专利名称：波谱学方法
技术领域：
本发明涉及一种波谱学方法，特别是多维波谱学。
已知众多的波谱学方法用于研究两个或多个二级体系(two-level system)的偶合。一种已知的方法是二维核磁波谱学(2D-NMR)。所述体系的一个实例在Friebolin的“基础的一维和二维NMR波谱学(Basic one-and two-dimensional NMR spectroscopy)”第2版(1993年4月)(John Wiley & Sons出版)中公开。众所周知NMR取决于磁核与外加磁场的交感。为了在NMR波谱中展开拥挤的数据，已开发了2D-NMR。在典型的2D-NMR图形中，样品受制于延迟时间间隔开的第一和第二激发脉冲。由于样品间的交感和特别是自旋-自旋偶合，从第二激发脉冲获得的信息不同于从提供额外维数的第一激发脉冲获得的信息。傅立叶变换应用于从每一个激发脉冲的时谱以获得各自的频谱。频谱在正交坐标轴上绘图以形成表面。表面上的峰提供有关样品间交感的附加信息。
2D-NMR图能用于测定分子结构并提供用于确定溶液中的成分的惟一的、特有的特征(“指纹”)。其在化学，生物学，和其它学科中广泛应用于分析复杂混合物的分子结构。然而，2D-NMR缺乏灵敏度，典型地在1015-1018分子级别的探测受限。另外，2D-NMR仅在时域提供有限的解决方案。
在其它的已知波谱学方法中，类似于那些在2D-NMR波谱学中使用的技术已在2D振动或红外(IR)波谱学中采用，其中原子或分子的振动模式是受激。一种这样的已知的所谓的“泵浦-探头”(pump-probe)技术是Woutersen等人在J.Phys.Chem.B 104，11316-11320，2000“使用极化敏感的二维振动的波谱学在水中测定三丙氨酸的结构(Structure Determination of Trialanine in Water Using Polarization Sensitive Two-DimensionalVibrational Spectroscopy)”中公开的技术。进一步也已进行了2D-IR泵浦-探头试验，例如Hamm等人在Proc.Nat.Acad.Sci.96，2036，1999中公开的“关于其三维结构的环状的五-肽的二维IR非线性波谱学(The two-dimensional IR non-linear spectroscopy of a cyclicpenta-peptide in relation to its three-dimensional structure)”。
根据已知的IR体系，首先泵浦脉冲，随后探头脉冲，最终的频谱图在各自的轴上提供代表关于样品中振动-振动交感的信息的表面。因为偶合的二级量子体系的数学描述本质上相等，因此在2D-NMR中使用的分析原理和技术同样可用于2D IR波谱学中。然而，探测灵敏度受输入激光噪音严格限制，结果表明在大的背景信号上产生非常小的变化，特别是由同样样品的光学密度小的变化引起入射光束的强度的小变化。因此，对要检测的成分的浓度的灵敏度更低。
在某些情况下产生的另一个问题是当激发和探测波长处于中红外区域时，因此会遇到在那个区域的差的执行探测器的问题。
目前的技术还没有提供在低浓度下的高灵敏度的质量，或允许给定的复杂化学样品的全频和实时结果的指纹，对分子交感的时间表的高临时清晰度。特别是多维波谱学对低浓度的情况还没有实施。
本发明在权利要求中给出。
现在将通过实施例描述本发明的实施方案，参照
图1示出一种实施根据本发明波谱学的方法的装置。
总的看来，本发明涉及的波谱学方法依赖于在体系中原子或分子的振动模式的激发，例如红外激发源的激发。在体系中振动之间的交感允许二维或多维的信息通过合适的激发方式(regimes)获得。本发明取决于允许输出信号随样品浓度呈线性改变外差法探测。结果，例如与自差探测法相比，能分析更低的浓度，其中所述的自差探测法是一种取决于浓度的二次函数，因此，对于低浓度而言是非常弱的小信号。而且本发明进一步取决于从外部源的外差法场或者取决于由样品中的本地振荡器产生的场，以至线性项决定输出信号中二次项。
参照图1，示出的装置通常包括一样品10，含有在红外波段发射射线的激光源和探测器14。可调激光12和18各自发射波长/波数为3164cm-1和2253cm-1的激发光束，其激发一个或多个样品分子结构的振动模式并通过调制频率或提供可变的时间延迟而得到多维数据。在795nm的固定频率光束由第三激光16产生以提供以有效离散的输入光束形式的输出或读出，频率(严格地作为第四束产生)通过样品10的结构的交感而变化。该探测的信号通常在电磁光谱如在740nm的可见或近红外部分，含有光子能量不少于1eV.。为了获得多维数据，通过间隔在时域中的连续的光束激发所述样品。然而，任何合适的多维波谱学技术可被采用，例如通过改变在频域而不是在时域的输入。相似地，通过在时域的其它脉冲或在频域的其它频率可获得任何维数。尽管示出了传输方案，但在合适情况下，例如在表面沉积的样品，能够采用反射方案(其中样品反射被探测的光束)，。
为了获得本发明改进的灵敏度，改变装置的参数以实现外差法探测。这可通过提供一外部的外差法激发源进行，例如含有又一个激发激光或宽带激光源(未示出)或通过适当调制激发激光12或20。
无论如何，对本领域读者来说，将会从下述讨论中理解或清楚在各种方式下，体系是可变的或调制的。其中所述的本领域的读者，能够基于该讨论，通过常规的试验能够实现相关的目的。
通过定义，包括本发明的所有的波谱学方法都发射一种信号，其强度能够如下定义I＝(ELO)2+(EHO)2+(ELO×EHO)cosφ (1)这里，EHO是样品的自差法信号，可被认为是由所检测的样品成分发射的总电场。ELO是“本地振荡器”场，即，具有固定相差φ的与施于探测器同一频率的场。在标准的自差法探测中，没有本地振荡器场，强度简单地是自差法EHO2项，其与待研究的化学体系的浓度呈二次变化。在外差法探测中，另外设置一个本地振荡器并使其与探测器的时间和空间一致。通过这样做，以及通过本领域的读者熟悉的任何合适的技术除去(ELO)2项，该截项用于决定方程式。由本地振荡器强度的常识知道，输出场在浓度上呈线性。
与典型的一维波谱如吸收谱，傅立叶变换红外(FTIR)光谱等相适应的方法相比，可最佳地理解根据本发明开发的根本的物理机理。所述的一维波谱学取决于感应和/或测量总体状态变化。与所述的“总体波谱学”不同，本发明包括“相干波谱学”。
在量子力学概念中，光子和分子状态含有两个分离但相关的二等分。变化总体(例如，“被激发进入第一激发态的电子”)的交感实际上涉及两个与入射场的交感，各自作为讨论的状态的各一半。通过比较，与入射场的单个交感产生所知的相干的，两个分子状态完全的量子力学重合。该体系在与两个状态之间不同能量的相关频率来回振荡。该振荡以特有的频率(例如，上面的EHO)依次发射一场。现在清楚为何自差法导致一个与被探测光子的二次函数关系。然而为了作为第二交感，本发明的场被引入样品的外部(或样品内)，浓度上具有线性函数每个样品分子的场加上一个从外部场产生光子探测的场。因此我们定义两种类型的波谱学，利用相干(相干波谱学)和利用总体(总体波谱学)。相干波谱学需要相匹配作为条件—能量和动力守恒的直接结果—以确定对光束的输出方向。对于一组单个的，离散输入波长，确定惟一的输出方向(角度)。
结果，本发明方法提供一种令人吃惊的灵敏度水平，在样品中产生的信号场的情况下，并取决于自动地具有正确相关系的外差法场这样的事实。
至于在其中实施外差法探测的方式，如上所述，或者通过改变样品参数或者通过外部场产生器获得。
对于样品例如在溶液中提供的样品，本地振荡器场将会以固有产生的非-共振分布的形式自然存在于样品/溶剂中。通过确保非-共振分布显著地(说，10倍)比共振或信号的自差法部分分布更大，ELO和截项(cross terms)用于支配方程式(1)，我们能够充分地认为信号是外差法的。同样，信号在浓度上是线性的，并且达到探测限度之前，能够清楚地获得远远更低的浓度。而且，通过改变溶剂的类型，溶剂的浓度或体积，或样品容器的不同厚度，能够控制本地振荡器分布的相对尺寸，允许检查大范围的浓度。
另一种方式中，通过加入合适量的荧光吸收分子能够控制样品的相关参数，所述的荧光吸收分子的电子吸收是具有可见光束的共振。该吸收导致辐射和作为本地振荡器场的分子的极化。这是一种特别有用的方法，因为可准确控制本地振荡器分子的浓度。在那种情况下，附加激发源提供需要的极化。
在内-样品情况下，如那些内在地或固有地产生的本地振荡器场(ELO)2项能够通过确定和减去特定的本地振荡信号除去。该本地振荡信号能够在校准步骤中获得。
在其它的方法中，能够采用传统的光学外差法，其中本地振荡器场在样品的外部产生，并直接入射到具有样品场的探测器上。所述的本地振荡器的产生通常通过例如，在具有部分可见光束的合适的液体或固体中的连续统产生。在那种情况下，控制外部信号的特定参数以至相关的项在上述的方程式(1)中占优势，与传统的光学外差法体系相比，其中线性分布如上述进行详细的讨论非常广。除去(ELO)2项，可使用禁闭探测器简单地实现，在该探测器中，将具有狭槽的机械轮在(“断路器”)引入到激发束。狭槽遮挡光束(参考频率)的重复频率传递到禁闭探测器，该禁闭探测器基本上是频率过滤器-它测量从探测器来的整个的网络信号并提取在参考频率发生的信号成分。假如该参考频率不同于产生本地振荡器信号的光束的重复频率，对本地振荡器专有的网络信号成分将会减除。这样，ELO2项消失，EHO2项可忽略，截项在浓度上是线性的。
在另一个实施方案中，在Muller等人“Imaging the Thermodynamic State of LipidMembranes with Multiplex CARS Spectroscopy”J.Phys.Chem.B.106，3715-3723中描述的“多路技术”类型通过在红外使用宽带脉冲实现，通过超速脉冲产生以同时激发样品和其周围的光谱部分的红外跃迁。通过合适的选择光束的输入角度，能够获得相应于输入频率的惟一方向。结果，输出信号是含有所有空间上光谱信息的锥形射线；在此情况下，探测器14可为2D阵列探测器，如电荷耦合器件(CCD)捕获编码成空间维数的光谱信息。一旦再次获得改进的光谱解析方法，除了空间维数外，将附加维数通过脉冲时间延迟或者通过在上面详细讨论的频率变化引入以给出其它的、完全的详细的有关样品产生的光谱信息。覆盖频率波段的外差法由“连续统产生”获得，其中，许多本地振荡器频率在样品中产生，例如通过白光的外加激发以提供与宽带激发交感的外差场。
在本发明的特定实施方式中，利用已知的作为“前方线路所”的几何学图形(即，没有列在同样平面的三束激光12，16，18)和宽带激发束(大范围的输入波长以单束存在)。以此方式，产生一输出角度范围，对于在两个红外光束中存在的准离散的波长的给定组合产生惟一的输出方向。因此，光谱信息展开成空间特性的输出光束，且阵列探测器有效地在一次机会(shot)中捕获，而该机会可通过使用窄波段激发光束和点对点调制而建立。
在其它的、可选择的实施方案中，不使用外差法，紫外或可见激发激发电子共振，该共振依次产生由电子能量水平之间的跃迁引起的荧光。这是上面讨论的直接红外激发型的组合。在那种情况下，不需要从激光16的附加“读出”信号。输入红外和紫外光束和改变时间延迟的调制再次以上面详细描述的方式产生多维数据，但基于总体波谱学。
本发明能被广泛应用实施，特别是其中使用两个或多个光的可变频率或时间延迟，直接或间接地测量振动/振动偶合的多维光学波谱学是适于研究分子确认和/或结构的任何领域。该技术在低分子浓度时特别有效。例如本发明改善了低浓度探测的灵敏度水平，以至在合适的频率选择范围内，能研究气相和表面-沉积样品以允许在复杂混合物中如蛋白质溶液中的成分和它们浓度的确认。
本领域技术人员能够认识到能够采用任何合适的特殊成分和技术以实施本发明。典型地，可采用至少一种可调制红外激光源和至少一种其它可调制的紫外、可见或红外激光源，可使用任何合适的激光或实际上任何其它合适的激发源。在如参照图1讨论的两个红外激发光束的情况下，可加入其它固定频率光束并可再次采用任何合适的源。同样地，样品和溶剂能为任何合适的类型，其中控制它的成分以调制成如上所详细描述的体系，并以任何合适的相，包括气相和液相/溶液相。可采用任何合适的探测器，例如CCD或2D IR波谱学技术中已知的其它探测器。
激发波长的范围通常如上所述为红外，但能够为任何需要的合适波长以激发待分析结构的振动模式。尽管上述讨论基本上涉及二维分析，但可通过输入激发的参数的合适变化引入任何维数，例如频率，时间延迟/脉冲数目，或任何其它合适的参数。
权利要求
1.一种波谱学方法，其具有至少一种激发源参数和样品参数的可控参数，包括控制可控参数以在所述大量样品中产生本地振荡器场，支配从所述样品的自差法信号，激发所述样品的振动模式并获得受激样品的光谱。
2.如权利要求1的方法，其中所述样品被激发以获得至少两维的光谱。
3.如权利要求2的方法，其中样品激发在至少一种时域和频域中改变，以获得至少两维的光谱。
4.如前述任一项权利要求的方法，其中所述的可控参数是样品参数。
5.如权利要求4的方法，其中所述样品参数通过在所述样品中加入吸收性的分子而改变。
6.如前述任一项权利要求的方法，其中所述的可控参数包括至少一种外加激发源光束的频率，相或振幅。
7.一种波谱学方法，包括激发样品的振动模式、激发样品的电子模式和测量样品荧光变化的步骤，其中激发所述样品以获得至少两维的光谱。
8.一种波谱学方法，包括激发样品的振动模式、使用激发光束激发振动模式周围的光谱部分，通过宽带激发源在所述样品中产生宽带本地振荡器场，并探测空间可解析的输出束。
9.一种波谱学装置，包括一以激发样品的振动模式的激发源，以及一激发源以在所述大量样品中产生本地振荡器场，支配所述样品的自差法信号，激发所述样品的振动模式并获得受激样品的光谱。
10.一种波谱学装置，包括一以激发样品的振动模式的激发源，和一以在所述大量样品中产生本地振荡器场的样品，支配所述样品的自差法信号，激发所述样品的振动模式并获得受激样品的光谱。
11.一种波谱学装置，包括一以激发样品的振动模式的第一激发源，和一以激发样品的电子模式的第二激发源，其中激发所述模式以获得至少两维的光谱。
12.一种波谱学装置，包括一以激发样品的振动模式的激发源，和一以激发样品的振动模式周围的光谱部分的激发源和一具有在至少一个空间的维数的探测场的探测器，其中激发所述样品以获得至少两维的光谱。
13.一种如权利要求1-6任一项的方法，其中控制所述参数以至，其中发射强度由I＝(ELO)2+(EHO)2+(ELO×EHO)cosφ代表，ELO是如此以至截项支配EHO2。
全文摘要
一种波谱学方法和装置，包括以激发样品的振动模式的激发源，通过时域或频域激发的改变提供多维光谱信息。控制其它的激发源参数或样品参数，以通过确保在样品中产生的非－共振本地振荡器场支配在样品中产生的自差法信号，提供相干波谱学。结果，外差法探测以一种使得输出信号对浓度呈线性函数的方式实现，提供改进的灵敏度。
文档编号G01N21/31GK1902471SQ200480040045
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月5日 优先权日2003年11月7日
发明者大卫·克拉格, 强森·D·帕尔马 申请人:帝国学院创新有限公司