专利名称：抗人心肌肌钙蛋白i合成多肽抗体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及以抗体为特征的体外实验用的生物制品，更具体的说，是一种抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)合成多肽抗体及其制备方法和测定cTnI的胶体金免疫检测卡。
背景技术：
目前在工业化国家，心血管疾病是威胁人类生命的主要疾病之一，发病率和死亡率均很高，对此类疾病进行早期诊断和治疗具有重大意义。心脏病的诊断包括临床表现，心电图的变化和心肌损伤生化标志物的实验室检测，其中心肌损伤生化标志物的检测在心肌损伤和急性心肌梗死的诊断方面起重要作用。而寻找和筛选早期、灵敏、特异的心肌损伤标志物和简便、快捷、灵敏的检测分析方法，一直是该领域的重要研究内容。
随着对心肌损伤标志物的深入研究和长期的临床实践验证，以前常用的标志物如AST(门冬氨酸氨基转移酶)，LDH(乳酸脱氢酶)及其同工酶，CK(肌酸磷酸激酶)及CK-MB(肌酸磷酸激酶同工酶)存在许多缺陷和不足，特异性不强是其最主要的缺点。此外，在早期诊断和灵敏度方面也不理想，有可能造成漏诊或误诊，因此已呈现出逐渐被新标志物取代的趋势。如目前常用的采用免疫学技术测定血清cTnI(心肌肌钙蛋白I)、cTnT(心肌肌钙蛋白T)和Mb(肌红蛋白)等，它们在诊断心肌损伤方面价值更高，有取代心肌酶学指标的趋势。
在这些生化指标中，抗人心肌肌钙蛋白cTnI尤为突出，它是心肌损伤的一种特异、灵敏的血清标志物，具有以下特点在急性心肌梗死发生后4-12h即有明显升高，可持续4-10d，可作为早期诊断的指标，且对心肌损伤的灵敏度和特异性都很高，因此cTnI的检测不仅可以用来早期诊断急性心肌梗死和心绞痛等，还可作为晚入院病人的回顾诊断和动态诊断指标。
人心肌肌钙蛋白I(cTnI)是含210个氨基酸的蛋白质，相对分子量为24KD，据NCBIProtein提供的cTnI氨基酸序列为1 madgssdaar eprpapapir rrssnyraya tephakkksk isasrklqlk tlllqiakqe61 lereaeerrg ekgralstrc qpleltglgf aelqdlcrql harvdkvdee rydieakvtk121 niteiadltq kifdlrgkfk rptlrrvris adammqallg arakesldlr ahlkqvkked181 tekenrevgd wrknidalsg megrkkkfes据报道，cTnI中心区域的第96-116的氨基酸残基因为含有抑制性区域，能促进与cTnC相结合，进而具有更强的抵抗蛋白水解酶的水解作用。也就是说，当心肌损伤时包含这段氨基酸残基的cTnI可与cTnC相结合，被cTnC所保护大量存在血液循环中，因此将这段肽段作为抗原进行免疫制备抗体进而组装成胶体金免疫检测卡可以提高检测敏感性和特异性。
但是由于人心肌组织难以获得，因此从组织中大量提取纯化cTnI，把它作为研究或者诊断用的抗原是极其困难的，不但价格昂贵，提取纯化成本高，临床上很难满足早期诊断急性心肌梗死和心绞痛的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高的抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)合成多肽抗体。
本发明的另一个目的是提供一种抗cTnI多克隆抗体的制备方法。
本发明的再一个目的是公开了抗人cTnI合成多肽抗体在制备心肌损伤胶体金免疫检测卡中的应用及其使用方法。
本发明的还一个目的是提供一种用于检测心肌损伤的包被有cTnI-PcAb和羊抗兔IgG的硝酸纤维素膜的胶体金免疫检测卡。
本发明的目的是通过如下的技术方案加以实现一种抗人心肌肌钙蛋白I合成多肽抗体，其特征在于该抗体的效价为1∶200000，亲和常数为0.985×109L/mol，作为合成多肽的氨基酸序列为N端98-110的氨基酸序列Arg-Gln-leu-His-Ala-Arg-Val-Asp-Lys-Val-Asp-Glu-Glu。
本发明的抗人心肌肌钙蛋白I合成多肽抗体的制备方法，它是以人心肌肌钙蛋白氨基酸序列中N端98-110的氨基酸肽段序列RQLHARVDKVDEE作为抗原肽，在氨基酸C端加入Cys(半胱氨酸)残基，使合成肽具有游离的巯基，蛋白载体具有游离的氨基，将它设计与血蓝蛋白(KLH)相偶联，合成人心肌肌钙蛋白I抗原肽。经高效液相层析纯化后，免疫动物，制备多肽抗体，经检测抗血清效价，达到要求后，收获抗血清，并经辛酸—硫酸铵沉淀法纯化而成。
本发明所述的胶体金免疫检测卡，它是由样品垫、含有胶体金标记抗体的玻璃纤维、包被有人心肌肌钙蛋白I多克隆抗体、羊抗兔IgG的硝酸纤维素膜、吸收垫组成，其制备方法如下(1)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，用纳米级胶体金颗粒标记制备的抗体并将玻璃纤维浸泡在该抗体溶液中；用纯化的人心肌肌钙蛋白I多克隆抗体包被微孔硝酸纤维素膜，即在硝酸纤维素膜上划线，使抗体包被在硝酸纤维素膜上，以捕捉样品中的抗原；用羊抗兔IgG的多克隆抗体另划一条线，以捕捉胶体金标记的多克隆抗体，作为免疫检测卡的质量控制线；(2).晾干后完全浸泡于含1％牛血清白蛋白的pH7.2的磷酸盐缓冲液中，以封闭纤维素膜的残余吸附能力，4℃冰箱过夜；(3).取出封闭的纤维素膜，用磷酸盐缓冲液洗涤，每次将纤维素膜浸泡洗涤，置于室温中干燥，再放于通风干燥箱内通风干燥，密封于塑料袋中，保存于4℃冰箱备用。
本发明选取cTnI上N端第98-110的氨基酸，为13个氨基酸的多肽，合成肽主要通过固相多肽合成方法制备。以Fmoc保护氨基酸为原料，在固相载体(树脂)上以逐步缩合的方式合成所需肽段，最后以适当的方法从载体上“切”下肽段，并脱去所有的保护基团。将此多肽用高效液相色谱分析纯化纯度可达95％，制得纯的合成肽抗原，其特点是选择合成天然cTnI蛋白上的一段氨基酸多肽，具有免疫原性、且水溶性好，经高效液相层析纯化和质谱分析证实所合成多肽达到后续实验的要求。同时为了加强这段多肽的免疫原性，把它和血蓝蛋白(KLH)载体偶联，用该连接物免疫家兔，采用经典的多克隆抗体制备技术制备cTnI合成多肽抗体，采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)对cTnI抗体进行检测，达到实验要求。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，用纳米级胶体金颗粒标记制备的抗体并将玻璃纤维浸泡在该抗体溶液中；用纯化的人心肌肌钙蛋白I多克隆抗体包被微孔硝酸纤维素膜，(nitrocellulose membrane，NCM)，并结合层析技术建立了cTnI的胶体金免疫层析分析法(colloidal gold immuno-chromatographicassay，GICA)，从而制备了简便、快速的胶体金免疫检测卡，以满足临床检测、诊断的需要，具体表现为一、高质量的兔抗人cTnI合成肽段多克隆抗血清本实验用连接物免疫家兔，制备多克隆抗体，用间接ELISA法测家兔血清抗体效价水平，用cTnI合成肽纯品制备抗原包被板，抗体效价可达到1∶200000，说明选取的肽段是暴露于蛋白质外部的亲水区，具有较高抗原性，可产生效价较高的抗肽抗体，可进行后续实验。同时用天然人cTnI抗原制备抗原包被板，抗体效价可达到1∶10000，说明本实验选取的cTnI合成肽段与天然cTnI抗原具有很好的交叉反应，证实cTnI合成肽段与天然cTnI抗原在空间构象上具有相似性，同时用辛酸—硫酸铵法进行抗体的纯化，获得纯化抗体浓度为3.8mg/ml。抗体亲和常数Ka为0.985×109L/mol，亲和力强；特异性高，与人cTnT、CK-MB无交叉反应。经免疫3只雌性处于成长期的纯系新西兰大耳白家兔，经过初次免疫和加强免疫，于加强免疫2周后用间接ELISA法测家兔血清抗体效价水平，发现1号、2号和3号家兔的抗体效价均较高，抗体效价可达到1∶200000。(见表1)表1免疫家兔ELISA法检测结果OD492nm(连接物抗原包被浓度5μg/ml)
注以上数值均为酶标仪在492nm处测定的OD值，P/N比值≥2.1为阳性，其中P和N分别为阳性孔和阴性孔的OD492nm值。
检验本发明选取的cTnI肽段与天然cTnI的交叉反应。其中3号家兔血清抗体效价可达到110000(见表2)，说明本实验课题选取的cTnI肽段制备的抗体与天然cTnI具有很好的交叉反应，用此抗体可进行后续实验，制备胶体金免疫检测卡。
表2免疫家兔ELISA法检测结果OD492nm(天然cTnI抗原包被浓度5μg/ml)
注以上数值均为酶标仪在492nm处测定的OD值，P/N比值≥2.1为阳性，其中P和N分别为阳性孔和阴性孔的OD492nm值。
二、兔抗人cTnI合成肽多克隆抗体亲和力的鉴定亲和力表示抗体与抗原结合的紧密程度，以亲和常数Ka表示，亲和常数以浓度的倒数为单位，即克分子浓度-1(mol-1)。其值越高表示抗原抗体结合的紧密程度越高。对不同抗体，亲和常数具有一个很大的范围可从1012～105mol-1或更小。本实验采用非竞争性ELESA法测定抗体的亲和常数，这是美国David Beaty用包被抗原检测抗体的方法，通过质量作用定律归纳出一个以抗体浓度计算抗体亲和常数的方法。本实验中以cTnI合成肽制备抗原包被板，包被浓度梯度为5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml(8∶4∶2∶1共4个浓度梯度)；将纯化的抗体以磷酸盐缓冲液(PBS)稀释成10个浓度梯度40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、1.5625×10-1、7.8×10-2(μg/ml)均加入各浓度包被的抗原孔中，测定OD492nm值并作出曲线，最佳的抗体的亲和常数Ka＝0.985×109L/mol。
三、人cTnI胶体金免疫检测卡测定结果本实验采用柠檬酸三钠还原法制备出酒红色的胶体金溶液，通过紫外可见分光光度计在400-700nm处进行扫描，在520nm处具有最大吸收峰。通过胶体金溶液的颜色以及紫外最大吸收值进一步证实了本实验制备的胶体金颗粒直径为24nm左右。制备直径在24nm的胶体金粒子是因为此粒径既能保证胶体金在NCM上合适的泳动速度，又是肉眼观察时最敏感的颜色，因而保证了检测的快速性和敏感性。
在硝酸纤维素膜上包被cTnI PcAb，最佳包被浓度3.5mg/ml，本实验选定喷涂量为2μl/0.05cm2；硝酸纤维素膜上包被羊抗兔IgG的多克隆抗体，最佳包被浓度2mg/ml，选定喷涂量为3μl/0.05cm2。是根据表12中Millipore公司提供HF135的Hi-Flow Plus膜对羊IgG的吸附能力＞95μg/cm2，本实验中对于0.05cm2膜面积选定包被抗体的量为5-7μg，达到最适吸附蛋白量使检测线、质控线最为清晰。
通过对反应条件的优化和选择，确立了人cTnI合成肽胶体金免疫检测卡分析法的最佳方案。 包括胶体金最佳标记抗体浓度测定，以及硝酸纤维膜上最佳包被抗体浓度的测定等最佳反应体系的选择。并进行方法学鉴定本发明的人cTnI GICA法制备的胶体金免疫检测卡的积极效果在于使复杂的操作简化为只需加样一步操作；只需微量检样；用肉眼观察试纸条显色与否即可判断阳性、阴性结果，无需任何仪器，也不受场地限制；检测只需10-15min就可知道结果。所以，该方法既可单人份检测，又可批量检测，无需特殊仪器设备，肉眼观察即可判断结果，具有简便、快速、直观、单份测定的优点，尤其适用于基层医院和大规模普查。
图1cTnI合成肽-KLH连接物的高效液相层析图；图2合成肽与KLH连接物的质谱图；图3胶体金免疫检测卡组装示意图；图4检测卡各种检测结果示意图，其中1为操作方法，2为阴性结果，3为阳性结果，4为试纸条失效，a为质控线，b为检测线。
具体实施例方式
实施例1抗人心肌肌钙蛋白I多肽的合成用Protscale软件中的Hopp&Woods模型预测cTnI分子的亲水性、抗原型及同源性分析，选取cTnI上N端第98-110的氨基酸，为13个氨基酸的多肽，合成肽主要通过固相多肽合成方法制备。以Fmoc保护氨基酸为原料，在固相载体(树脂)上以逐步缩合的方式合成所需肽段RQLHARVDKVDEE氨基酸序列。最后以适当的方法从载体上“切”下肽段，并脱去所有的保护基团。将此多肽用高效液相色谱分析纯化可达95％(具体见图1)，制得纯的合成肽抗原。
实施例2合成肽与载体蛋白(KLH)的连接(MBS连接法)(1)将5mgKLH溶于0.5ml PBS中，置透析袋内，于4℃用PBS透析过夜后，转入玻璃试管内。(2)加入MBS/DMF 70ul，室温搅拌30分钟。(3)取经PB预平衡的PD-10层析柱，缓慢加样，PB洗脱，大约收集12-20管，每管0.5ml，通过紫外可见分光光度计测定洗脱液280nm OD值。第一峰代表MBS/KLH结合物，呈絮状；第二峰含游离的MBS。收集MBS/KLH结合物部分。(4)将5mg合成肽溶于PBS中，如合成肽不溶于PBS，则可溶于6mol/0.1mol/lPB中。(5)将合成肽溶液与MBS/KLH结合物混合，以0.1mol/l盐酸或0.1mol/l氢氧化钠调PH至7.3，室温磁力搅拌3h，置4℃蒸馏水透析过夜，换一次蒸馏水后，继续透析≥4h。连接物置-20℃保存备用，质谱鉴定见图2。
实施例3
cTnI合成肽抗原的多克隆抗体制备多克隆抗体制备技术的具体流程包括动物免疫，抗血清效价检测，收获抗血清，抗体纯化以及抗体质量鉴定几个部分，现分述如下一、动物免疫选择新西兰大耳白家兔体重1.5-1.8Kg，经初次及多次加强免疫制备人cTnI多肽合成抗体；(1).免疫效果的检测在第二次加强免疫后10-14天于家兔耳缘静脉少量采血，分离血清，用间接ELISA法检测家兔血清中的抗体效价。
(2).收集抗血清一次性大量放血，当抗血清效价达到最大并不再升高(或开始下降)时，采用颈动脉放血收集血清(a)实验兔的四肢和头部固定在实验台上用手术剪剪开颈部皮肤，暴露出颈动脉，将颈动脉用眼科剪剪一小口，插入一段细塑料管，放开止血钳，用三只50ml离心管接血，血液总量约100-150ml。
(b)将采集的血液置于室温，静置2小时后，置4℃冰箱过夜，用长玻璃吸管剥离凝血块，使血清便于析出。
(c)将血液在1000rpm×10min离心，收集血清(血清总量40-50ml)，加0.1％叠氮钠防腐，按1ml/管和0.5ml/管分装后置于-20℃冰箱保存备用。
二、ELISA法检测家兔血清效价(a)包被抗原，用包被缓冲液将抗原分别稀释至2μg/ml、5μg/ml和10μg/ml，共铺两块抗原包被板(聚苯乙烯酶联板)，每孔100μl，4℃过夜，然后弃去孔内液体，缓冲液洗三次，每次3分钟，拍干。空白对照孔加入不含抗原的缓冲液。
(b)每孔加入含0.5％BSA的封闭液100μl，4℃过夜，洗涤液洗三次，每次3分钟，拍干。
(c)于家兔耳缘静脉少量采血，静置沉淀4小时后，分离血清，将血清分别稀释至1∶100、1∶2000、1∶5000、1∶1万、1∶5万、1∶10万、1∶20万，分别取不同稀释度血清加入抗原包被板，每孔100μl，37℃水浴2小时，洗涤液洗三次，每次3分钟，拍干。阴性对照孔加入未经免疫的正常家兔的血清。
(d)将HRP标记的羊抗兔IgG抗体用含0.05％Tween-20的PBS稀释100倍，每孔加入100μl，37℃水浴2小时，洗涤液洗三次，每次3分钟，拍干；每孔加入邻苯二胺底物溶液100μl，室温避光放置30分钟；每孔加入2mol/L的浓硫酸50μl终止反应；用酶标仪于492nm处测OD值并判断结果。
三、cTnI合成多肽抗血清的纯化采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化。
(1)取cTnI抗血清1ml，加入4ml的0.06mol/L pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液。用1mol/L Tris溶液调上液pH至4.5。缓慢滴加125μl的辛酸溶液，常温搅拌30min，然后，10000rpm(4℃)，离心30min。弃沉淀，上清液用0.45μm滤膜过滤后，用1mol/L Tris溶液调pH至7.4。
(2)加等量饱和硫酸铵后，调pH至7.0，然后4℃搅拌30min，10000rpm(4℃)，离心15min，弃上清，沉淀用三蒸水溶解后，透析48小时(以三蒸水透析)。
(3)透析袋内溶液在280nm处测O.D值。
四、纯化后的cTnI合成多肽抗血清蛋白含量的测定紫外吸收法测定蛋白质含量。原理由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处。本实验将纯化后的抗血清稀释20倍后，测O.D260nm和O.D280nm。
实施例4人cTnI胶体金免疫检测卡的制备(1)胶体金的制备玻璃容器的硅化按使用说明书将硅烷化试剂(Sigmacote)加入玻璃容器中，轻轻晃动，使容器内壁表面与试剂充分作用，室温干燥后即可使用。专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以三蒸水淋洗，即可继续使用。
称取氯金酸(HAuCl4)1克，溶解于100ml去离子水中，配成1％的氯金酸溶液。取1ml该溶液置于250ml烧杯内，加入99ml去离子水，加热至沸腾，立即加入2ml 1％的柠檬酸三钠溶液，迅速搅拌均匀，观察颜色变化，1分钟后出现蓝色，继续加热，变为灰色继而黑色，2-3分钟后出现浅紫—深紫—深红—橙红—酒红，颜色稳定不变。继续加热10min，冷却至室温，补充去离子水至100ml。经一次性灭菌过滤器过滤，装入洁净玻璃瓶中，4℃保存备用。
(2)胶体金的鉴定用紫外可见分光光度计在400-700nm处进行扫描，在520nm处具有最大吸收峰。
(3)cTnI多克隆抗体(PcAb)胶体金标记最佳pH值的选定(a)取7支试管，每管各加入上述制备的胶体金溶液2ml。用0.1mol/L的碳酸钾溶液将其pH值分别调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。
(b)将上述不同pH值的胶体金溶液分别各取1ml分别转移至另外的7支试管中，每管加入10μg纯化的cTnI PcAb，混合均匀，室温反应10min后加入10％的氯化钠溶液100μl，静置2h，观察溶液颜色变化。
(c)然后，12000rpm离心10min，去掉上清，加入含1％BSA的PBS溶解沉淀，观察各管底部胶体金的颜色和溶解情况。以沉淀完全溶解呈均匀的透明紫红色溶液管的pH值为最佳pH值。最佳pH值为8.0。
(4)cTnI-PcAb胶体金标记最佳蛋白浓度的选择(a)用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值至8.0的最佳值，在6支试管中各加入1ml胶体金溶液。然后，分别加入1μg、2.5μg、5.0g、7.5μg、10μg、15μg纯化的PcAb，反应10min后，各管加入10％氯化钠溶液100μl，静置2h，观察各管颜色变化。
(b)然后，12000rpm离心20min，去掉上清，加入含1％BSA的PBS溶解沉淀，观察各管底部胶体金的颜色和溶解情况，以沉淀完全溶解成均匀的紫红色溶液管的最低蛋白浓度加其20％为最佳蛋白浓度。
(5)cTnI-PcAb的胶体金标记(a)将100ml制备好的胶体金溶液的pH值调节到8.0，从中取1ml加入纯化的cTnIPcAb 6μg混匀，室温反应10min，2000rpm，4℃，离心20min，去掉沉淀。上清液12000rpm，4℃，离心20min，弃上清。
(b)沉淀分别溶于100μl、200μ1、300μl、400μl含0.2％BSA的0.01mol/L pH8.0的PBS溶液，即制备成10％、5％、3％、2.5％浓缩的胶体金标记物。
(c)将玻璃纤维浸泡在不同浓缩度的胶体金标记的抗体溶液中，充分浸泡30min后取出。室温干燥18h以上，塑料袋密封，4℃冰箱保存。
(6)抗体在硝酸纤维素膜上的包被(a)将纯化的cTnI-PcAb用0.01mol/L含0.14M氯化钠的PBS(pH7.2)稀释至浓度为3.5mg/ml，3.0mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5 mg/ml各1ml。用微量注射器分别吸取5μl，分别在硝酸纤维素膜(NCM)上划线，线宽1mm，喷涂量为0.4μg/mm2，使抗体包被在NCM上，以捕捉样品中的抗原。
(b)在离抗体划线4mm处用浓度为3mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml的羊抗兔IgG的多克隆抗体另划一条线，喷涂量为0.8μg/mm2以捕捉胶体金标记的PcAb，作为试纸条的质量控制线。
(c)半小时晾干后完全浸泡于含1％牛血清白蛋白(BSA)的pH7.2的PBS溶液中，以封闭纤维素膜的残余吸附能力，4℃冰箱过夜。次日取出封闭的纤维素膜，用PBS洗涤3次，每次将纤维素膜浸泡5min，洗涤后的纤维素膜置于室温中干燥3h以上，再放于30℃通风干燥箱内通风干燥1h，密封于塑料袋中，保存于4℃冰箱备用。
(7).人cTnI胶体金免疫检测卡的组装、切割免疫层析分析试纸条切割尺寸样品垫(2cm×0.5cm)吸收垫(1.7cm×0.5cm)玻璃纤维结合垫(1cm×0.5cm)白色聚苯乙烯塑料垫板PVC(6cm×0.5cm)粘合胶条(2cm×0.5cm)NCM(2.5cm×0.5cm)取切割好的PVC板一块，将包被有cTnI PcAb和羊抗兔IgG的硝酸纤维素膜沿PVC板长径粘贴于PVC板中央，将吸收垫(引水纤维)贴于靠近包被有羊抗兔IgG的多克隆抗体的一端，并与硝酸纤维素膜密切接触，约重叠2mm。将含有胶体金标记抗体的玻璃纤维(宽0.5mm)贴于NCM膜下方与之相接触重叠。将样品垫贴于PVC板上，与结合垫相重叠约2mm。组装成0.5×6cm的胶体金免疫检测卡(具体见附图3)。
实施例5胶体金免疫检测卡质量鉴定(1)检测结果判断按检测卡操作方法，在室温条件下(15-30℃)，检测以正常人阴性血清配制的cTnI合成肽纯品标准溶液，上样10-15min，5ng/ml的cTnI合成肽纯品即可被检出，5ng/ml以下的cTnI标准品则不出现检测带，即为阴性结果。因此我们把观察结果的最佳时间定为上样后15min。检测灵敏度为5ng/ml，而高cTnI含量的样品，当其渗过检测区时，即可看见检测线出现，而不必等到15min。
检测结果可能有三种情形1.在检测区和质控区各出现一条紫红色的条带，表示检测结果为阳性。2.只在质控区出现一条紫红色的条带，表示检测结果为阴性。3.在检测区和质控区均无紫红色条带出现，表示检测试纸条失效。(具体见附图4)(2)检测范围的测定检测以正常人阴性血清配制的cTnI合成肽纯品标准溶液，5ng/ml以下的cTnI合成肽纯品不能被检出，对5ng/ml到1μg/ml cTnI合成肽纯品其检测带的颜色，呈现肉眼可见的由浅到深紫红色变化，对浓度＞1μg/ml cTnI样品其检测线颜色肉眼判断无差别。故该试纸条半定量检测血清cTnI的适用范围为5ng/ml-1μg/ml，(3)特异性的检测在检测样本中加入几种相关的蛋白质cTnT、CK-MB对检测结果无交叉反应。
(4)反应温度的测定在4℃条件下操作，上样后18min观察结果，5ng/ml cTnI标准品的检测线不出现，将观察时间延长到20min，检测线才出现，故4℃条件下操作，应在上样后20min时观察结果。
(5)保存时间37℃保存的试纸条第2、3、4和5天检测结果与第1天检测结果相同，检测线和控制线的颜色深浅在正常范围内。从第6天起，检测线和质控线的颜色均变浅，但仍在正常范围内，故37℃至少可保存5天。4℃保存的试纸条，至第12周其检测结果仍在正常范围内，故该检测试纸条在4℃至少可保存12周。
(6)检测结果保存时间检测过的试纸条放室温干燥，等完全干燥后重新判断一次结果，与15min时判断的结果一致。干燥后的试纸条4℃保存12周，检测结果无变化，故检测结果至少可保存12周。
实施例6胶体金免疫检测卡使用方法(1)检测时，将标有“marker”字样的一端插入待测样本中，等混合有胶体金的样品出现在NCM上时，将试纸条取出，放在干净、水平的台面上，观察结果。
(2)灵敏度测试将cTnI合成肽纯品浓度为1.0mg/ml的贮备液用健康人血清配制成0ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、5μg/ml的标准系列溶液，将本实验制备的试纸条分别插入上述标准系列溶液中，5秒后取出，观察各含量标准品出现阳性检测带，其中最低的cTnI浓度就是分析灵敏度。
(3)测定范围的确定将cTnI合成肽纯品用健康人血清配成10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、500ng/ml、250ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml和1ng/ml浓度系列。按上述方法用试纸条分别检测之，观察检测线颜色深浅的变化，以确定该试纸条用于半定量检测时的适用范围。
(4)特异性的检测在检测样本中加入几种相关的蛋白质cTnT、CK-MB观察检测结果有无交叉反应。
(5)反应温度对实验结果的影响在室温(约25℃)、4℃条件下进行检测操作，观察不同温度对检测结果的影响。
(6)保存条件和保存时间的确定将切割好的检测试纸条分别存放于37℃和4℃，观察温度对试纸条的影响。保存于37℃的试纸条每天取出3条分别检测0ng/ml、5ng/ml、50ng/ml的cTnI合成肽纯品，直至第12周。
(7)检测结果保存时间的观察上述检测过的试纸条干燥后密封于塑料袋内，室温保存，每周观察一次结果，以观察检测结果的保存时间。
权利要求
1.一种抗人心肌肌钙蛋白I合成多肽抗体，其特征在于，该抗体的效价为1∶200000，亲和常数为0.985×109L/mol；制备该抗体的抗原为合成多肽，其氨基酸序列为人心肌肌钙蛋白IN端98-110的RQLHARVDKVDEE氨基酸序列。
2.一种抗人心肌肌钙蛋白I合成多肽抗体的制备方法，其特征在于，以人心肌肌钙蛋白I氨基酸序列中N端98-110的RQLHARVDKVDEE氨基酸肽段序列作为抗原肽，合成人心肌肌钙蛋白I抗原肽；纯化的抗原肽与血蓝蛋白载体偶联合成人工抗原，经高效液相层析纯化后，免疫动物，制备多肽抗体，经检测抗血清效价，达到要求后，收获抗血清，并经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化而成。
3.如权利要求1所述的抗人心肌肌钙蛋白I合成多肽抗体在制备心肌损伤胶体金免疫检测卡中的应用。
4.一种检测人心肌肌钙蛋白I的胶体金免疫检测卡，其特征在于，所述免疫检测卡它是由样品垫、含有胶体金标记抗体的玻璃纤维、包被有人心肌肌钙蛋白I多克隆抗体、羊抗兔IgG的硝酸纤维素膜、吸收垫组成。
5.一种检测人心肌肌钙蛋白I胶体金免疫检测卡的制备方法，其特征在于按如下步骤进行(1)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，用纳米级胶体金颗粒标记制备的抗体并将玻璃纤维浸泡在该抗体溶液中；用纯化的人心肌肌钙蛋白I多克隆抗体包被微孔硝酸纤维素膜，使抗体包被在硝酸纤维素膜上，以捕捉样品中的抗原；用羊抗兔IgG的多克隆抗体另划一条线，以捕捉胶体金标记的多克隆抗体，作为免疫检测卡的质量控制线；(2).晾干后完全浸泡于含1％牛血清白蛋白的pH7.2的磷酸盐缓冲液中，以封闭纤维素膜的残余吸附能力，4℃冰箱过夜；(3).取出封闭的纤维素膜，用磷酸盐缓冲液洗涤，每次将纤维素膜浸泡洗涤，置于室温中干燥，再放于通风干燥箱内通风干燥，密封于塑料袋中，保存于4℃冰箱备用。
全文摘要
本发明公开了一种抗人心肌肌钙蛋白I(cTnI)合成多肽抗体及其制备方法与应用。其制备方法是以cTnI氨基酸序列中的一段(N端98－110氨基酸)合成多肽，其氨基酸序列RQLHARVDKVDEE，以此作为半抗原与蛋白载体连接后，制备出人工免疫原，对动物进行免疫，有效的诱导机体产生免疫应答，从而得到抗体。本发明制备的cTnI合成多肽抗体可与天然心肌肌钙蛋白I分子发生特异性结合反应。用该抗体包被微孔硝酸纤维素膜，用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金颗粒标记该抗体，并结合层析技术制备的cTnI胶体金免疫检测卡，其具有较高的灵敏度和特异性。为急性心肌梗的早期诊断提供了特异、灵敏、简便、快速的诊断技术。
文档编号G01N33/53GK1982337SQ20051012233
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月14日 优先权日2005年12月14日
发明者张春明, 王德芝, 陈冀莹, 赵启仁, 穆传杰, 秦丽莉, 李玉彬, 胡晓林 申请人:中国医学科学院放射医学研究所