专利名称：静电纺丝制备的固定酶电极及其方法
技术领域：
本发明涉及一种静电纺丝制备的固定酶电极及其方法，属于固定化酶电极技术。
背景技术：
固定化酶电极是将具有生物催化作用的酶固定在电极材料表面，从酶催化电极反应产生的电极电位和响应电流得到组分的详细信息。固定化酶电极是生物传感器、生物燃料电池等的关键组成部件。其中生物传感器作为近几十年来出现的一种新型传感技术，在临床诊断、食品和药物分析、环境分析、生物药物开发、工业控制、军事、生物芯片和生物技术等方面均有应用。生物燃料电池可以利用生物体内的有机物作为燃料产生电能，是一种清洁、绿色、纯天然的可再生能源。
常见的固定酶电极制备方法主要有包埋、共价键、吸附、交联、静电组装等。包埋法是将酶用凝胶或微胶囊包埋于格状结构或胶囊结构中，方法简便，采用具有良好生物亲和性的凝胶材料使固定酶量多，活性高，电极灵敏度高，但是酶易流失，从而使使用寿命降低；吸附法是利用酶与载体间的范德华力、离子键、氢键等作用力固定酶的方法，可以保留酶的活性，酶结合力强，但是酶的负载量较低，灵敏度低，长期使用会由于解吸附造成灵敏度下降；交联法是使酶与带两个以上的多功能团试剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体，这种方法是用化学结合的固定酶，结合力强，酶不易流失，但缺点是交联剂降低了酶的活性；静电组装是通过带相反电荷的聚电解质静电相互作用固定酶，方法简单，稳定性好不受基体材料的尺寸限制，可以在分子水平控制膜的组成结构和厚度，适用性广；此外，还有碳糊固定酶电极、导电聚合物固定酶电极等方法。
目前市售的生物传感器酶电极均用上述方法制备。如US6，280，587，CN1，186，115主要采用包埋酶的方法制备酶电极；Decher G等用静电自组装形成的高分子聚合物膜固定酶电极(Decher G et.al，Chem.Macromol.Symp.1991，46)。CN1563969A综合了包埋技术、纳米技术，用PEM膜层制备了酶电极。
静电纺丝是聚合物溶液或熔体借助于高压静电作用进行喷射拉伸而形成超细纤维的纺丝方法。通过静电纺丝可最终在接收屏上形成纳米级长丝(Z.M.Huang，Y.Z.Zhang，M.Kotaki，et al.，[J].Comp.Sci.Technol.，2003，632223-2253.)。静电纺丝法可用于超级电容器、聚合物电解质、场效应晶体管等的研制中，也可以用来固定酶。Lili Wu等利用PVA静电纺丝的方法固定化纤维素酶催化纤维素的水解(Lili Wu，Xiaoyan Yuan.，Jing Sheng，[J].Journal of Membrane Science 2005，250167～173)，Jia等用静电纺丝制备的纳米纤维固定α-糜蛋白酶(Jia HF，Zhu GY et.al，Biotechnol Prog，2002)。Bin Ding等提出用PVA和PAA共纺的方法构筑NH3亲和型传感器(Bin Ding，JinhoKim，Yasuo Miyazaki，[J].Sensors and Actuators B，2004，101373-380)，但通过静电纺丝的方法固定化酶构筑安培型生物传感器和生物燃料电池尚未见文献报道。通过静电纺丝的方法制备超细纤维同时固定酶，制备的活性酶膜面积大，制备方法简单，适用于批量化生产，在生物传感器及生物燃料电池电极的制备方面将有很现实的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种静电纺丝制备的固定酶电极及其方法，该固定酶电极具有活性酶膜面积大，制备过程简单，使用寿命长的特点。
本发明是通过下述技术方案加以实现的，一种静电纺丝制备的固定酶电极，它由电极基底、反应层构成。其特征在于，反应层由聚合物的纳米纤维薄膜及膜内氧化还原酶构成，或者反应层由聚合物的纳米纤维薄膜及膜内氧化还原酶和粒径为5～100纳米电活性金属粒子或碳纳米管构成，或者反应层由聚合物的纳米纤维薄膜及膜内氧化还原酶和电子介体构成。
上述的聚合物的纳米纤维薄膜为聚乙烯醇、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯胺中的一种或两种以上的纳米纤维薄膜。
上述聚合物薄膜的层数为1-3层，每层膜厚度在5～50nm。
上述氧化还原酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆红素氧化酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、辣根过氧化物酶、细胞色素C氧化酶、微过氧化物酶中的一种或两种以上。
上述电活性纳米金属粒子为金颗粒、银颗粒、铜颗粒、二氧化硅颗粒中的一种或两种以上，粒径范围在30～80nm。
上述电子介体为二茂铁系聚合物、含配位键的锇或钌电活性过渡金属螯合物。
上述的生物酶电极的制备方法，其特征在于包括以下过程1)用粒径10-50μm的Al2O3粉在鹿皮上打磨工作电极的下端部分，使之光亮洁净，经二次去离子水反复冲洗后，置于pH＝6.8的磷酸缓冲溶液(PBS)中经循环伏安扫描至稳定。
2)用聚乙烯醇、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯胺中的一种或两种以上，加入去离子水，经水浴加热并搅拌使之完全溶解，搅拌下冷却至室温，制得质量体积比浓度为1％-10％的水溶液。
3)向按步骤2)已配制好的溶液中，加入葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆红素氧化酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、辣根过氧化物酶、细胞色素C氧化酶、微过氧化物酶中的一种或两种以上酶溶液或混合溶液，每毫升溶液加入10～500u。
(1)或者向步骤3)配制的含酶溶液中加入含有金颗粒、银颗粒、铜颗粒、二氧化硅颗粒中的一种或两种以上，加入比例为每毫升凝胶溶液中加入10-40μl。
(2)或者向步骤3)含酶和金属颗粒的溶液种加入二茂铁系聚合物、含配位键的锇或钌电活性过渡金属螯合物。
4)将步骤3)中含有氧化还原酶的溶液或按步骤3)中(1)或步骤3)中(2)配制好的溶液分别注入带有针头(12号，内径0.8mm，长度约为30mm，尖端磨平)的注射器，将注射器固定在注射泵上。以流量为0.1ml/h，电压为10kV，在接收屏上和电极上收集纺丝纤维，纺丝时间为1.5-3h。纺丝结束后置于低温箱中(4℃)备用。
5)将纺丝置于浓度为10％-30％的戊二醛溶液的上方，在37℃常压环境下以戊二醛的蒸汽对纺丝纤维进行交联。交联后用去离子水清洗，得到静电纺丝制备的固定酶电极。
本发明的有益效果在于，1)通过静电纺丝的方法制备的固定酶电极可以将酶和电子介体有效的固定在基片表面，扫描电镜照片表明通过静电纺丝方法得到了固定有酶和电子介体的纳米纺丝纤维膜。
2)静电纺丝所得到的酶电极具有更好的响应性能，其响应电流高。通过在纺丝膜中加入电子介体，提高了酶膜的电子传输能力，有利于提高酶电极的抗干扰能力。
3)通过静电纺丝的方法制备超细纤维同时固定酶，制备的活性酶膜面积大，制备方法简单，适用于批量化生产，该方法在生物传感器及生物燃料电池电极的制备方面将有很现实的意义。
图1为未加酶的静电纺丝扫描电镜照片，图2为按照实施例1制备的静电纺丝电极电镜照片。从图中可以看到在纺丝纤维上出现了一些呈梭状的突起，这是因为酶的加入，削弱了溶液形成纺丝喷射细流的能力，从而产生了梭形珠。
图3中(A)为用聚乙烯醇(PVA)静电纺丝的IR谱图，(B)为用实施例2制备电极的IR谱图。
图4中(a)为实施例3与浇铸膜法所得酶电极C-V曲线的比较；(b)实施例3与实施例7所得酶电极的C-V曲线；(c)实施例5酶电极的C-V曲线；(d)实施例6酶电极的C-V曲线。
具体实施例方式
实施例1将金基片用粒径均匀的Al2O3粉在鹿皮上打磨抛光，经二次蒸馏水反复冲洗后，置于pH＝6.8的磷酸缓冲溶液(PBS)中经循环伏安扫描至稳定。称取PVA加入去离子水，经水浴加热并搅拌使PVA完全溶解，搅拌下冷却至室温，制得浓度质量体积比为8％的PVA水溶液。取5ml已制好的PVA水溶液，加入198μL的葡萄糖氧化酶，以保证溶液中GOD浓度为200U/ml。向PVA水溶液中加入120μL纳米金溶液。加入纳米金溶液的PVA/葡萄糖氧化酶混合溶液注入带有针头的注射器，将注射器固定在注射泵上。在距离针头10cm处放置接地接收屏(铝箔)，在铝箔中央开孔，孔的直径与基片直径相当。将预处理过的基片穿过该孔并固定好，使基片端面与铝箔平齐。基片与接地相连，而将针头与高压电源相连，打开注射泵开关，设定流量为0.1ml/h。随着注射泵的步进挤压，纺丝液在针头形成半球状液滴，此时打开高压电源并调整电压为10kV，在接收屏上和基片上收集纺丝纤维。通过卤钨灯观察纺丝过程，纺丝时间为1.5-3h。实验结束后，关闭高压电源，把针头、接收屏以及基片放电，并将铝箔与基片取下，置于冰箱中(4℃)备用。将纺好的基片和接收铝箔置于冰箱中备用。将纺好的基片置于25％的戊二醛溶液的容器上方，在37℃常压环境下放置一段时间(2h)，以戊二醛的蒸汽对纺丝纤维进行交联。
实施例2用铜电极作为工作电极的基底电极，其他与实施例1相同。
图3为在铜电极基底上未加酶与加酶电极的对比。(A)上3364cm-1左右的宽峰是PVA中O-H的伸缩振动峰，也是PVA的特征吸收峰；2943cm-1左右为-CH2的伸缩振动峰；1420cm-1左右是O-H和C-H弯曲振动以及-CH2的弯曲振动引起的吸收峰；1096cm-1左右是C-O(多缔和体)单键伸缩和O-H弯曲振动吸收峰，854cm-1左右是与全同立构序列有关的特征峰。在PVA/GOD谱图[图(B)]上出现了PVA的特征吸收峰，同时由于葡萄糖氧化酶分子中N-H的伸缩振动峰与O-H的伸缩振动峰相交叠，因此在3348cm-1左右处的吸收峰比PVA的宽。PVA/GOD红外谱图上1654cm-1处的特征吸收峰为酰胺键吸收峰。由此可以说明PVA/GOD酶膜上确有酶的存在。
实施例3用铂电极作为工作电极的基底电极，其他与实施例1相同。
实施例4用碳电极作为工作电极的基底电极，其他与实施例1相同。
实施例5将加入纳米金颗粒的浓度调整为2.3％(V/V)，纺丝时间1.5h(V/V)，纺丝时间2.5h，其余与实施例1相同。
实施例6将加入纳米金颗粒的浓度调整为2.3％(V/V)，纺丝时间5.5％(V/V)，纺丝时间2.5h，其余与实施例1相同。
实施例7用实施例1的方法但不加纳米金颗粒制备。
图4显示出实施例3、实施例7、实施例5、实施例6酶电极的C-V曲线对比。扫描速率为50mV/s时，静电纺丝固定酶电极的峰值电流相对浇铸膜固定酶电极有较大提高。未加入纳米金溶液的酶电极的C-V曲线其峰值响应电流较小，且没有出现氧化还原峰。由于葡萄糖、尿酸、抗坏血酸等物质均会在0.6V电位附近出现峰值电流，通过加入纳米金使葡萄糖出现峰值电流的工作电位降低，从而排除了在对葡萄糖进行测试时尿酸、抗坏血酸等物质的干扰。加入的纳米金的量较小，纺丝时间较短，所得纺丝纤维膜较薄(目应固载的酶量也较少)，峰值响应电流相对较小。随着纳米金含量的增加和纺丝时间的延长，酶电极峰值响应电流有了较大提高。
实施例8用纳米银颗粒代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例9用纳米铜颗粒代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例10用纳米二氧化硅颗粒代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例11用混合的纳米金和纳米二氧化硅颗粒代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例12用混合的纳米金和纳米银和纳米二氧化硅代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例13用单壁纳米管代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例14用多壁纳米管代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例15用二茂铁代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例16用普鲁士蓝代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例17用含配位键的锇螯合物代替纳米金颗粒，其余与实施例1相同。
实施例18用乳酸氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例19用尿酸氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例20用胆固醇酯酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例21用胆红素氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例22用乙酰胆碱酯酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例23用漆酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例24用辣根过氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例25用细胞色素C氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例26用微过氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例27用混合的葡萄糖氧化酶和微过氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例28用混合的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例29用胆固醇氧化酶代替葡萄糖氧化酶，其余与实施例1相同。
实施例30用明胶代替聚乙烯醇，其余与实施例1相同。
实施例31用壳聚糖代替聚乙烯醇，其余与实施例1相同。
实施例32用海藻酸钠代替聚乙烯醇，其余与实施例1相同。
实施例33称取海藻酸钠加入去离子水，经水浴加热并搅拌使海藻酸钠完全溶解，搅拌下冷却至室温，制得浓度质量体积比为3％的海藻酸钠水溶液。取5ml已制好的海藻酸钠水溶液，加入260μl的葡萄糖氧化酶和1g聚乙烯吡咯烷酮。再向海藻酸钠水溶液中加入200μl去离子水，加入200μl纳米银溶液。加入纳米银溶液的海藻酸钠/葡萄糖氧化酶混合溶液注入带有针头的注射器，将注射器固定在注射泵上。按实施例1的方法制备电极。设定注射泵流量为0.15ml/h，调整高压电源电压为8kV，纺丝时间为2h。以戊二醛的蒸汽对纺丝纤维进行交联。其余与实施例1相同。
实施例34将基片打磨抛光，冲洗后，置于pH＝6.8的磷酸缓冲溶液(PBS)中经循环伏安扫描至稳定。配制1％的二茂铁的乙醇溶液，并在基片上滴加20μl，室温下晾干。称取明胶加入去离子水，制成5％的明胶水溶液。取5ml加入200μl的葡萄糖氧化酶。再加入200ul去离子水和纳米银溶液。将混合液注入带有针头的注射器，将注射器固定在注射泵上。在距离针头10cm处放置接地接收屏(铝箔)，在铝箔中央开孔，孔的直径与基片直径相当。将预处理过的基片穿过该孔并固定好。基片与接地相连，而将针头与高压电源相连，打开注射泵开关，设定流量为0.15ml/h。随着注射泵的步进挤压，在基片上收集纺丝纤维。通过卤钨灯观察纺丝过程，纺丝时间为2h。实验结束后，关闭高压电源，把针头、接收屏以及基片放电，并将铝箔与基片取下，置于冰箱中(4℃)备用。将纺好的基片和接收铝箔置于冰箱中备用。将纺好的基片用25％的戊二醛溶液交联。
权利要求
1一种静电纺丝制备的固定酶电极，该酶电极由电极基底、反应层构成，其特征在于，反应层由聚合物的纳米纤维薄膜及膜内氧化还原酶构成，或者反应层由聚合物的纳米纤维薄膜及膜内氧化还原酶和粒径为5～100纳米电活性金属粒子或碳纳米管构成，或者反应层由聚合物的纳米纤维薄膜及膜内氧化还原酶和电子介体构成。
2按权利要求1所述的酶电极，其特征在于，聚合物的纳米纤维薄膜为聚乙烯醇、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯胺中的一种或两种以上的纳米纤维薄膜。
3按权利要求1所述的酶电极，其特征在于，聚合物薄膜的层数为1-3层，每层膜厚度在5～50nm。
4按权利要求1所述的酶电极，其特征在于，氧化还原酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆红素氧化酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、辣根过氧化物酶、细胞色素C氧化酶、微过氧化物酶中的一种或两种以上。
5按权利要求1所述的酶电极，其特征在于，电活性纳米金属粒子为金颗粒、银颗粒、铜颗粒、二氧化硅颗粒中的一种或两种以上，粒径范围在30～80nm。
6按权利要求1所述的酶电极，其特征在于，电子介体为二茂铁系聚合物、含配位键的锇或钌电活性过渡金属螯合物。
7一种制备权利要求1所述的生物酶电极的方法，其特征在于包括以下过程1)用粒径10-50μm的Al2O3粉在鹿皮上打磨工作电极的下端部分，使之光亮洁净，经二次去离子水反复冲洗后，置于pH＝6.8的磷酸缓冲溶液中经循环伏安扫描至稳定；2)用聚乙烯醇、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚苯胺中的一种或两种以上，加入去离子水，经水浴加热并搅拌使之完全溶解，搅拌下冷却至室温，制得质量体积比浓度为1％-10％的水溶液；3)向按步骤2)已配制好的溶液中，加入葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、胆红素氧化酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、辣根过氧化物酶、细胞色素C氧化酶、微过氧化物酶中的一种或两种以上酶溶液或混合溶液，每毫升溶液加入10～500u；(1)或者向步骤3)配制的含酶溶液中加入含有金颗粒、银颗粒、铜颗粒、二氧化硅颗粒中的一种或两种以上，加入比例为每毫升凝胶溶液中加入10-40μl；(2)或者向步骤3)配制的含酶溶液中加入二茂铁系聚合物或含配位键的锇或钌电活性过渡金属螯合物；4)将步骤3)中含有氧化还原酶的溶液或按步骤3)中(1)或步骤3)中(2)配制好的溶液分别注入带有针头的注射器，将注射器固定在注射泵上，以流量为0.1ml/h，电压为10kV，在接收屏上和电极上收集纺丝纤维，纺丝时间为1.5-3h，纺丝结束后置于4℃低温箱中备用；5)将纺丝置于浓度为10％-30％的戊二醛溶液的上方，在37℃常压环境下以戊二醛的蒸汽对纺丝纤维进行交联，交联后用去离子水清洗，得到静电纺丝制备的固定酶电极。
全文摘要
本发明公开一种静电纺丝制备的固定酶电极及其方法，属于固定化酶电极技术。所述的酶电极由电极基底、反应层构成，反应层由聚合物的纳米纤维薄膜及膜内氧化还原酶构成，或者反应层由聚合物的纳米纤维薄膜及膜内氧化还原酶和粒径为5～100纳米电活性金属粒子或碳纳米管构成，或者反应层由聚合物的纳米纤维薄膜及膜内氧化还原酶和电子介体构成。其制备方法包括以下过程电极打磨，聚合物溶液的配制，配制含有氧化还原酶的聚合物溶液，或向含有氧化还原酶的聚合物溶液中加入钠米金属颗粒或电子介体，将上述溶液用静电纺丝制得酶电极。本发明的优点在于制备的酶电极活性酶膜面积大，抗干扰能力强，制备方法简单，适用于批量化生产。
文档编号G01N27/327GK1737560SQ20051001496
公开日2006年2月22日 申请日期2005年9月2日 优先权日2005年9月2日
发明者许鑫华, 陈强, 刘强, 袁晓燕, 任光雷 申请人:天津大学