞系10分钟。除BT20之外对所有细胞系(例如MCF-7，T47D，SKBR-3)EGF/HRG的剂量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM，对BT20的最大剂量应增大到500nM，因为用100nM的EGF不会达到饱和。
3.抽吸培养基，转移到冰上，并加入裂解缓冲液以裂解原位细胞。
4.刮取并转移裂解物至微离心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微离心10min。(可选择进行离心)5.收集上清液作为裂解产物，分装储存于-80℃待使用。
测定；测定设计如图4A中图解所示，根据裂解探针(902)和结合化合物(904)、(906)和(908)的结合，来参比定量Her2-Her3异型二聚体(900)。将标记为“PS”的光敏剂通过亲和素-生物素连接物连接到裂解探针(902)上，并用分子标签Pro14、Pro10和Pro11分别标记结合化合物(904)、(906)和(908)。结合化合物(904)对Her3上的磷酸化位点具有特异性。
总测定体积为40ul。用裂解缓冲液将裂解物体积调整到30ul。抗体用裂解缓冲液稀释至10ul。典型地，每个反应中使用相当于-5000至15000个细胞的裂解产物。检测极限为等价于-1000细胞的裂解产物。
步骤反应中预先混合的结合化合物(即分子标签的或生物素的抗体偶联物)的最终浓度Pro4_抗Her-20.1ug/mlPro10_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1ug/ml生物素_抗Her-21-2ug/ml1.向测定的96孔中加入10ul抗体混合物到30ul的裂解物中并室温下温育1小时。
2.加入2ul的链亲和素衍生的裂解探针(终浓度2ug/孔)到测定的孔中并温育45min。
3.加入150ul的PBS与1％的BSA至96孔滴定板(MilliporeMAGVN2250)中并在室温下温育1hr用以阻断。
4.通过真空吸引器抽空过滤板。将测定反应转移到过滤板上并施加负压抽空。
5.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
6.加入200ul照射缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
7.加入30ul照射缓冲液并照射20分钟。
8.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析，采用22cm毛细管的ABI3100CE仪(注射条件5kV，75sec，30℃；运行条件600sec，30℃)。
测定缓冲液如下裂解缓冲液(新制作并在冰上保存)终浓度ul 储存量1％Triton X-100 1000 10％20mM Tris-HCl(pH 7.5) 200 1M100mM NaCl 200 5M50mM NaF 500 1M50mM β-甘油磷酸Na 1000 0.5M1mM Na3VO4100 0.1M5mM EDTA 100 0.5M10ug/ml胃蛋白酶抑制剂100 1mg/ml1片(每10ml)Roche Complete蛋白酶抑制剂(#1836170) N/A N/A水6500 N/A共计10ml洗涤缓冲液(4℃储存)终浓度ul 储存量1％NP-4050 10％1x PBS 50 10x150mM NaCl15 5M5mM EDTA5 0.5M水380 N/A共计500ml照射缓冲液终浓度ul储存量
0.005x PBS 501xCE标准 3 100x10mM Tris-HCl(pH8.0) 0.1M10pM A160 1nM10pM A315 1nM10pM HABA 1nM水10000 N/A共计10ml数据分析1.使每个分子标签的相对荧光单位(RFU)信号按照CE参考标准A315(一种荧光素衍生的脱氧腺苷单磷酸，其已知峰位置与根据电泳分离的测定中的分子标签相关)而标准化。
2.从相应的分子标签信号中减去“无裂解产物”本底对照的RFU。
3.报告Her-1或Her-3的异型二聚化程度，作为相应的RFU与来自于使用生物素抗-Her-2的测定孔中的Pro4_抗-Her-2RFU的参比。
4.报告Her-1，2，3的受体磷酸化程度，作为Pro2_PT100抗-磷-Tyr的RFU与来自于使用生物素抗-Her-2的测定孔中的Pro4_抗-Her-2RFU的参比。
测定结果如图4B-4H所示，图4B表示Her1-Her2异型二聚体的量随着EGF浓度的增加而在MCF-7细胞上增加，而同样的二聚体的量随着HRG浓度的增加基本上没有变化。图4C表示了Her2-Her3异型二聚体上的相反结果。也就是说，Her2-Her3异型二聚体的量随着HRG浓度的增加而在MCF-7细胞上增加，而同样的二聚体的量随着EGF浓度的增加基本上没有变化。图4D和4E表示Her1-Her2异型二聚体的量随着EGF浓度的增加而分别在SKBR-3细胞和BT-20细胞上增加。
实施例2对组织裂解物的Her-2异型二聚化和受体磷酸化的分析在该实施例中，测定了来自于人类乳腺癌样本的组织裂解物中的Her1-Her2和Her2-Her3异型二聚体和磷酸化状态。
样品分离1.通过切割在冷冻状态下机械破碎速冻组织。
2.将组织转移至微离心管中并加入3x组织体积的裂解缓冲液(附录I)，然后搅拌以使组织分散在缓冲液中。
3.冰育30min并不时搅拌混匀。
4. 14000rpm，4℃下离心20min。
5.收集上清液作为裂解产物并使用一小份通过BCA测定实验(Pierce)来测定总蛋白质浓度6.分装剩余物质以储存于-80℃待使用。
测定设计1.总测定体积为40ul。
2.测定裂解物，其成连续的滴定系列40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31ug的总等价物，并用裂解缓冲液将体积调整到30ul。来自该滴定系列的数据证实了二聚化或磷酸化信号的特异性。
3.包括所有稀释在裂解缓冲液中的eTAg-抗体的通用抗体混合物在以下浓度下使用。
4.将针对每个受体的单独的生物素-抗体分别加入反应中。
5.用每个组织裂解物进行三种eTag测定，每种使用不同的对应于被测特定受体二聚化的生物素-抗体。
6.测定含有该受体特异性生物素-抗体的不同测定中每种受体的表达水平。
7.仅在含有生物素-抗Her-2的测定中参比测定二聚化和磷酸化信号。
测定对照用MCF-10A和MCF-7细胞系分别作为阴性和阳性的定性对照。细胞系要么未受刺激，要么用100nM EGF或100mM HRG刺激。当替换组织样品时，包括了裂解缓冲液作为本底对照。
反应中预先混合的抗体的最终浓度通用抗体混合物
Pro4_抗Her-20.1ug/mlPro10_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.01ug/ml单独的生物素抗体生物素_抗Her-12ug/ml生物素_抗Her-22ug/ml生物素_抗Her-32ug/ml步骤1.向通用抗体混合物中加入生物素抗体以制备抗体反应混合物。
2.向测定的96孔中加入10ul通用反应混合物到30ul的裂解物中并室温下温育1小时。
3.加入2ul的链亲和素衍生的裂解探针(终浓度2ug/孔)到测定的孔中并温育45min。
4.加入150ul的PBS与1％的BSA至96孔滴定板(MilliporeMAGVN2250)中并在室温下温育1hr用以阻断。
5.通过真空吸引器抽空过滤板。将测定反应转移到过滤板上并施加负压抽空。
6.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
7.加入200ul照射缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
8.加入30ul照射缓冲液并照射20分钟。
9.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析，采用22cm毛细管的ABI3100毛细管电泳仪(注射条件5kV，75sec，30℃；运行条件600sec，30℃)。
数据分析1.使每个分子标签的RFU信号按照CE参考标准A315而标准化。
2.测定RFU的截止值(分别针对二聚化或磷酸化程度)，不计算其之下的比例，因为信号值太低而不可靠。在该截止值之下，被测裂解稀释液系列中的RFU信号不可滴定。可用预计二聚化和磷酸化信号不存在或非常低的一大组正常组织来测定该值。这些值还代表将与肿瘤组织进行比较的正常组织上二聚化或酸化的基本水平。
3.如果有的话，为了监测RFU值高于截止值的正常组织，测定所测Her-1或Her-3异型二聚化或磷酸化峰的单独RFU水平和参比读数。这些样品代表异常值，记录时其应当被用作对相应肿瘤组织样品相匹配的供体对照。
4.对所有表现出可滴定RFU信号的肿瘤样品，采用每个Her-1、Her-2、Her-3或者组织裂解物滴定系列的磷酸化程度的最低信号作为本底。从高剂量裂解物(如40ug)的分子标签中减去该本底以得到特异RFU信号。如果滴定系列中没有信号剂量响应，则将所有的信号(通常非常低)看作本底并且没有特异性信号能用作参比分析。
5.报告Her-1或Her-3的异型二聚化程度，作为相应的特异RFU与来自于Pro4_抗-Her-2的特异RFU的参比。如果没有获得特异RFU的话，则二聚化程度为阴性。
6.报告Her-1，2，3的受体磷酸化程度，作为Pro2_抗磷-Tyr的特异性RFU与来自于Pro4_抗Her-2的特异性RFU的参比。如果没有获得特异RFU的话，则磷酸化程度为阴性。
图5A-5C中所示的数据代表用本发明的测定测得的多个患者的乳腺组织样品。来自于免疫组织化学(DAKO Herceptest)的临床Her-2状况在10个肿瘤样品中有9个为阴性，表明要么没检测到Her-2着色，要么小于10％的肿瘤细胞着色，或者大于10％的肿瘤细胞的部分细胞膜上着色微弱几乎不可见。本发明的测定实验同时测定了正常和肿瘤组织上的Her-1、Her-2和Her-3表达。Her-1与Her-2和Her-2与Her-3的异型二聚化程度仅在肿瘤组织中检测到，在任何正常组织中都未测得。
实施例3对细胞裂解物的Her1或Her2同型二聚化和受体磷酸化的分析样品制备的操作基本上如实施例2中所描述。用EGF和TGFα处理细胞系以引起Her1的同型二聚化。对于不具有配体的Her2的同型二聚化，将过表达Her2的未受刺激SKBR-3或MDA-MD453细胞与低水平表达Her2的未受刺激MCF-7细胞相比较。
测定设计将对受体具有特异性的单克隆抗体分别与分子标签或生物素偶联(生物素偶联后再通过亲和素桥与光敏剂连接)，使得裂解探针和结合化合物竞争性结合该实施例中同样的表位。使用的另一种结合抗体包括能识别受体上重叠表位的第二抗体，这样可生成参比信号作为同型二聚化的测量值。从第二抗体中得到的信号还提供了样品中受体总量的测量值。受体总量在单独的测定孔中测定。受体磷酸化可以和同型二聚化或总受体量一起定量测定。
步骤测定体积为40ul，主要步骤类似于实施例2。对每个样品建立两个测定孔A和B以便分别定量二聚化程度和受体总量。
对于Her1-Her1同型二聚体的定量测定孔A中的抗体混合物终浓度Pro12_抗Her-10.05-0.1ug/ml生物素_抗Her-11-2ug/ml测定孔B中的抗体混合物终浓度Pro10_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1ug/ml生物素_抗Her-11-2ug/ml对于Her2-Her2同型二聚体的定量测定孔A中的抗体混合物终浓度Pro4_抗Her-10.05-0.1ug/ml生物素_抗Her-11-2ug/ml测定孔B中的抗体混合物终浓度Pro4_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1ug/ml生物素_抗Her-11-2ug/ml
数据分析1.使每个分子标签的RFU信号按照CE参考标准A315而标准化。
2.从相应的分子标签信号中减去“无裂解产物”本底对照的RFU。
3.报告Her-1或Her-2的同型二聚化程度，作为测定孔A中相应的标准化RFU与测定孔B中相应的总受体量标准化RFU的参比。
4.报告Her-1或Her-2同型二聚体的受体磷酸化程度，作为测定孔B中Pro2_PT100抗磷-Tyr的标准化RFU与来自于同一测定孔B中的总受体量标准化RFU的参比。
测定结果如图6A-6B和图7所示，图6A表示Her1-Her1同型二聚体的量随着EGF浓度的增加而在BT-20细胞上增加。图6B表示BT-20细胞中Her1磷酸化的量随着EGF浓度的增加而增加。通过比较表达Her2的SKBR-3细胞中的信号与细胞表面上Her2表达水平降低的MCF-7细胞中的信号，证明了对Her2-Her2同型二聚体的检测。如图7所示的图表中，用MCF-7细胞没有检测到特异的可滴定Her2-Her2同型二聚体信号，而来自SKBR-3细胞的Her2-Her2同型二聚体信号清楚地位于来自MCF-7细胞的信号之上。
实施例4对细胞裂解物的Her-1-Her3异型二聚化和受体磷酸化的分析样品分离如下1.血清饥饿的乳腺癌细胞系在使用前培养过夜。
2. 37℃下在培养基中用HRG刺激细胞系10分钟。对于T47D细胞HRG的剂量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。
3.抽吸培养基，转移到冰上，并加入裂解缓冲液以裂解原位细胞。
4.刮取并转移裂解物至微离心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微离心10min。(可选择进行离心)5.收集上清液作为裂解产物，分装储存于-80℃待使用。
测定设计总测定体积为40ul。用裂解缓冲液将裂解物体积调整到30ul。抗体用裂解缓冲液稀释至5ul。典型地，每个反应中使用相当于-5000至15000个细胞的裂解产物。反应中预先混合的抗体的最终浓度Pro10_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1ug/ml生物素_抗Her-31-2ug/ml1.向测定的96孔中加入5ul抗体混合物到30ul的裂解物中并室温下温育1小时。
2.加入5ul的链亲和素衍生的分子剪(molecular scissor)(终浓度4ug/孔)到测定的孔中并温育45min。
3.加入150ul的PBS与1％的BSA至96孔滴定板(MilliporeMAGVN2250)中并在室温下温育1hr用以阻断。
4.通过真空吸引器抽空过滤板。将测定反应转移到过滤板上并施加负压抽空。
5.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
6.加入200ul照射缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
7.加入30ul照射缓冲液并照射20分钟。
8.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析，采用22cm毛细管的ABI3100毛细管电泳仪(注射条件5kV，425sec，30℃；运行条件600sec，30℃)。
数据分析1.使每个eTag受体的RFU信号按照CE参考标准A315而标准化。
2.从相应的eTag受体信号中减去“无裂解产物”本底对照的RFU。
3.报告异型二聚化程度，作为Her-1衍生的Pro10 RFU与来自抗-Her-3的Pro11 RFU的参比。
4.报告受体磷酸化程度，作为来自Pro2_PT100抗-磷-Tyr的RFU与来自于使用生物素抗-Her-3的测定孔中的Pro11_抗-Her-3RFU的参比。
测定结果如图8A和8B所示。数据表明Her1-Her3异型二聚化程度和二聚体磷酸化程度随着HRG浓度的增加而增加。
实施例5癌细胞系中Her1-Her3受体二聚体表达的增加以应答表皮生长因子的增加在该实施例中，测定了来自于癌细胞系22Rv1和A549的细胞裂解物中的Her1-Her3异型二聚体，该细胞系用多种浓度的表皮生长因子(EGF)进行了处理。采用了三种结合化合物和裂解探针进行测量，如下所述。
样品分离1.血清饥饿的乳腺癌细胞系在使用前培养过夜。
2. 37℃下在培养基中用EGF刺激细胞系10分钟。向两个细胞系施加的EGF剂量例如在0-100nM之间改变。
3.抽吸培养基，转移到冰上，并加入裂解缓冲液以裂解原位细胞。
4.刮取并转移裂解物至微离心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微离心10min。(可选择进行离心)。测定蛋白质浓度。
5.收集上清液作为裂解产物，分装储存于-80℃待使用。
测定设计基本上与图4A中所示相同，除了以下不同点之外结合化合物(904)、(906)和(908)分别用分子标签Pro10、Pro11和Pro2标记。总测定体积为40ul。用裂解缓冲液将裂解物体积调整到30ul。抗体用裂解缓冲液稀释至5ul。典型地，每个反应中使用相当于-5000至15000个细胞的裂解产物。检测极限为等价于-1000细胞的裂解产物。步骤反应中预先混合的结合化合物(即分子标签的或生物素的抗体偶联物)的最终浓度Pro10_抗Her-10.05-0.1ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.1至0.2ug/ml生物素_抗Her-31-2ug/ml1.向测定的96孔中加入5ul抗体混合物到30ul的裂解物中并室温下温育1小时。
2.加入5ul的链亲和素衍生的裂解探针(终浓度4ug/孔)到测定的孔中并温育45min。
3.加入150ul的PBS与1％的BSA至96孔滴定板(MilliporeMAGVN2250)中并在室温下温育1hr用以阻断。
4.通过真空吸引器抽空过滤板。将测定反应转移到过滤板上并施加负压抽空。
5.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
6.加入200ul照射缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
7.加入30ul照射缓冲液并照射20分钟。
8.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析，采用22cm毛细管的ABI3100 CE仪(注射条件5kV，70sec，30℃；运行条件425sec，30℃)。
测定缓冲液如下裂解缓冲液(新制作并在冰上保存)终浓度ul储存量1％Triton X-1001000 10％20mM Tris-HCl(pH 7.5)500 1M100mM NaCl 200 5M50mM NaF 500 1M50mMβ-甘油磷酸Na 500 1.0M1mM Na3VO4100 0.1M5mM EDTA 100 0.5M10ug/ml胃蛋白酶抑制剂 100 1mg/ml1片(每10ml)Roche Complete蛋白酶抑制剂(#1836170)N/A N/A水7ml N/A共计10ml洗涤缓冲液(4℃储存)1x PBS中0.5％Triton X-100照射缓冲液终浓度ul 储存量0.005x PBS 50 1x
CE标准1(A27，ACLARA Biosciences，Inc.，Mountain View，CA) 4 5000xCE标准2(荧光素) 4 5000x水9942 N/A共计10ml数据分析1.使每个分子标签的相对荧光单位(RFU)信号按照CE参考标准2而标准化。
2.从相应的分子标签信号中减去“无裂解产物”本底对照的RFU。
3.报告Her-1的异型二聚化程度，作为相应的RFU与来自于使用生物素抗-Her-3的测定孔中的Pro11_抗-Her-3RFU的参比。
4.报告Her-1，2，3的受体磷酸化程度，作为Pro2_PT100抗-磷-Tyr的RFU与来自于使用生物素抗-Her-3的测定孔中的Pro11_抗-Her-3RFU的参比(数据未显示)。
图9A和9B表示Her1-Her3异型二聚体的量随着EGF浓度的增加分别在22Rv1和A549细胞上增加。
实施例6乳腺肿瘤组织裂解物中出现的具Her1、Her2和Her3的IGF-1R异型二聚体在该实施例中，采用了与图4A中所示基本上相同的测定试验，测定了来自于12个不同人类乳腺肿瘤组织细胞中Her1-IGF-1R、Her2-IGF-1R和Her3-IGF-1R二聚体的存在。样品制备操作如下1.通过切割在冷冻状态下机械破碎速冻组织。
2.将组织转移至微离心管中并加入3x组织体积的裂解缓冲液，然后搅拌以使组织分散在缓冲液中。
3.冰育30min并不时搅拌混匀。
4. 14000rpm，4℃下离心20min。
5.收集上清液作为裂解产物并使用一小份通过BCA测定实验(Pierce)来测定总蛋白质浓度
6.分装剩余物质以储存于-80℃待使用。
测定试验建立如下1.总测定体积为40ul。
2.测定裂解物，其成连续的滴定系列40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31ug的总等价物，并用裂解缓冲液将体积调整到30ul。来自该滴定系列的数据证实了二聚化的特异性。
3.包括稀释于裂解缓冲液中的所有结合化合物和生物素抗体的通用抗体混合物在以下浓度下使用。
反应中预先混合的抗体的最终浓度Pro10_抗Her-20.1ug/mlPro14_抗Her-10.1ug/mlPro11_抗Her-30.1ug/mlPro7_抗IGF-1R0.1ug/mlPro2_抗磷-Tyr0.2ug/ml生物素_抗Her-22ug/ml步骤1.向测定的96孔中加入5ul通用反应混合物到30ul的裂解物中并室温下温育1小时。
2.加入5ul的链亲和素衍生的分子剪(终浓度4ug/孔)到测定的孔中并温育45min。
3.加入150ul的PBS与1％的BSA至96孔滴定板(MilliporeMAGVN2250)中并在室温下温育1hr用以阻断。
4.通过真空吸引器抽空过滤板。将测定反应转移到过滤板上并施加负压抽空。
5.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
6.加入200ul照射缓冲液并施加负压抽空。重复一次。
7.加入30ul照射缓冲液并照射20分钟。
8.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析，采用(i)CE仪ABI3100，22cm毛细管，(ii)CE注射条件5kV，70sec，30℃，(iii)CE运行条件425sec，30℃。
数据分析1.使每个分子标签的RFU信号按照CE参考标准1而标准化。
2.寻找每个分子标签的可滴定信号。不能滴定的信号假定为非特异性信号并且不能用于数据解析。根据预计二聚化信号不存在或非常低的一大组正常组织来测定截止值。这些值还代表了将与肿瘤组织进行比较的正常组织上的二聚化基本水平。
3.报告IGF-1R与Her-1或Her-2或Her-3的异型二聚化程度作为相应的RFU。
测定的十二个乳腺肿瘤中有两个表达了Her1-IGF-1R、Her2-IGF-1R和Her3-IGF-1R异型二聚体，如图10A-C中所示。各图面中的线条表明被测受体异型二聚体量和对指示异型二聚体呈阳性的两个乳腺肿瘤样品中所测裂解物的量之间的走向。
实施例7PI3K/Her-3受体活化复合物在该实施例中，测定设计如图11A和11C中所示，用以测定乳腺癌细胞系MCF-7中包含Her2、Her3和PI 3K的受体复合物。具有第一分子标签(图中为“mT1”，以下为“eTag1”)结合化合物(1106)对Her3受体(1102)的胞外区域具有特异性，具有第二分子标签(图中为“mT2”，以下为“eTag2”)结合化合物(1110)对PI3K蛋白(1100)的p185成分具有特异性，而连接有光敏剂的裂解探针(1108)对Her3受体(1102)的胞内区域具有特异性，其中“H2”表示Her2受体(1104)，“H3”表示Her3受体(1102)，“p85”和“p110”为PI3激酶(1100)的成分，其通过其p85部分结合于H3的磷酸化位点(表示为“P”)。这两个测定设计类似，除了图11A的设计中裂解探针特异于Her3受体，而图11C的设计中裂解探针特异于PI3激酶的p85成分之外。该测定操作如下。
样品制备
1.血清饥饿的乳腺癌细胞系在使用前培养过夜。
2. 37℃下在培养基中用HRG刺激细胞系10分钟。用于MCF-7细胞的HRG剂量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。
3.抽吸培养基，转移到冰上，并加入如上所述的裂解缓冲液以裂解原位细胞。
4.刮取并转移裂解物至微离心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微离心10min。(可选择进行离心)5.收集上清液作为裂解产物，分装储存于-80℃待使用。
裂解缓冲液(新制作并在冰上保存)终浓度ul储存量1％Triton X-100 1000 10％20mM Tris-HCl(pH 7.5) 200 1M100mM NaCl200 5M50mM NaF 500 1M50mM β-甘油磷酸Na 1000 0.5M1mM Na3VO4100 0.1M5mM EDTA100 0.5M10ug/ml胃蛋白酶抑制剂 100 1mg/ml1片(每10ml)Roche Complete蛋白酶抑制剂(#1836170) N/A N/A水6500 N/A共计10ml测定设计根据各图中所示的图解来参比定量受体复合物的形成。也就是说，测定读数是分子标签eTag2/eTag1的峰值比。
总测定体积为40ul。用裂解缓冲液将裂解物体积调整到10ul。抗体用裂解缓冲液稀释至20ul。典型地，每个反应中使用相当于-5000至15000个细胞的裂解产物。
步骤在加入反应之前预先混合的抗体工作浓度为对于在Her-3处具有裂解探针的Her-3/PI3K复合物(图11A的设计)
eTag1_抗Her-3为10nM(该测定中eTag1为Pro14)eTag2_抗PI3K为10nM(该测定中eTag2为Pro1)生物素_抗Her-3为20nM通用标准US-1为700nM[所述通用标准US-1为偶联着生物素和分子标签Pro8的BSA，其用于使测定中链亲和素-光敏剂胶珠的量标准化]。利用常规技术例如Hermanson(引用如上)使分子标签前体的NHS-酯与抗体上的游离氨基反应，从而使分子标签直接连接到抗体上。
对于在PI3K处具有裂解探针的Her-3/PI3K复合物(图11C的设计)eTag1_抗PI3K为10nM(该测定中eTag1为Pro1)eTag2_抗Her-3为10nM(该测定中eTag2为Pro14)生物素_抗PI3K为20nM通用标准US-1为700nM9.向测定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗体混合物到10ul的裂解物中并4℃下温育1小时。
10.加入10ul的链亲和素衍生的裂解探针(终浓度4ug/孔)到测定的孔中并温育45min。
11.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。
12.加入30ul照射缓冲液并照射。
13.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析。
数据分析1.使每个分子标签的相对荧光单位(RFU)信号按照其国际通用标准US-1而标准化。
2.从相应的标准化eTag受体信号中减去“无裂解产物”本底对照的RFU。
3.报告受体复合物的形成，作为标准化eTag2/eTag1信号的参比(如图11B和11D所示)。
实施例8Shc/Her-3受体-适配体相互作用在该实施例中，测定设计如图12A和12C中所示。图12A中，Her2受体(1200)和Her3受体(1202)在细胞表面膜(1204)中形成二聚体，并且所表示的每个受体都具有磷酸化位点(1209和1210)。Shc蛋白(1206和1208)分别结合于磷酸化位点(1210)和(1209)上。第一结合化合物(1214)和裂解探针(1216)对Her2受体(1200)胞外区域的不同抗原决定簇具有特异性。第二结合化合物(1212)对Shc蛋白(1206和1208)具有特异性。图12A和12C的测定设计类似，除了图12A的设计中裂解探针特异于Her2受体，而图12C的设计中裂解探针特异于Her3受体之外。因此，在前一种情况中，测定了总的Her2受体，而后一种情况中测定了总的Her 3受体。测定操作如下。样品的制备操作如上(实施例7)。
测定设计根据各图中所示的图解来参比定量受体复合物的形成。也就是说，图12B和12D中，测定读数是作为HRG浓度的函数的mT2/mT1峰值比。
总测定体积为40ul。用裂解缓冲液将裂解物体积调整到10ul。抗体用裂解缓冲液稀释至20ul。典型地，每个反应中使用相当于-5000至15000个细胞的裂解产物。
步骤在加入反应之前预先混合抗体工作浓度为对于在Her-3处具有裂解探针的Her-3/Shc复合物(图12A的设计)eTag1_抗Her-3为10nM(该测定中eTag1为Pro14)eTag2_抗Shc为10nM(该测定中eTag2为Pro12)eTag3_抗磷-Tyr为10nM(该测定中eTag3为Pro2)生物素_抗Her-3为20nM通用标准US-1为700nM对于在Her-2处具有裂解探针的Her-2/Shc复合物(图12A的设计)eTag1_抗Her-2为10nM(该测定中eTag1为Pro14)eTag2_抗Shc为10nM(该测定中eTag2为Pro12)eTag3_抗磷-Tyr为10nM(该测定中eTag3为Pro2)生物素_抗Her-2为20nM
通用标准US-1为700nM1.向测定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗体混合物到10ul的裂解物中并4℃下温育1小时。
2.加入10ul的链亲和素衍生的裂解探针(终浓度4ug/孔)到测定的孔中并温育40min。
3.加入200ul洗涤缓冲液并施加负压抽空。
4.加入30ul照射缓冲液并照射。
5.转移每个反应中10ul至CE测定板上分析。
数据分析1.使每个分子标签的相对荧光单位(RFU)信号按照其国际通用标准US-1而标准化。
2.从分子标记相应的标准化信号中减去“无裂解产物”本底对照的RFU。
3.报告受体复合物的形成，作为标准化mT2/mT1信号的参比(如图12B和12D所示)，以及受体磷酸化程度(数据未示出)作为mT3/mT1信号。
实施例9乳腺肿瘤样品中Her2-Her3异型二聚体测量值与Her3-PI3K复合物测量值之间的关系在该实施例中，利用上述方法分别测定人类乳腺肿瘤样品以确定Her2-Her3异型二聚体的量和Her3-PI3K复合物的量。图13表示了从该测定中获得的数据，表明这两个测量值有关联。
实施例10乳腺肿瘤裂解物和正常组织裂解物中Her1-Her2和Her2-Her3异型二聚体的表达冷冻的人类乳腺肿瘤样品和正常组织样品来自William BainbridgeGenomic Foundation(Bainbridge Island，WA)。测定形式如图3E中所示，在32个肿瘤组织样品和30个正常组织样品中进行。肿瘤组织由肿瘤和正常细胞的混合物构成，根据供应商提供组织的病理学数据，正常组织占大约25％至90％以上。样品制备和实施测定基本上如实施例2和6中所描述。报告的数据是根据峰面积或者从结合化合物中释放的分离分子标签的强度，所述结合化合物特异性地结合于与裂解探针相对的受体，即相当于图3E中“mT1”的分子标签。不需要标准化根据样品中肿瘤细胞百分数而产生的信号值。
从这些测定中得到的数据如图14A(Her1-Her2异性二聚体测定值)和图14B(Her2-Her3异性二聚体测定值)中所示，其中空心方块(□)表示对肿瘤组织的测量值，实心菱形(◆)表示对正常组织的测量值。数据表明，相对于正常组织样品细胞中的的表达，肿瘤组织样品的基本片断中的肿瘤细胞表达了大量的Her1-Her2异型二聚体和Her2-Her3异型二聚体。
实施例11福尔马林固定的石蜡包埋组织样品中的受体二聚体测定在该实施例中，测定由球状细胞系制成的典型固定组织中是否存在Her受体二聚体。对异型二聚体的测定设计与图4A中所述的基本上相同，除了以下所述的不同点之外。也就是说，采用了四种成分(i)包括偶联着裂解引发部分(该实施例中是光敏剂衍生的链亲和素，如图3E所示)并对二聚体中的一种受体具有特异性的生物素化单克隆抗体的裂解探针，(ii)由第一分子标签衍生出的单克隆抗体，其对受体的特异性相同于裂解探针，(iii)由第二分子标签衍生出的单克隆抗体，其对受体的特异性相反于裂解探针，以及(iv)用第三分子标签衍生出的单克隆抗体，其对胞内磷酸化酪氨酸具有特异性。对同型二聚体的测定设计基本上与图1D中所述相同，除了以下所述的不同点之外。
在每种情况下，典型的固定组织制备如下用EGF或者HRG刺激组织培养基上生长的细胞，如前面实施例中所述，之后将其洗涤并刮取。离心所取下的细胞以形成球状，然后加入福尔马林并在4℃下将混合物温育过夜。用MilesTissue Tek III Embedding Center在石蜡中包埋该固定球，之后用显微切片机(Lecia 2145型)从该球上切下10μm的组织切片。将组织切片放置在带正电的玻璃显微载玻片上(通常每片上有多个组织切片)并在60℃下烘烤1hr。
对载玻片上的组织切片测定如下用EZ-Dewax试剂(Biogenex，San RamonCA)采取制造商推荐的方法脱去载玻片上组织切片的石蜡。简而言之，向每个组织切片中加入500μL EZ-Dewax并在室温下温育该切片5min，之后用70％的EtOH洗涤该载玻片。重复该步骤并最后用去离子水冲洗该载玻片，之后将该载玻片在室温下水中温育20min。接着将载玻片浸入pH 10的1X AntigenRetrieval溶液(Biogenesis，Brentwood，NH)，之后在微波炉中加热15min(高功率设定下5min然后在低功率设定下10min)。冷却到室温后(大约45min)将载玻片放在水中水浴5min，然后干燥。将干燥载玻片上的组织切片用疏水蜡笔圈上从而形成了能够容纳置于组织切片上的试剂的区域(如图1H-1I所示)，之后在1X Perm/Wash(BD Biosciences)中洗涤载玻片三遍。向每个切片加入50-100μL阻断缓冲液，将该载玻片放在含有去离子水的封闭潮湿盒子中4℃下2hr，之后通过抽吸去掉各切片中的阻断缓冲液。(阻断缓冲液为含有蛋白酶抑制剂(Roche)、磷酸酶抑制剂(氟化纳、钒酸钠、β-磷酸甘油)和10％鼠血清的1X Perm/Wash溶液)。向各切片加入含有结合化合物和裂解探针的抗体混合物(每种5μg/mL，除了Her1-Her2测定中生物素-Ab5(抗Her1)为10μg/mL之外)，并将载玻片放置在潮湿的盒子中4℃下过夜。然后用100μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的Perm/Wash洗涤切片三遍，之后加入50μL在1XPerm/Wash溶液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中的光敏剂。接着将载玻片在黑暗潮湿的盒子中4℃下温育1-1.5hr，之后在保特载玻片在黑暗中的同时通过抽吸去除光敏剂。当保持在黑暗中时，接着将载玻片浸入.01X PBS中并冰育1hr。从PBS中取出载玻片，干燥，并向各切片加入40-50μL具有2pM荧光素的0.01XPBS，之后用高功率的激光二极管(GaAIAs IR发射器，型号OD-880W，OPTO DIODECORP，Newbury Park，CA)照射1hr。荧光素作为一个标准有助于将电泳图上峰值与分子标签相关联。照射之后，将包裹着各个组织切片的溶液用吸球轻柔地混匀并转移到Applied Biosystems(Foster City，CA)3100型毛细管电泳仪上的CE板上进行分析。
图15A表示了对乳腺癌细胞系MDA-MB-468(ATCC登录号no.HTB-132)的固定球切片中的Her1-Her1同型二聚体和受体磷酸化的分析数据，其中细胞系由未受刺激的细胞或者以100nM EGF刺激的细胞制备而成。用2μg/mL生物素化的抗Her1单克隆抗体(Labvision)作为裂解探针(用于裂解亚甲蓝衍生的链亲和素(如上所述)，通过生物素连接)的一抗。用2μg/mL Pro10衍生的抗Her1单克隆抗体来测定同型二聚化的Her1。用0.8μg/mL Pro1衍生的抗Her1单克隆抗体(Labvision)来测定总Her1。反应中还包含3.2μg/mL未标记的抗体Ab-5。用0.5μg/mL Pro2衍生的单克隆抗体(抗磷酸化Tyr、CellSignaling)来测定胞内磷酸化程度。从固定组织测量获得的数据证实并符合了在细胞裂解物的测量中，由于EGF的刺激而造成了Her1-Her1同型二聚体表达和胞内磷酸化的增加。
图15B表示对乳腺癌细胞系MCF-7和SKBR-3的固定球切片中的Her2-Her2同型二聚体和受体磷酸化的分析数据。所有用作裂解探针或结合化合物单克隆抗体的使用浓度在5μg/mL。为产生更好的裂解效果，该测定中采用了两种裂解探针，一种针对Her2的胞外抗原决定簇，一种针对Her2的胞内抗原决定簇。从固定组织测得的数据证实，SKBR3细胞比MCF-7细胞表达了较高的Her2-Her2同型二聚体水平。
图15C表示对乳腺癌细胞系MCF-7的固定球切片中的Her1-Her2异型二聚体和受体磷酸化的分析数据，其中细胞系由未受刺激的细胞或者以40nM EGF刺激的细胞制备而成。采用了两种裂解探针，一种包括抗Her1单克隆抗体(5μg/mL)，另一种包括抗Her1单克隆抗体(10μg/mL)(均来自Labvision)，以便提高分子标签释放的速率。数据表明由于EGF的刺激，在固定组织中检测到了Her1-Her2异型二聚体表达。
图15D表示对乳腺癌细胞系22Rv1的固定球切片中的Her1-Her2异型二聚体和受体磷酸化的分析数据，其中细胞系由未受刺激的细胞或者以100nM EGF刺激的细胞制备而成。对固定组织的测量再次证明了用EGF处理后造成Her1-Her2二聚体和Her受体磷酸化的增量调节。
图15E表示对乳腺癌细胞系MCF-7的固定球切片中的Her2-Her3异型二聚体和受体磷酸化的分析数据，其中细胞系由未受刺激的细胞或者以40nM HRG刺激的细胞制备而成。在该实施例中，结合反应和裂解反应在含有切片的试管中进行，而不是显微载玻片。除此之外，该方法与检测Her1-Her2二聚体的方法基本上相同。(例如，通过离心实施洗涤步骤)该数据表明由于HRG的刺激，在固定组织中检测到了Her2-Her3异型二聚体表达的增加。
图15F表示对MCF-7细胞的固定球切片中的Her2-Her3异型二聚体和PI3K-Her3二聚体的分析数据，其中细胞未受刺激或者受到40nM HRG刺激。该针对PI3K-Her3的测定设计基本上如图11A中所述。在两种情况下都接着进行上述固定化方法，除了都不用抗原修复试剂处理样品之外。数据表明通过HRG处理，Her2-Her3二聚体增加，但PI3K-Her3二聚体的量基本保持不变。
图15G表示对总PI3K，总Her2-Her3二聚体，以及总Her3的分析数据，其均与微管蛋白的量相关。用常规的夹心式测定法来测定微管蛋白，该方法采用了裂解探针和具有分子标签的结合化合物。测定微管蛋白用来测试针对代表样品中总细胞数目的靶的标准化二聚体测定的步骤，这在测定具有不同细胞类型的样品时可能需要。数据表明PI3K-Her3和Her2-Her3与微管蛋白的比例与直接在PI3K-Her3和Her2-Her3上进行的测定的定性相同。
权利要求
1.一种测定患者疾病状态的方法，该患者所患疾病的特征在于一种或多种细胞表面受体复合物的异常表达，该方法包括以下步骤直接测定患者样品中一种或多种细胞表面受体复合物中每种的量；将上述每种量与其在标准样品中的相应量相比较；以及将患者样品中的量与标准样品中分别相对应的量之差与患者的疾病状态相关联。
2.权利要求1所述的方法，其中所述患者样品是所述固定的组织样品或者所述冷冻的组织样品。
3.权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种细胞表面受体复合物是一种或多种受体酪氨酸激酶复合物并且其中所述疾病是癌症。
4.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种细胞表面受体复合物是一种或多种PDGF受体复合物。
5.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种PDGF受体复合物选自以下物质构成的组PDGFRα同型二聚体、PDGFRβ同型二聚体、PDGFRα-PDGFRβ异型二聚体、PDGFR-SHC复合物、PDGFR-PI3K复合物、Her1-PDGFR受体二聚体、Her2-PDGFR受体二聚体、Her3-PDGFR受体二聚体以及PDGFR-IGF-1R受体二聚体。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述疾病是癌症或者其中所述疾病与异常的纤维化状态相关。
7.权利要求6所述的方法，其中所述癌症选自以下病症构成的组乳腺癌、卵巢癌、和成胶质细胞瘤。
8.权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种PDGF受体复合物通过以下步骤测定向所述一种或多种PDGF受体复合物的每种提供一种试剂对，该试剂对包括具有有效近程的裂解引发部分的裂解探针，以及一种或多种结合化合物，每种具有一种或多种分子标签，通过可裂解连接物连接于其上，不同结合化合物的所述分子标签具有不同的分离特征；将所述裂解探针和针对每种所述一种或多种PDGF受体复合物的一种或多种结合化合物与患者样品混合，使得裂解探针和一种或多种结合化合物特异性结合于其相应的PDGF受体复合物上，并且所述一种或多种结合化合物的可裂解连接物处于裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及分离和鉴定所释放的分子标签，从而测定在所述患者样品中所述一种或多种PDGF受体复合物的存在与否或者量。
9.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种细胞表面受体复合物是一种或多种VEGF受体复合物。
10.权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种VEGF受体复合物选自以下物质构成的组VEGFR1同型二聚体、VEGFR2同型二聚体、VEGFR1-VEGFR2异型二聚体、VEGFR2-VEGFR3异型二聚体、VEGFR2-SHC复合物、以及VEGFR3-SHC复合物。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述疾病是癌症或者其中所述疾病与异常的血管生成相关。
12.权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种VEGF受体复合物通过以下步骤测定向所述一种或多种VEGF受体复合物的每种提供一种试剂对，该试剂对包括具有有效近程的裂解引发部分的裂解探针，以及一种或多种结合化合物，每种具有一种或多种分子标签，通过可裂解连接物连接于其上，不同结合化合物的所述分子标签具有不同的分离特征；将所述裂解探针和针对每种所述一种或多种VEGF受体复合物的一种或多种结合化合物与患者样品混合，使得裂解探针和一种或多种结合化合物特异性结合于其相应的VEGF受体复合物上，并且所述一种或多种结合化合物的可裂解连接物处于裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及分离和鉴定所释放的分子标签，从而测定在所述患者样品中所述一种或多种VEGF受体复合物的存在与否或者量。
13.权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种细胞表面受体复合物是选自以下物质构成的组的受体二聚体VEGFR1(Flt1)-VEGFR2(KDR)、VEGFR2(KDR)-VEGFR2(KDR)、PDGFRα-PDGFRα、PDGFRα-PDGFRβ、PDGFRβ-PDGFRβ、Kit/SCFR同型二聚体、FGFR同型二聚体、NGFR(TrkA)-NGFR(TrkA)、α2-肾上腺素受体同型二聚体、α2-肾上腺素-β2-肾上腺素异型二聚体、β2-肾上腺素受体同型二聚体、GABABR1-GABABR2受体异型二聚体、ATII受体同型二聚体、cholescystokinin-多巴胺受体同型二聚体、bradykinininB2受体同型二聚体、M2-M3muscarinic受体异型二聚体、CCR2受体同型二聚体、μ-δ鸦片受体异型二聚体、D1多巴胺受体同型二聚体、5-HT 1B-5-HT 1D受体异型二聚体、D2多巴胺受体同型二聚体、α2c-肾上腺素-M3 muscarinic受体异型二聚体、D3多巴胺受体同型二聚体、以及β2-肾上腺素-δ鸦片受体异型二聚体。
14.权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种受体二聚体通过以下步骤测定向所述一种或多种受体二聚体的每种提供一种试剂对，该试剂对包括具有有效近程的裂解引发部分的裂解探针，以及一种或多种结合化合物，每种具有一种或多种分子标签，通过可裂解连接物连接于其上，不同结合化合物的所述分子标签具有不同的分离特征；将所述裂解探针和针对每种所述一种或多种受体二聚体的一种或多种结合化合物与患者样品混合，使得裂解探针和一种或多种结合化合物特异性结合于其相应的受体二聚体上，并且所述一种或多种结合化合物的可裂解连接物处于裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及分离和鉴定所释放的分子标签，从而测定在所述患者样品中所述一种或多种受体二聚体的存在与否或者量。
15.一种针对一种或多种二聚体作用药物的癌症治疗来选择患者的方法，该方法包括以下步骤将含有癌细胞的患者样品从患者中分离；直接测定患者样品中一种或多种细胞表面受体二聚体中每种的量；将上述每种量与其在标准样品中的相应量相比校；以及无论何时来自所述患者样品的一种或多种细胞表面受体二聚体的量超出了标准样品中分别相应的量时，选择该患者用于一种或多种二聚体作用药物的治疗。
16.权利要求15所述的方法，其中所述细胞表面受体二聚体为VEGFR二聚体并且所述二聚体作用药物选自以下物质构成的组PTK787/K222584，ZD6474，SU6668，SU11248，CHR200131，CP547632，AG13736，CEP7055/5214和KRN633。
17.权利要求15所述的方法，其中所述细胞表面受体二聚体为PDGFE二聚体并且所述二聚体作用药物选自以下物质构成的组SU6668，SU11248，AG13736，CHR200131。
18.权利要求15所述的方法，其中所述细胞表面受体二聚体为FGFR二聚体并且所述二聚体作用药物选自以下物质构成的组CP547632和CHR200131。
19.根据权利要求15、16、17或18所述的方法，其中所述一种或多种细胞表面受体二聚体通过以下步骤测定向所述一种或多种细胞表面受体二聚体的每种提供一种试剂对，该试剂对包括具有有效近程的裂解引发部分的裂解探针，以及一种或多种结合化合物，每种具有一种或多种分子标签，通过可裂解连接物连接于其上，不同结合化合物的所述分子标签具有不同的分离特征；将所述裂解探针和针对每种所述一种或多种细胞表面受体二聚体的一种或多种结合化合物与患者样品混合，使得裂解探针和一种或多种结合化合物特异性结合于其相应的细胞表面受体二聚体上，并且所述一种或多种结合化合物的可裂解连接物处于裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及分离和鉴定所释放的分子标签，从而测定在所述患者样品中所述一种或多种细胞表面受体二聚体的存在与否或者量。
20.权利要求19所述的方法，其中所述患者样品是所述固定的组织样品、所述冷冻的组织样品或者循环上皮细胞。
21.一种测定患者癌症状态的方法，该患者所患癌症的特征在于一种或多种细胞表面受体复合物的异常表达，该方法包括以下步骤直接测定患者样品中一种或多种细胞表面受体复合物中每种的量；将上述每种量与其在标准样品中的相应量相比较；以及将患者样品中的量与标准样品中分别相对应的量之差与患者的疾病状态相关联；其中所述一种或多种细胞表面受体二聚体通过以下步骤测定向所述一种或多种细胞表面受体复合物的每种和一种或多种组织指示物提供一种试剂对，该试剂对包括具有有效近程的裂解引发部分的裂解探针，以及一种或多种结合化合物，每种具有一种或多种分子标签，通过可裂解连接物连接于其上，不同结合化合物的所述分子标签具有不同的分离特征；将所述裂解探针和针对每种所述一种或多种细胞表面受体复合物和一种或多种组织指示物的一种或多种结合化合物与所述患者样品混合，使得裂解探针和一种或多种结合化合物特异性结合于其相应的靶上，并且所述一种或多种结合化合物的可裂解连接物处于裂解引发部分的有效近程内，使分子标签被释放；以及分离和鉴定所释放的分子标签，从而测定在所述患者样品中所述一种或多种细胞表面受体复合物的存在与否或者量。
22.权利要求21的方法，其中所述疾病是癌症并且其中所述患者样品是固定组织样品、冷冻组织样品、或者循环上皮细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述疾病状态是所述患者对二聚体作用药物治疗的反应。
24.权利要求22的方法，其中所述癌症选自以下病症构成的组乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及结直肠癌。
25.权利要求22的方法，其中所述一种或多种细胞表面受体复合物选自以下物质构成的组PDGFRα同型二聚体、PDGFRβ同型二聚体、PDGFRα-PDGFRβ异型二聚体、PDGFR-SHC复合物、PDGFR-PI3K复合物、Her1-PDGFR受体二聚体、Her2-PDGFR受体二聚体、Her3-PDGFR受体二聚体、PDGFR-IGF-1R受体二聚体、VEGFR1同型二聚体、VEGFR2同型二聚体、VEGFR1-VEGFR2异型二聚体、VEGFR2-VEGFR3异型二聚体、VEGFR2-SHC复合物、以及VEGFR3-SHC复合物。
26.根据权利要求21、22、23、24或25所述的方法，其中所述组织指示物是微管蛋白或细胞角蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种患者样品中的新种类的生物标记，其包括细胞表面膜受体的二聚体。一方面，本发明包括一种测定疾病状态或健康状况的方法，其中将这类状况与在患者样品中，尤其是固定的组织样品中直接测定的一种或多种细胞表面膜受体二聚体的量相关联。另一方面，本发明包括一种测定来自个体的样本中癌症状态的方法，其中将样本细胞中一种或多种细胞表面受体二聚体的量测量值同这种状态相关联，包括癌症前期状态的存在与否、癌状态的存在与否、癌症预后、或者对治疗的反应性。优选地，本发明的方法通过采用成组的具有可释放的分子标签的结合化合物来实现，其对一种或多种类型的受体二聚体的多种成分具有特异性。
文档编号G01N33/543GK1829915SQ200480015245
公开日2006年9月6日 申请日期2004年3月30日 优先权日2003年4月1日
发明者P·－Y·陈－惠, H·萨利米－穆萨维, Y·施, S·辛, R·杜亚, A·穆克赫吉, S·皮达帕蒂 申请人:莫诺格兰姆生物科技公司