专利名称：定向非球形细胞的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及定向期望的细胞、或细胞部分、优选地期望的精细胞的一种方法和装置，更具体地，本发明涉及定向、选择和保留有活力的期望精细胞的一种方法和装置。
背景技术：
长期以来需要一种可靠、定性、定量和划算的方法来选择精子，其可以用于产生期望性别的动物。
尤其是，畜牧业的农夫或饲养员要求优先性别的牛、猪、绵羊、山羊、鹿、水牛、马等等。例如，公牛对于乳牛业农夫的用途很少，而养猪农夫长期知道母猪比公猪长得快。
类似地，养牛和山羊的农夫非常明白这些物种的雄性比雌性更快长肉。
哺乳动物的卵子只携带X染色体而精子携带X或Y染色体。所以后代的性别由精细胞确定。当精子与卵子结合并且精子携带X染色体时，后代是雌性(XX)。然而，如果精子携带Y染色体，一旦与雌性携带的X染色体结合，所得到的后代将是雄性(XY)。
已知在X(较大)和Y(较小)精子之间存在DNA含量的差异，例如猪的是3.4％，牛的是3.9％，绵羊的是4.2％。这种可测量的差异可以用来确定精子的性别，即，是携带X染色体(雌性)还是Y染色体(雄性)的精子。
现有技术讨论和提供了把哺乳动物精子拣选为X和Y群体的方法。然而，能够在检测后保持精子活力的唯一可靠方法介绍了测量各精子的DNA质量(mass)。这些方法基本上使用了改良的应用荧光测量的流式细胞仪来检测X和Y精子之间的小差异，其中精子以单行穿过一个系统，其测量单个精子的DNA含量。
已经发展了许多技术以使用前方位置的倾斜(bevelled)的样品注射尖和第二荧光检测器。该第二荧光检测器适于当精子经过此系统时，确定扁平卵圆形的精子头部相对于第一检测器的方向。
在两种情况中，所测量的是荧光的量级。这要求两个单独的荧光检测器，或至少两个不连续的荧光读数。
进一步的改进考虑到那些不需要的精子将要被阻挡并作为废物穿过和被丢弃。
现有技术因此介绍了一种流式细胞计数系统，其要求两套单独的精细胞荧光量级的测量仪器，一个用来确定精子的性别，另一个确定精子的方向。本领域技术人员将认识到，由于精细胞的形态学(扁平卵圆形)和极高的折射指数，不可能准确地测量精子的DNA含量，除非所述精子正确地定向于DNA荧光检测器。
现有技术的方法已经证明是昂贵的-并且通常不能提供超过常规效率80％的效率，尽管已经报导了95％的效率。而且，此前使用的方法有时会使得光电倍增管超负荷，而导致相对高的背景噪音对信号比和无法接受的大量错误性别精子。
Johnson和Pinkel在Cytometry 7268-273(1986)中的教导提供了两个荧光检测器，一个在90度，第二个在0度。这些检测器同时从精子核的边缘侧和扁平侧收集荧光信号。在90度的荧光检测器用于确定垂直于第二荧光检测器的单个精子的方向，第二检测器测量荧光量级并因此测量精子的总DNA含量(以及性别)。
Lawrence Johnson在属于XY Inc.的US 5,135,759中公开的现有技术教导了一种方法，其测量两个检测器的荧光量级以提供相应数据。即，用荧光来确定任何所给精细胞的方向和DNA含量(性别)。此Johnson专利使用折射的非荧光光线发射，不能看到确定方向的新概念。
Johnson方法/装置完全地基于一种改良的流式细胞仪。流式细胞仪是分析单个细胞和把细胞分成3个群体的常用实验室工具。本质上流式细胞仪把细胞注射到一种鞘流系统，其将细胞梳理为单列并将它们定向到一个光学/聚焦平面中。取决于内几何学，喷嘴也可以将细胞径向定向在鞘式流体流中。
然后在来自喷嘴的压力下把细胞喷射为小滴的流，每个小滴理想上包含单个精子(一些小滴包含多个精子而一些不含)。单个精子通常在小滴内光学地分析，通过对单个小滴施加根据分析确定的正、负或零电荷，然后将所述小滴穿过带电的偏转平面，拣选为单个群体而达到。无需详述，此过程是有问题的，尤其在高速时。然而XY Inc.声明拣选纯度90-98％依赖于操作速度，即速度越高，拣选的准确性越低。
Johnson/XY，Inc.方法的一个显著缺点是拣选的精子的存活度。小滴以高速离开喷嘴，并且取决于拣选速率，小滴的速度可以到达每秒20米的速率，导致巨大压力作用于精子而作用于收集导管中的流体或其壁。小滴在空气中流动也将精子暴露于氧化胁迫，认为这种胁迫可能影响精子存活度并导致活精子产量相对较低。
US 6,263,745、US 6,357,307&US 6,604,435公开了各种喷嘴系统。这些文献形成了同一发明的不同方面。它们都涉及对流式细胞仪的改良喷嘴系统，大致描述了一种加速精细胞运输的方法，有希望地在将要被拣选和分析的正确方向。US 5,985,216。此文献描述了一种锥形的拣选喷嘴。报道它能够从一个样品中对期望的和存活的精子类型定向和允许拣选。上述文献都未公开本发明的新方面。
WO98/34094教导了一种适于流式细胞仪的上射照明(epillumination)系统，其不要求精子被对准或定向。它有效地组织并指导收集流式细胞仪的发光的样品流的荧光，通过使用抛物面或椭圆体形的收集器。’094方法给出了相对低的通道流动并可能危及细胞存活度。
WO01/85913描述了一种分析携带X和Y的精子的DNA体积的方法。此文献讨论了使用电磁辐射(或仅仅电磁辐射的光)和改良的差分干涉反差光学来测量性别差异特征，诸如精细胞头部的体积。电磁辐射可以是激光、微波或紫外光。’913文献的核心攻击了荧光测量导致的定向、失真读数和背景信号的问题。此文献陈述了这“能够使得光电发射光中的小差异可被区分，甚至当每次光电发射事件发出的总光线高时，或者甚至当每秒有大量光连续事件时”。此’913专利测量了相位偏移中的微小改变，即光的波形特征在穿过精子之前和之后的差异。此文件教导了使用复杂的改良干涉光学和偏振光来确定样品方向。并未预期使用相位对比或暗场光学来测量折射的非荧光光线来确定样品方向。
因此需要一种简单和有效的方法和装置，其能够使单独细胞准确和快速地从细胞群体中被拣选，并且其中的细胞保持存活。
发明目标本发明的一个目标是提供一种改进的方法和/或装置来选择期望的细胞、或细胞部分，或是一种避免或最小化前述缺点的，或将至少给公众提供一种有用的选择。
发明概述因此，本发明的一个方面提供了一种方法来确定一种流程中的一个细胞的方向，其中所述方向用于允许确定细胞由于大小、质量、体积或密度的差异，并且因此由测量非荧光光线而确定细胞方向。
优选地，由使用通带滤片以排除除了一种相位对比光学系统或一种使用暗场光学技术的系统以外的所有光来确定方向。
优选地，此细胞是非球面细胞。
优选地，此细胞是精细胞。
优选地，确定细胞方向的方法不要求细胞包被在小滴内。
优选地，确定细胞方向的方法与测量细胞的DNA含量的方法协作。
优选地，确定细胞方向的方法与测量细胞的DNA含量的方法同时使用。
优选地，确定细胞方向的方法用于选择期望的染色体组的精子的方法中。
优选地，确定细胞方向的方法进一步用于一种方法来区分携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子和/或选择具有期望性别的细胞群体。
因此，本发明的第二个方面提供了一种方法来选择期望的细胞或细胞部分，此方法具有以下步骤(i)将合适地维持的细胞从细胞样品穿过到测试区域中，(ii)将所述感兴趣的细胞样品暴露于具有第一波长的第一光源，(iii)将所述感兴趣的细胞样品暴露于具有第二不同波长的第二不同光源，(iv)收集在以上(ii)和(iii)发射的光能，(v)分析在(iv)收集的光以确定是否达到期望的预先确定参数，(vi)选择达到所述期望参数的细胞或细胞部分，(vii)将所选择的细胞收集到合适地保持存活度的培养基中，和/或(viii)除去不需要的细胞或细胞部分作为废物。
优选地，细胞是精细胞。
优选地，精细胞以合适的DNA-特异性结合荧光染料染色。
优选地，第一光源是在所述DNA特异性结合荧光染料中激发荧光的合适波长。
优选地，第一光源形成有一种或多种波长的发射荧光，以使得分析精细胞的DNA含量。
优选地，荧光染料选自SYBR green I、SYBR green II、SYBR gold、和双苯酰亚胺(Bisbenzimide)H33342。
优选地，第二光源用于确定细胞的方向。
优选地，第二不同光源使用一种衍生自相位对比光学系统或使用暗场光学技术的光源。
优选地，细胞同时暴露于所述第一光能和第二不同光能。
优选地，细胞穿过一个定位装置，其中细胞的方向被流体力学地定向以达到相对于检测器的均一径向几何学。
优选地，测试区域是矩形的容纳区域，其适于在分析过程中保持单独细胞最优选地精细胞的方向。
优选地，将要测试的细胞被以足以维持和保持细胞存活度的流动速度运送到矩形测试区域，优选地以每秒超过1,000细胞，最优选地在每秒1,000至100,000细胞之间。
优选地，将要测试的细胞被以每秒从5,000至40,000细胞的流动速度运送到矩形测试区域。
本发明的第三方面提供了一种装置以选择期望的细胞或细胞部分，此装置包括(i)从感兴趣的细胞样品把合适地维持的细胞传递到测试区域的装置，(ii)将所述感兴趣的细胞样品暴露于具有第一波长的第一光源的装置，(iii)将所述感兴趣的细胞样品暴露于具有不同波长的第二不同光源的装置，(iv)收集和如有必要的话，放大所述样品在(ii)和(iii)发射的光的单独装置，(v)分析由单独装置(iv)收集的数据以确定是否达到期望的预先确定参数的装置，(vi)选择、收集和维持细胞在存活状态达到所述期望的预先确定参数的装置，和/或(vii)除去不需要的细胞或细胞部分作为废物的装置。
优选地，所述第一光源是电磁辐射源，诸如激光。
优选地，所述第一光源适于允许分析细胞的DNA含量。
优选地，所述第二光源衍生自相位对比光学系统或使用暗场光学技术的系统。
优选地，所述第二光源适于确定细胞的方向。
优选地，在暴露于所述第一光源之后收集从所述样品发射的光的所述装置包括一个或多个显微镜物镜或类似物。
优选地，在暴露于所述第二光源之后收集从所述样品发射的光的所述装置是一种光学检测系统，适于收集非荧光波长的光能。
优选地，所述分析和辨识装置是多通道分析器或装有合适地开发的计算机软件程序的计算机。
本发明的第四方面提供了一种运输装置以从样品注射管经由流体力学径向地定向的喷嘴以层流运输合适地维持的精细胞并流向测试区域，所述运输装置包括具有第一末端部分和第二末端部分的细长管，包括一喷嘴的第一末端部分，包括预-收集或减速区域的第二末端部分，并且其中，第一和第二末端部分分开在一大致矩形的截面测试区域的两侧，并且其中，包括所述喷嘴的所述第一末端部分具有第一末端和第二末端，所述第一末端适于与一个样品注射管连通以接收所述样品，所述第二末端靠近所述测试区域，所述喷嘴的大小和形状足以维持所述精细胞在流体力学径向方向的层流，且包括所述预-收集或减速区域的所述第二末端部分构造为搬运精细胞到收集装置，如此所述细胞在离开测试区域之后被维持在存活状态，适于用在体外或体内授精步骤。
优选地，预-收集或减速区域从大致矩形截面的测试区域向外展开。
优选地，在使用中，当细胞从注射管传递到运输装置时，定向喷嘴将单独细胞定向并维持在一个位置，其允许每个单独细胞穿过具有第一波长的第一光源，并允许所述细胞发射的光被检测并分析DNA质量，并且其同时允许所述细胞穿过具有第二不同波长的第二不同光源以被检测并分析正确方向。
优选地，单独细胞同时暴露于所述第一和第二光源。
本发明的第五方面提供了一种方法以选择期望的精细胞或精细胞部分，此方法具有以下步骤(i)将从雄性哺乳动物收集来的完整、活精子用合适的荧光染料染色，如此DNA均一地吸收荧光染料，(ii)在一种合适的维持培养基中维持染色的精子，此培养基足以维持精子和/或细胞中包含的DNA在存活状态，(iii)将含有精子的维持培养基传递到合适的激发光源前，导致染色的DNA发荧光，(iv)将含有精子的维持培养基传递到两个装置，一个装置用来测量染色的DNA的荧光，另一个用来检测精子的方向，(v)收集所述精细胞发射的光能，将光能转化为电信号，并由多-通道分析器或合适地装有程序的CPU分析电信号，(vi)选择达到期望的预先确定标准的精细胞或精细胞部分，并(vii)除去不能达到期望的预先确定标准的细胞或细胞部分的一种装置。
发明概要Lawrence Johnson在属于XY Inc.的US 5,135,759中公开的现有技术教导了一种方法，其使用90度和0度光学检测器来收集和测量荧光的量级，以确定任何所给精细胞的方向和DNA含量(性别)。
与之相比，本发明提供了一种新方法，其使用第一检测器来测量从精子扁平表面的荧光的量级以测量DNA，使用第二检测器来测量衍生自单独光源的折射的非荧光光线的量级。单独光源衍生自相位对比或暗场光学系统的部分以提供方向数据。重要地，所有激发光和荧光以及来自任何其它光源的任何不需要的或异常光都被第二检测系统由合适的通带光学滤片排除，从而提供来自凹面的更清晰的信号(即精子扁平表面发射的任何荧光都被排除而不测量)。使用相位对比或暗场光学来测量所述非荧光光线达到了显著较少的PMT负荷。PMT负荷的减少因此允许较高的处理速率、处理成本的经济和显著较高的精子存活度保持，由于较短的单个样品处理时间。Johnson方法是速度受限的，因为较高的处理速度会导致信号弹跳造成背景噪音对信号的比值不期望的高。
令人惊讶地，本发明人发现一种方法，其中精细胞的方向通过将使用相位对比或暗场技术的光穿过感兴趣的精细胞而确定，此方法提供了改进的效率并增加了所得结果的可靠性。换言之，精细胞的方向-确定结果是否应被接受用于进一步分析的正确方向-可以通过测量由精细胞发射的非荧光光线而确定。
使用相位对比光学或暗场光学技术作为一种方法来测量折射的非荧光此前从未被认为是一种确定非球形细胞方向的方法。
本发明也发现，不同于现有技术，在方法的分析和收集阶段不需要将感兴趣的细胞包被或限制在带电的培养基中。以前，一旦已经确定了精细胞的DNA含量，细胞就被包被在附带有电荷的小滴中，此电荷取决于细胞的X或Y性染色体含量。然后基于小滴容纳的电荷而分离小滴。本发明仅仅基于分析器程序中预先确定的参数而选择具有期望性别染色体的细胞。如果达到标准，细胞不被处理地通过，并保持在存活状态，适于体内或体外授精使用。如果未达到标准，细胞可以永久固定穿过质膜的渗透性，通常由热传递，但并非必需地，由暴露于激光，或部分地或完全地由烧蚀光解方法而破坏，通常由暴露于激光。
本发明还教导了使用位于定向喷嘴下游的矩形测试区域。从定向喷嘴出现的细胞可以被保持在正确的径向方向以允许准确地DNA分析。已经发现，本发明的测试区域的大致矩形构造提供了所获得结果的较高准确度和可靠性。此前的测试方法将被测量的细胞保持在圆形的横截面流或液态小滴中，当细胞离开喷嘴时，其是大致椭圆或圆形结构的。这种结构尽管允许期望方向的商业上可接受的细胞流动率，但也造成了误差，由于被液流或小滴的曲面折射的光是被测量的。
重要地，这种矩形测试区域提供了4个扁平表面。这种改进导致比使用曲面的系统显著减少不需要的折射光，因此排除了错误读数。同样地，提供了4个扁平表面提供了比此前公开的系统大大改善的可靠性。
本发明因此包括至少4个新部分，其方面此后将以更深度地列出。第一，本发明使用相位对比或暗场光学来确定相对于DNA测量检测器期望的细胞方向。第二，本发明不要求感兴趣的细胞被包被在小滴中或以其它方式以使得期望的细胞被物理地与不需要的细胞分离开。第三，使用大致矩形的测试区域减少了不需要的光对方法的影响测量。第四，本发明教导了一种激光促动装置来临时或永久地固定不需要的细胞或甚至破坏不需要的细胞。
因此，上述特征提供了优于现有的细胞选择/拣选方法显著的、令人惊讶和新的优势，尤其是优于那些所指为精细胞的性别的选择方法。
发明详述以下实施例仅为示范性的，其中特定整数是指具有已知等价物的，认为这种等价物合并于此处，如同单独地提出的。
实施例仅仅描述了优选的实施方案，并非限制性的。
本申请特定地相关于选择携带期望的性染色体的精细胞。现在可达到提供纯度为95％或甚至98％或更高的存活的带有X染色体的精子的群体或带有Y染色体的精子的群体的能力。
本发明的各种其它目标和特征以及附带优势将会更完全地被理解，当它们与附图结合理解时，其中相似的参考数字在多幅图中指相同或类似部分，并且其中图1是表示系统方法学的示意图。
图2是整个方法的流程图。
图3表示运输装置。
图4图示注射管、运输装置和收集点的关系。
图5表示由图4的‘A-A’线，组成装置的部件的截面关系。
图6提供了包括各部件的装置的综观。
实施例1现在转向图1至6，详述了本方法中涉及的各装置和方法步骤。
将要根据性别特征区分的活精子通过标准收集技术收集，并维持在合适的培养基诸如Tris缓冲培养基中。细胞内的DNA以非毒性的荧光染料染色，优选地SYBR green I、SYBR green II、SYBR gold或双苯酰亚胺(Bisbenzimide)H33342。完整的染色精子然后置于由光学纤维或中空的玻璃纤维(26)提供的荧光激发能源下。优选的激发波长是约488-497mm并取决于所使用的特定荧光染料。发射的信号由荧光收集物镜(11)或类似物收集，由光倍增管(PMT)(18A)测量，并由装有合适程序的CPU/分析器(19)处理/分析以确定单独精子的方向。如果在分析后，所研究的细胞达到期望的标准，选择、收集精细胞，并维持在合适的维持液体中-为了之后用于体内或体外授精步骤。
没有达到预先确定标准的细胞可以由热传递过程(通常但并非必需地由暴露于激光)永久地固定，或者由烧蚀光解方法而破坏，通常由暴露于激光(20)。
现在参考图1、&3-6，单列的单独精细胞被允许穿过一个喷嘴(8)(见图3)进入测试区域(10)。测试区域(10)(见图5)通常是矩形的，其大小允许单独精细胞被容纳并且保持它们的方向为了DNA分析。精细胞的流动在整个过程中是连续的。预期的处理流动率为每秒约10,000至35,000精子，尽管每秒1,000至100,000的流动率也认为是可能的。流动率将是使得精子保持存活的并取决于系统因子。因子包括系统运行的压力，其大约在30psi和70psi之间，强度/PMT负荷和激光重复频率为约3至300KHz。
DNA分析和选择期望的精子包括两个阶段。这些阶段优选地同时进行，但不是必需的。可能有一些情况时这些阶段是伴随的，例如当分析后单独精子排成列而在不需要的精子被固定化之前。还可能有一些情况是当离开测试区域的精子在取决于预先确定标准被保持或丢弃之前经历进一步测试时。
在阶段A，一个单独精细胞(1)已经预先用荧光染料染色了。荧光染料结合于DNA。荧光染料结合DNA的量取决于存在DNA的量。由于X染色体比Y染色体含有更多DNA，雌性精子(X)将比雄性精子(Y)吸收更多可测量的荧光染料。
吸收的荧光染料越多，发射的荧光越多，可以测量各荧光细胞之间的差异。
单独精细胞穿过矩形测试区域(10)并暴露于由中空矩形玻璃纤维(26)输送的荧光染料激发光源(27)。结合于DNA的荧光染料被激发和发荧光。由一个物镜(11)收集荧光，由合适的通带滤片(24、25)过滤以滤去所有非荧光光线并由PMT(18A)收集，并发送到装有合适程序的CPU/分析器(19)以分析。
参考图1，阶段B与阶段A同时工作。这里，到达矩形测试区域(10)的单独精子(1)置于相位对比或暗场光学电容器(22)从而收集被测试精子发射的折射非荧光光线。通带滤片(24)用于确保排除了任何残留的荧光或任何其它不需要的发生在带宽(450nm-550nm)之内的光。折射的光任意地过滤过另一滤片(24)以排除热传递或烧蚀光分解激光发射的电磁能，由PMT(18)收集，并运输到装有合适程序的CPU/分析器(19)以分析。使用上述相位对比或暗场方向确定方法基本上要求除了衍生自相位对比系统(16、22、22A)的电磁能以外其它所有可测的电磁能都被90度的PMT系统排除而不测量，由提供合适的光学滤片(23、24)。
一完成分析，未达到预先确定标准的细胞由热传递方法永久固定，或由烧蚀光分解装置(激光)破坏。激光/固定输出(21)位于分析/测量操作点的下游并由CPU/分析器(19)控制。
图1由以下描述1.细胞
10.测试区域(矩形地构造以提供四个大致扁平的表面)11.荧光收集物镜16.相位对比或暗场物镜17.预-放大器(任选)18.PMT18A.PMT19.CPU/分析器20.固定外部触发的Q-开关激光或烧蚀外部触发的Q-开关激光21.光学纤维或中空的矩形玻璃纤维以运输固定或烧蚀能22.相位对比或暗场电容器22A.用于相位对比或暗场光学系统的第二光源23.通带滤片以排除450nm-550nm的波长24.通带滤片以排除来自20的异常的不需要的光25.通带滤片以排除所有非荧光的波长26.提供荧光激发光的光学纤维或中空矩形玻璃纤维27.荧光激发光源还预期了包括第二几何轴向运动系统的一种装置，其允许对将要收集的期望细胞柔和地减速，经由一个吸液管或类似物收集并维持在一种合适培养基中为了之后的使用。收集装置位于运输装置和测试区域的下游，作用相似于河流系统中的丁坝。见图4。
实施例2图3至6所示的装置描述了机制，通过此机制合适地保持的完整精子被提供用于如上所述的测试。
在一个实施方案中，运输装置由一个具有五个功能区域的细长管界定。在第一个区域即定向区域，离开样品注射管(110)的大部分精子(1)(优选地具有倾斜的注射尖以最小化由入口点(18)进入喷嘴的鞘流对层流的效应)，定向为进入测试区域(10)的期望位置以分析。喷嘴的独特内部几何学与鞘流的层流结合产生特殊的流体动力学力，其提供精子的一种流，其大部分在用于测试的正确方向。由一个大致矩形截面的管(5)达到维持精子的方向，其邻近一个喷嘴(8)。方向维持区域的下游是第二区域即测试区域(10)。在分析后，不需要的精子被固定或排出在第三区域。第四区域是减速预-收集区域(‘3-3’)，在被选择的期望性别的存活精子被收集到第五区域即收集区域之前。收集的细胞维持在合适的环境(4、41)中用于选择后用途。
测试区域(10)大致是个空腔、管或孔，其大小和形状足于容纳和维持单独细胞的方向并允许测试、分析和随后选择达到期望标准的细胞。在一个实施方案中，矩形测试区域的小轴在截面观看时是大约32μm，长轴是70μm。
尤其是，矩形截面管(5)维持了精细细胞(delicate cell)由喷嘴(8)产生的方向，并使得细胞以单列(file)进入测试区域(10)通过第一光源。第一光源优选地衍生自激光。用合适的荧光染料诸如SYBR I、SYBR II、SYBR gold、双苯酰亚胺(bisbenzimide)H33342等染色的细胞被激发，发荧光并测量荧光的量级。例如SYBR II，在488nm处具有峰值激发，在525nm处具有峰值发射。
与上述同时，单独精细胞暴露于第二不同的光源，诸如衍生自光相位对比或暗场系统的光。此光源垂直地设立于第一光源。被测试的精子发射光。捕获光，放大并由多通道分析器或合适的计算机分析工具分析。
精子穿过第一光源时发射的荧光用于鉴定精子携带的是X染色体还是Y染色体。精细胞从第二不同光源折射的非荧光光线提供了改良地确定其方向。
实施例3考虑到图3-6，发明人使用了实施例2中描述的新的流体动力学径向定向的喷嘴(8)来将单独精子径向定位进入位于喷嘴“出口”(‘A-A’)的矩形截面毛细管。定向喷嘴(8)的出口邻近测试区域(10)。这使得从样品注射管(110)发射的精子建立理想的径向和焦平面方向，同时如光学分析所要求的穿过喷嘴。作为一个结果，更多部分进入测试区域(10)的单独精子将会正确地与荧光物镜(11)校正以便于鉴别测试区域(10)内单独精子的染色体组。测试区域的下游一种高速激光(20)永久地固定或破坏不确定性别的精子，即未能正确定向的和并非期望的染色体组的精子。
一旦完成加工，精子柔和地减速通过柔和地变细的减速区域或预-收集区域(‘3-3’)进入收集管(未显示)。
独特的预-收集/减速区域是毛细管的柔和扩张的延长物。已经观察到，发散的角度和扩张的长度直接影响减速速率。一个实施方案中的预-收集区域采用“P”弯管(4)的形式并位于减速区域的末端。“P”弯管(4)预先装有在开始处理前稀释到所示水平(41)的精子以阻止从分析/处理区域喷射。
为了体外授精的目的，不能游动的/死精子可以由硅石胶态悬浮液(percoll)密度梯度离心或如对IVF预计的漂浮(swim-up)技术移去。熟练的读者将明白任何非活性、不能游动或死亡的精子是不能用于体外授精应用的。
实施例1至3描述了现有技术与本发明的关键差异，即使用相位对比或暗场光学系统或类似的，用于确定单独精子(90度检测器)相对于DNA检测器(0度检测器)的方向。这提供了获得令人惊讶的系统效率，并提供了较高的加工速度，增加分析的准确度，通过非-超负荷光倍增管(PMT)。
实施例4来自样品注射管(110)和通过流体力学定向喷嘴(8)的精子的显著高比例在进入测试区域(10)之前被正确地校正，如上所述。一进入测试区域，单独精子就同时被在90度的相位对比或暗场光学(16、22、22A)分析方向和被0度(11)的荧光检测器分析DNA含量，如图6所示。收集数据并由CPU/分析器(19)处理数据，使用固定的外部触发Q-开关激光(20)选择期望性别的精子，优选地在2.69μm波长发射，尽管其它波长也可以使用，或可以使用采用其它波长的烧蚀外部触发Q-开关激光。
不用说，选择/固定化阶段在测试区域的下游发生，并在进入减速/预-收集区域之前。已经发现，2.69μm激光系统很好地适于本发明的精子性别方法，因为它输送所需的动力、穿过和吸收性能。
上述固定化激光(尽管一些详述可以在整体工作要求内改变)的详述为·波长2,690nm(或对较高穿过但较低吸收的2,620nm，还没对这个波长计算)·固态。掺杂铬、铥、铒的YAG晶体(CTE:YAG)(尽管可以使用二极管激光，假如在所需的重复频率和脉冲宽度水平能产生足够动力)·外部触发的Q开关·脉冲宽度大约500ns·重复频率-可变地至300kHz·分裂波束，脉冲输送通过两个直接相对的脱水的(低OH)硅光学纤维或中空的矩形低OH玻璃纤维。在样品界面的内核或中空中心输送纤维的表面测量＝70×10μm带有圆末端的矩形，成形自展平的直径30μm(内核)的光学纤维，或电磁能可以由两个基本矩形截面的空心、低OH玻璃纤维，中空部分为约70μm×32μm。
·外部触发的Q开关激光将回复到脉冲之间非常低的动力CW校正模式以维持谐振器的正确内部热状态。
读者将会明白，只有正确定向的细胞可以用于准确预测DNA含量并因此预测精子的性别特征。
本详述(包括任何附带权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征，和/或公开的任何方法或工艺的所有步骤，可以组合在任意组合中，除了至少一些这种特征和/或步骤被互相排除的组合。
服务于同样、相当或类似目标的可替换特征可以取代本详述(包括任何附带权利要求、摘要和附图)中公开的各特征，除非另外明确指出。因此，除非另外明确指出，公开的每个特征仅仅是相当或类似特征的一类系列的一个例子。
本发明不受限于前述实施方案的细节。本发明扩展到本详述(包括任何附带权利要求、摘要和附图)中公开的各特征中的任何一个新的、或任何新的组合，或扩展到如此公开的任何方法或工艺的步骤的任何一个新的、或任何新的组合。
优势本发明具有以下优势的一个或多个△相对廉价△允许优良的样品流动率△提供所收集样品的纯度增加△所选样品的存活度改进△提供增加的效率△更容易机械操作△改进的可靠性△增加样品定向的可靠性变更已经描述并以示例的方式图示了本发明的一些优选方面，但将要理解的是，对本发明的其它变更和改变也可以发生而不离开本发明。
例如，可以想象，尽管本详述主要地是指选择携带X和Y染色体的精细胞，也可以设想从血液样品中选择红细胞或白细胞，或者从合适地制备的样品选择革兰氏阴性菌。
使用这种方法来分离和选择感兴趣的病毒也是一种选择。
熟练的读者也将立刻意识到，除去不需要的波长的光能也取决于所研究的样品而变化。类似地，尽管使用波长在2.69μm的光学/中空纤维布置对于实施例中所指的固定或烧蚀激光是优选的，不那么合适但更完美适当的波长可以由空气输送。事实上，一些可能的波长不适于纤维输送。相应地，尽管荧光可以由空气输送，优选的是荧光激发波长由纤维光学输送。
也将理解的是，所指的一个细胞也可以是指一个细胞部分并尤其是指一个细胞的成分，诸如核DNA、线粒体DNA、RNA，或指有机体或病毒，其已经侵袭了所述细胞，或并非通常发现在细胞中，或伴随所述细胞或所述细胞部分。
本文件描述了使用本发明关于从农业上重要的动物选择具有期望性别的精子，但一个熟练的读者将立刻意识到，以上描述的方法和装置将可以应用于对所有有胎盘哺乳动物选择期望性别的精子。
在本详述的描述和权利要求中，词语“包括”和其变化形式诸如“包括”和“包括着”，不意味着排除其它附加物、组成、整体或步骤。
参考文献1.M.Montag，K.Rink，G.Delacretaz & H.van der Ven，2,000.Laser-inducedimmobilisation and plasma membrane permeabilization in human sperm.Human Reproduction， Vol 15，No.4，846-852.
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权利要求
1.确定非球形细胞在一过程中的方向的第一方法，其中所述方向用于在第二方法中由于细胞或细胞部分的大小、质量、体积或密度差异从细胞样品选择期望的细胞或其部分，所述方法特征在于，细胞的方向通过测量由相位对比或暗场光学系统提供的折射非荧光光线而确定，所述折射非荧光光线已经先穿过一个或多个通带滤片，其足以排除除了来自相位对比或暗场光源以外的所有波长。
2.根据权利要求1所述的方法，当与所述第二方法协同和优选地同时使用来选择期望细胞或细胞部分时，其中所述细胞或细胞部分的大小、质量、体积或密度的差异通过测量所述细胞或其部分的DNA含量而确定。
3.根据权利要求2所述的确定非球形细胞或其部分的方向的方法，其进一步用于在一种方法中通过测量单独精细胞的DNA质量自携带Y染色体的精子选择出携带X染色体的精子。
4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中选择期望细胞或细胞部分的方法包括以下步骤(i)将合适地维持和定向的细胞或细胞部分从感兴趣的细胞样品运输到一测试区域，(ii)将所述感兴趣的细胞样品暴露于具有第一波长的第一光源，(iii)将所述感兴趣的细胞样品暴露于具有第二不同波长的第二光源，(iv)由合适检测器收集在以上(ii)和(iii)发射的光能，(v)分析在(iv)收集的光以确定是否达到期望的预先确定参数，(vi)选择达到所述期望参数的所述细胞或所述细胞部分，(vii)将所选择的细胞收集到合适地维持存活度的培养基中，和/或(viii)固定或破坏不需要的细胞或细胞部分。
5.根据权利要求4所述的方法，其中将被选择的细胞是携带X染色体或携带Y染色体的精细胞。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述精细胞以合适的DNA特异性结合荧光染料染色。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述荧光染料选自SYBR greenI、SYBR green II、SYBR gold、和双苯酰亚胺(Bisbenzimide)H33342。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一光源是一种适于提供荧光的激发光源，优选地在从488nm-497nm处具有峰值激发。
9.根据权利要求4至8中任一所述的方法，其中所述第一光源用于使荧光染料处理的细胞发荧光，从而产生足够的荧光来测量精细胞的DNA含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一光源用于使荧光染料处理的细胞发荧光，从而产生足够的荧光来测量精细胞的DNA质量。
11.根据权利要求4至10中任一所述的方法，其中所述第二光源用于确定所述精细胞的方向。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二光源包括相位对比或暗场光学系统的部分和一个或多个通带滤片，所述滤片足以排除所述第一光源发射的激发光和荧光波长以及固定或烧蚀装置发射的任何不需要的、异常光。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞同时暴露于所述第一光源和第二光源。
14.根据权利要求13所述的方法，其中精细胞穿过适于流体力学地定向单独精细胞的样品定向装置，以使大部分精细胞对所述第一和第二检测器呈现为均一的方式，所述定向装置适于运输存活的单独精细胞到测试区域，并且其中所述测试区域是一个大致矩形的容纳区域，适于容纳和维持单独精细胞的方向，用于检测、测量DNA，以及依据一个或多个预先确定的选择参数的选择、固定或破坏。
15.根据权利要求14所述的方法，其中将待测试的所述精细胞，以每秒超过5,000细胞的流速，优选地以每秒超过10,000精细胞的流速，运输到一个矩形测试区域。
16.根据权利要求15所述的方法，其中分析每个单独精细胞以确定它在测试过程是正确地校正的，正确地校正表示读数真实，并且其中一旦每个细胞的DNA含量已经被测量以确定其性别，细胞呈现为不能授精或相反，取决于单独精细胞是否是期望的染色体含量和维持在合适的培养基中。
17.一种选择期望细胞或细胞部分的装置，所述装置包括(i)从感兴趣的细胞或细胞部分的样品把合适地维持和定向的细胞传递到测试区域的装置，(ii)将所述感兴趣的细胞样品暴露于具有第一波长的第一光源的装置，(iii)将所述感兴趣的细胞样品暴露于具有不同波长的第二不同光源的装置，(iv)收集和如有必要的话，放大所述样品在(ii)和(iii)发射的光的单独检测装置，(v)分析由单独检测装置(iv)收集的数据以确定是否达到期望的预先确定参数的装置，(vi)收集、选择和维持期望的细胞在存活状态达到所述期望的预先确定参数的装置，和/或(vii)固定或除去不需要的未达到所述预先确定参数的细胞或细胞部分的固定或烧蚀装置。
18.根据权利要求17所述的装置，其中待测试的所述细胞或细胞部分是完整的存活的精细胞。
19.根据权利要求18所述的装置，其中所述精细胞以每秒超过5,000细胞的流速，优选地以每秒超过10,000精细胞的流速被运输到一个矩形测试区域。
20.根据权利要求18或19所述的装置，其中被选择的精细胞包括大致同源性别的活精细胞群体，所述群体具有携带X染色体的群体或携带Y染色体的群体，纯度为大于95％，优选地纯度为大于98％。
21.根据权利要求17至20中任一所述的装置，其中所述第一光源是一种激发光源，优选地在488nm波长处具有峰值激发并在525nm处提供峰值发射，取决于所用的DNA-结合荧光染料。
22.根据权利要求17至21中任一所述的装置，其中所述第一光源用于分析细胞的DNA含量。
23.根据权利要求17至22中任一所述的装置，其中所述第二光源使用相位对比或暗场光学和一个或多个通带滤片，所述滤片足以排除所述第一光源发射的激发光和荧光波长以及固定或烧蚀装置发射的任何不需要的、异常光。
24.根据权利要求17至23中任一所述的装置，其中每个单独细胞同时暴露于所述第一和第二不同光源。
25.根据权利要求17至24中任一所述的装置，其中所述收集所述样品暴露于所述第一光源之后发射的光的装置，包括相位对比或暗场光学系统的部分。
26.根据权利要求25所述的装置，其中所述收集所述样品暴露于所述第二光源之后发射的光的装置是能够收集非荧光波长光能的光学检测器。
27.根据权利要求17至26中任一所述的装置，其中所述分析装置是多通道分析器或装有合适地开发的计算机软件的计算机。
28.根据权利要求17至27中任一所述的装置，其中所述提供所述第一光源和固定或烧蚀装置的装置是纤维光学运输系统，优选地包括空心的低OH玻璃纤维。
29.一种运输装置，其适于根据权利要求1-16中任一所述的方法，连续地从样品注射管由一个流体力学径向定向的喷嘴运输单独的完整、存活精细胞到一个测试区域、一个减速或预-收集区域和一个收集装置，所述运输装置包括一细长管，其包括第一末端部分和第二末端部分，所述第一末端部分包括一个喷嘴，所述第二末端部分包括一个预-收集或减速区域，并且其中，所述第一和第二末端部分分开在大致矩形截面测试区域的两侧，并且其中，包括所述喷嘴的所述第一末端部分具有第一末端和第二末端，所述第一末端适于与所述样品注射管连通以接收所述样品，所述第二末端靠近所述测试区域，所述喷嘴的大小和形状足以维持大部分所述精细胞在期望的流体力学径向方向的层流中，且包括一个预-收集或减速区域的所述第二末端部分构造为搬运精细胞到收集装置，以使所述细胞在离开所述测试区域之后，所选择的精细胞被维持在存活状态，适于用于体外或体内授精步骤。
30.根据权利要求28所述的运输装置，其中所述预-收集或减速区域从所述大致矩形截面的测试区域向外展开。
31.根据权利要求29或30所述的运输装置，其中所述预-收集区域包括一系列格栅或丁坝，其足以在测试后当单独精子从所述测试区域到所述收集装置时对单独精子减速。
32.根据权利要求29至31中任一所述的运输装置，其中在使用中，当细胞从注射管传递到所述运输装置时，定向喷嘴将大多数单独细胞的正确方向维持在一个位置，其允许每个单独细胞穿过具有第一波长的第一光源，并允许所述细胞发射的光被检测并分析DNA质量，并且其同时允许所述细胞穿过具有第二不同波长的第二不同光源以被检测并分析正确方向。
33.一种选择适用于体内或体外授精的期望存活精细胞的方法，所述方法具有以下步骤(i)将从雄性哺乳动物收集来的完整、活精子用合适的DNA特异性结合荧光染料染色，如此DNA均一地吸收荧光染料，(ii)在一种合适的维持培养基中维持染色的精子，此培养基足以维持精子和/或细胞中包含的DNA在存活状态，(iii)将含有精子的维持培养基传递到合适的激发光源前，导致染色的DNA发荧光，(iv)将含有精子的维持培养基传递到两个装置，一个装置用来测量染色的DNA的荧光，另一个用来检测精子的方向，(v)收集所述精细胞发射的光能，将光能转化为电信号，并由多-通道分析器或合适地装有程序的CPU分析电信号，(vi)选择达到期望的预先确定标准的精细胞，并(vii)固定或破坏不能达到期望的预先确定标准的细胞。
34.根据权利要求1-16中任一所述的方法或根据权利要求33所述的方法，用以产生用于体外授精步骤的存活精子。
35.根据权利要求1-16中任一所述的方法或根据权利要求33所述的方法，用以产生用于体内授精步骤的存活精子。
36.一种存活精细胞，其是根据权利要求1-16中任一所述的方法或根据权利要求33所述的方法的产物，来自根据权利要求17-27中任一所述的一种装置，或来自根据权利要求29-32中任一所述的一种运输装置。
37.根据权利要求17所述的选择期望的细胞或细胞部分的装置，其参考任一实施例和图1和图5基本描述于此。
38.根据权利要求29所述的运输装置，其参考任一实施例和图3、4和6基本描述于此。
全文摘要
本发明涉及使用一种精细胞定向的方法来确定细胞由于大小、质量或密度的差异。诸如DNA质量差异等细胞差异用于将携带X染色体的精细胞与携带Y染色体的精细胞区分开，然后用于体外或体内授精步骤。单独精细胞的方向由测量非荧光光线而确定。本方法使用一个检测器来测量荧光(对精子扁平表面的DNA(性别)测量)的量级，使用第二个检测器来测量衍生自单独光源的折射的非荧光光线的量级。单独光源来自一个相位对比或暗场光学系统的部分以提供方向数据。重要地，所有激发光和荧光都被通带光学滤片排除在第二检测系统之外，从而提供来自凹面更清晰的信号(没有来自精子扁平表面的荧光信号)。据报道，当精细胞的方向由将使用光学相位对比或暗场光学的光穿过目标精细胞而确定时，提供了所获得结果中改进的效率、改进的处理速度和增加的可靠性。本发明的进一步方面描述了用于固定或破坏不需要的精子的固定或烧蚀激光。
文档编号G01N21/64GK1918286SQ200580004125
公开日2007年2月21日 申请日期2005年1月19日 优先权日2004年2月5日
发明者安德鲁·弗朗汀－罗莱特 申请人:赛莱特Xy有限责任公司