专利名称：Zibc基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ZIBC(Zinc finger protein Implicated in BreastCarcinogenesis)基因，该基因编码的蛋白，含有该基因的表达载体及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
肿瘤细胞的生长和增殖与许多蛋白有关，发现新的肿瘤基因及其编码的蛋白，抑制肿瘤基因表达这些蛋白，可有效阻止肿瘤细胞的生长和增殖，从而达到治疗肿瘤的效果。
发明内容
本发明发现了一种与乳腺癌等的癌细胞的生长和增殖有关的蛋白，克隆了编码该蛋白的基因，构建了含有该基因的表达载体和含有该表达载体的宿主细胞，并且发现该蛋白可促进乳腺癌、子宫癌、肝癌等肿瘤细胞的生长和增殖，基于以上发现，完成了本发明。
因此，在一个方面，本发明提供了可促进肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供了编码上述蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
在另一个方面，本发明提供了含有上述基因或者编码上述蛋白的基因的表达载体。
在又一个方面，本发明提供了由上述表达载体转化的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供了生产本发明的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤培养上述转化的宿主细胞，使转化细胞产生本发明的重组蛋白；和从培养物中分离出重组蛋白。
在另一个方面，本发明提供了针对上述蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。它可以是单克隆或多克隆抗体。
在另一个方面，本发明提供了检测所述蛋白的试剂盒，它含有上述特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示的蛋白。
此外，本发明提供了用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明还提供了以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增的引物，该引物如下所示
P1gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc tP2gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc。
本发明还提供了上述基因、蛋白或抗体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
附图简述
图1是本发明蛋白的结构示意图。
图2是ZIBC的原核表达图。
图3是ZIBC对肿瘤细胞生长增值的影响，左侧方柱为媒介物，右侧方柱为ZIBC。
以下是本发明的详细描述。
基因获取方式根据基因芯片检测所获EST序列，再通过生物信息学分析数据，设计了上下游引物，以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增，获取了该基因的ORF。引物设计如下P1gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc tP2gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc此基因命名为ZIBC(Zinc finger protein Implicated in BreastCarcinogenesis)。
真核表达载体的构建
以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pcDNA3.1(-)(Invitrogen)载体中，经转化DH5α(Invitrogen)菌株，得到ZIBC的真核表达载体。
ups 5’-GGAA TTCGCCACCATGGAGATCTCCTCTCATC-3’downs 5’-CGGGATCCACCCTAATGTTGGGCTTAATT-3’原核表达载体的构建以下列序列为引物，经过PCR扩增，克隆到pGEX-4T-3(Amersham)载体中，经转化BL21(Invitrogen)菌株，得到ZIBC的原核表达载体。
ups 5’-GGAATTCCATGGAGATCTCCTCTCATC-3’downs5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCTACCTAATGTTGGGCTTAATT-3’此基因定位与染色体1p35.1，全长为1882bp。表达蛋白约50kD。ORF序列(1326bp)。
编码蛋白的开放阅读框架编码一个441个氨基酸的蛋白质。根据生物信息学预测，这个蛋白质含有两个个主要的结构域，第一个是从第25至第121个氨基酸的BTB/POZ结构域，第二个是从第340至第419个氨基酸的未知保守结构域。图1是该基因的结构示意图。
同源序列H.sapiens ZBTB8 zinc finger and BTB domain containing8
M.musculus Zbtb8 zinc finger and BTB domain containing8对该蛋白进行生物信息学分析，发现其广谱表达。
cDNA sources膀胱，骨，脑，眼睛，心脏，肾，肝脏，肺，乳腺，肌肉，周围神经系统，前列腺，皮肤，小肠，胃，舌，睾丸，子宫，胚胎，成人。
通过使用本发明的蛋白或者免疫学上等效的多肽，可以获得其抗体，抗体用于所述蛋白的检测和纯化。可以利用本发明的蛋白或其部分氨基酸序列作为免疫原来产生抗体。可以通过将抗体接种给宿主动物并回收血清的常规方法产生多克隆抗体。还可以通过常规杂交瘤方法产生单克隆抗体。
利用MTT法检测不同浓度的ZIBC对MCF-7和T47-D(乳腺癌细胞)、ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细胞等肿瘤细胞增殖的影响，结果发现，ZIBC有促进肿瘤细胞增殖的作用。
通过抑制所述蛋白表达，或通过利用针对所述蛋白的抗体，可以抑制肿瘤细胞的生长和增殖，从而可以达到治疗肿瘤的目的。
实施例实施例1用PCR方法从人乳腺癌文库克隆编码ZIBC蛋白的基因用乳腺癌文库(Clontech公司)为模板，用下列引物进行PCR扩增Primer15’-gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc t-3’Primer25’-gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc-3’扩增反应条件在50μl的反应体系中含有50mmol/L KCL，10mmol/L Tris-Cl(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/LdNTP，20pmol引物，1U的Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)。在PTC-100型PCR仪(MJR公司)上按下列条件反应25个周期94℃ 30sec；55℃ 1min；72℃ 2min。扩增产物用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒纯化，用DNA限制性内切酶NotI和BamHI(NEB公司)进行切割(37℃ 12Hours)。由博亚公司进行测序得到一1326bp序列。
实施例2ZIBC在原核细胞中的表达及纯化pGEX-4T-3-ZIBC可以在大肠杆菌BL21菌株中30℃诱导表达GST-ZIBC的融合蛋白，首先制备BL21的感受态细胞挑取单克隆到适量培养基中，37℃ 250rpm培养至A6000.4-0.5，2500g离心15分钟，备用。将1-50ng pGEX-4T-3-ZIBC转化到上述制备的感受态细胞中，用Glutathione Sepharose 4B进行纯化，纯化的步骤如下(1)取单克隆到2-3mL 2YTA培养基中培养4-5小时。转接到100mL的锥形瓶中生长过夜。
(2)转接到500mL的锥形瓶中培养3-5小时。
(3)加0.5mL 1M IPTG 30℃，培养3-6小时。
(4)3000rpm 10分钟离心收集细胞。
(5)用25mL PBS重悬细胞。超声10分钟。
(6)加1.25mL 20％Triton X-100，混匀1小时。
(7)1000rpm 10分钟离心，加入0.5mL 50％ slurry of GlutathioneSepharose 4B，室温30分钟。
(8)1000rpm 5分钟离心，PBS洗三遍。
(9)用0.5mL洗脱Buffer洗脱，短暂离心后收集上清。
电泳结果如图2所示。
实施例3MTT法检测不同浓度的ZIBC对肿瘤细胞增殖的影响MTT(四甲基偶氮唑兰)可被细胞摄取，并被活细胞内线粒体脱氢酶还原成一种不溶于水的蓝紫色产物甲瓒，并沉淀于细胞中，而死细胞没有这种功能。甲瓒可溶于二甲基亚砜(DMSO)，溶液在570nm处有最大吸收。故该波段处吸收值越大代表存活细胞量越多。MTT法广泛应用于细胞毒性实验、细胞生长测定等。本实验利用MTT法观察ZIBC对MCF-7生长的影响。具体操作方法如下将培养到对数生长期的MCF-7和T47-D(乳腺癌细胞)、ECC-1和Ishikawa(子宫癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)细胞接种于96孔板中，每孔接种细胞数为1×104个。次日按照浓度梯度加入ZIBC(100ng)，每浓度作用6孔细胞，37℃，5％CO2进行培养。分别培养1d、2d、3d、4d后，在每个细胞培养孔内加入50μlLl mg/mL的MTT溶液，同样培养条件下作用4小时后取出，小心吸出每孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150μL，轻微振荡10分钟，使蓝紫色结晶充分溶解在二甲基亚砜中。用自动酶标仪测量96孔板中每孔在570nm处的吸光值。结果如图3所示，说明本发明的蛋白有促进肿瘤细胞增殖的作用。
ZIBC序~1SEQUENCE LISTING<110>北京大学<120>ZIBC基因及其编码的蛋白和应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1326<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(1323)<223>
<400>1atg gag atc tcc tct cat cag tct cac ctc ctg cag caa ctg aac gag 48Met Glu Ile Ser Ser His Gln Ser His Leu Leu Gln Gln Leu Asn Glu1 5 10 15cag cgc agg caa gat gta ttt tgt gac tgc agt att cta gtt gaa ggg 96Gln Arg Arg Gln Asp Val Phe Cys Asp Cys Ser Ile Leu Val Glu Gly20 25 30aag gtc ttc aaa gca cat cga aat gta tta ttc gct agt agc ggc tac144Lys Val Phe Lys Ala His Arg Asn Val Leu Phe Ala Ser Ser Gly Tyr35 40 45ttt aaa atg ctt ctt tct cag aat tca aag gag acg agt cag cca acc192Phe Lys Met Leu Leu Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Ser Gln Pro Thr50 55 60aca gct aca ttt cag gct ttc tcc cct gac act ttt aca gtt atc ttg240Thr Ala Thr Phe Gln Ala Phe Ser Pro Asp Thr Phe Thr Val Ile Leu65 70 75 80gac ttc gta tat tct ggc aaa ctg tct ctt act ggt cag aat gtc ata288Asp Phe Val Tyr Ser Gly Lys Leu Ser Leu Thr Gly Gln Asn Val Ile85 90 95gaa gtg atg tcg gct gct agc ttc ctt cag atg act gat gtc ata agt336Glu Val Met Ser Ala Ala Ser Phe Leu Gln Met Thr Asp Val Ile Ser100 105 110gta tgt aag act ttt att aaa tct tcc tta gac att agt gag aaa gaa384Val Cys Lys Thr Phe Ile Lys Ser Ser Leu Asp Ile Ser Glu Lys Glu115 120 125aaa gat cgc tat ttc agt ctc tca gat aaa gat gcc aat tct aat ggt432
ZIBC序~1Lys Asp Arg Tyr Phe Ser Leu Ser Asp Lys Asp Ala Asn Ser Asn Gly130 135 140gta gaa cgt tcc tct ttt tat agt ggt ggc tgg caa gaa gga agc agt 480Val Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Gly Gly Trp Gln Glu Gly Ser Ser145 150 155 160tct cca cgt tct cac cta agc cca gag caa gga aca ggt ata ata agt 528Ser Pro Arg Ser His Leu Ser Pro Glu Gln Gly Thr Gly Ile Ile Ser165 170 175gga aaa tct tgg aat aag tat aat tat cat cca gcc tcc cag aag aat 576Gly Lys Ser Trp Asn Lys Tyr Asn Tyr His Pro Ala Ser Gln Lys Asn180 185 190act caa caa ccc ttg gcc aag cat gaa cca agg aaa gag tcc att aaa 624Thr Gln Gln Pro Leu Ala Lys His Glu Pro Arg Lys Glu Ser Ile Lys195 200 205aag acc aaa cat ttg aga ttg tca cag cct tct gaa gtt act cat tat 672Lys Thr Lys His Leu Arg Leu Ser Gln Pro Ser Glu Val Thr His Tyr210 215 220aag tca agc aaa cga gaa gta cga aca tct gat tct tcc agc cat gtt 720Lys Ser Ser Lys Arg Glu Val Arg Thr Ser Asp Ser Ser Ser His Val225 230 235 240tcc cag tct gaa gaa caa gca cag att gat gct gaa atg gac tct act 768Ser Gln Ser Glu Glu Gln Ala Gln Ile Asp Ala Glu Met Asp Ser Thr245 250 255cct gtt ggc tat cag tac ggt caa gga tct gat gtc aca tcc aaa agc 816Pro Val Gly Tyr Gln Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Val Thr Ser Lys Ser260 265 270ttt cca gat gat ctg cct cgg atg cga ttc aag tgc ccg tac tgc aca 864Phe Pro Asp Asp Leu Pro Arg Met Arg Phe Lys Cys Pro Tyr Cys Thr275 280 285cat gtg gtg aag cgg aag gca gac cta aag cgc cac ctt cgt tgt cat 912His Val Val Lys Arg Lys Ala Asp Leu Lys Arg His Leu Arg Cys His290 295 300aca gga gaa agg ccc tat cca tgt caa gct tgt gga aaa aga ttt agc 960Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Pro Cys Gln Ala Cys Gly Lys Arg Phe Ser305 310 315 320agg cta gac cat cta agt agc cat ttt cga aca att cac cag gca tgt1008Arg Leu Asp His Leu Ser Ser His Phe Arg Thr Ile His Gln Ala Cys325 330 335aaa ctc atc tgc aga aaa tgt aaa cgt cat gtg aca gat cta aca ggg1056Lys Leu Ile Cys Arg Lys Cys Lys Arg His Val Thr Asp Leu Thr Gly340 345 350caa gtg gta cag gag gga acc agg cgc tac aga ctg tgt aat gag tgt1104
ZIBC序~1Gln Val Val Gln Glu Gly Thr Arg Arg Tyr Arg Leu Cys Asn Glu Cys355 360 365ctt gca gaa ttt ggc ata gac agc ctc ccc att gac ttg gaa gct gaa1152Leu Ala Glu Phe Gly Ile Asp Ser Leu Pro Ile Asp Leu Glu Ala Glu370 375 380caa cat ctt atg tcc cca tca gat gga gat aag gat tcc aga tgg cac1200Gln His Leu Met Ser Pro Ser Asp Gly Asp Lys Asp Ser Arg Trp His385 390 395 400ttg agt gaa gat gag aat aga tcc tat gtg gag att gta gaa gat ggg1248Leu Ser Glu Asp Glu Asn Arg Ser Tyr Val Glu Ile Val Glu Asp Gly405 410 415tct gct gat ctg gtc atc caa cag gtt gat gat agt gaa gaa gaa gaa1296Ser Ala Asp Leu Val Ile Gln Gln Val Asp Asp Ser Glu Glu Glu Glu420 425 430gaa aaa gaa att aag ccc aac att agg tag1326Glu Lys Glu Ile Lys Pro Asn Ile Arg435 440<210>2<211>441<212>PRT<213>人<400>2Met Glu Ile Ser Ser His Gln Ser His Leu Leu Gln Gln Leu Asn Glu1 5 10 15Gln Arg Arg Gln Asp Val Phe Cys Asp Cys Ser Ile Leu Val Glu Gly20 25 30Lys Val Phe Lys Ala His Arg Asn Val Leu Phe Ala Ser Ser Gly Tyr35 40 45Phe Lys Met Leu Leu Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Ser Gln Pro Thr50 55 60Thr Ala Thr Phe Gln Ala Phe Ser Pro Asp Thr Phe Thr Val Ile Leu65 70 75 80Asp Phe Val Tyr Ser Gly Lys Leu Ser Leu Thr Gly Gln Asn Val Ile85 90 95Glu Val Met Ser Ala Ala Ser Phe Leu Gln Met Thr Asp Val Ile Ser
ZIBC序~1100 105 110Val Cys Lys Thr Phe Ile Lys Ser Ser Leu Asp Ile Ser Glu Lys Glu115 120 125Lys Asp Arg Tyr Phe Ser Leu Ser Asp Lys Asp Ala Asn Ser Asn Gly130 135 140Val Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Gly Gly Trp Gln Glu Gly Ser Ser145 150 155 160Ser Pro Arg Ser His Leu Ser Pro Glu Gln Gly Thr Gly Ile Ile Ser165 170 175Gly Lys Ser Trp Asn Lys Tyr Asn Tyr His Pro Ala Ser Gln Lys Asn180 185 190Thr Gln Gln Pro Leu Ala Lys His Glu Pro Arg Lys Glu Ser Ile Lys195 200 205Lys Thr Lys His Leu Arg Leu Ser Gln Pro Ser Glu Val Thr His Tyr210 215 220Lys Ser Ser Lys Arg Glu Val Arg Thr Ser Asp Ser Ser Ser His Val225 230 235 240Ser Gln Ser Glu Glu Gln Ala Gln Ile Asp Ala Glu Met Asp Ser Thr245 250 255Pro Val Gly Tyr Gln Tyr Gly Gln Gly Ser Asp Val Thr Ser Lys Ser260 265 270Phe Pro Asp Asp Leu Pro Arg Met Arg Phe Lys Cys Pro Tyr Cys Thr275 280 285His Val Val Lys Arg Lys Ala Asp Leu Lys Arg His Leu Arg Cys His290 295 300Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Pro Cys Gln Ala Cys Gly Lys Arg Phe Ser305 310 315 320Arg Leu Asp His Leu Ser Ser His Phe Arg Thr Ile His Gln Ala Cys
ZIBC序~1325 330 335Lys Leu Ile Cys Arg Lys Cys Lys Arg His Val Thr Asp Leu Thr Gly340 345 350Gln Val Val Gln Glu Gly Thr Arg Arg Tyr Arg Leu Cys Asn Glu Cys355 360 365Leu Ala Glu Phe Gly Ile Asp Ser Leu Pro Ile Asp Leu Glu Ala Glu370 375 380Gln His Leu Met Ser Pro Ser Asp Gly Asp Lys Asp Ser Arg Trp His385 390 395 400Leu Ser Glu Asp Glu Asn Arg Ser Tyr Val Glu Ile Val Glu Asp Gly405 410 415Ser Ala Asp Leu Val Ile Gln Gln Val Asp Asp Ser Glu Glu Glu Glu420 425 430Glu Lys Glu Ile Lys Pro Asn Ile Arg435 440
权利要求
1.可促进肿瘤细胞的生长和增殖的蛋白，尤其重组蛋白，该蛋白具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，或者通过所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，取代或增加而得到的氨基酸序列。
2.编码权利要求1的蛋白的基因，它是具有序列1所示的碱基序列的DNA或者与所述DNA在严格条件下杂交的DNA。
3.含有权利要求2的基因或者编码权利要求1的蛋白的基因的表达载体。
4.由权利要求3的表达载体转化的宿主细胞。
5.生产权利要求1的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤培养权利要求4的转化的宿主细胞，使转化细胞产生权利要求1的重组蛋白；和从培养物中分离出重组蛋白。
6.针对权利要求1的蛋白的抗体，它是使用所述重组蛋白作为免疫原而产生的特异性抗体。
7.检测所述蛋白的试剂盒，它含有上述特异性抗体，可以进行抗原-抗体反应，用于检测具有序列2所示的蛋白。
8.用于检测序列1所示的核苷酸序列的探针诊断试剂盒，它含有与核苷酸序列1中的部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。
9.以乳腺cDNA文库作为模板进行PCR扩增的引物，该引物如下所示P1gct agc ggc cgc cgc atg gag atc tcc tP2gcg agg atc cct acc taa tgt tgg gc。
10.权利要求1的蛋白或权利要求2的基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及ZIBC(Zinc finger protein Implicated inBreast Carcinogenesis)基因，该基因编码的蛋白，含有该基因的表达载体及其在肿瘤治疗中的应用。
文档编号G01N33/53GK1807451SQ20051001119
公开日2006年7月26日 申请日期2005年1月18日 优先权日2005年1月18日
发明者尚永丰, 吴歌 申请人:北京大学