一种中药复方制剂的质量控制方法

专利名称：一种中药复方制剂的质量控制方法
技术领域：
本发明是一种中药复方制剂的质量控制方法，属于中药的技术领域。

背景技术：
心脑血管疾病如冠心病、脑血栓、老年性痴呆等均是当今世界最常见和危害最大的疾病之一，在许多国家已成为人口死亡的主要原因之一；据调查，近年来的发病率有逐年增高趋势，而且中、青年患者不断增加，心脑缺血性疾病已成为危害我国人民健康的常见病、多发病；为了达到防治目的，许多发明人及药品企业对其做了大量的研究工作。药物制剂必须要在保证产品质量稳定可控安全的基础之上，才能不断的更新发展，为了更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，更好的指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，需要研究、控制该中药复方制剂质量的方法；目前，在相关药物制剂中，一般仅以黄芪甲苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1为检测指标，但是它根本不能全面反应产品的质量，仅以此用来控制中药复方制剂的质量不是十分合理；如果用别的指标进行控制，由于没有现成的检测方案、检测条件等等，所以比较难于实施。


发明内容
本发明的目的在于提供一种新的中药复方制剂的质量控制方法。这种方法向相关的生产、检测机构提供了检测的指标、检测的手段、技术方法等等，以便更好的控制该制剂的质量，保证用药的安全性，能够更好的指导生产，使生产工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地。
该中药复方制剂的药味组成及配比如下(按重量份) 方案一 三七1～99重量份 黄芪 99～1重量份 方案二 三七1～99重量份 黄芪总皂苷 30～0.1重量份 方案三 三七总皂苷 0.1～30重量份黄芪 99～1重量份 方案四 三七总皂苷 0.1～30重量份黄芪总皂苷 30～0.1重量份 上述中药复方制剂的剂型为注射剂或口服制剂；其中注射剂包括直接用于注射给药的注射液、直接供静脉滴注的静脉输液、需稀释后用于静脉滴注的注射用浓溶液和用冷冻干燥法或喷雾干燥法制备的注射用无菌粉末或无菌块状物；口服制剂包括片剂、分散片剂、胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、颗粒剂、丸剂、微丸剂、散剂、滴丸剂、缓释制剂、控释制剂、口服液体制剂、凝胶剂、煎膏剂、浸膏剂和膜剂。临床上用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常、脑血栓、老年性痴呆、肝肾综合症、心肺病、糖尿病及其并发症等疾病。
本发明是这样构成的 以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括以下全部或部分内容 (1)指纹图谱测试，包括以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种； (2)黄芪药材、三七对照药材、黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中全部或部分成分的鉴别测试方法； (3)黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中全部或部分成分的含量测试方法。
以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱 a、采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取待测中药复方制剂适量，加水或甲醇或乙醇或正丁醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇或乙醇溶解或稀释至合适浓度，作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取芒柄花素，用甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇∶水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190-400nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～50个； (5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱； (6)将待测复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部 I.计算待测复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00； II.待测复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱比较，相对偏差不得超过±20％。
b、采用液相色谱法测试以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇或水稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取适量黄芪和三七药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、黄芪甲苷中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇∶水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190-400nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～40个； (5)以(1)～(3)所述方法作为待测复方制剂中以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱； (6)将待测复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部 I.计算待测复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00； II.待测复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱比较，相对偏差不得超过±20％。
所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱 a、采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取待测复方制剂0.1g，加正丁醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇稀释至5ml，作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取芒柄花素，用甲醇溶解并稀释至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至20分钟，乙腈的比例为从4％升至25％，从20分钟至40分钟，乙腈的比例为从25％升至45％，从40分钟至60分钟，乙腈的比例为从45％升至70％，从60分钟至70分钟，乙腈的比例为从70％升至80％，从70分钟至80分钟，乙腈的比例为从80％升至100％，流速为1ml/min、检测波长为254±2nm，柱温25℃； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～30个； (5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱； (6)将待测复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部 I.计算待测复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00； II.待测复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱比较，相对偏差不得超过±10％。
b、采用液相色谱法测试以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇或水稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取适量黄芪和三七药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、黄芪甲苷中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至12分钟，乙腈的比例为15％，从14分钟至45分钟，乙腈的比例为从15％升至30％，从45分钟至60分钟，乙腈的比例为从30％升至80％，流速为1ml/min、检测波长203±2nm，柱温30℃； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～30个； (5)以(1)～(3)所述方法作为待测复方制剂中以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱； (6)将待测复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部 I.计算待测复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00； II.待测复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱比较，相对偏差不得超过±10％。
所述的以黄芪、三七制成的复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述复方制剂的鉴别方法包括以下中的一种或几种 a、中药复方制剂中黄芪的薄层色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，滤过，滤液蒸干，残渣加0.05％～5％氢氧化钠溶液溶解，滤过，滤液用盐酸调节pH值至3～6，用醋酸乙酯或正丁醇提取，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酸乙酯或甲醇或乙醇溶解，作为供试品溶液；另取黄芪对照药材、同法制成对照药材溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板或聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇1～30∶0.2～10为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点； b、中药复方制剂中黄芪甲苷的薄层色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇溶解后加于中性氧化铝柱，用10％～70％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水溶解后加水饱和正丁醇提取，和并正丁醇液，用水洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板或聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇-水1～30∶1～20∶0.2～10的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％～50％硫酸乙醇溶液，80～160℃加热至斑点显色清晰，置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点； C、中药复方制剂中黄芪甲苷的液相色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加水溶解后用正丁醇或醋酸乙酯提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇或70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液15％～85％∶85％～15％为流动相，检测波长为190～410nm或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
d、中药复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，用正丁醇或乙醇或甲醇或醋酸乙酯或三氯甲烷提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取三七对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚回流提取，弃去三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚液，残渣加水饱和正丁醇或醋酸乙酯提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇或乙醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇或乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲醇-水5～40∶10～100∶5～50∶0.2～30 10℃以下放置的下层溶液或正丁醇醋酸乙酯或甲酸乙酯-水1～10∶0.2～2∶1～15的上层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～50％硫酸乙醇试剂或50％硫酸试剂，80℃～160℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点，阴性无干扰； e、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别 取待测复方制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或流动相或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰； f、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的薄层色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇提取，提取液作为供试品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品中的一种或两种，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇-醋酸乙酯或甲酸乙酯-水0.5～10∶1～15∶1～20∶0.1～3为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱与对照药材相应的位置上，应显相同颜色斑点； g、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的液相色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为190～410nm，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂的鉴别方法包括以下中的一种或几种 a、中药复方制剂中黄芪的薄层色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加乙醇提取，滤过，滤液蒸干，残渣加0.3％氢氧化钠溶液溶解，滤过，滤液用盐酸调节pH值至5～6，用醋酸乙酯提取，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液；另取黄芪对照药材、同法制成对照药材溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇10∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点； b、中药复方制剂中黄芪甲苷的薄层色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加甲醇溶解后加于中性氧化铝柱，用40％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水溶解后加水饱和正丁醇提取，合并正丁醇液，用水洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水13∶7∶2的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光下及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点； c、中药复方制剂中黄芪甲苷的液相色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加水溶解后用水饱和正丁醇提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇或70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，32％∶68％乙腈-水为流动相，蒸发光散射检测器检测，柱温30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
d、中药复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，用正丁醇提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照药材溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷回流提取，弃去三氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰； e、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别 取待测复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰； f、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的薄层色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加甲醇提取，提取液作为供试品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素中的一种或两种，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-醋酸乙酯-水2.5∶3∶4∶0.5为展开剂，展开，展距5cm，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点； g、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的液相色谱鉴别方法 取待测复方制剂适量，加甲醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至10分钟，水的比例为从40％升至50％，从10分钟至20分钟，水的比例为从50％升至60％，从30分钟至50分钟，水的比例为60％，检测波长为250nm，柱温30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述复方制剂含量的测试方法应包括以下中的一种或几种 a、中药复方制剂中黄芪甲苷的含量测定 取待测复方制剂适量，加水溶解后用正丁醇或醋酸乙酯提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液15％～85％∶85％～15％为流动相，检测波长为190～410nm或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含的限度不得少于0.02mg； b、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定 取待测复方制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或流动相或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项 (1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于2.5mg； (2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于3.5mg； (3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.25mg； 每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于6mg； c、中药复方制剂中总皂苷的含量测定 取待测复方制剂适量，置量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取适量，置量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加1％～50％香草醛-冰醋酸溶液0.1～10ml，高氯酸0.1～15ml，摇匀，30～80℃水浴上加热3～50分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以黄芪甲苷或人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547±10nm的波长处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以黄芪甲苷或人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1计，不得少于10mg； d、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的含量测定 取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为190～410nm，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或两项 (1)每单位量含芒柄花素的限度不得少于0.01mg； (2)每单位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.01mg。
所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述复方制剂含量的测试方法是以下一种或几种方法 a、中药复方制剂中黄芪甲苷的含量测定 取待测复方制剂适量，加水溶解后用水饱和正丁醇提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，32％∶68％乙腈-水为流动相，蒸发光散射检测器检测，柱温30℃；以外标一点法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含黄芪甲苷的限度不得少于0.04mg； b、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定 取待测复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温为30℃；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项 (1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于5mg； (2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于7mg； (3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg； (4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于12mg； c、中药复方制剂中总皂苷的含量测定 取待测药物适量，置10ml量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取0.6，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，摇匀，60℃水浴上加热15分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1计，不得少于20mg； d、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的含量测定 取待测复方制剂适量，加甲醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至10分钟，水的比例为从40％升至50％，从10分钟至20分钟，水的比例为从50％升至60％，从30分钟至50分钟，水的比例为60％，检测波长为250nm，柱温30℃；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或两项 (1)每单位量含芒柄花素的限度不得少于0.02mg； (2)每单位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.02mg。
所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述的中药注射制剂的含量测定结果，按照重量百分比计算，黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中的全部或部分物质的总含量占制剂中扣除辅料和水分外的总固体量的25％以上。
与现有技术相比，本发明能更加完善的控制以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量。中药成分复杂，如果只用其中一、两种成分来说明其内在质量，具有一定的片面性，更无法判断其药效的指标成分。因此本申请人制定了以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱、鉴别和含量测定来全面控制中药复方制剂的质量。但是由于中药复方制剂中的各药材之间所含的化学成分复杂，对指纹图谱的制定、鉴别和含量测定造成干扰，导致鉴别、含量测定和各部分指纹图谱特征不稳定，所以必须控制流动相、展开剂等色谱条件，才能得到良好的薄层色谱、含测条件和指纹图谱。也就是说，由于处方中各成分相互之间的干扰影响，导致中药复方制剂中黄芪、三七部分的指纹图谱特征峰发生改变，而只有采用本发明的条件，才能得到理想的薄层色谱、含测条件和指纹图谱。
通过实验证明，本发明质量控制方法对以黄芪、三七制成的中药复方制剂产品的质量控制更为有效，方法精密度、稳定性均较高。
实验例1 以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱 a、实验仪器、试剂及样品 对照品芒柄花素中国药品生物制品检定所 b、色谱条件与系统适应性实验 1.色谱柱的选择 研究过程中，选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，分别试用了Inertsil ODS-3(250mm×4.6mm，5μm)Kromasil C18(200mm×4.6mm，5μm)、Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)三种牌号的色谱柱，结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果，其中Diamonsil C18色谱柱分离效果最好，柱效最高(以参照物芒柄花素计算)。故最终选用Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)为实验研究柱。
2.流动相的选择 研究过程中分别考察了(1)甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠(20∶80)，(2)乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠(10∶90)，(3)乙腈-0.05mol/L磷酸氢二钠(梯度洗脱)(4)乙腈-水(梯度洗脱)，溶剂比例为从0分钟至20分钟，乙腈的比例为从4％升至25％，从20分钟至40分钟，乙腈的比例为从25％升至45％，从40分钟至60分钟，乙腈的比例为从45％升至70％，从60分钟至70分钟，乙腈的比例为从70％升至80％，从70分钟至80分钟，乙腈的比例为从80％升至100％。结果显示流动相(1)条件下，峰形较差，1小时内出峰较少，仍有不少组分滞留在后出峰；流动相(2)流动相条件下，峰形较差，分离不好；(3)条件下，峰拖尾严重，出峰不完全；流动相(4)条件下，峰形较好，出峰完全且分布均匀，故而最终被选用。
3.检测波长的确定 研究中在乙腈-水(梯度洗脱)流动相条件下，分别考察了在不同波段典型波长230、254、270、300下的色谱峰情况，结果表明，254nm检测时能兼顾各成分色谱峰的峰度、分离度和基线，故选择254nm为本品指纹图谱检测波长。
4.仪器、色谱柱及积分参数 4.1仪器参数选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的LC-10Avp高效液相色谱仪，WML-2010色谱工作站。色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温40℃，流速1.0ml/min。
4.2积分参数峰宽10；斜率100；最小峰面积500。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰面积占总峰面积小于0.5％)的计算，同时保证与参照物的相关性。
5.供试品溶液的制备 取待测中药复方制剂0.1g，加正丁醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇稀释至5ml，作为供试品溶液。
6.参照物溶液的制备 取芒柄花素，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为参照物溶液。
7.指纹图谱及技术参数 根据10批样品制定标准指纹图谱，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度均在0.90～1.00之间。
实验例2 以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱 a、实验仪器、试剂及样品 对照品人参皂苷Rg1中国药品生物制品检定所 b、色谱条件与系统适应性实验 1.色谱柱的选择 研究过程中，选用了常规的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，分别试用了Zorbax、Inertsil ODS-3、Diamonsil ODS(均为C18，4.6mm×200mm，5μm)三种牌号的色谱柱，结果显示三种牌号的色谱柱均可达到较好的分离效果，其中Diamonsil ODS色谱柱分离效果最好，柱效最高，可以达到5400(以参照物人参皂苷Rg1计算)。故最终选用Diamonsil ODS色谱柱(4.6mm×200mm，5μm)为实验研究柱。
2.流动相的选择 研究过程中分别考察了(1)甲醇-水(20∶80)，(2)乙腈-水(10∶90)，(3)乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(梯度洗脱)(4)乙腈-水(梯度洗脱)(梯度洗脱体积配比为从0分钟至12分钟，乙腈的比例为15％，从14分钟至45分钟，乙腈的比例为从15％升至30％，从45分钟至60分钟，乙腈的比例为从30％升至80％)四种流动相系统。结果显示流动相(1)条件下，峰形较差，1小时内出峰较少，仍有不少组分滞留在后出峰；流动相(2)流动相条件下，峰形较差，分离不好；(3)条件下，峰拖尾严重，出峰不完全；流动相(4)条件下，峰形较好，出峰完全且分布均匀，故而最终被选用。
3.检测波长的确定 研究中在乙腈-水(梯度洗脱)流动相条件下，分别考察了在不同波段典型波长203、210、230、254下的色谱峰情况，结果显示，在203nm下色谱峰较多，峰形较好，故最终选用203nm±2作为检测波长。
4.仪器、色谱柱及积分参数 4.1仪器参数选用了液相色谱分析领域主流配置和性能良好的Agilent1100系列高效液相色谱仪，Chemstation色谱工作站。色谱柱为Diamonsil ODS(4.6mm×200mm，5μm)；柱温40℃，流速1.0ml/min。
4.2积分参数Slope Sensitivity1，peak width0.05，最小峰面积为参照物(S)峰峰面积的5％，最小峰高为S峰峰高的5％。如此设定可以避免一些很小面积的色谱峰(单峰面积占总峰面积小于0.5％)的计算，同时保证与参照物的相关性。
5.供试品溶液的制备 精密称取本品适量，加水制成每1ml含50mg的溶液，即得。
6.参照物溶液的制备 人参皂苷Rg1为三七主要活性成分之一，其积分面积在指纹图谱中所占比例较大且较稳定，同时兼顾中间体和药材的研究，因此选定人参皂苷Rg1作为参照物。
7.指纹图谱及技术参数 根据10批样品制定标准指纹图谱，将供试品指纹图谱与标准指纹图谱比较，相似度均在0.90～1.00之间。
实验例3 中药复方制剂中黄芪的薄层色谱鉴别方法 为了突出黄芪的特征，选择了黄芪对照药材作为其特征斑点，但是由于中药复方制剂中存在较多与黄芪对照药材结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对黄芪对照药材进行了展开 经过筛选，确定了以硅胶G薄层板为固定相，以三氯甲烷-甲醇(10-1)为展开剂，在此条件下，黄芪对照药材特征斑点的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例4 中药复方制剂中黄芪甲苷的薄层色谱鉴别方法 为了突出黄芪的特征，选择了黄芪甲苷作为其特征斑点，但是由于中药复方制剂中存在较多与黄芪甲苷结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对黄芪甲苷进行了展开 经过筛选，确定了以硅胶G薄层板为固定相，以三氯甲烷-甲醇-水(13-7-2)的下层溶液为展开剂，在此条件下，黄芪甲苷特征斑点的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例5 中药复方制剂中黄芪甲苷的液相色谱鉴别方法 为了突出黄芪的特征，除了薄层鉴别方法以外，选择了黄芪甲苷作为其特征成分，但是由于中药复方制剂中存在较多与黄芪甲苷结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对黄芪甲苷进行了分离 经过筛选，确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈-水(32∶68)为流动相，在此条件下，黄芪甲苷保留时间适中，峰行尖锐，对称，阴性无干扰。
实验例6 中药复方制剂人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的薄层色谱鉴别方法 为了突出三七的特征，选择了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1作为其特征斑点，但是由于药材中存在较多与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下薄层板和展开条件对麦冬进行了展开 经过筛选，确定了以硅胶G薄层板为固定相，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，在此条件下，人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的Rf值适中，和其它斑点分离清晰，阴性无干扰。
实验例7 中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的液相色谱鉴别方法 为了突出三七的特征，选择了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1作为其特征成分，但是由于药材中存在较多与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1结构相近、极性相似的成分，普通条件难以达到质量控制的要求，因此我们筛选了以下色谱柱和流动相对人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1进行了分离 经过筛选，确定了以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％，在此条件下，人人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1保留时间适中，峰行尖锐，对称，阴性无干扰。
实验例8 黄芪甲苷含量测定 仪器与试药 (1)主要仪器 高效液相色谱仪P-426Alltech 蒸发光散射检测器 2000ES Alltech 高效液相色谱仪1100 series Agilent 超声波清洗机 KQ250B 昆山市超声仪器有限公司 电热真空干燥箱ZK-30ABX 北京中兴伟业仪器公司 电子分析天平 AE240Mettler (2)试药黄芪甲苷中国药品生物制品检定所 所用甲醇、乙腈均为色谱纯，均购于天津四友生物医学技术开发公司水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。
照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
1 色谱条件 色谱柱Platihum C18 4.6×250mm 5μm； 流动相乙腈-水(32∶68)； 流速1.0ml/min； 蒸发光检测器检测漂移管温度110℃，气流量2.7L/min； 柱温30℃。
根据上述条件得到黄芪甲苷、供试品、阴性色谱图；黄芪甲苷峰达到基线分离，与相近峰分离清晰完全，保留时间适中，峰形尖锐，对称，理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于2000。
2 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷干燥器减压干燥24小时的黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，即得。
3 供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，取内容物，研细，从中精密称取约5g，加水20ml溶解后用水饱和正丁醇提取，每次40ml，和并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml溶解后通过D101大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，依次用水50ml、40％乙醇30ml、70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇5ml溶解，摇匀，滤过，取续滤液即得。
4 测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液200μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算黄芪甲苷的含量，即得。
5 线性关系考察 精密吸取黄芪甲苷(0.2085mg/ml)对照品溶液2、4、8、12、16μl，注入液相色谱仪，以黄芪甲苷的量(μg)的常用对数值为横坐标，峰面积的常用对数值为纵坐标做图，绘制标准曲线。 黄芪甲苷线性关系 黄芪甲苷回归方程Y＝1.0700X+6.0705； 黄芪甲苷相关系数γ＝0.9999； 黄芪甲苷在0.417～3.336μg范围内线性良好。
6 精密度试验 精密吸取对照品溶液(0.1668mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，连续进样5次。
对照品溶液精密度试验 结果表明，精密度良好。
7 稳定性试验 7.1 对照品稳定性试验 精密吸取对照品溶液(0.1668mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，注入液相色谱仪，分别于0、6、12、24、48小时重复测定1次，记录峰面积积分值。对照品溶液稳定性试验 结果表明，对照品溶液在48小时内稳定性良好。
7.2 供试品稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，分别在0、6、12、24、48小时重复测定1次，记录峰面积积分值。
供试品溶液稳定性试验 结果表明，供试品溶液在48小时内稳定性良好。
8 重复性试验 取装量差异项下本品，取内容物，研细，从中精密称取约5g(共5份)，按正文供试品溶液的制备和测定项下的方法进行处理，分别从中精密吸取20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。供试品重复性试验结果 结果表明，重现性良好。
9 加样回收率试验 采用加样回收法，取装量差异项下本品，取内容物，研细，从中精密称取约2.5g(共6份)，分置具塞锥形瓶中；精密吸取黄芪甲苷对照品水溶液(0.1233mg/ml)1ml(共6份)，分置上述具塞锥形瓶中，加水20ml溶解后用水饱和正丁醇提取，每次40ml，和并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml溶解后通过D101大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，依次用水50ml、40％乙醇30ml、70％乙醇80ml洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇5ml溶解，摇匀，滤过，取续滤液即得。精密吸取续滤液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
经测定已知中药复方制剂中黄芪甲苷的含量分别是0.05448mg/g。黄芪甲苷加样回收率试验 黄芪甲苷平均回收率＝98.03％；RSD＝0.88％ 9 三批样品黄芪甲苷含量测定 取中试样品三批，按正文所述方法处理，精密吸取20μl进样测定。
三批中试样品黄芪甲苷含量测定结果 实验例9 总皂苷含量测定 1 仪器、试药 1.1仪器普析通TU-1810SPC 紫外/可见分光光度仪 SARTORIUS BP211D 电子分析天平 1.2试药香草醛 分析纯 天津市光复精细化工研究所 甲醇 色谱纯 J.T.Baker 冰醋酸 分析纯 上海试剂一厂 高氯酸 分析纯 天津市鑫源化工厂 纯净水 娃哈哈 2 方法与结果 2.1检测波长的选择 精密称取人参皂苷Rg15.14mg，置100ml量瓶中，加适量甲醇超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1.2ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，在700～400nm波长范围内进行扫描，结果表明，黄芪甲苷在547nm处有最大吸收，空白无干扰，因此选择547nm为分光光度法测定中药复方制剂中总皂苷的检测波长。
2.2对照品溶液的制备 人参皂苷Rg15mg，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。
2.3供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取1.0ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在547nm的波长处测定吸收度。以外标一点法计算，即得。
3 线性关系的考察 精密称取人参皂苷Rg1对照品5.03mg，置100ml量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml，分置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)，在547nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，黄芪甲苷的量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。
回归方程Y＝0.0062X+0.0047；r＝0.9999 人参皂苷Rg1在20.12～100.6μg范围线性良好。
人参皂苷Rg1标准曲线测定数据 3 精密度试验 精密量取对照品溶液(0.0503mg/ml)1.2ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，按正文测定法项下操作，连续测定5次。
精密度实验 5 稳定性试验 5.1对照品溶液的稳定性试验 精密量取对照品溶液(0.0503mg/ml)1.2ml，置10ml具塞试管中，水浴蒸干溶剂，取出，精密加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，取出，立即在冰水浴中冷却2分钟，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，以随行溶剂为空白，按正文测定法项下操作，分别在0、10、20、40、60分钟时测定。
对照品溶液稳定性实验 5.2供试品溶液的稳定性实验 取本品装量差异项下本品，取内容物，研细，从中取约50mg，按正文测定法项下进行操作，分别在0、10、20、40、60分钟时测定。
供试品溶液稳定性实验 6 重复性试验 取本品装量差异项下本品，取内容物，研细，从中取约50mg(共5份)，按正文测定法项下进行操作。 重复性实验 7 回收率试验 采用加样回收法，取装量差异项下本品，取内容物，研细，从中取约25mg(共5份)，精密称定，分置25ml量瓶中；精密量取人参皂苷Rg1对照品溶液(0.624mg/ml)1ml(共5份)，精密称定，分置上述25ml量瓶中，加水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml具塞试管中，按正文测定法项下进行操作，以随行溶剂为空白，依法测定吸收度，按外标一点法计算，即得。
中药复方制剂中总皂苷的含量23.55mg/g 加样回收率实验 平均回收率＝98.37％ RSD＝0.77％ 8 三批中试样品含量测定 取本品样品三批，按正文所述方法处理。三批样品含量测定结果 实验例10 三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1含量测定 1 仪器与试药 1.1仪器 Alltech UVIS-201高效液相色谱仪，Alltech HPLC system工作站(美国) KQ250B超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司) ZK-30ABX电热真空干燥箱(北京中兴伟业仪器公司) Mettler AE240电子天平(上海梅特勒公司) 1.2试药 三七皂苷R1中国药品生物制品检定所 人参皂苷Rg1中国药品生物制品检定所 人参皂苷Rb1中国药品生物制品检定所 所用甲醇、乙腈均为色谱纯，均购于德国Merck公司 水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。
2色谱条件 色谱柱Diamonsil(TM)C18，5μm；250×4.6mm； 流动相乙腈-水为流动相，梯度洗脱；梯度洗脱系统 流速1ml/min，两次进样间隔平衡时间3min； 检测波长203nm； 柱温30℃； 进样量10μl 理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于3000。
检测波长的选择 三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1，均在203nm波长处有最大吸收，因此选用203nm作为本品的检测波长。
3对照品溶液的制备 取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每ml含三七皂苷R10.62mg、人参皂苷Rg11.42mg和人参皂苷Rb12.14mg的溶液，作为贮备液；再分别吸取上述溶液各1ml，置同一5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得每ml含三七皂苷R10.124mg、人参皂苷Rg10.284mg和人参皂苷Rb10.428mg的对照品溶液。
4供试品溶液的制备 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中精密称取2.5g，置25ml量瓶中，加甲醇40ml，超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。
5阴性供试品溶液的制备 照本品处方称取除三七总皂苷外的其它成分，按本品制备工艺制成阴性供试品。精密称取0.31428g，照供试品溶液的制备项下方法制备，作为阴性供试品溶液。
6系统适用性试验 根据上述色谱条件得到三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、混合对照品、样品、阴性色谱图，理论板数n大于3000，样品中各对照品峰与相近峰分离清晰完全，分离度大于1.5，阴性无干扰。
7线性关系的考察 取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每ml含三七皂苷R10.62mg、人参皂苷Rg11.42mg和人参皂苷Rb12.14mg的溶液，作为贮备液；精密量取前述对照品贮备液各0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml，分置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别从中精密吸取10μl，依次注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标做图，绘制标准曲线。
回归方程为三七皂苷R1Y＝208361.76X-1972.29 r＝0.9995； 人参皂苷Rg1Y＝293933.01X-13982.75 r＝0.9994； 人参皂苷Rb1Y＝192503.18X-9202.56 r＝0.9993。
结果表明三七皂苷R1在0.248-2.480μg范围内线性关系良好； 人参皂苷Rg1在0.568-5.680μg范围内线性关系良好； 人参皂苷Rb1在0.856-8.560μg范围内线性关系良好。 线性关系试验测定结果 8 精密度试验 取对照品混合溶液(三七皂苷R10.124mg/ml、人参皂苷Rg10.284mg/ml和人参皂苷Rb10.428mg/ml)，连续测定5次，考察对照品溶液精密度。
精密度试验 9 稳定性试验 9.1对照品溶液稳定性试验 取对照品混合溶液(三七皂苷R10.124mg/ml、人参皂苷Rg10.284mg/ml和人参皂苷Rb10.428mg/ml)，分别在0、2、6、10、24小时进样测定，考察对照品溶液稳定性。对照品溶液的稳定性试验 9.2供试品溶液的稳定性试验 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中精密称取2.50824g，按正文供试品溶液制备下进行操作，分别在0、2、6、10、24小时进样测定。 稳定性试验 结果表明供试品溶液在24小时内基本稳定。
10重复性试验 取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约2.5g(共5份)，按正文测定法供试品溶液制备和测定项下进行操作。 重复性试验 结果表明，本法重复性较好。
11、加样回收率试验 采用加样回收法，取装量差异项下本品，取内容物，混匀，从中取约1.25g(共5份)，分别置25ml量瓶中，另精密量取混合对照品溶液4ml(其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1的浓度为0.399mg/ml、1.751mg/ml、2.432mg/ml)，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHz)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
经测定已知中药复方制剂中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1的含量分别是1.190、5.865、8.232mg/g。
三七皂苷R1加样回收率试验 平均回收率＝98.06％；RSD＝0.67％。
人参苷Rg1加样回收率试验 平均回收率＝97.03％；RSD＝1.15％。
人参苷Rb1加样回收率试验 平均回收率＝97.89％；RSD＝0.89％。
12 三批中试样品含量测定 取本品样品三批，按正文所述方法处理。 三批样品含量测定结果
具体实施例方式 实施例1采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取本发明粉针制剂0.1g，加正丁醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇稀释至5ml，作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取芒柄花素，用甲醇溶解并稀释至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至20分钟，乙腈的比例为从4％升至25％，从20分钟至40分钟，乙腈的比例为从25％升至45％，从40分钟至60分钟，乙腈的比例为从45％升至70％，从60分钟至70分钟，乙腈的比例为从70％升至80％，从70分钟至80分钟，乙腈的比例为从80％升至100％，流速为1ml/min、检测波长为254±2nm，柱温25℃； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据13批供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～30个； (5)以上述方法作为本发明粉针制剂中以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备本发明粉针制剂的指纹图谱； (6)将本发明粉针制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求 I.计算本发明粉针制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00； II.本发明粉针制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±10％。
实施例2采用液相色谱法测试以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取本发明粉针制剂0.1g，加甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取适量黄芪和三七药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、黄芪甲苷中的一种，用甲醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至12分钟，乙腈的比例为15％，从14分钟至45分钟，乙腈的比例为从15％升至30％，从45分钟至60分钟，乙腈的比例为从30％升至80％，流速为1ml/min、检测波长203±2nm，柱温30℃； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～40个； (5)以上述方法作为本发明粉针制剂中以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱； (6)将本发明粉针制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求 I.计算本发明粉针制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00； II.本发明粉针制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±10％。
实施例3采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取本发明粉针制剂适量，加甲醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解或稀释至合适浓度，作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取芒柄花素，用甲醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为甲醇∶0.5％磷酸溶液，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至30分钟，甲醇的比例为从5％升至30％，从30分钟至50分钟，乙腈的比例为从30％升至50％，从50分钟至60分钟，乙腈的比例为从50％升至70％，从60分钟至70分钟，甲醇的比例为从70％升至85％，从70分钟至90分钟，甲醇的比例为从85％升至100％，流速为1.5ml/min、检测波长为250±4nm，柱温60℃； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有8～40个； (5)以上述方法作为本发明粉针制剂中以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱； (6)将本发明粉针制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求 I.计算本发明粉针制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00； II.本发明粉针制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±20％。
实施例4采用液相色谱法测试以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取本发明粉针制剂适量，加乙醇稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取适量黄芪和三七药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、黄芪甲苷中的一种，用乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为甲醇∶2.5％冰醋酸，梯度洗脱，流速为2.0ml/min、检测波长为200±2nm，柱温60℃； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有10～40个； (5)以上述方法作为本发明粉针制剂中以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱； (6)将本发明粉针制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求 I.计算本发明粉针制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00； II.本发明粉针制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±20％。
实施例5采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取本发明小水针适量，加水溶解，滤过，滤液蒸干，残渣乙醇溶解或稀释至合适浓度，作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取芒柄花素，用乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶0.25％甲酸，梯度洗脱，流速为0.5ml/min、检测波长为252±4nm范围内的一个或几个，柱温20℃； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～50个； (5)以上述方法作为本发明小水针中以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱； (6)将本发明小水针的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，符合下列要求 I.计算本发明小水针的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00； II.本发明小水针指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±20％。
实施例6采用液相色谱法测试以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱 (1)供试品溶液的制备取本发明小水针适量，加水稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液； (2)参照物溶液的制备取适量黄芪和三七药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、黄芪甲苷中的一种，用水溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液； (3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶0.5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5ml/min、检测波长为202±4nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测，柱温在20℃范围内； (4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～40个； (5)以上述方法作为本发明小水针中以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱； (6)将本发明小水针的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部 I.计算本发明小水针的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00； II.本发明小水针指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％； III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间的相对偏差不得超过±20％。
实施例7复方制剂中黄芪的薄层色谱鉴别方法 取本发明粉针制剂适量，加乙醇提取，滤过，滤液蒸干，残渣加0.3％氢氧化钠溶液溶解，滤过，滤液用盐酸条件pH值至5～6，用醋酸乙酯提取，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液；另取黄芪对照药材、同法制成对照药材溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇10∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
实施例8复方制剂中黄芪甲苷的薄层色谱鉴别方法 取本发明粉针制剂适量，加甲醇溶解后加于中性氧化铝柱，用40％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水溶解后加水饱和正丁醇提取，和并正丁醇液，用水洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水13∶7∶2的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光下及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点。
实施例9复方制剂中黄芪甲苷的液相色谱鉴别方法 取本发明小水针制剂适量，加水溶解后用水饱和正丁醇提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇或70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，32％∶68％乙腈-水为流动相，蒸发光散射检测器检测，柱温30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例10复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法 取本发明粉针制剂适量，用正丁醇提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照药材溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷回流提取，弃去三氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。
实施例11复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别 取本发明粉针制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰。
实施例12复方制剂中黄芪的薄层色谱鉴别方法 取本发明粉针制剂适量，加醋酸乙酯提取，滤过，滤液蒸干，残渣加2.5％氢氧化钠溶液溶解，滤过，滤液用盐酸条件pH值至3，用醋酸乙酯提取，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液；另取黄芪对照药材、同法制成对照药材溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以二氯甲烷-乙醇15∶7为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点； 实施例13复方制剂中黄芪甲苷的薄层色谱鉴别方法 取本发明小水针适量，加乙醇溶解后加于中性氧化铝柱，用60％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水溶解后加水饱和正丁醇提取，合并正丁醇液，用水洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各8μl，分别点于同一硅胶聚酰胺薄膜上，以二氯甲烷-乙醇-水10∶8∶5的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以8％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点； 实施例14、复方制剂中黄芪甲苷的液相色谱鉴别方法 取本发明胶囊适量，加水溶解后用醋酸乙酯提取，合并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，醋酸乙酯液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，20％∶80％甲醇-5％冰醋酸水溶液为流动相，检测波长360nm检测，柱温60℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
实施例15复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法 取本发明小水针适量，用甲醇提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取三七对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加乙醚回流提取，弃去乙醚液，残渣醋酸乙酯提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用乙醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各12μl，分别点于硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-甲酸乙酯-水5∶1∶8的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以50％硫酸试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点，阴性无干扰。
实施例16复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别 取本发明小水针适量，置量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，25％∶75％甲醇-2.5％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为2.0ml/min，蒸发光检测器检测，柱温在60℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰。
实施例17复方制剂中黄芪甲苷的含量测定 取本发明葡萄糖输液制剂适量，加水溶解后用水饱和正丁醇提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，32％∶68％乙腈-水为流动相，蒸发光散射检测器检测，柱温30℃；以外标一点法进行计算，本发明葡萄糖输液制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含黄芪甲苷的限度不得少于0.04mg。
实施例18复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定 取本发明粉针制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温为30℃；以外标法或标准曲线法进行计算，本发明粉针制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项 (1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于5mg； (2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于7mg； (3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg； (4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于12mg。
实施例19复方制剂中总皂苷的含量测定 取本发明粉针制剂适量，置10ml量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取0.6，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，摇匀，60℃水浴上加热15分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1计，不得少于20mg。
实施例20复方制剂中黄芪甲苷的含量测定 取本发明粉针制剂适量，加水溶解后用醋酸乙酯提取，合并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，40％∶60％甲醇-5.0％冰醋酸水溶液为流动相，检测波长203nm检测，柱温20℃；以外标一点法或标准曲线法进行计算，本发明粉针制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含的限度不得少于0.02mg； 实施例21复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定 取本发明小水针适量，置量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，15％∶85％甲醇-3.0％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，流速为2.0ml/min，蒸发光检测器检测，柱温60℃；以外标法或标准曲线法进行计算，本发明小水针以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项 (4)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于2.5mg； (5)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于3.5mg； (6)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.25mg； 每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于6mg。
实施例22复方制剂中总皂苷的含量测定 取本发明分散片适量，置量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取适量，置量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加15％香草醛-冰醋酸溶液0.1ml，高氯酸1ml，摇匀，40℃水浴上加热30分钟，取出，立即以流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以黄芪甲苷或人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547±10nm的波长处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算，本发明分散片以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以黄芪甲苷或人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1计，不得少于10mg。
实施例23复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的的含量测定 取本发明粉针制剂适量，加甲醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至10分钟，水的比例为从40％升至50％，从10分钟至20分钟，水的比例为从50％升至60％，从30分钟至50分钟，水的比例为60％，检测波长为250nm，柱温30℃；以外标一点法或标准曲线法进行计算，本发明粉针制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为 (1)每单位量含芒柄花素的限度不得少于0.02mg； (2)每单位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.02mg。
实施例24复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的的含量测定 取本发明滴丸适量，加乙醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为255nm，柱温50℃；以外标一点法或标准曲线法进行计算，本发明滴丸以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为 (1)每单位量含芒柄花素的限度不得少于0.01mg； (2)每单位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.01mg。
权利要求
1、一种以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法包括以下全部或部分内容
(1)指纹图谱测试，包括以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱中的一种或两种；
(2)黄芪药材、三七对照药材、黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中全部或部分成分的鉴别测试方法；
(3)黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中全部或部分成分的含量测试方法。
2、按照权利要求1所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱
a、采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱
(1)供试品溶液的制备取待测复方制剂适量，加水或甲醇或乙醇或正丁醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇或乙醇溶解或稀释至合适浓度，作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备取芒柄花素，用甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；
(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇∶水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190-400nm范围内的一个或几个，柱温在20～60℃范围内；
(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～50个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测中药复方制剂中以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部
I.计算待测复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；
II.待测复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；
III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱比较，相对偏差不得超过±20％。
b、采用液相色谱法测试以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱
(1)供试品溶液的制备取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇或水稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备取适量黄芪和三七药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、黄芪甲苷中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；
(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈或甲醇∶水或0.1％～5％冰醋酸或0.1％～5％甲酸或0.005％～5％磷酸溶液，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min、检测波长为190-400nm范围内的一个或几个或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内；
(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～40个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测复方制剂中以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部
I.计算待测复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.80～1.00；
II.待测复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的10％；
III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱比较，相对偏差不得超过±20％。
3、按照权利要求2所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于该方法采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱和以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱
a、采用液相色谱法测试以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱
(1)供试品溶液的制备取待测复方制剂0.1g，加正丁醇溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇稀释至5ml，作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备取芒柄花素，用甲醇溶解并稀释至合适浓度，作为参照物溶液；
(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至20分钟，乙腈的比例为从4％升至25％，从20分钟至40分钟，乙腈的比例为从25％升至45％，从40分钟至60分钟，乙腈的比例为从45％升至70％，从60分钟至70分钟，乙腈的比例为从70％升至80％，从70分钟至80分钟，乙腈的比例为从80％升至100％，流速为1ml/min、检测波长为254±2nm，柱温25℃；
(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～30个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测复方制剂中以黄芪黄酮类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部
I.计算待测复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；
II.待测复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；
III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱比较，相对偏差不得超过±10％。
b、采用液相色谱法测试以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱
(1)供试品溶液的制备取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇或水稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
(2)参照物溶液的制备取适量黄芪和三七药材中的主要活性成分对照品，包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、黄芪甲苷中的一种，用水或甲醇或乙醇溶解，定容至合适浓度，作为参照物溶液；
(3)色谱条件色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料流动相为乙腈∶水，梯度洗脱，，溶剂比例为从0分钟至12分钟，乙腈的比例为15％，从14分钟至45分钟，乙腈的比例为从15％升至30％，从45分钟至60分钟，乙腈的比例为从30％升至80％，流速为1ml/min、检测波长203±2nm，柱温30℃；
(4)标准指纹图谱的制定以上述方法作为制定以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段；依据10批或10批以上供试品所测得的图谱，制定标准指纹图谱，以确定的参照物色谱峰的保留时间为基准，计算其它共有色谱峰的相对保留时间，所述标准指纹图谱中，共有峰有3～30个；
(5)以(1)～(3)所述方法作为待测复方制剂中以黄芪皂苷类、三七皂苷类成分特征为主的指纹图谱的测试手段，制备待测样品的指纹图谱；
(6)将待测复方制剂的指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，应符合下列要求中的部分或全部
I.计算待测复方制剂的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度，应为0.90～1.00；
II.待测复方制剂指纹图谱中，非共有峰面积不得超过总峰面积的5％；
III.除参照物色谱峰之外的其他共有色谱峰与参照物色谱峰的相对保留时间与标准指纹图谱比较，相对偏差不得超过±10％。
4、按照权利要求1所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂的鉴别方法包括以下中的一种或几种
a、中药复方制剂中黄芪的薄层色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加醋酸乙酯或乙醇或甲醇或正丁醇提取，滤过，滤液蒸干，残渣加0.05％～5％氢氧化钠溶液溶解，滤过，滤液用盐酸调节pH值至3～6，用醋酸乙酯或正丁醇提取，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酸乙酯或甲醇或乙醇溶解，作为供试品溶液；另取黄芪对照药材、同法制成对照药材溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板或聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇1～30∶0.2～10为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点；
b、中药复方制剂中黄芪甲苷的薄层色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇溶解后加于中性氧化铝柱，用10％～70％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水溶解后加水饱和正丁醇提取，和并正丁醇液，用水洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板或聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇-水1～30∶1～20∶0.2～10的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％～50％硫酸乙醇溶液，80～160℃加热至斑点显色清晰，置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点；
C、中药复方制剂中黄芪甲苷的液相色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加水溶解后用正丁醇或醋酸乙酯提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇或70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液15％～85％∶85％～15％为流动相，检测波长为190～410nm或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
d、中药复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，用正丁醇或乙醇或甲醇或醋酸乙酯或三氯甲烷提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取三七对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚回流提取，弃去三氯甲烷或二氯甲烷或乙醚液，残渣加水饱和正丁醇或醋酸乙酯提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇或乙醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇或乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯或甲酸乙酯-甲醇-水5～40∶10～100∶5～50∶0.2～30 10℃以下放置的下层溶液或正丁醇醋酸乙酯或甲酸乙酯-水1～10∶0.2～2∶1～15的上层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5～50％硫酸乙醇试剂或50％硫酸试剂，80℃～160℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点，阴性无干扰；
e、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别
取待测复方制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或流动相或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰；
f、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的薄层色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇提取，提取液作为供试品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品中的一种或两种，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各1～30μl，分别点于同一硅胶G薄层板或硅胶H薄层板或硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷或二氯甲烷-甲醇或乙醇-醋酸乙酯或甲酸乙酯-水0.5～10∶1～15∶1～20∶0.1～3为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下或紫外光灯365nm或254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱与对照药材相应的位置上，应显相同颜色斑点；
g、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的液相色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为190～410nm，柱温在20～60℃范围内；供试品色谱中，应具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
5、按照权利要求4所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂的鉴别方法包括以下中的一种或几种
a、中药复方制剂中黄芪的薄层色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加乙醇提取，滤过，滤液蒸干，残渣加0.3％氢氧化钠溶液溶解，滤过，滤液用盐酸调节pH值至5～6，用醋酸乙酯提取，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酸乙酯溶解，作为供试品溶液；另取黄芪对照药材、同法制成对照药材溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇10∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸汽中熏后置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；
b、中药复方制剂中黄芪甲苷的薄层色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加甲醇溶解后加于中性氧化铝柱，用40％甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水溶解后加水饱和正丁醇提取，和并正丁醇液，用水洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣用甲醇溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水13∶7∶2的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光下及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色斑点；
c、中药复方制剂中黄芪甲苷的液相色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加水溶解后用水饱和正丁醇提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇或70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水32％∶68％为流动相，蒸发光散射检测器检测，柱温30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
d、中药复方制剂中三七、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的薄层色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，用正丁醇提取，滤过，滤液作为供试品溶液；另取红参或人参对照药材、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种，制备对照药材溶液；三七对照药材溶液的制备取三七对照药材适量，加三氯甲烷回流提取，弃去三氯甲烷液，残渣加水饱和正丁醇提取，提取液加氨试液，分取上层，蒸干，残渣用甲醇溶解，作为对照药材溶液；对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品，分别加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-水15∶40∶22∶10在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试剂，105℃烘至斑点显色清晰，分别置日光及紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰；
e、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的液相色谱鉴别
取待测复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温在30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰，阴性无干扰；
f、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的薄层色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加甲醇提取，提取液作为供试品溶液；另取芒柄花素、毛蕊芒柄花素中的一种或两种，加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液；采用中国药典附录公开的薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-醋酸乙酯-水2.5∶3∶4∶0.5为展开剂，展开，展距5cm，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；
g、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的液相色谱鉴别方法
取待测复方制剂适量，加甲醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至10分钟，水的比例为从40％升至50％，从10分钟至20分钟，水的比例为从50％升至60％，从30分钟至50分钟，水的比例为60％，检测波长为250nm，柱温30℃；供试品色谱中，具与对照品色谱有保留时间一致的色谱峰。
6、按照权利要求1所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂含量的测试方法应包括以下中的一种或几种
a、中药复方制剂中黄芪甲苷的含量测定
取待测复方制剂适量，加水溶解后用正丁醇或醋酸乙酯提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液15％～85％∶85％～15％为流动相，检测波长为190～410nm或蒸发光散射检测器检测，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含的限度不得少于0.02mg；
b、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定
取待测复方制剂适量，置量瓶中，加水或甲醇或流动相或乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇或乙腈-水或0.5％～5％冰醋酸水溶液或0.02％～5％磷酸水溶液或0.5％～5％甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为0.5～2.0ml/min，检测波长为190～410nm范围内的一个或几个或蒸发光检测器检测，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项
(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于2.5mg；
(2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于3.5mg；
(3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.25mg；
每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于6mg；
c、中药复方制剂中总皂苷的含量测定
取待测复方制剂适量，置量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取适量，置量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加1％～50％香草醛-冰醋酸溶液0.1～10ml，高氯酸0.1～15ml，摇匀，30～80℃水浴上加热3～50分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以黄芪甲苷或人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547±10nm的波长处测定吸收度，以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以黄芪甲苷或人参皂苷Rg1或人参皂苷Rb1或三七皂苷R1计，不得少于10mg；
d、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的含量测定
取待测复方制剂适量，加甲醇或乙醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶或二烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇或乙腈，流动相B为水或0.05％～10％冰醋酸水溶液或0.05％～10％甲酸水溶液或0.01％～5％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长为190～410nm，柱温在20～60℃范围内；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或两项
(1)每单位量含芒柄花素的限度不得少于0.01mg；
(2)每单位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.01mg。
7、按照权利要求6所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述中药复方制剂含量的测试方法是以下一种或几种方法
a、中药复方制剂中黄芪甲苷的含量测定
取待测复方制剂适量，加水溶解后用水饱和正丁醇提取，和并提取液，用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水溶解后通过D101大孔吸附树脂柱，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，蒸干，残渣用甲醇溶解或稀释至合适浓度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；以黄芪甲苷对照品的甲醇或乙醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水32％∶68％为流动相，蒸发光散射检测器检测，柱温30℃；以外标一点法进行计算，各制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含黄芪甲苷的限度不得少于0.04mg；
b、中药复方制剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中一种或几种的含量测定
取待测复方制剂适量，置量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1中的一种或几种对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至15分钟，乙腈的比例为20％，从15分钟至21分钟，乙腈的比例由20％上升至40％，从21分钟至25分钟，乙腈的比例为20％；流速为1.0ml/min，检测波长203nm，柱温为30℃；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或几项
(1)每单位量含人参皂苷Rg1的限度不得少于5mg；
(2)每单位量含人参皂苷Rb1的限度不得少于7mg；
(3)每单位量含三七皂苷R1的限度不得少于0.5mg；
(4)每单位量含人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的总和的限度不得少于12mg；
c、中药复方制剂中总皂苷的含量测定
取待测药物适量，置10ml量瓶中，加蒸馏水适量使溶解并定至刻度，摇匀，精密量取0.6，置25ml量瓶中，水浴蒸干，立即取出，精密加5％香草醛-冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸2.0ml，摇匀，60℃水浴上加热15分钟，取出，立即以冰水浴或流水冷却，精密加冰醋酸至刻度，摇匀，作为供试品溶液，以人参皂苷Rg1为对照品，同法制得对照品溶液。以随行溶剂为空白，采用中国药典附录公开的分光光度法，在547nm的波长处测定吸收度，以外标一点法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，每单位量含总皂苷以人参皂苷Rg1计，不得少于20mg；
d、中药复方制剂中芒柄花素、毛蕊芒柄花素的一种或两种的含量测定
取待测复方制剂适量，加甲醇提取，提取液作为供试品溶液；以芒柄花素、毛蕊芒柄花素对照品的甲醇溶液为对照，采用液相色谱法，色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇，流动相B为水，梯度洗脱，溶剂比例为从0分钟至10分钟，水的比例为从40％升至50％，从10分钟至20分钟，水的比例为从50％升至60％，从30分钟至50分钟，水的比例为60％，检测波长为250nm，柱温30℃；以外标一点法或标准曲线法进行计算，待测复方制剂以相当于每日用成品量为单位量，含量限度应为以下一项或两项
(1)每单位量含芒柄花素的限度不得少于0.02mg；
(2)每单位量含人毛蕊芒柄花素的限度不得少于0.02mg。
8、按照权利要求6或7所述的以黄芪、三七制成的中药复方制剂的质量控制方法，其特征在于所述的注射制剂的含量测定结果，按照重量百分比计算，黄芪甲苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、总皂苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1中的全部或部分物质的总含量占制剂中扣除辅料和水分外的总固体量的25％以上。
全文摘要
本发明涉及一种由黄芪和三七或其提取物、有效部位制成的中药复方制剂的质量控制方法，该质量控制方法包括该组方制剂中黄芪、三七的指纹图谱测试方法和/或鉴别测试方法和/或含量测定方法，本发明为该组方制剂的质量控制提供了一种可靠、稳定、全新的方法，使该制剂的工艺控制更加严格合理，质量更加稳定，同时为大生产提供了可靠稳定的检测方法，为确保患者用药的有效性、安全性提供了数字化的说明。
文档编号G01N30/02GK1939391SQ200510107819
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月30日 优先权日2005年9月30日
发明者于文风 申请人:北京奇源益德药物研究所