分离系统、分离系统的组分以及制造和使用它们的方法

专利名称：分离系统、分离系统的组分以及制造和使用它们的方法
相关申请本申请是2003年6月25日以Robert W.Allington，ShaofengXie，Tao Jiang和Mingcheng Xu的名义以发明名称SEPARATIONSYSTEM，COMPONENTS OF A SEPARATION SYSTEM AND METHODS OF MAKINGAND USING THEM申请的美国专利申请10/607,080的部分继续，而该申请又是2002年6月26日以Shaofeng Xie和Robert W.Allington的名义以发明名称SEPARATION SYSTEM，COMPONENTS OF A SEPARATIONSYSTEM AND METHODS OF MAKING AND USING THEM申请的美国专利申请10/180,350的部分继续。
背景技术：
本发明涉及分离系统和它们的组分和更具体地涉及包括整体式(monolithic)可渗透的聚合物材料的分离系统和组分。
整体式大孔隙材料例如有机整体式大孔隙聚合物材料和整体式二氧化硅填料已知是用于分离系统如色谱分离或提取系统的组分。一种类型的此类材料是作为通过在至少包含生孔剂(porogen)的聚合反应混合物中聚合一种或多种单体所生产的整体式大孔隙聚合物填料或固体载体而形成的。一些聚合反应混合物已知包括其它材料如交联剂、催化剂和小的可溶性聚合物，它们能够在聚合之后溶解以控制孔隙度、分离-有效开孔尺寸分布和其它特性。另外，该填料可以在形成之后加以改性以添加官能团。
该填料或固体载体通常容纳在壳体如色谱柱或压力容器中。容纳该填料的部分壳体作为反应器。在制造整体柱的一种现有技术工艺中，聚合反应混合物可以被添加到柱筒之内并在其中引发聚合反应，从而在柱壁之内形成大孔隙的聚合物填料或固体载体。
这些填料或固体载体有广泛的应用，其中包括气相、液相和超临界流体色谱法、膜色谱法和过滤、固相提取、催化反应器、固相合成以及其它。用于填料或固体载体的柱或其它容器的效率、分离所需要的时间、以及用于填料或固体载体的柱或其它容器的可再现性是重要的商业因素。分离系统如有多孔聚合物在其中的色谱柱的效率与容纳大孔隙聚合物材料的柱或其它组件的选择性和区带扩展有关。这些因素中的一些受到在分离过程中流动相在填料或固体载体中的分子扩散和速度的影响。
其中流动相的分子扩散和速度影响柱效率的方式能够部分地通过这些因素对于理论塔板等效高度(HETP)(柱效率的惯用标识)的影响来解释。范第姆特方程式(van Deemter Equation)显示了在区带扩展、流速和按照H(HETP)的扩散之间的关系，如下H＝A+B/u+Cu，其中低H对应于高效率U＝流动相的流速A＝径向涡流扩散系数B＝纵向分子扩散系数C＝质量传递系数分子扩散取决于分子的扩散，但不取决于床的填料。涡流扩散取决于颗粒填料的均匀性。
来自质量传递的区带扩展能够通过使用无孔颗粒和具有小于1.5微米的尺寸的多孔颗粒来减到最少。然而，采用无孔颗粒的填料具有极低的表面积，这对于提纯过程是有害的(与分析过程相反)，因为该提纯过程需要高的样品载荷。极小的填充颗粒的使用需要高压或低速度，而高压在采用当前的仪表配置的大部分分离工艺中是困难的，低速度为给定的分离增加了时间(有时用H/分钟表达)。
包括大孔隙聚合物整体式填料或固体载体作为组分的现有技术分离系统使用由聚合物中的颗粒(它大于所需的尺寸、较不均匀并包括微孔隙)形成的填料或固体载体。颗粒的大尺寸和它们的均匀性缺乏会导致在分离-有效开孔尺寸分布中缺乏均匀性。分离-有效开孔的尺寸的不均匀性和在现有技术多孔聚合物中的大量微孔隙大大地有助于区带扩展，正如范第姆特方程式所示。大量的微孔隙通过捕捉样品和将样品保持一定时间来有助于区带扩展。这通常称作进出孔隙以及在固定相和流动相之间的不平衡质量传递。
由多孔聚合物形成的现有技术填料或固体载体具有分离-有效开孔尺寸的较低均匀性、较不希望的表面特征和由管壁效应产生的在它们的外壁中的空隙、和因此区带扩展比在分离系统中所希望的更高和效率比在分离系统中所希望的更低。
对于与在聚合反应过程中发生的收缩以及在聚合之后在一些现有技术多孔聚合物中发生的收缩相关的问题，现有技术无法提供足够的液体混合物。在聚合反应过程中发生收缩的问题是因为单体无规分散在聚合反应液体混合物中和聚合物由有序结构化的单体组成。因此，在大部分的聚合反应中聚合物的体积小于该混合单体的体积。在全部的以上制备方法中在聚合反应过程中都会发生该收缩。与聚合后发生收缩有关的诸多问题中的一个是因为高度亲水性聚合物载体与高度亲水性含水流动相或其它高度极性流动相(例如，含有低于5-8％的有机溶剂含量的液体混合物)之间的不相容性。
用于分离系统中的多孔聚合物材料和它们的组分在聚合反应过程中的收缩会导致在多孔聚合物表面上的不规则空隙和在聚合物内部分离-有效开孔尺寸的不规则性，这有害于柱效率和该生产方法的可再现性。柱效率由管壁效应降低的一个原因是管壁效应允许样品流过管壁通道和绕过分离介质。生产方法的可再现性被管壁效应降低的一个原因是管壁效应的程度以及管壁效应的位置对于不同的柱是不可预料的。
在以上列出的现有技术专利中具有大通道的柱具有低的表面积和容量。该柱的低容量对于需要高样品载荷的提纯方法是有害的。尽管为尝试解决收缩问题付出了大量的努力、时间和花费，但是现有技术无法针对减低的容量提供液体混合物。
因为以上现象和/或其它缺陷，由以上方法制备的柱子具有几个缺点，例如(1)它们使柱子的分辨率与用珠粒填充的商购柱几乎没有差别；(2)由这些方法获得的分离的分辨率和速度只不过比用二氧化硅珠粒或聚合物珠粒填充的常规柱略高或与其差不多，尤其对于大分子的分离而言；(3)由于具有各种形状和尺寸的不规则颗粒的堆积所导致的宽的孔隙分布会降低柱效率；(4)由于在以上材料中颗粒尺寸和形状的不均匀性所导致的有效开孔尺寸的不均匀性严重地促使区带扩展；(5)在以上材料中大量的微孔隙也大大地促使该区带扩展；和(6)在柱中使用的材料的收缩降低了柱的效率。这些问题限制了它们在高分辨率色谱分析中的使用。
美国专利5,453,185建议了以下方法通过使用不溶性聚合物代替部分单体以减少在聚合反应混合物中的单体含量，从而减少收缩。这减少了收缩但对于需要高含量的官能化单体的柱的容量和保留容量因子是有害的。在这些专利中没有提到收缩对于分辨率的有害影响和所得的多孔聚合物表面上的不规则空隙以及在聚合物内部分离-有效开孔的不规则性，它们对于柱效率和该生产方法的可再现性是有害的。
现有技术的欧洲专利1,188,736描述了通过在一端被密封和另一端开口的聚四氟乙烯管内由单体、交联剂、生孔性溶剂和引发剂的原地共聚合反应制造多孔的聚(甲基丙烯酸乙二醇酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)的方法。所得的柱用于气液色谱法。这一现有技术方法的缺点在于无法得到具有为实际应用所需要的特性的材料，这至少部分地归因于它在有开口端的塑料管中进行聚合反应。
美国专利2,889,632；4,923,610和4,952,349公开了在包括两个板和分离器的密封设备内制造薄的大孔隙膜的方法。在这一方法中，所需的膜载体从多孔聚合物片材的薄层上冲切并加以改性以便具有所需的官能团。多层的多孔片材容纳在载体设备中进行“膜分离”。这些专利将在欧洲专利1,188,736中描述的方法延伸到制备多孔膜，并改进了在膜分离中用于实际应用的技术。所得的材料是包括从尺寸低于2纳米的微孔隙到大孔隙的各种孔隙的大孔隙膜。聚合物颗粒的尺寸低于0.5微米。膜分离的分离机理不同于普通液相色谱法的分离机理。
该多孔材料具有几个缺点，例如(1)膜的薄度限制了它的保留因子；和(2)由这些颗粒形成的孔隙是小的并且不能由以下液相色谱柱在高流速下使用，该色谱柱具有比单个膜厚度更长的层床长度。该微孔隙和其它捕获用孔隙可以捕获将要分离的分子并有助于区带扩展。在本说明书中的术语“捕获用孔隙”指有助于区带扩展的孔隙，如尺寸范围从稍微大于所要分离的分子到七倍于所要分离的分子的直径的孔隙。
美国专利5,334,310；5,453,185和5,728,457各公开了在密封的柱内原地制造大孔隙的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)聚苯乙烯的方法。这一方法延伸了在欧洲专利1,188,736和美国专利2,889,632；4,923,610和4,952,349中描述的用于制备供蛋白质分离用的液相色谱柱的方法。美国专利5,334,310；5,453,185和5,728,457自称旨在通过除去含有珠粒的常规填充柱的间隙体积来改进柱效率。根据这些专利形成的填料具有由生孔剂、单体的类型和含量以及聚合温度所控制的分离-有效开孔尺寸分布。该大孔隙聚合物由各种尺寸的颗粒的互连聚集物组成，在聚集物之间形成了供流动相的传输用的大孔隙通道。在该聚集物或簇之中，存在着供分离用的小孔隙。小颗粒是由约100-300纳米的紧密填充的极小颗粒形成的。
根据这些专利制备的材料的缺点在于在这些颗粒之内或之间的微孔隙以物理方式捕获样品分子并使分离降级。虽然这些专利声称在该整体式介质中没有如含珠粒的填充床中存在的间隙空间，但是在聚集物和互连颗粒之间的大通道实际上会引起与含珠粒的常规填充柱中的珠粒之间的间隙空间相同的问题。由各种尺寸的聚集物或簇形成的大通道是不均匀的并提供无规的间隙空间，即使具有窄的颗粒尺寸分布。因为该无规的间隙空间，柱效率是差的。
美国专利5,334,310；5,453,185和5,728,457公开了在横截面面积从平方微米到平方米的柱子内的分离介质的制备。在这些专利中公开的方法具有一些缺点。所述缺点的一部分由在这些专利中提名的发明人于1997年在Chemistry of Materials，1997，9，1898中公开。
一个重要的缺点是从以上已取得专利的方法制备的较大直径(26mm内径)柱具有太不规则的分离-有效开孔尺寸分布，使得无法有效用于色谱分离中。分离-有效开孔的尺寸的不规则分布是由于在26mm直径的模具中的聚合放热、聚合物的热隔离效果、差的热传递、引发剂的自动加速的分解和因为使用偶氮二异丁腈作为引发剂而伴随而来的氮气快速释放之类的有害影响所引起的。已经发现，由聚合放热和热传递困难所产生的跨越该柱的温度升高和差异会导致在大直径模具(例如，直径大于15mm的模具)中的加速聚合和导致在柱中心和柱外壁之间的温度梯度，该温度梯度导致不均匀的孔隙结构。在该文章中建议，该问题可以通过聚合反应混合物的缓慢添加来减轻。这有助于部分地解决该问题，但不可能完全地解决该问题。对于较大直径的柱子仍然有温度梯度，这导致在分离-有效开孔尺寸分布上均匀性的缺乏。
这一问题也可以通过在出版物Analytical Chemistry，2000，72，5693中的理论计算来验证。该作者提出了通过堆叠细的圆柱体来构造用于径向流色谱的大直径柱的模块化方法。然而，在圆盘之间密封以形成连续填料的操作是困难的和费时的。
美国专利5,334,310；5,453,185和5,728,457公开了弱阴离子交换的材料和反相柱。所制备的弱阴离子交换剂具有低分辨率、低容量、低刚性、缓慢分离和非常差的可再现性。反相介质具有非常小的容量、不理想的分辨率、和非常差的可再现性。它们不能用于具有高的水含量的流动相(如水中的低于8％的乙腈)中，归因于非常疏水性的介质在这一非常极性的流动相中的收缩所导致的管壁通道化效应。这一介质也在分离中被压缩并在柱的头部导致过量的空隙体积。以上专利提供了关于如何制备弱阳离子交换剂、强阳离子交换剂、强阴离子交换剂、正相介质和疏水性相互作用介质的很少的指导。以膜、珠粒或凝胶为基础的这些介质是已知的。然而，已知的制备方法是以离线方式进行的，不能用于整体柱的原地制造。根据美国专利2,889,632；4,923,610和4,952,349制备的整体式膜具有低的容量和分辨率。
从Peters等人的“Preparation of Large-Diameter‘Molded’，Porous Polymer Monoliths and the Control of Pore StructureHomogeneity”，Chemistry of Materials v.9，n7，7月，1997获知慢慢地聚合该整体式填料以企图避免温度梯度。在一个实施方案中，温度保持在55摄氏度的恒定低温或保持在60摄氏度。在另一个实施方案中，保持低的聚合速率和通过逐渐添加单体来减少放出的热量并因此限制反应速率。
这些方法的缺点在于提供了不均匀的分离-有效开孔尺寸分布、聚合物填料的低劲度和对于许多液相色谱分离而言不切实际地过大的分离-有效开孔。该低温导致了减少的交联，和对于一些聚合物而言，会导致得到没有充分劲度的填料。
这一出版物也描述了该作者获得关于在聚合反应过程中该柱的内部温度的信息的方法。该方法包括将温度测量装置包埋在柱中。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供与具有分离-有效开孔的聚合物有协同关系的新型分离系统。
本发明的再一个目的是提供新型色谱柱。
本发明的再一个目的是提供制造色谱柱的新型装置。
本发明的又一个目的是提供形成色谱柱的新型方法。
本发明的还一个目的是提供新型可渗透的整体式介质。
本发明的还有一个目的是提供具有改进的分辨率的可渗透的整体柱。
本发明的还有一个目的是提供具有改进的容量的可渗透的整体柱。
本发明的还有一个目的是提供具有改进的流速的柱。
本发明的仍然一个目的是提供当与含水溶剂一起使用时具有减少的溶胀倾向的柱。
本发明的还有一个目的是提供具有改进的可再现性的柱。
本发明的再一个目的是提供形成可渗透的整体柱的新型技术，该柱具有为了改进容量或分辨率或流速的目的而所选择的分离-有效开孔的受控尺寸。
本发明的再一个目的是提供制备用于制备性分离的大直径柱的新方法。
本发明的还一个目的是提供新型大直径柱。
本发明的仍然另一个目的是提供使用辐射方法制备包括可渗透的聚合物载体的聚合物材料的方法。
本发明的还一个目的是提供新型的弱阴离子交换柱。
本发明的还一个目的是提供新型反相柱。
本发明的还一个目的是提供高效的强阴离子交换柱。
本发明的还一个目的是提供高效的弱阳离子交换柱。
本发明的还一个目的是提供高效的强阳离子交换柱。
本发明的还一个目的是提供高效的正相柱。
本发明的再一个目的是提供避免由于在聚合反应过程中的收缩或在洗涤过程中或在分离过程中该分离介质的溶胀所引起的分离介质质量下降的方法。
本发明的再一个目的是提供其中一排的柱子(这些柱子在特性上是非常接近的)一起操作的色谱系统。
本发明的再一个目的是提供制造可用于色谱法(包括液相色谱、气相色谱和超临界流体色谱法、电色谱法)、催化反应器、过滤、或需要与样品相邻的或至少部分地与样品水平地定位的可渗透的聚合物载体或固体可渗透的聚合物支持体的其它应用中的整体式可渗透的固体载体的新型方法。
本发明的再一个目的是提供新型高分辨率介质和获得它的新型方法。
本发明的再一个目的是提供一种新型可渗透的固体载体，其具有由于互连聚集颗粒的更加均匀的尺寸和形状所产生的均匀的分离-有效开孔尺寸分布。
本发明的又一个目的是提供具有较少微孔隙或没有微孔隙的新型可渗透的固体载体。
本发明的再一个目的是提供在聚合物载体的壁上没有空隙的新型可渗透的固体载体。
本发明的又一个目的是提供改进整体式色谱介质的容量的新型方法。
本发明的还有一个目的是提供具有改进的分辨率的可渗透的整体柱。
本发明的再一个目的是提供形成可渗透的整体柱的新型技术，该柱具有为了改进容量或分辨率或流速的目的而选择的受控尺寸的分离-有效开孔。
本发明的再一个目的是提供制备用于制备性分离的大直径柱的方法。
本发明的还一个目的是提供高效的催化反应器。
本发明的还一个目的是提供高效的固相提取床。
本发明的又一个目的是提供含有以共价键方式键接的颗粒的新型可渗透的整体式介质，该颗粒具有受控的微细彻底地卷绕的表面构型但几乎没有或没有微孔隙。
本发明的仍然一个其它目的是具有可以忽略的由于在聚合反应过程中的热效应所引起的不均匀性的整体式色谱床。
本发明的再一个目的是提供依赖于将热传导至柱中来控制色谱柱中的聚合反应的新型方法。
本发明的再一个目的是利用照射到床上的受控辐射来控制聚合速率和所造成的热梯度。
本发明的再一个目的是用相对安全的辐射源如提供中等能量X-射线(例如，低于200kEV)、UV或可见辐射的那些辐射源来控制聚合反应。
本发明的再一个目的是提供几乎没有或没有微孔隙的可渗透的、大容量的柱。
本发明的再一个目的是提供制备具有从纳米到毫米的小直径的柱的方法。
本发明的又一个目的是提供制备具有高达100mm的中等直径的色谱分析均匀柱和具有高达1000mm或更大的大直径的柱的方法。
本发明的又一个目的是提供聚合方法，其中温度梯度对于多孔聚合物中的分离-有效开孔的均匀性的影响减到最少。
本发明的再一个目的是提供聚合方法，其中避免了放热反应的失控温度(run-away temperature)。
本发明的再一个目的是提供聚合方法，其中在聚合物混合物内的最高温度低于自维持的失控温度，但是该温度在聚合物混合物的反应阶段内至少持续一定的时间。
本发明的再一个目的是提供使用能量传导来形成大的整体柱的新型方法。
本发明的再一个目的是提供新型的聚合方法，其中温度维持在一定水平，该水平使得可以避免在聚合反应过程中横穿整体式填料的横截面的温度有重大差别，但可以从热量提供足够的能量以便使得在聚合的后期阶段中有足够的交联，并且使得在没有达到放热的失控温度的情况下在合理量的时间中使聚合反应高度完成。
本发明的再一个目的是提供使用阶梯温度提高和梯度(连续的、逐渐的变化，而不是突变)温度提高以制备整体柱的新型的制备色谱柱的方法。
本发明的再一个目的是提供控制聚合反应过程中的热量生成和散逸速率的新型方法。
本发明的再一个目的是提供改进聚合物的刚性的方法。
根据本发明的以上和其它目的，聚合反应混合物与生孔剂或溶剂原地聚合，形成具有分离有效开孔的聚合物填料。在这一说明书中，“分离-有效开孔”指在分离过程例如色谱法中起作用的孔隙或通道或其它开孔。术语“孔隙”一般指颗粒中的开孔，其基本上是圆形的，并且可以是贯通颗粒的通孔(通孔)或进入到颗粒中的开孔或在一些情况下进入到或穿过颗粒聚集物的开孔。由于在横截面上基本上是圆形的，这意味着该孔隙不是完美的圆形和例如可以由不完美球体的扇形面所界定，其中孔隙是在相邻的球面之间的开放空间。一些其它术语当它们在本说明书中使用时在下文中来定义。分离因子包括影响保留和容量的那些因子或在分离过程中起作用的其它因子。在本说明中的术语“大孔隙的”是关于分离系统中的整体式材料以它的通常含义给出。它的通常含义指在颗粒小球之间的孔隙或其它空隙，该孔隙或其它空隙具有超过50nm的直径但不考虑开孔的长度，而不是它的字面上的以下含义将开孔限于具有基本上圆形横截面的孔隙和没有明显长于另一个横截面尺寸。
在本说明书中的术语“可渗透的”应当按照与术语“大孔隙的”同样的方式解释，最通常关于分离技术中的整体式材料而使用但优先于术语“大孔隙的”来使用，以便使具有通道和其它开孔以及孔隙的材料与具有其中的仅仅一种或另一种的那些材料区分开，并允许对于词语“可渗透的”使用形容词以便将无孔的可渗透材料与含有孔隙的那些材料区分开，避免与术语“大孔隙的”字面意义混淆。在本说明书中该术语“可渗透的无孔的”描述了具有开孔如通道或类似物但不含有以上定义的孔隙的介质。失控温度是这样一种温度，在该温度下在不加入热量的情况下反应继续进行，因为由反应产生的热量维持温度高于反应温度，但与加入的热量无关，这样反应变成自维持的。词语“温度-时间调节的”指在低于失控温度但足够高的温度下已经聚合了足够长的时间以使聚合反应进行到高度完成的整体式材料，其中聚合物仍然具有所需的特性如足够的劲度、合适的分离-有效开孔尺寸、均匀的分离-有效开孔尺寸分布等等。这常常与聚合速率有关，因此，温度-时间调节是通过控制外部施加的热量来控制聚合速率而实现的。
对于具体考虑的温度-时间调节聚合的一个限制是，聚合的时间和温度适合于形成所需量的交联以获得为具体应用所需的劲度或劲度缺乏。这一限制在优选实施方案中通过平衡多个聚合影响因素来满足，这些因素例如是将能量引入聚合反应混合物中的速率、活化的引发剂或活化剂的含量、可获得的单体的含量和考虑到聚合物和单体的类型为足够的交联所需要的温度、以及对于键接的干涉例如空间位阻或在已发生了大部分的聚合反应之后被其它分子阻断。
平衡聚合影响因素的一种方式是控制将能量引入混合物中的速率和/或将能量从外源引入混合物中的方式，如来自水浴的热能通过在混合物的表面上传导而被引入或X-射线能量通过辐射被引入混合物中。在优选的实施方案中，热量是用水浴引入在混合物的表面上。放出的热量是通过控制反应速率来控制的，而反应速率又是通过控制水浴温度来控制的。在本实施方案中水浴的温度将放热的放出速率控制到一定水平，其考虑到热量从混合物中散逸的速率和热量从水浴进入到混合物中的速率，保持温度低于自维持的反应温度但又是足够的高，以便在合理的时间中获得具有足够的交联的基本上完全的反应。
在一个实施方案中，由反应放出的热量是通过水浴的温度来控制的。它能够通过水浴的温度来控制，因为由反应放出的放热一般与反应速率成正比，并随提高的速率而增加。反应速率能够通过向水浴中加入热量以提高水浴的温度来提高，或者逐渐地(梯度温度控制)或随着聚合反应进行一步一步地。例如，在梯度温度控制中，温度是在考虑到妨碍聚合的影响因素(如单体的消耗)的情况下在保持聚合增长速率恒定的速率下提高，这样反应速率是如此的低以排除失控聚合反应并且是足够的低以避免热梯度，热梯度另外可以在柱的特性中引起均匀性的缺乏。甚至对于非常大的柱而言，借助于这些限制因素仍然有可能控制反应以提供所需的特性。
借助于这一技术，混合物的焓(它在优选实施方案中由温度决定)增加到可以活化引发剂和提供一定速率的聚合反应的预定水平，该速率能够在没有达到自维持的反应速率的情况下由计划的程序提供温度-时间调节的聚合物。这一预定水平的焓在本说明书中称作控制引发点。在达到控制引发点后，反应速率基本上保持恒定直至一定的聚合水平，在该水平下温度可以在一个或多个步骤(如果需要的话)中提高到更高的焓，直到聚合反应完成为止，它通常是95％或更高。聚合水平足以使得温度可以提高到为了实现温度-时间调节所需要的温度水平的那一点被称作安全点(一个或多个)，其中存在一个以上的步骤使温度有提高或大的提高。
在本发明的一个实施方案中，在聚合反应过程中的收缩得到补偿和在本发明的另一个实施方案中，避免了在聚合后的溶胀(它可能另外随后导致收缩)。收缩导致在聚合物表面上扩大的空隙并可能导致在聚合物内部孔隙或其它分离-有效开孔尺寸分布的均匀性的缺乏。当在聚合反应过程中产生时，空隙被认为是由有序结构化的聚合物所减少的体积(与聚合前单体的体积相比)产生的。由于表面自由能的差异，该空隙主要位于柱壁和聚合物之间。该空隙有可能被偶氮二异丁腈(AIBN)产生的氮气所占据，它是聚合反应的常用引发剂。
在第一个实施方案中，收缩的补偿是通过在聚合反应过程中施加足够的压力以便在分离-有效开孔的分布上产生均匀性和避免管壁效应空隙来实现的。这一压力已经发现也可在一定程度上控制颗粒尺寸以及填料中开孔的性质和形状。在聚合反应过程中维持柱在大气压力下以适应收缩的确可靠地防止了空隙的形成。一般250psi压力可以方便使用，但已经成功地使用更高和更低的压力。当置于一定量的压力下时，当该填料停止收缩时该空隙被除去。在第二个实施方案中，避免了另外在聚合后发生的收缩。例如，当暴露于一些液体混合物如有机溶剂时一些填料倾向于膨胀，和然后，在以后如在含水流动相中的分离试验中发生收缩，引起空隙。在这些实施方案中，当暴露于液体混合物时，通过阻止该柱收缩来防止收缩。压力的应用是在暴露于含水液体混合物的过程中防止收缩的一个方法。用于补偿收缩和/或溶胀、减少收缩或避免收缩的其它方法也可以按照以下更详细的描述来使用。可以相信，外部施加的压力克服了在正在反应的聚合反应混合物内部的以及在聚合反应混合物和柱的内壁之间的不均匀力，以维持均匀的分离有效因子、分离-有效开孔尺寸和分布、以及聚合物与柱内壁的均匀连续接触。
令人吃惊地，一些类型的聚合物填料不含孔隙，如果它们在聚合反应过程中承受压力以补偿收缩的话或在一些反相柱当暴露于亲水性液体混合物(如在含水流动相中)时补偿收缩的情况下。相反，它们含有约2微米直径的固体颗粒，以共价键方式键接在一起，它们之间有较大流动通道(分离-有效开孔)。令人惊讶的事情是，虽然这些颗粒没有孔隙，但填料的色谱容量是高的。这被认为归因于出乎意外地形成了约50-200nm深和宽的凹槽或波纹和其它奇特表面结构特征。典型的颗粒像非常小的小行星的用望远镜看到的视图。
在聚合反应过程中施加的压力根据所需结果来选择，例如可以是线性地升高的压力、恒定压力或分阶段的压力梯度。在一个实施方案中，分离-有效开孔尺寸是通过选择在聚合反应过程中产生孔隙并且在聚合后必须从填料中洗掉的生孔剂的类型和比例来控制。这一比例通过试验性试验来进行选择以获得所需特性。生孔剂的总量也进行选择。
在另一个实施方案中，希望制备出以下材料的填料当暴露于一些液体混合物如有机洗涤性液体混合物时倾向于膨胀，和然后，在以后例如在含水流动相中的分离试验中发生收缩，在柱壁和聚合物载体之间产生空隙并在分离-有效开孔尺寸分布上有变化。例如，具有分离-有效开孔的一些反相填料可能在聚合时收缩(其它则不收缩)，和在聚合之后，在聚合反应过程中不发生收缩的一些填料以及发生收缩的一些填料如果暴露于水或一些其它极性液体混合物则发生收缩。在希望改进此类材料的填料的实施方案中，这一收缩的补偿可以是在聚合反应过程中采用活塞的压缩和/或在聚合之后在以下条件下的压缩这些条件通常引起与在分离试验中发生的收缩同等或更多地收缩，以迫使重新排序或再定位或补偿该收缩。在收缩采用压力补偿或收缩被防止以避免引起空隙的任一种情况下，与采用流体的压力相比，非流体的压力如采用活塞是优选的。在本说明书中的词语“压力”排除了术语“压缩”并与后者区分开来，如果词语“压缩”用于表明将盐的液体混合物应用于凝胶整体料以打开该凝胶整体料的孔隙。
解决这一问题的另一个途径是将亲水性引入到反相介质中，导致溶胀和防止聚合物在分离试验中的高度亲水性环境中收缩。更具体地说，聚合反应混合物被施加于柱(在优选实施方案中)中或施加于其它一些合适的模具中并在柱或模具内引发聚合反应。柱或模具被充分地密封(1)如果聚合反应在烘箱中进行，避免由蒸发引起的计划外的损失；或(2)如果聚合反应在水浴中进行，避免污染或稀释。在聚合反应过程中，压力被施加于该聚合反应液体混合物。优选，该压力被维持在高于大气压力的水平以防止因为收缩而形成空隙，直至聚合反应已形成了分离介质的固体填料或聚合反应已完成为止。聚合反应液体混合物在聚合反应过程中所接触到的柱或模具的内表面是非反应性的或可以经过处理以提高对于填料的表面的粘合性。
聚合反应混合物在一些实施方案中包括(1)所选择的单体；(2)对于一些类型的柱而言，添加剂；(3)引发剂或催化剂；和(4)用于形成分离-有效开孔的一种或多种生孔剂。在一些实施方案中在聚合之前或之后能够增加官能团。生孔剂、引发剂、待增加的官能团、添加剂、和反应条件以及该单体和/或聚合物需要针对具体类型的柱进行选择，如反相、弱阳离子、强阳离子、弱阴离子、强阴离子柱、亲合性载体、正相、固相提取和催化床。聚合反应混合物的组分进行选择以提供所需质量的柱。
根据本发明的色谱柱优选包括具有内壁的壳体以接收可渗透的整体式聚合物填料，在填料中分离-有效开孔或表面特征具有利用在聚合反应混合物中的生孔剂在聚合物中所形成的受控尺寸并在聚合反应过程中由压力控制尺寸。这一填料在色谱柱中用作样品的载体。可渗透的整体式聚合物填料具有光滑的壁，在填料壁中没有可见的不连续性以及在填料内基本上没有不连续性或开口。在本说明书中的不连续性指尺寸足以被肉眼看见的凸起部分或开口或凹陷或与正常光滑度或图案有关的其它变化。在本说明书中，术语“尺寸补偿的聚合物”或“尺寸补偿的聚合物的”指以下具有分离-有效开孔的整体式聚合物可渗透材料，其中在分离-有效开孔中的不连续性和均匀性缺乏已经通过在本说明书中所指的方法来防止，例如，对于一些类型的柱在聚合反应过程中或在聚合之后在暴露于极性液体混合物的过程中通过施加压力和/或进行温度-时间调节，或通过使用一种柱，该柱通过在用含水液体混合物洗涤过程中或在使用含水液体混合物的分离操作中的使用过程中在含水液体混合物存在下施加压力而防止在含水液体混合物存在下进一步收缩。一种类型的不连续性或均匀性缺乏是管壁效应和另一种类型是在聚合物填料中的不同横截面位置上分离-有效开孔的尺寸存在差异。
柱的一个实施方案是通过使用适于在聚合反应过程中容纳聚合反应混合物的温度受控反应室和对在所述温度受控反应室中的所述聚合反应混合物施加压力的设备来制备的。聚合反应混合物至少包括聚合物形成用材料和生孔剂。在一个实施方案中，该压力是通过具有光滑表面在外部流体或机械压力下与聚合反应混合物接触的可移动元件施加的，虽然该压力能够用气体如氮气或用加压的液体直接施加于聚合反应混合物。
一个实施方案的反相介质已经用与现有技术不同的疏水性和亲水性来形成。反相介质包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯和它们的结合物。这些介质通过含有所需官能度(包括苯基，C4，C8，C12，C18和羟基或疏水性和亲水性基团的其它结合物)的单体的直接聚合来制备，以便在含水流动相中具有不同的选择性和可润湿性。聚合反应条件和生孔剂进行考察和选择，以实现大分子，尤其是蛋白质、肽、低聚核苷酸和合成均聚物的高分辨率分离。在一个实施方案中反相介质是以聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)为基础的。在这一专利的另一个实施方案中，反相介质是以聚(甲基丙烯酸硬脂基酯-共-二乙烯基苯)为基础的。在另一个实施方案中，反相介质是以聚(甲基丙烯酸丁基酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)为基础的。
具有卓越特性的反相填料主要由包括二乙烯基苯(DVB)和二甲基丙烯酸乙二醇酯在内的交联剂、以及包括苯乙烯(ST)或含有不同碳链长度的甲基丙烯酸酯(MA)在内的单体的共聚物形成。一般，最佳结果是当交联剂大于40wt％时。优选地，二乙烯基苯和苯乙烯的比率是在7∶1到9∶1的范围内和优选4∶1(按重量)，但是作为替代可以是64％DVB或40％苯乙烯以及72wt％DVB或1g二乙烯基苯，1g苯乙烯。该柱也可以在17∶3和19∶1之间的比率范围内和优选9份的二乙烯基苯对1份的苯乙烯。具有亲水性官能团的单体能够被添加来减少聚合物介质在含水流动相中的收缩以防止分离过程中的管壁效应。DVB在全部单体中的含量优选是40％-100％。在一个优选的实施方案中，DVB的含量是80％(它是商购最高值)以改进该柱的载荷容量。该填料也可以包括具有疏水性表面基团的甲基丙烯酸酯或取而代之的是包括脲甲醛的乙烯基化合物或二氧化硅。
离子交换填料主要地由甲基丙烯酸酯聚合物形成。弱阴离子交换填料主要地由甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)的聚合物和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)的聚合物形成。强阴离子交换剂填料主要是甲基丙烯酸缩水甘油酯、2-(丙烯酰氧基乙基)三甲基铵甲基硫酸盐(ATMS)、二甲基丙烯酸乙二醇酯的聚合物。聚合反应混合物还可包括1，4-丁二醇，丙醇和AIBN。弱阳离子交换剂填料主要地由甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸(AA)和二甲基丙烯酸乙二醇酯形成。强阳离子交换剂填料主要地由甲基丙烯酸缩水甘油酯、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)和二甲基丙烯酸乙二醇酯形成。在所有这些离子交换剂中，官能团能够在填料形成之前或之后添加。EDMA在全部单体中的含量优选是40％-80％。
交联剂如EDMA的含量的提高将通过减少介质在水相中的溶胀来提高该柱的刚性。聚合反应混合物的每一种是在加压的聚合中加以改性，以便获得高流速和高低流速下的高分辨率。含有为相互作用所需的官能团的单体的共聚合反应以及其它官能化单体的受控改性以含有所需的相互作用性官能团的结合可以提高柱的容量，同时改进分离介质的刚性。这一受控改性也可以一般通过用亲水性官能团覆盖潜在的疏水性表面区域来改进该柱的亲水性。选择改性条件来不仅提供该介质的更高容量和更高亲水性，而且防止聚合物基质在含水液体混合物中的溶胀，该溶胀会在同时包括珠粒和整体料的其它高度亲水性聚合物基质中发生。
聚合物填料可以在任何尺寸或形状的柱(包括通常的液相色谱柱)中形成，它可以是圆柱体、或盘旋柱、弯曲或直的毛细管、或微芯片(microchip)，或具有任何尺寸或几何结构。待分离成它的各组分的样品或混合物被注入到该柱中和液相穿过该柱以将样品分离成它的组分。该组分可以在级分收集器中检测和/或收集和/或被插入另一个设备如气相色谱仪或质谱仪。在一个实施方案中，多个柱在包括泵送系统、溶剂体系和检测系统的色谱系统中并联连接。该柱是具有高的可再现性的可渗透的聚合物柱，以使它们对于相关的分离可以一起工作。在一个实施方案中，生产出具有远大于25mm的直径的色谱圆盘或填料。
在一个实施方案中，反应通过独立的方式例如电磁辐射，如UV-vis，X-射线或γ射线来控制，代替或连同仅仅对时间、水浴的温度以及在聚合反应混合物中的反应物的依赖。在不使用独立的方式的这一实施方案中，通过传导如热量传导进出水浴也可以将热量加入到柱中。该热量可以从热源添加或借助与热质(thermal mass)的显著大部分的冷却剂(coolant)接触的冷却设备而被除去，并在反应器中在反馈的控制下维持反应物料的温度在所需的温度范围内或如果需要的话在反应过程中改变它。
在本实施方案的一个版本中，可变强度或可变波长的X-射线可用来控制反应物的聚合反应速率使得放热在控制之下。在这一版本的一种变型中，X-射线辐射穿透该柱以为整个柱或在所选择的位置给予能量，从而提高或降低聚合速率。这可通过充分地辐射该单体以离解它的双键来制造单体自由基和因此提高它们的反应性来进行。另一个方式是使用对辐射敏感的引发剂，它通过在用于反应物料的温度区域中的辐射来活化。选择引发剂以具有比仅仅有单体时低得多的活化时间和温度。因为该引发剂仅仅在足够强度的辐射之后形成自由基，该辐射可独立于其它因素用来控制聚合反应。
使用光引发剂控制聚合反应能够通过所添加的成分如闪烁剂和增感剂来增强。例如，X-射线可以活化在溶剂内的闪烁剂，以便响应于X-射线而发光。优选，闪烁光可以通过添加荧光增感剂来协助以提高光引发剂在引发聚合反应上的活性。该闪烁剂和增感剂进行选择，导致来自X-射线的能量被闪烁剂有效吸收和在光引发剂的吸收谱带内的有效波长下的光辐射。
使用辐射如X-射线的聚合反应用于制备具有从微米到米的横截面的整体式材料。X-射线能够深入地穿透该材料。有机和无机聚合物都能够使用X-射线或γ-射线制备。高能量X-射线和γ-射线能够以大的深度穿行该材料。低能量到中等能量X-射线以较少的深度穿透该材料，导致更长的聚合时间但使用更安全。在一个实施方案中，较低能量X-射线被利用来通过采用X-射线闪烁剂和光引发剂的结合物引发聚合反应。我们已经发现，从低于12小时到大于一个星期的非热(光致引发)控制的聚合时间可以提供令人满意的色谱柱。柱的热聚合通常遭受失控放热反应和对于20mm以上直径的柱有极端温度梯度。这会导致降低色谱分析性能的不均匀性。采用X-或γ-射线、或甚至UV可获得的较缓慢的、受控的聚合速率在仍然维持合理的聚合速率的同时以可容忍的放热速率引起较缓慢的聚合反应。由放热所引起的热梯度可以变得足够小，以便不降低直径超过1米的柱的性能。
借助于稳定化添加剂的选择，可以防止过度的放热速率和所导致的工艺(聚合反应)温度以及温度梯度。这一稳定化添加剂具有的性能使得该反应能够在高达将形成所需的聚合物的一定速率下自由地进行，但不能在更高的速率下，因为将产生太高的温度。例如，借助于过氧化物引发剂Disterylhiodipropionate(DSTDP)淬灭由副反应产生的羟基，每种情况下与主反应相比，副反应之后将继续产生额外的热量。另一个途径是将稳定剂用于主反应。根据在反应温度下在主要溶剂中有有限的溶解度或活性和在高于反应温度的温度下有更高溶解度来选择该稳定剂。在类似的条件下，可以使用稳定剂，它优选可溶于该生孔剂并具有与温度有关的溶解度或活性。
将柱的尺寸按比例放大以便具有更高的介质容量是在制备性色谱法和催化反应器中高度需要的。在本发明的一个实施方案中，大直径柱是通过在柱内部的两步聚合反应制备的。首先，直径小于目标柱的直径的多个细的圆筒柱是在有或没有压力的条件下在模具中制备的。将该细柱放置于填充了与在该细柱的形成中所用的相同的聚合反应液体混合物的大柱内部。在细柱的一侧的厚度应该不超过8mm，这是防止温度梯度形成的已知的最高值，温度梯度归因于在放热聚合反应中热散逸的困难。温度梯度导致变化的、不均匀的分离-有效开孔尺寸分布，这对于色谱分析使用是有害的。
在制备供分离系统用的尺寸补偿的聚合物时，对于给定类型的分离的特性能够通过改变在聚合反应过程中施加的压力的量和/或对于一些聚合物(如在形成反相分离介质中所使用的聚合物)，通过在使用时或当另外与极性溶剂如含水溶剂或洗涤液接触时施加压力，用给定的聚合物对于应用作相应调节。在聚合物本身的性质已经针对应用的类型进行选择之后，可以制造和试验这些柱。以试验为基础，该特性能够在一些柱中通过施加压力来改变。可以相信，在一些柱中压力的施加会提高颗粒尺寸的均匀性，并且或者因为颗粒尺寸的变化或者因为其它原因，在整个聚合物中分离有效开孔的尺寸分布和均匀性得到提高。颗粒尺寸和分离-有效开孔尺寸的均匀性的提高可以改进分辨率。压力的提高一般会改进容量和分辨率以及压力-时间梯度。可以相信，在一些柱中，通过在聚合反应过程中和/或在聚合物的使用或聚合物用极性液体混合物洗涤的过程中施加压力，微孔隙可以大大地减少或消除，因此减少区带扩展。
通常，小或大尺寸的柱的特性能够通过控制聚合反应混合物在聚合反应过程中的焓来加以控制。在优选的实施方案中这可通过能量的引入和/或除去来实现。在一些实施方案中，该焓是通过在聚合反应过程中温度控制或通过温度和压力来加以控制，不需要由辐射引入能量，但在一些情况下，能量还可以由辐射添加。这一控制能够减少分离-有效开孔的均匀性的缺乏以及产生其它所希望的特性。对于这一目的，该焓被维持在聚合反应的范围内，但是低于失控(run-away)焓，并且处于一定的焓，其中阻止材料作时间-温度调节的过度放热没有由反应热产生。特别经济的是用水浴来实施。对于一些聚合反应混合物，例如，该焓是通过热量的引入或除去或通过辐射如UV辐射、IR辐射、X-射线辐射、可见光辐射或类似辐射或传导进入到聚合反应混合物中的热与辐射的结合的控制使用而被维持在这一范围内。该焓也可通过压力的施加来提高。对于放热反应的情况，该焓是通过让热量在与它的生成速率相当的速率下逃逸而被维持低于失控温度。
对于一些聚合反应混合物，该反应是通过仅仅采用引入热量(如通过加热的水浴)将温度提高到所需的反应温度来引发的。转移到聚合物(polymeric)混合物中的热量能够通过周期性地改变反应来控制，同时热量通过改变介质的温度来转移，从聚合物混合物中将热量转移到该介质中，以控制热量的生成速率。在优选的实施方案中，与填料的外表面接触的表面的温度被保持足够地低以避免在一种会在柱中导致过度温度梯度的速率下引入热量，但该温度对于聚合物的充分交联而言又显得足够地高。这通过逐步或逐渐地(例如随着缓慢提高的速率，线性地)提高外表面的温度来实现。所加入的温度被控制在控制-引发点和第一安全点之间，以便使得反应的变化速率是低的。这将保持低的放热，直至聚合反应进行地足够充分，提高温度以便在合理的时间中完成聚合反应并生产出温度-时间调节的聚合物。
从以上叙述可以理解，本发明的新型整体式固体载体具有几个优点，例如(1)按照优于现有技术的方式提供色谱图；(2)它能够简单地和廉价地制造；(3)它对于一些分离提供比现有技术分离更高的流速，因此缩短了一些分离的时间；(4)对于一些分离过程在比一些现有技术过程更低的压力下提供高分辨率分离；(5)通过降低柱的成本用一次性柱提供高的分辨率；(6)允许容易地制备许多不同形状的柱，例如用于环形色谱分析法的环形柱(annular column)，并且按照任何尺寸来制备，尤其小尺寸，如用于微芯片和毛细管和用于使用整体式可渗透的聚合物尖端的质谱分析注射器；(7)它能够快速地分离小的和大的分子；(8)它能够对于许多方法提供出众的分离介质，在这些方法中尤其包括萃取、色谱法、电泳、超临界流体色谱法，以及用于催化、TLC和集成CEC分离或化学反应的固体载体；(9)它能够对于某些已知的可渗透的整体式分离介质提供更好的特性；(10)它提供用于制备具有均匀的分离-有效开孔尺寸分布的大直径柱的新型方法；(11)它提供在高度含水流动相中没有管壁效应和具有改进的柱效率的分离介质；(12)它改进了分离有效因子；和(13)它减少了反相柱中的溶胀和收缩的问题。
附图简述本发明的上述和其它的特征将可以更好地由下列详细说明来理解，当参考附图来考虑时，其中

图1是用于制造根据本发明的实施方案的色谱柱的方法的一个实施方案的示意图；图2是在聚合反应过程中对于玻璃柱施加压力的固定设备的组装件；图3是在聚合反应过程中对于不锈钢柱施加压力的另一种固定设备的组装件；图4是在聚合反应过程中对于玻璃柱施加压力的仍然另一种固定设备的组装件；图5是在圆筒形柱内部在120psi液压下所聚合的强阳离子交换剂的扫描电子显微(SEM)照片；图6的色谱图显示了用柱从蛋白质样品得到的峰，其中畸变已经通过在聚合反应过程中的压力来避免；图7是显示三个柱的照片，其中位于左侧的一个是在聚合反应过程中有压力的情况下制备的，和位于右侧的两个是在没有压力的情况下聚合的；图8是有一排柱子的色谱系统的方框图，它们具有可再现的特性(在该排中它们彼此相似)；图9是显示了用中等能量(110kEV)X-射线辐射的聚合反应所实现的色谱分离的色谱图；图10是用于色谱柱的UV或可见光聚合反应装置的俯视图11是图10的装置的侧剖视正面图；图12是用于色谱柱的X-射线聚合反应装置的示意性正面图；图13是图12的装置的一部分的俯视图；图14是通过线14-14截取的图12的装置的一部分的正面剖视图；图15是图13的通过线15-15截取的正面剖视图；图16用于聚合反应混合物以形成整体柱的装置的示意图；图17是可用于图16的实施方案中的有温度测量装置在其中以监测温度梯度的柱的中断、简化的部分剖视图；图18是针对在合理量的时间中可获得的聚合度，将低温恒定温度聚合反应与低温可变温度聚合反应比较的图解；图19是显示了在一个过程中从柱的中心到外表面的温度的图解，在该过程中外表面的温度保持在与柱的中心相同的温度下；图20是具有反应式1、反应式2和反应式3的附图，举例说明了用于AMPS与GMA和EDMA的共聚合反应的方法和该方法的改进形式；知图21是在温度-时间调节的柱中进行的分离的色谱图。
发明详述广泛地，将可聚合的混合物放置于含有生孔剂或溶剂的容器中并进行聚合反应，形成用于分离系统例如色谱柱的具有分离-有效开孔的填料。有利地，聚合反应在将使用该填料的容器中进行，如色谱柱或提取室或类似物。在本发明的一个实施方案中，混合物进行聚合反应，同时补偿在聚合反应过程中的收缩效应以形成尺寸补偿的聚合物填料。在其它实施方案中收缩可通过对倾向于在水存在下溶胀的材料施加压力来避免，以形成尺寸补偿的聚合物填料的另一个实施方案。在仍然其它实施方案中，分离-有效开孔尺寸和分布是由压力和/或由聚合反应混合物的成分的选择和/或由使用外部影响因素如电磁辐射的方法和/或由温度-时间调节来控制的。收缩被补偿或避免的原因是它会引起与容器壁靠近的扩大的空隙并且它对于柱内的孔隙或其它分离-有效开孔尺寸分布具有有害影响。
在优选的实施方案中，该补偿是通过在聚合反应过程中施加压力来实现的，以便当材料在聚合反应过程中收缩时至少保持具有分离-有效开孔的材料的完整性。将柱维持在大气压力下以适应收缩可能不能在每一种情况下都防止空隙的形成，并且可能提供差的可再现性。该聚合物、单体、引发剂和生孔剂已经进行选择以改进该柱的特性，并且可以用于在聚合反应过程中有压力的聚合反应的实施方案或用于其它方法。在另一个实施方案中，在填料已经形成之后以及在由其它反应引起溶胀(如对于一些反相填料而言在聚合之后用含水液体混合物洗涤)之后或期间对该填料施加压力。在聚合反应过程中聚合反应液体混合物所接触到的柱或模具的表面是非反应性的或可以加以处理以提高粘合性。
在一个实施方案中，聚合反应混合物包括至少一种乙烯基化合物和生孔剂。引发剂包括在聚合反应混合物中或引发过程应用于乙烯基单体和生孔剂以形成一种供色谱柱或其它将聚合物填料用于分离的设备使用的整体式填料。一般，除了该乙烯基单体之外，聚合反应混合物包括乙烯基聚合物、或单体和聚合物的混合物、引发剂和生孔剂。然而，没有在聚合反应混合物中引入引发剂的其它聚合方法在现有技术中是已知的并且都能够使用，如辐射，来形成聚合物。另外，本发明的一些方面可以应用于聚合反应中的除乙烯基之外的单体和聚合物，例如脲甲醛或二氧化硅，以形成脲甲醛或二氧化硅填料。
由这些方法形成的色谱柱包括有内壁的支撑体以接收可渗透的整体式聚合物填料，该填料具有在聚合反应过程中形成的并且在尺寸上部分地由聚合反应过程中的压力和部分地由聚合反应混合物的组分和组分比例的选择来控制的预选择尺寸分布的分离-有效开孔。例如，分离-有效开孔尺寸是由聚合反应混合物中生孔剂的数量和类型控制的，其与一些其它成分的数量成比例。该压力可以在稍微高于大气压力到在柱壁的强度之内的压力值的范围内进行选择。可渗透的整体式聚合物填料具有光滑的壁和在填料内基本上没有微孔隙。填料可具有表面官能团。例如，可以添加疏水性表面基团如酚基来减少在反相填料中采用含水型溶剂时的溶胀，但是在这一情况下容量也会减少。类似地，亲水性表面基团可以添加，以提高在反相填料中的容量。
在壁中没有微孔隙或通道式开孔的可渗透的、整体式聚合物填料的一个实施方案是主要由乙烯基聚合物形成的，虽然在实施本发明时可以使用许多其它聚合物。弱离子交换可渗透的整体式聚合物填料主要地由甲基丙烯酸酯(如按照2.5-3.5的值与1.8-2.2的值的重量比率和优选按照3∶2的重量比率的甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸亚乙基酯)的聚合物形成。具有卓越的特性的反相可渗透的整体式聚合物填料主要由二乙烯基苯的聚合物和苯乙烯的聚合物形成。优选，二乙烯基苯和苯乙烯的比率大约是按照3.5-4.5的值与0.8-1.2的值的比率和优选按照4∶1(重量比)，但还可以是64％DVB(二乙烯基苯)或40％苯乙烯和72wt％DVB或按照在2∶3的比率到3∶2的比率范围内或优选1∶1的二乙烯基苯与苯乙烯比率。该柱也可以按照在8∶1的比率到10∶1的比率范围内的和优选9∶1的二乙烯基苯与苯乙烯比率。100％DVB也是优选的。
在图1中显示了制造色谱柱的方法的一个实施方案10的方框图，该方法包括制备聚合反应混合物的步骤12，聚合该混合物的步骤14，和制备供色谱试验用的柱的步骤16，和进行色谱试验的步骤18。用于聚合反应混合物的步骤14中的聚合反应混合物包括单体和/或能够聚合的聚合物、引发剂或引发过程如辐射、和生孔剂，它们中的许多是现有技术中已知的。制备色谱(chromatographic)混合物的步骤12、聚合的步骤14、为色谱试验作准备的步骤16和进行色谱试验的步骤18部可以采取不同的形式。这些变化中的一些将在以下进行描述。
步骤14包括让聚合反应化合物进行反应且同时压缩它以减少空隙的子步骤20，洗涤该聚合物的子步骤22，和在一些实施方案中，让该聚合物进行反应以增加某些官能团的步骤24。尽管聚合时在没有压缩该聚合反应混合物的情况下也可以获得可工作的柱，但是通过施加这一压缩已经获得了显著的改进。这些改进是足够显著的，以便能够在一些类型的柱中和对于一些应用在竞争性的商购柱与非竞争性的柱之间形成差异。由这一压缩防止空隙的形成和不均匀的分离-有效开孔可能源于该聚合物在密封容器中在聚合反应过程中的收缩所产生的空白空间的不均匀分布。空白空间的不均匀分布可以归因于在柱壁表面、聚合物表面、氮气和生孔剂之间的表面张力的差异。该压缩必须足以吸收这一收缩和因此减少该柱在聚合反应过程中的总体积。这一方法也会影响在柱中的分离-有效开孔尺寸，并且能够用于逐步的方法中以便在分离-有效开孔尺寸中产生变化，如果需要的话。
该洗涤步骤22是希望除去生孔剂和未反应的单体或用于特定的柱中但不希望保留在柱中的其它成分的常规步骤。在这一步骤之后是按照某种方式进行反应，以便增加官能团例如以上所述的基团，这些官能团在该柱希望用于分离蛋白质时是重要的。在一些实施方案中，该洗涤步骤引起该填料的溶胀，随后有收缩。因为该收缩可以引起通道空隙，在一个实施方案中对溶胀的填料施加压力，防止在收缩过程中空隙的形成。
在图2中，显示了聚合装置28的方框图，它具有压力源23，对聚合反应混合物32施加压力的压力输送机构25、压缩活塞27、和封闭容器21。在该优选实施方案中，该压力源23是恒定液压的调节源，但是其它压力源如弹簧或空气或惰性气体的压力源都可以使用。类似地，在该优选实施方案中，机构25是具有光滑表面的活塞以便为在聚合反应过程中已被该活塞表面压住的聚合的填料提供光滑表面，但是其它压力源如直接施加于可渗透的整体式聚合物填料上的气体也可以使用。在优选的实施方案中，在聚合反应过程中压缩活塞27向内移动进入柱段21中，对于在室32内的聚合反应混合物施加压力。当聚合反应已完成时，生孔剂能够通过被泵抽通过该柱的溶剂除去。聚合反应在温度受控的环境29中进行，它在优选实施方案中是水浴，但能够是任何此类温度控制机构如加热的室。这一设备的材料可以是现有技术中已知的任何常规材料。
在图3中显示了聚合装置28的一个实施方案的剖视图，该装置具有金属柱筒1022，封闭容器88，输送机构25，和压缩活塞112以及压力盖80。金属柱1022被紧密地固紧在封闭容器88上，利用在它们之间的密封件1021。密封件1021的压缩是由在圆筒122中的肩部1052和该装置的扳手卡面(wrench flat)1023A和B提供的，它利用螺纹1053连接于该柱1022上，因此在该柱1022和该封闭容器88之间提供了防漏的连接。该输送机构25由压缩活塞112，o-形环110，棒条106，固定套环104，另一个o-形环100，和液压活塞头602组成，它们全部被排列和安装在圆筒122之中，使得该压缩活塞112和o-形环110在封闭容器88内部形成紧密密封。压力盖80含有配合于圆筒122的流体入口33，在它们之间有衬垫94。
压力盖80和圆筒122紧密地连接，防止所施加的加压流体通过该流体入口33渗漏。输送机构25则按照所示的那样定位，在封闭容器88中产生体积。该圆筒122在o-形环100处的内径与封闭容器88的内径的比率的二次方提供了压力倍增因子。柱1022的相对端在柱室32中填充了聚合反应反应物，和封堵栓塞1024在开口中配接。封堵盖子604利用螺纹拧到该柱1022之上，对封堵栓塞1024施力以密封该开口。虽然优选实施方案在这里显示了紧密配接栓塞1024来提供密封作用，但是另一种密封装置如o-形环能够容易地用于提供面密封或径向密封。该流体入口33连接到受控的压力源，如可控制的液压泵或压缩气体的调节瓶。
优选实施方案的这一描述使用流体源施加的压缩气体或压缩液体通过流体入口33，然而压缩力能够容易地由其它方式供应；比如，但不限于压在输送机构25上的弹簧，堆叠在输送机构25上的利用重力提供压缩作用的砝码，或向心力，其经过设置可以引起输送机构25压缩在柱室32内部的整体式聚合物柱材料。
一旦组装完备，该装置28置于温度受控的环境29中，在优选实施方案中它是热控制的水浴。流体压力然后施加通过流体入口33，它由压力盖80、衬垫94、液压活塞头602和o-形环100所包含。所施加的力引起液压活塞头602运动远离压力盖80，并对棒条106的末端施加力。这一棒条106将力传递到压缩活塞112，对整体式聚合物柱材料施加压缩压力，优选在光滑表面1101上。这一光滑表面会引起在最终应用中在暴露于分析流体的整体式聚合物材料上产生连续、均匀的表面并减少该整体式聚合物柱材料对于压缩活塞112的粘合性。
封堵栓塞1024，柱1022，密封件1021，封闭容器88，和压缩活塞112限制该整体式聚合物材料。随着化学反应进行，整体式聚合物材料的体积下降，和输送机构25进一步移到该封闭容器88中。在o-形环100和o-形环110之间截获的空气被允许通过在圆筒122中的漏气开口603逃逸。反应物材料用这样的方式压缩可以防止在整体式聚合物材料中形成不希望有的空隙，并且消除了在整体式聚合物材料和柱1022之间的将降低该柱的使用性能的管壁效应。
随着反应进行和整体式聚合物材料体积减少，压缩活塞112移动更接近该柱1022。接近聚合反应结束，该固定套环104接触到在圆筒122中的肩部1052，停止输送机构25的前进运动。新形成的整体式聚合物材料的破碎可以由这一作用来防止。在这一位置上，压缩活塞112的光滑表面1101大约与柱的末端一般齐，并且该整体式聚合物材料填充该柱1022，但没有在该材料中的不希望有的空隙或在该材料和柱1022之间的管壁效应。使用该扳手卡面1023A和1023B，聚合物装置28作为组装件从柱1022中分离。色谱仪接头然后安装在两端。
在图4中显示了与聚合装置28的实施方案相似的聚合装置28A的另一个实施方案的剖视图，该实施方案具有玻璃柱筒922，活塞头组装件401，位移活塞40和封堵栓塞923。在一些分析化学应用中，润湿的表面不能含有金属组分。虽然这一优选实施方案的讨论提及玻璃柱922和塑料件，但是任何非金属材料，比如但不限于提供可接受的机械性能的玻璃、陶瓷或塑料，都能够使用。此外，这里的讨论提及所施加的压力是由合适的流体压力源所提供，但是，提供压缩作用的其它方式(其中包括但不限于弹簧、砝码、或机械装置)能够容易地使用。
活塞头组装件401包括组装和装入到该柱922中的活塞76、o-形环38和中间部分50。由位移活塞40和o-形环64组成的柱塞组装件20被组装和装入液压缸部分21中，使得在该液压缸部分21中凹穴92远离该流体入口33。这一柱塞组装件20被完全地推入到该位移腔室60中。
该液压缸部分21和柱塞组装件30然后利用螺纹拧到该柱922之上。通过使用合适的工具，活塞组装件401被推进到液压缸部分21中，直到该环形肩部42接触到位移活塞40为止，其中减少直径的颈48装配到该凹穴92中。该柱922填充反应物，和封堵栓塞923被插入柱922的开口端。封堵盖子924然后利用螺纹拧紧到柱922的端部，紧密地将封堵栓塞923固定保持在柱922上。虽然这一实施方案利用了在封堵栓塞923和柱922之间的紧密配合，但是，其它方法，包括但不限于产生面密封或径向密封的o-形环，能够容易地使用。
流体压力源然后施加通过流体入口33。流体通过液压缸部分21、位移活塞40和o-形环64包含在位移腔室60之中。将组装的组件然后放入到温度受控的环境29中。对于这一实施方案，使用热控制的水浴，但是控制反应温度的任何合适方法都能够使用。
此类流体压力的应用会引起位移活塞40运动远离该流体入口33。位移活塞40的这一运动将力施加于中间部分50的环形肩部42上，其然后通过活塞76将压力施加于在柱922中的整体式聚合物材料上。
随着反应物化学物质进行聚合，体积下降。压力对于整体式聚合物材料的受控施加可以防止不希望有的空隙在整体式聚合物材料中的形成，以及防止随着体积下降在整体式聚合物材料与柱922的壁之间形成管壁效应。随着反应进行，活塞76进一步移到该柱922中，以替代这一体积减少。在活塞上的光滑表面74会产生该整体式聚合物材料的均匀表面以便在其最终应用中提供给分析流体一致的界面，和防止整体式聚合物材料粘附于活塞76的表面上。
接近反应的终点，该环形肩部42接触到该柱922的末端，防止中间部分50在该柱922中做任何进一步运动。这可以防止在空隙和管壁效应已经消除之后该整体式聚合物材料的破碎。这一环形肩部42也限制了活塞能够运行的距离，使得在柱922中所形成的整体式聚合物材料的孔隙度和尺寸得到控制。
在聚合反应完成之后，液压缸部分21与位移活塞40和它的o-形环64一起从柱922中移出。封闭盖子924和封闭栓塞923然后被取掉，最终取掉活塞头组装件401。色谱仪接头然后安装在两端。
还有可能通过将压缩气体直接施加于反应物化学物质的表面上从而在反应物化学物质上提供压缩作用。当选择特殊的柱模式时，该方法被认为不如以上技术，因为所得到的整体式聚合物材料的表面将不是光滑或平坦的，并且比整体式聚合物材料的本体具有更多孔隙。在其它柱模式中气体的直接施加可能是更可适用的。可能需要截掉聚合物棒条的末端以实现高分辨率分离。在图5中显示了在120psi液压下在柱壳体内聚合的强阳离子交换剂的扫描电子显微(SEM)照片(放大9,000倍)，显示出了没有孔隙的颗粒小球但在具有高表面积(因为不规则的表面区域)的它们之间存在通道和在较低程度上显示了颗粒小球的更多堆叠的片状构型。有凸起覆盖它们的表面区域的该颗粒的粗糙表面区域显示一种迹象，其可能表明了由增生(accretion)实现的生长。
在图6中显示了从在柱中分离的蛋白质样品得到的具有峰的色谱图，其中溶胀和收缩的问题通过压力的施加得以避免。峰是有区别的和较高的，且有良好分辨率。这一特殊的色谱图属于在3ml/分钟的流速下对于伴清蛋白、卵清蛋白和胰蛋白酶抑制剂的蛋白质样品而言的梯度洗脱，其中使用pH 7.6的0.01 MTris缓冲剂作为一种溶剂和1M氯化钠溶液作为另一种溶剂，以0至50％第二种溶剂的梯度，在5分钟时间中。在该柱中的反压是250磅/平方英寸，而没有补偿的柱预计对于相同的梯度将具有更高的反压。
在图7中，显示了三种填料，其中位于左侧的一个是在聚合反应过程中有压力的情况下制备的，位于右侧的两个是在没有压力的情况下聚合的。图7说明了由柱形成过程中的收缩所引起的在柱表面上形成的不连续性。在柱内部有类似的不连续性，呈现不可预见地间隔的较大开孔的形式。这些图还说明了不连续性能够被除去，导致在相同组成和相同尺寸的柱之间更好的可再现性以及在色谱试验中的改进的分辨率。
在图8中显示了制备性液相色谱系统101的方框图，该系统具有泵送系统121，柱和检测器的阵列141，收集器系统117，控制器119，和吹洗系统123。该柱和检测器的阵列141包括多个柱，在它们之中有可渗透的填料。优选该填料是尺寸补偿的聚合物填料。该泵送系统121在控制器119的控制下将溶剂供应给该柱和检测器的阵列141。吹洗系统123与泵阵列135连通以清洗该泵以及在泵之间的管线和在色谱试验轮次之间的柱。泵阵列135在控制器119的控制下将溶剂供应给该柱和检测器的阵列141，流出物从其中流出进入到收集器系统117中。该控制器119接收来自在该柱和检测器阵列141中的检测器的指示溶质的谱带的信号，并且因此按照现有技术中已知的方式活化该级分收集器系统117。一种合适的级分收集器系统是可从Isco，Inc.，4700 Superior Street，Lincoln，NE 68504商购的FOXY7200级分收集器。
为了将溶剂供应到该泵阵列135中，泵送系统121包括多个溶剂储存器和支管(其中的第一个和第二个分别在131和133处标明)，泵阵列135和发动机137(它在控制器119的控制下驱动，以操作泵的阵列135)。该控制器119还控制在泵阵列135中的阀门以控制溶剂的流量和梯度的形成，当发动机同时驱动在泵阵列135中的往复泵的活塞以便从该阵列中的多个泵中泵送溶剂和从溶剂储存器和支管如131和133中抽出溶剂时。
虽然在优选实施方案中使用往复式活塞泵的阵列，但是任何类型的泵都是合适的，不论是否是往复式和是否是活塞式。大量的不同泵和泵送原理都是在现有技术中已知的和对于本领域中的技术人员来说是已知的，并且任何此类已知的泵或泵送原理在大多数情况下以常规的工程设计就可以适应于在这里公开的本发明。尽管两种溶剂公开在图1的实施方案中，但仅仅一种溶剂或两种或两种以上的溶剂都可以使用。
为了处理该流出物，收集器系统117包括收集溶质的级分收集器141，支管143和处置来自支管143中的废物的废物贮藏罐145。一个或多个级分收集器与柱和检测器的阵列143连通，以便从柱中接收溶质，用支管或不用支管。支管可用来合并来自一个以上柱中的溶质并将它们一起沉积在单个贮器中，或各柱可以将溶质沉积在其本身的贮器中，或一些柱可以各自将溶质沉积在其本身的相应贮器中和其它的柱可以将溶质合并在同一贮器中。该支管143与柱和检测器的阵列141连通，从各柱中引出流出物并将它沉积在废物贮藏罐145中。
因为图8的系统包括柱的阵列，各自参与类似的任务，该柱的可再现性是特别重要的，因为希望执行单个任务的各个柱具有与执行该任务的全部其它柱尽可能相似的特性。因此，对于在进行彼此密切相关的样品的分离时希望协作的任何柱组有相当大的优势，本发明的可渗透的聚合物柱具有特殊的应用。
为了制造含有聚合物填料作为分离介质但在其侧壁中没有开孔或在填料本体中没有大开孔的柱或其它设备，聚合反应设备的一个实施方案包括适应于在聚合反应过程中容纳聚合反应混合物的温度受控的反应室以及对于在所述温度受控的反应室中的所述聚合反应混合物施加压力的设备。聚合反应混合物包括单体，聚合物和生孔剂。在优选的实施方案中，施加压力的设备是用可移动的元件施加压力的设备。聚合反应混合物包括交联试剂和交联用单体。刚性、容量和分离-有效开孔分布是通过交联试剂、单体的量，聚合温度和压力来控制的。
聚合反应是在封闭容器中进行以避免在使用烘箱的情况下的溶剂损失或避免在水浴反应室的情况下混合物被水稀释或污染。压力是在一些混合物如用于离子交换柱的混合物的聚合反应过程中施加的，以平衡由收缩形成的真空。聚合物填料在聚合之后进行洗涤以除去生孔剂。就一些聚合物而言，如果采用含水液体混合物，填料在洗涤过程中或在色谱试验过程中倾向于溶胀，例如如果填料是反相填料。
为了将混合物分离成它的组分，如上所述形成了可渗透的聚合物填料。它可以在任何尺寸或形状的柱(包括常规液相色谱柱)中形成，这些柱是相当规则的管式圆筒、或毛细管、或微芯片或具有任何尺寸或几何结构。样品与填料并置，当样品穿过该填料时样品的组分会发生彼此的分离。
例如，为了由液相色谱法从样品中的蛋白质混合物中分离出蛋白质，柱作为填料而形成并且在有生孔剂的情况下原地聚合。在使用之前收缩得到补偿。样品被注入到该柱中并让溶剂流过该柱，从而，当被携带通过该填料时样品被分离成它的组分。在一个实施方案中，多种的样品在单独的柱中以高的可再现性同时进行分离。
用于分离过程中的色谱柱的一个实施方案具有带内腔壁的色谱腔，并在腔壁里容纳可渗透的整体式聚合物填料。该填料是具有被控制尺寸的分离-有效开孔的聚合物，该开孔是在聚合之前由聚合反应混合物中的生孔剂在聚合物中形成并且至少部分地由聚合反应过程中的压力来控制尺寸。可渗透的整体式聚合物填料具有光滑壁以及在可渗透的整体式聚合物填料内基本上没有孔隙。在优选的实施方案中，该填料是由乙烯基聚合物形成的，但可以由其它材料如脲甲醛或二氧化硅形成。这些可以包括表面基团如疏水性基团以减少采用含水溶剂时的溶胀或亲水性基团以提高容量。
在聚合反应混合物中的各成分以及在不同填料中的各成分的比例的一些例子是举例说明而已。例如，没有通道式开孔的弱离子交换剂可渗透的整体式聚合物填料主要由甲基丙烯酸酯聚合物形成。有利地，该可渗透的整体式聚合物填料主要地是由按照在1∶1和7∶3的比率范围内的比率(按重量)和优选按照3∶2的比率的甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸亚乙基酯的聚合物所形成的。
强阴离子交换剂包括作为它的主要成分的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和二(乙烯基)甲基丙烯酸亚乙基酯(EDMA)，按照在0.8-1.2范围内的值与在2.8-3.2范围内的值的比率和优选按照1∶3的比率。在优选实施方案中聚合反应液体混合物包括0.4克GMA，0.5克的2-(丙烯酰氧基乙基)三甲基铵甲基硫酸盐，1.2克EDMA，1.5克的1，4-丁二醇，1.35克丙醇，0.15克水和0.02克AIBN。
弱阳离子交换剂包括甲基丙烯酸甲酯(MMA)、GMA和EDMA的聚合反应液体混合物，按照在4.5-5.5范围内的MMA的值与在0.8-1.2范围内的GMA的值与在11-13范围内的EDMA的值的比率，和优选按照5∶1∶12的比率。聚合反应液体混合物包括0.2克AA，0.5克甲基丙烯酸甲酯(MMA)，0.1克GMA，1.2克EDMA，2.55克十二烷醇，0.45克环己醇和0.02克AIBN。在聚合之后，该柱在5M(摩尔浓度)氢氧化钠NaOH之中的0.25M氯乙酸钠溶液中于60℃下水解六小时。
其它例子是(1)甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸亚乙基酯，按照在1∶1至2∶1范围内的重量比；或(2)二乙烯基苯和苯乙烯，按照在3∶1至9∶1范围内的比率；或(3)二乙烯基苯和苯乙烯，按照4∶1的比率或二乙烯基苯的量是在35wt％至80wt％二乙烯基苯和优选64wt％二乙烯基苯的范围内；或(4)二乙烯基苯，苯乙烯和生孔剂，按照分别8∶2∶15的比率；或(5)二乙烯基苯，苯乙烯和十二烷醇，按照7-9个单位的二乙烯基苯与1.5-2.5个单位的苯乙烯与13-17个单位的十二烷醇的比率，掺混了引发剂；或(6)二乙烯基苯，苯乙烯和十二烷醇，按照分别8∶2∶15的比率，掺混了引发剂；或(7)二乙烯基苯，苯乙烯，十二烷醇和甲苯，按照分别7-9与1.5-2.5与9-13与2.5-3.5的比例，掺混了引发剂；或(8)二乙烯基苯，苯乙烯，十二烷醇和甲苯，按照分别8∶2∶11∶3的比例，掺混了引发剂；或(9)甲基丙烯酸缩水甘油酯，二甲基丙烯酸亚乙基酯，环己醇和十二烷醇，按照0.5-0.7与0.3-0.5与1-2与0.1-2.5的比例，掺混了引发剂；或(10)甲基丙烯酸缩水甘油酯，二甲基丙烯酸亚乙基酯，环己醇和十二烷醇，按照分别0.6∶0.4∶1.325∶0.175的比例。
通常，制备用于目标应用的具有分离-有效开孔的整体式聚合物载体的方法包括以下步骤(1)用所选择的配方制备聚合反应混合物；(2)将混合物放入到具有所需形状和尺寸的容器中，在本发明的一些实施方案中有时称为柱；(3)用加压配件或无压密封件密封该柱；(4)在所选择的压力下或在没有压力下，在温度受控的加热浴或烘箱中聚合该聚合反应混合物；(5)从加热浴或烘箱中取出柱并安装所选择的或特别设计的配件以获得所需功能；(6)用所选择的溶剂，优选通过程序控制的流体，从柱中洗出生孔剂和可溶性物质；(7)在一些实施方案中，泵送配方设计的改性液体混合物以获得为了相互作用所需的官能度；(8)在控制的条件下在加热浴或烘箱中进行特殊的改性；(9)从柱中洗出该改性液体混合物，优选用程序控制的流体；(10)稳定化、组装和调理该柱，以使它能够在所需条件下以高分辨率使用；(11)用在目标应用中的样品分离来表征该柱；和(12)用所选择的贮存液体混合物替代在柱中的液体。步骤7到9是任选的或重复的，这取决于待使用的介质的功能。步骤1到5在两个或更多个阶段的聚合方法中加以改进和进行重复。
在本发明的一些实施方案中，聚合反应混合物包括下列当中的一种或多种(1)单体；(2)生孔剂；(3)引发剂或催化剂；和/或(4)添加剂或填料(任选的)。在填充或注入到柱中之前，聚合反应混合物可以用氦气脱气达15分钟以上，或由真空脱气，或由两者的结合来脱气。这一脱气的目标是除去在混合物内的氧气。该氧气能够在不同情形下作为抑制剂或引发剂，导致了无法预测的聚合行为，这对于柱的分辨率和可再现性是有害的。
以上方法的合适单体包括现有技术中已知的单、二和多官能化单体，优选含有乙烯基或羟基silica官能团的单体，它可以作为中间体原地产生。典型的单乙烯基单体包括苯乙烯和它的含有羟基，卤素，氨基、磺酸、羧酸、硝基和不同的烷基链如C4、C8、C12和C18的衍生物，或可用于在聚合之前或之后产生这些官能度的它们的保护形式；和所述单体还包括丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，乙烯基吡咯烷酮，乙酸乙烯基酯，丙烯酸，甲基丙烯酸，乙烯基磺酸，和能够用于原地产生这些化合物的这些基团的衍生物。这些单体的混合物都能够使用。带有羟基、乙烯基、烷基的硅氧烷或它们的衍生物和它们的混合物是优选的。在本发明的实施方案中，单官能化单体的量是全部单体的2％-60％。它们显著地变化，取决于介质的类型。
典型的二或多官能化单体优选是具有桥连结构部分如苯、萘、吡啶、烷基乙二醇或它的低聚物的含两个或更多个乙烯基的单体。这些多乙烯基化合物的例子是二乙烯基苯，二乙烯基萘，二丙烯酸亚烷基酯，二甲基丙烯酸酯，二丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺，二乙烯基吡啶，乙二醇的二甲基丙烯酸酯和二丙烯酸酯，聚乙二醇的二甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯，季戊四醇的二-、三-、或四甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯，三羟甲基丙烷的三甲基丙烯酸酯和丙烯酸酯，以及这些化合物的混合物。带有常常原地产生的二、三和四羟基的硅氧烷在本发明中也是优选的。在本发明的实施方案中，多官能化单体的典型量是40％-80％。
该引发剂包括现有技术中已知的全部引发剂如偶氮化合物和过氧化物。典型引发剂的例子是偶氮二异丁腈，苯甲酰基过氧化物，2，2’-偶氮双(异丁酰胺)脱水物，2，2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸化物。在本发明的实施方案中，引发剂的典型量是全部单体的0.5％-2％。当使用硅氧烷时，使用催化剂如酸，而不是引发剂。催化剂的量是毫摩尔到摩尔/升聚合反应混合物。没有在聚合反应混合物中掺入引发剂的其它聚合方法在现有技术中是已知的并且都能够使用，如辐射，来形成聚合物。
该生孔剂是在聚合之后能够被除去以产生分离-有效开孔结构的任何材料或化合物。可以使用的典型的生孔剂是有机溶剂，水，低聚物，聚合物，可分解的或可溶性的聚合物。有机溶剂的一些实例是醇，酯，醚，脂肪族和芳族烃，酮，二-、三-、四-甘醇，丁烷二醇，甘油或这些溶剂的结合物。生孔剂的选择取决于所需的分离-有效开孔尺寸和分离-有效开孔分布。
在一些实施方案中，选择单种的生孔性溶剂或多种生孔性溶剂的结合物。单种的生孔性溶剂或多种生孔性溶剂的结合物可以与单体和引发剂混合以形成均匀的流体混合物，但是单种的生孔性溶剂或多种生孔性溶剂的结合物对于所形成的聚合物具有差的溶剂化能力。聚合反应通常由引发剂引发。在低聚物的形成之后是交联形成交联的聚合物或核，和聚合物或核的连续生长。这些聚合物链和核是以生孔性溶剂的溶剂化能力允许的尺寸从液体混合物中沉淀析出。这些聚合物链和核首先悬浮于液体混合物中，然后通过碰撞和交联形成小颗粒。小颗粒被生孔剂和单体溶胀，并且通过聚合反应和与其它核或颗粒之间的聚集作用而继续生长。较大的颗粒由碰撞聚集在一起并且由交联在适当的位置固定。聚合物和核的沉淀的时间和速度显著地影响颗粒、聚集物或簇的尺寸以及在这些颗粒和聚集物中形成的分离-有效开孔尺寸和分离-有效开孔尺寸分布。
已经发现，非常差的溶剂和相当良好的溶剂的结合物通常更好地调节聚合物在液体混合物中的溶解度或可溶胀性，导致所需的孔隙度和分离-有效开孔尺寸分布。不良溶剂的选择是更重要的，因为大的分离-有效开孔的产生是最重要的。在大的分离-有效开孔产生之后，总是能较容易地发现良好或相当良好的溶剂来调低该分离-有效开孔尺寸。已经发现，对于由聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺制成的介质，醇或含有羟基或多个羟基的中性化合物是不良溶剂的更好选择。溶解度或溶剂化能力能够使用不同链长度和不同数目的羟基的醇来容易地调节。聚合物的良溶剂选自许多通常的良溶剂，如甲苯，四氢呋喃，乙腈，甲酰胺，乙酰胺，DMSO。在本发明的实施方案中，生孔剂的典型量是20％到80％，更优选40％到60％。
用于本发明中的添加剂或填料是能够为介质增加特别需要的特征的那些材料。具有分离-有效开孔的聚合物的一个重要特性是聚合物的刚性。不溶的硬质聚合物颗粒、二氧化硅颗粒、或其它无机颗粒能够被添加到聚合反应混合物中以增强在聚合之后具有分离-有效开孔的聚合物。具有非常大数目或数量的分离-有效开孔的聚合物通常不具有良好的强度或韧性。它们时常是易碎的。硬质颗粒能够用作聚合物的框架。在另一个实施方案中，在大直径的柱的制备过程中热传递的问题可通过向聚合反应混合物中添加非常单分散的无孔隙颗粒来减少。相当经常，需要大直径的柱用于高流量制备性色谱仪或催化床来允许仅仅有低的反压的高流速。
在具有分离-有效开孔的聚合物的一个实施方案中，单分散的大的无孔隙颗粒或珠粒是以接近于致密堆积的模式进行紧密地填充。聚合反应混合物被填充到大珠粒的间隙空间中并在这些间隙空间中聚合。流动模式和柱效率可通过致密填充的单分散珠粒来改进。具有非常大数目或数量的分离-有效开孔的材料能够在该大直径的柱中制备而无需害怕低刚性的介质的塌陷，因为大的单分散的珠粒是该大直径柱的支撑材料。能够实现高流速，这归因于大数目或大量的分离-有效开孔，还有聚合物的稳固结构。
在另一个实施方案中，在采用掺入具有分离-有效开孔的聚合物作为填料的两阶段或多阶段聚合反应来制备大柱的过程中避免了热散逸的问题。在本发明的一个实施方案中，从相同的聚合反应混合物制备的具有分离-有效开孔的多个细柱被用作填料，以减少在大柱的原地制造过程中的热散逸问题。在本发明的另一个实施方案中，处于相同的目的将聚合物棒条用作填料。在本发明的一个实施方案中，填充材料是大的、无孔隙的二氧化硅珠粒。
该聚合物、单体、引发剂、生孔剂、添加剂和聚合温度进行选择以改进该柱的特性并且可以用于在聚合反应过程中使用压力的聚合反应的实施方案或其它方法。该方法的一些方面可以适用于单体和在除自由基反应以外的聚合反应(如缩聚反应和可形成二氧化硅整体料的溶胶凝胶方法)中形成的聚合物。
在本发明的一个实施方案中的柱硬件(hardware)包括用作色谱柱的硬质管(具有各种形状，其中包括圆柱形，圆锥形，矩形，和多边形)或这些管的组装件。该管可以从现有技术中已知的任何常规材料制备，其中包括金属，玻璃，二氧化硅，塑料或其它聚合物，更优选不锈钢或玻璃。这一管的内部尺寸能够是从微米到米，按直径、厚度、宽度、或深度计。可渗透的固体材料可以覆盖该管的整个横截面区域，其中在轴向或径向上通过该管来进行样品的分离(Lee，W-C，等人，“RadialFlow Affinity Chromatography for Trypsin Purification”，ProteinPurification(book)，ACS Symposium Series 427，Chapter 8，American Chemical Society，Washington，D.C.，1990.)，这取决于分离的模式，更具体地说取决于轴向流或直流式色谱或径向流色谱。在聚合反应过程中聚合反应液体混合物所接触到的柱或模具的内表面是非反应性的或可以加以处理以提高对填料表面的粘合性。该管能够加入在现有技术中已知的任何可使用的接头以便将它与其它仪器(更具体地说色谱仪)相连。
在本发明的一个实施方案中，该整体式可渗透的固体聚合物是在毛细管中形成的，它能够是例如具有150微米的内径的毛细管。在另一个非常重要的实施方案中，整体式可渗透的刚性材料是在可拆卸的80.mm内径Teflon密封环中形成和密封的，这常常在压力下。这一环和柱可以作为低成本的、可靠的、大容量的、高分辨率的、非常快速的、可容易替换的替代品色谱柱来销售。在另一个实施方案中，管的直径是10mm。在另一个实施方案中，该管的直径是4.6mm和该材料是不锈钢。在本发明的另一个实施方案中，塑料注射器圆筒用作柱。在另一个实施方案中，整体式基质是在模具中形成的，该模具包含金属容器、密封板和有多个圆柱形孔穴的插件。插件的厚度是1-10mm。模具能够是在由二氧化硅或硬质聚合物制成的板上有多个通道或凹槽的微型设备。该整体式材料能够以任何尺寸和形状形成，使得它适合于特别设计的微型设备，例如具有多孔的微滴定板(micro-titerplate)，这些孔含有本主题介质和任选在底部具有小的洗脱口。对于所设计的形状和尺寸或这些设备的应用没有限制。
聚合反应混合物被填充或注入到具有所需形状和尺寸的柱中，这取决于待聚合形成为可用作固体载体的具有分离-有效开孔的填料的产品的最终用途。有利地，聚合反应在将采用该填料的柱中进行，如色谱柱，催化床，提取室或类似物。在本发明的一个实施方案中，在聚合反应过程中对于聚合反应混合物施加正压力，以控制聚集物的颗粒尺寸和补偿在聚合反应过程中的体积收缩。与从未加压的聚合反应得到的聚集物颗粒尺寸相比，聚集物的颗粒尺寸已经发现更均匀和更大。在聚合反应过程中的体积收缩是通过正的空气压力或有正压力的移动活塞来补偿的。
更具体地说，在优选实施方案中聚合反应混合物被施加于柱中或施加于一些其它合适模具中。聚合反应在该柱或模具内被引发。如果聚合反应在烘箱中进行的话，该柱或模具被充分地密封以避免生孔剂或单体的计划外的蒸发损失；或避免污染或稀释，如果聚合反应在水浴中进行的话。在聚合反应过程中，压力被施加于聚合反应液体混合物。优选该压力被维持在高于大气压力的水平以控制聚集物的尺寸和该聚集物在聚合物中的分布，以及防止由于收缩而在聚合物壁表面上和在介质内部中形成空隙，和防止介质与柱壁分离(这将形成穿过该缝隙或壁通道的另一种流体通路)，直到聚合反应已经完成为止。将该柱维持在大气压力下以适应收缩不能在每一种情况下都防止空隙的形成并且提供差的可再现性。压力源能够是气体压力，来自非相容性液体的压力、气压驱动的活塞、冲刺(sprint)力或液压。
在本发明的一个实施方案中，任何数量的增压模具(管)能够在单个水浴中保持在恒定或受控制的温度下，并且同等地从单个(例如氮气，水等)支管增压。这提高了均匀性和生产速度。
在本发明的另一个实施方案中，所选择的压力由高压氮气施加于聚合反应混合物上。在本发明的仍然另一个实施方案中，通过在图2、3或4中所示的加压设备，在聚合反应过程中将所选择的压力施加于聚合反应混合物上。该柱在一端被密封和聚合反应混合物被填充到该柱中。另一端由图2，3或4中所示的设备密封。包括柱的聚合反应用固定设备的总组装件示于图2，3或4中。由来自注射泵的液压驱动的具有光滑特氟隆栓塞的活塞对聚合反应施加压力。聚合反应混合物由特氟隆栓塞和o-形环密封在柱中。当将恒定的正压力施加于聚合反应混合物时，实际压力是在液压和摩擦力之间的差值。在聚合反应过程中，在单体转化成聚合物时活塞移向柱内，以补偿由于聚合物的收缩所产生的空隙。这会防止由于这一收缩而在密封的柱内部产生的任何负压力和空隙空间，因此改进柱效率。
可以相信，该收缩是在每一方向上的。所形成的空隙可能由AIBN产生的氮气或在柱内有负压力的情况下由溶剂蒸汽所占据。该空隙可以是在聚合物壁上的大的不规则凹陷或散布在整个聚合物表面上的小的不规则凹陷。该空隙也可以分布在聚合物内部，导致分离-有效开孔尺寸分布的不均匀性。这些不规则空隙和缝隙会导致柱的管壁效应或区带扩展。它们对于柱效率是有害的并且降低柱的分辨率。这些空隙和缝隙还会导致在同一批次生产中或从一个批次生产到另一个批次生产的柱性能彼此之间的低再现性。
在本发明的一个实施方案中，所选择的压力被施加于聚合反应混合物上以控制聚集物的尺寸和分离-有效开孔尺寸分布。颗粒尺寸随着在聚合反应过程中在聚合反应混合物上的压力的变化而变化。该颗粒尺寸在较高的压力下是较大的。在正压力下，在聚合反应过程中聚合物的收缩仅仅在压力的方向上发生。这防止在聚合物内部形成空隙和在与柱壁相邻的壁表面上形成空隙/缝隙。
在聚合反应过程中，随着从单体到聚合物的转化率提高，单体浓度持续下降。交联的聚合物持续从液体混合物中沉淀析出并且彼此聚集形成更大的颗粒或簇。这些颗粒沉淀并利用交联剂如具有乙烯基的活性聚合物链彼此连接。这些互连的颗粒沉降到柱的底部，导致在柱的顶部较低的单体浓度。
分离-有效开孔尺寸受到总单体浓度和它们的比率的高度影响。沿着重力方向形成了不均匀的分离-有效开孔尺寸梯度，这导致区带扩展。因为该颗粒尺寸部分地受到聚合反应的压力的控制，分离-有效开孔尺寸的梯度能够通过在聚合反应过程中调节压力来加以校正。在一个实施方案中，在聚合反应过程中将线性地提高的压力施加于聚合反应混合物。在另一个优选实施方案中，在聚合反应过程中将分阶段的压力梯度施加于聚合反应混合物。提高/降低压力的速度和模式经过选择可以控制在整个聚合反应过程中聚集物的颗粒尺寸和它的分布。当分离-有效开孔尺寸分布的线性梯度是所希望的时，它也能够通过用不同的速度和不同的最高压力改变聚合反应过程中的压力来实现。
聚合反应温度取决于引发剂的选择。当使用AIBN和苯甲酰基过氧化物时，典型的温度范围是50到90摄氏度。加热源能够是现有技术中已知的任何类型。优选的途径是温度受控的加热浴或烘箱。反应时间能够是0.5-48小时，这取决于引发剂和反应温度的选择。在本发明的一个实施方案中，聚合反应是在60摄氏度的温度受控的水浴中进行20小时。
当使用光敏引发剂时，辐射如IR、UV-vis或X-射线用作聚合反应的引发源。在一个实施方案中反应由引发剂的热活化来引发。在另一个实施方案中，在有或没有化学引发剂的情况下它通过由能量辐射如X-射线的应用来引发。如果使用X-射线，则引发剂应该进行选择以便在超过聚合反应温度的温度下热活化。另一方面，当在反应物料接受活化所需的给定区域中的温度下在X-射线照射下时，该引发剂活化。该引发剂也可以进行选择，以使离解的活化时间和温度比只有单体时低得多。活性引发剂(自由基)的产生仅仅通过X-射线的强度来控制。因为X-射线强度是可控制的，反应速率是可控制的和将不会“失控”或过热。而且，该引发剂可以经过选择以使得当在反应物料接受活化所需的给定区域中的温度下在X-射线照射下时活化。
在一个实施方案中，X-射线为聚合反应提供全部或一部分的能量。X-射线光子的能量将根据聚合物的制备方法和根据厚度或横截面的差异来变化。较低能量X-射线用于较小直径聚合物棒条的制备，以及较高能量X-射线或较长时间地暴露于较低能量X-射线都可以用于大直径的聚合物棒条的制备。在优选的实施方案中，聚合反应温度通过开关该X-射线来控制。当X-射线被关掉时，聚合反应在几秒内迅速地停止，因为自由基的寿命典型地是一秒左右。
在一个实施方案中，利用X-射线作为能源，光引发剂用于引发聚合反应。该光引发剂是在聚合物领域中的光聚合反应中使用的典型光引发剂，其中包括γ-射线、X-射线、UV、可见光和IR敏感性光引发剂。该光引发剂包括偶氮化合物如偶氮二异丁腈，过氧化物如二苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)膦氧化物，酮如菲醌、2-氯噻吨-9-酮、4，4’-双(二甲基氨基)二苯甲酮、4，4’-双(二乙基氨基)二苯甲酮、4，4’-双(二甲基氨基)二苯甲酮、2-氯噻吨-9-酮，苯偶酰二甲基酮缩醇，有机金属配合物。这些光引发剂包括在阳离子和自由基聚合反应中使用的光引发剂。在一个实施方案中，AIBNI用作光引发剂。在另一个实施方案中，菲醌用作光引发剂。
在一个实施方案中，闪烁剂和增感剂用来增强光引发剂的活性。例如，X-射线可以通过激发溶剂以使它将能量转移到已经添加的已知闪烁剂中来引起闪烁或通过直接引起具有闪烁性能的溶剂的闪烁来引起闪烁。优选，闪烁光通过添加荧光增感剂来辅助，以提高光引发剂在引发聚合反应上的活性。该闪烁剂和增感剂经过选择，以便导致来自X-射线的能量被闪烁剂高效吸收以及在光引发剂的吸收谱带内的有效波长中的光辐射。
能够使用的闪烁剂包括现有技术中的发光材料中的任何一种。一般，该闪烁剂包括含有苯环的化合物，如三联苯、四联苯、萘、蒽，含有杂环的化合物，具有羰基的化合物，具有两个或更多个发色团(lurorophor)的化合物和有机金属化合物，以及无机化合物如ZnTe，ZnSe，ZnS，CsI，Gd2O2S和CaWO4。在一些实施方案中，2，5-二苯基唑(PPO)，2-苯基-5-(4-联苯基)1，3，4-二唑(PBD)，2-(1-萘基)-5-苯基唑(á-NPO)用作闪烁剂。在一个实施方案中，三联苯用作闪烁剂。在另一个实施方案中，ZnSe用作闪烁剂。
优选，多步骤引发过程用于采用光引发剂的X-射线辅助的聚合反应。使用闪烁剂和光引发剂的结合物的引发机理被认为是多步骤引发过程。首先，该X-射线活化溶剂分子，形成电子激发的溶剂分子。激发的溶剂分子快速地将它们的激发能转移到该闪烁剂，形成电子激发的闪烁。然后，闪烁剂的激发态通过发射光子而驰豫到基态。发射的光子被光引发剂吸收和形成活性自由基。该游离引发剂自由基接触单体的乙烯基官能团和引发聚合反应过程。该过程能够被描述为如下X-射线hγ-激发的溶剂分子*--激发的闪烁剂分子*--UV或可见hγ’-激发的引发剂分子*--引发剂自由基-聚合物自由基。
X-射线辐射的聚合反应能够用于制备均聚物如聚苯乙烯、聚四氢呋喃，树脂如环氧树脂或其它交联的材料，以及多孔聚合物载体如呈现柱、膜形状的分离介质，或在任何其它外壳之内的材料。该方法能够用于任何形状的模制部件的制备。在一个实施方案中，使用X-射线辐射作为能源制备聚苯乙烯。在有窄开口和圆柱体形状的玻璃管形瓶的模具中制备聚苯乙烯。液体混合物聚合反应和本体聚合反应两者用于制备均匀多孔性苯乙烯(均聚苯乙烯)材料。在另一个实施方案中，聚甲基丙烯酸缩水甘油酯树脂是通过使用相同的方法制备的。在另一个实施方案中，制备多孔的聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)。在另一个实施方案中，制备多孔的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)聚合物载体。
X-射线能够用于制备具有从微米到米的横截面的多孔整体式聚合物载体。X-射线辐射的聚合反应用来制备整体式液相色谱柱，其中包括毛细管和微孔分析柱，常规的分析柱，以及制备性柱和处理(process)柱。在一个实施方案中，制备在内径1cm的玻璃柱中的多孔整体式载体。柱通过SEM、孔隙度测定法和色谱法来表征。
在这一玻璃外壳内的聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)整体柱显示出优异的分离肽的性能。X-射线能够深入地穿透该材料。有机和无机聚合物能够使用X-射线或γ-射线制备。高能量X-射线和γ-射线能够以高的深度穿过材料。如果需要更大的深度，则未聚合的混合物能够位于X-射线束中，并且以所选择的方式进行旋转和平移，使得总体的、时间平均的辐射在整个所要聚合的主体中是足够均匀的。需要指出的是，在色谱流的目标方向上定向的辐射不会因为该辐射束的吸收而在床中引起突出的色谱不均匀性。轴向不均匀性不一定会像径向不均匀性那样降低性能。
低能量的X-射线以较低的深度穿透该材料，但使用起来更安全。在一个实施方案中，低能量的X-射线用来在直径3.5cm的玻璃柱中制备多孔整体式载体。在另一个实施方案中，在88mm直径的聚合物的柱外壳内制备整体式载体。通过控制X-射线光子的强度和能量和通过水夹套来控制聚合反应的温度，以使反应混合物的至少一侧得到控制。优选该水冷方法在柱的轴向上而不是在径向上冷却该柱，以避免热梯度和导致不均匀性。全部流路会在色谱流的方向上经历相同的不均匀性，因此对于分离没有影响作用。在整个聚合反应过程中在这一大直径的柱的中心处的聚合反应温度大约与在柱的边缘上的聚合反应温度相同。在四天的聚合反应之后单体的转化得以完成。
X-射线辐射的聚合反应能够与热聚合相结合。聚合速率和孔隙度能够通过聚合速率(它通过X-射线的能量和强度来控制)和聚合反应的温度来控制。鉴于辐射的聚合方法的经济性和安全性，较低能量和强度的X-射线优选用于大直径的整体式聚合物载体的制备中。在3.5cm直径柱中在48小时的聚合反应之后，单体转化率完成了大于70％。为了加速聚合反应速率和在短时间内完成该转化，使用在对应于引发剂的所需温度下的热聚合。在一个实施方案中，通过使用X-射线辐射，随后在X-射线辐射的聚合反应之后于70℃下热聚合，制备多孔的聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)。聚合物的孔隙度能够通过单体组成、X-射线强度和能量、引发剂和闪烁剂的结合物的选择、以及在X-射线辐射的聚合反应和热聚合反应中的聚合温度来控制。在该聚合方法中使用的生孔剂与在较早描述的纯热聚合反应中使用的那些相同。获得可供液相色谱使用的优异的聚合物载体。
紫外线和可见光辐射在过去已用于制备聚合物，其中包括均聚物、板状聚合物树脂和多孔聚合物表面涂层，但不是本发明中的聚合物材料。UV和可见光两者都能够穿透薄的、固体的、透明的材料。紫外线和可见光已经用于制备薄的、透明的材料如膜。当材料的厚度提高时，多孔聚合物的均匀性更成为问题。这归因于在穿过多孔固体材料时光的散射和衰减。光能够穿过固体材料的深度迅速地下降，这取决于材料的官能团和折光指数。考虑到由两个相制成的丙烯酸类干燥多孔性柱折光指数约1.5的丙烯酸类树脂和折光指数1.00的空气。它如此完全地散射光，以致于该材料看起来像白垩，白色和不透明。在此以前，这些明显的差异已经阻止了UV或可见光在聚合反应中的使用。
紫外线和可见光能够用于制备聚合物材料(包括以上列举的具有高均匀性的材料)和制备若干英寸厚的聚合物材料。在柱和使用紫外线和可见光制造柱的方法的一个实施方案中，对于该聚合反应选择了在所选择的光的波长下与目标聚合物树脂有非常类似或相同的折光指数的溶剂。在所选择的波长下的光能够在聚合反应过程中穿过该聚合物，归因于很少采用的克里斯欣森(Christiansen)效应，其中该目标多孔树脂变得相当得半透明的或透明的。在特殊波长范围内的光显示出透明度，因为孔隙充满溶剂。优选，单色光(其在聚合物固体和溶剂两者中的折光指数是非常接近的)被选择用于聚合反应。由光而非热活化的引发剂用作光引发剂。如果使用白光，透射光对应于特殊的波长，在该波长下在聚合物固体和溶剂或溶剂结合物两者中光的折光指数是非常接近的。选择光引发剂以吸收在该近透明聚合物和溶剂波长范围中的光并且由该光活化。该引发剂吸收这一波长范围。
优选，当光引发剂被活化时它分裂成缺少最初的发色团的片段。该片段在所选择的光的波长范围内不吸收。当光线被光引发分子中的发色团吸收时，结果是在表面上的局部聚合反应。如果该发色团经受得住这一反应，则它们将阻断下一光线活化下一个光引发剂分子，因此将聚合反应限制于最初的表面。因此，该光能够以更高的深度穿过聚合物混合物并且光的透射增加。这一效果称为消感应吸收作用(Bleaching Effect)。已经发现在这方面良好的光引发剂是2，4，6-三甲基苯甲酰基二苯基膦氧化物。该消感应吸收作用和该克里斯欣森效应在利用光引发或e-射线引发所进行的非常厚的层、或深的多孔性聚合物的生产中是协同作用的。在后一种情况下，X-射线激发溶剂，该溶剂然后将二级能量传递到所谓的“增感剂”，后者则发荧光以活化该引发剂。如果在被X-射线激发时溶剂本身发荧光，则附加程度的协同作用也存在。常常p-三联苯用作X-射线聚合反应的增感剂。可以使用的荧光性溶剂包括许多芳基化合物，如甲苯，邻-、间-、或对-二甲苯，或1，2，3-三甲苯(或其它异构体)。在一个实施方案中，均聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)是通过使用邻二甲苯作为生孔性溶剂由普通的液体混合物聚合反应制备的。邻二甲苯、单体和特别是聚合物的折光指数是接近的。在液体混合物中所得聚合物接近于透明但有少量的半透明，归因于白光的少量散射。
测量目标聚合物的折光指数。选择良溶剂和不良溶剂两者以便具有与目标聚合物的折光指数接近的折光指数。通过调节溶剂的比率，溶剂混合物的折光指数将几乎与聚合物的相同。因此，穿过被溶剂溶胀的聚合物的光的透射率能够达到最高值。在一个实施方案中，多孔聚甲基丙烯酸酯型整体料通过使用溶剂的结合物来制备。
在制备大直径的温度-时间调节的聚合物填料时，需要避免由聚合反应过程中的不均匀聚合温度引起的不均匀的聚合物整体料。均匀的聚合物应该在给定的横截面中按照分离-有效开孔的孔隙尺寸分布的模式具有低于25％的变化，以及优选对于大部分所进行的分离具有低于2％的变化。在本说明书中，模式是分布曲线的峰。分布曲线是在不同直径的孔隙尺寸(开孔)下孔隙体积/单位重量的多孔材料的百分率。如果有比热散逸更快的热生成速率，则产生不均匀聚合温度。具有不均匀聚合温度的倾向是通过聚合反应的自加速所增加的，这会导致热量以难以控制的方式和同时以几何级不均匀的方式增加。聚合反应的自加速的趋势是通过在凝胶效应和聚合温度的提高两个方面的结合而增大。
为了具有均匀聚合温度，生热速率需要与热散逸的速率相同。所需的聚合温度是由聚合反应过程中热生成和热散逸的平衡速率来确定的。通过优化聚合温度，热量散逸速率能够被控制以等于热量生成速率。
当聚合温度是足够低时，聚合反应的自加速不会发生。在低的聚合温度下，从引发剂产生自由基的速率和聚合反应的速率是缓慢的。虽然聚合物自由基不太倾向于因为凝胶的高粘度而由聚合物自由基或引发剂自由基的碰撞所终止，但是低的聚合速率和自由基产生速率会因为氢转移或聚合物链重排而增加聚合反应终止的机会。总体聚合速率没有提高，归因于对于活性聚合物自由基的终止的不利影响。
当聚合反应温度高于阈值温度时，聚合反应的自加速会发生。这一阈值温度将随单体的聚合反应或共聚反应速率而变化并且取决于聚合反应混合物的环境如生孔剂和单体。不同的生孔剂能够对于聚合物和引发剂自由基具有不同的终止作用。不同的单体具有不同的聚合速率和终止速率。因此，选择低温以平衡热量的生成和散逸，同时避免因为凝胶效应所引起的聚合反应的自加速。在本发明的一个实施方案中，低温用于聚合反应以避免聚合反应的自加速以及在聚合反应过程的一部分中控制不同直径的柱(包括大直径的柱)中的热量生成和散逸速率，而凝胶效应导致随后在聚合反应过程的另一个部分中有更高的温度。例如，在使用这一方法的一个聚合反应中，环境聚合温度用来在50mm直径和25cm长度的柱中制备多孔分离介质。
然而，在一些情况下在低温下聚合的缺点是刚性的缺乏。这可能是因为聚合物基质的交联度不是足够地高，这样多孔聚合物在溶剂中溶胀。这也是因为单体在低温下的转化率不是足够地高，导致在基质中分离-有效开孔的巨大尺寸。特大的孔隙会急剧降低聚合物基质的强度，使得多孔聚合物在中等或高压下或在中等或高流速下无法用于色谱分离。然而，在低温下的初始聚合反应之后提高聚合反应温度能够改进交联度和单体的转化率。在本发明中，在初始聚合反应之后提高聚合温度以改进交联度和单体转化率，以便改进多孔聚合物基质的刚性。高温固化过程用于改进多孔聚合物的刚性。在本发明的一个实施方案中，在环境聚合温度下的低温聚合之后，70℃用来固化该多孔聚合物。在本发明的另一个实施方案中，在40℃下的低温聚合之后，60℃用来固化该聚合物。
用于色谱分离的多孔聚合物基质的至关重要的性能是分离-有效开孔尺寸的分布的均匀性。低温和高温聚合的结合常常导致在基质中分离-有效开孔尺寸的不均匀分布，归因于由不同位置的不同聚合温度所产生的分离-有效开孔的尺寸的差异。多孔聚合物基质的分离-有效开孔的尺寸在一定程度的单体转化和一定程度的交联之后没有因为足以影响多孔聚合物的色谱性能的更高温度而变化。在达到这一点之后聚合反应温度的进一步提高不会改变足以影响到多孔聚合物的色谱性能的分离-有效开孔的尺寸分布，而是通过提高单体的转化率和交联度来改进聚合物基质的刚性。
在本发明中，聚合反应的温度和时间被优化以便实现高度的单体转化和交联，和以便平衡聚合反应的热量生成和热量散逸速率，从而实现对于色谱分离而言足够好的分离-有效开孔的均匀尺寸分布。聚合温度进一步提高以改进单体转化率和交联度。聚合温度和聚合反应时间的各个步骤的程序用于制备供色谱应用和需要均匀的分离-有效开孔尺寸分布的其它应用的多孔分离介质。例如，在本发明的一个实施方案中，在所需的聚合反应时间长度下聚合反应温度从环境温度到70℃的优化的、程序控制的分步骤提高可用于制备具有良好色谱性能的多孔聚合物基质。
对于一些聚合反应，在安全点聚合温度和时间的程序控制分步骤提高可以提供良好的分离介质，但对于其它聚合反应，这也许不是足够好的。另一种程序可用于改进在此类情况下的填料。同时，该另一种程序能够减少为了实现所需转化率和交联度的聚合反应时间。该另一种程序可用于这样的情形，其中所需的交联度和转化率也许不能实现，归因于太低的聚合温度，而该聚合温度是为了平衡热量生成和热量散逸速率和/或避免聚合反应在第一个程序中的自加速所需要的。
在低温聚合下在一定量的单体转化之后，该另一种程序采用聚合反应温度的缓慢线性提高。该另一种程序可以提高聚合反应速率，缩短聚合反应时间，提高从单体到聚合物的转化率，同时在聚合反应过程中维持热量生成和热量散逸的平衡。在这种情形下在提高的温度下的热量产生不会更快，归因于在一定量的单体转化之后在聚合反应过程中单体浓度的下降。由于单体的浓度降低，聚合反应的自加速也不会发生。在本发明中，聚合温度的线性梯度被优化以便与低温聚合和高温固化过程相结合，实现用于色谱分离的多孔聚合物的分离-有效开孔尺寸的最优分布。
在本发明的一个实施方案中，从环境温度到70℃的聚合温度的线性梯度用于制备具有良好色谱性能的多孔聚合物。在本发明的另一个实施方案中，从40℃到60℃的聚合温度的线性梯度连同在40℃下的初始聚合反应和在60℃下的固化可用来制备具有良好色谱分离性能的分离介质。
聚合温度的程序控制分步骤、多步骤或线性提高不仅适用于大直径的柱，而且非常适用于小直径柱的制备中，以改进介质的色谱性能。已经发现，这一方法能够用于从小直径柱到大直径柱的色谱柱按比例增大的制备。在本发明的一个实施方案中，完全相同的温度程序用于制备具有4.6mm和34mm的直径的柱，以实现分离介质的相同色谱性能。在本发明的另一个实施方案中，程序控制的温度被改进以制备具有34mm直径的柱。
在图18中显示了图解352，具有时间的横坐标，温度的左侧轴纵坐标和聚合反应完成百分比的右轴纵坐标，有两条实线曲线354和356以及两条虚线曲线364和366。该曲线354是显示温度的曲线和该曲线364是显示了在柱表面上在低的恒温(维持聚合反应混合物中的温度低于自维持温度)下对于不同量的聚合反应所消逝的时间而言的完成百分比。聚合反应快速地提升，然后稳定在太低的聚合反应的值。低温会导致劲度的缺乏和不均匀的聚合物。劲度的缺乏是低温的结果，一旦凝胶效应变得明显，低温将交联降低到低值并将分离-有效开孔的尺寸提高到不希望有的尺寸。一般，在柱的中心和表面之间有几个摄氏度的温度提高，导致得到不均匀的聚合物。曲线366说明了在控制-引发点358和安全点360之间以及对于聚合反应的温度梯度过程从安全点360到基本上完成点362之间的对于不同量的消逝时间而言的完成百分比，和曲线356显示了在相同点之间的在柱的表面上的温度变化。
在柱表面上的温度更缓慢地提高以及在控制-引发点358和安全点360之间的聚合速率慢慢地提高，并且不会导致聚合反应混合物的温度显著提高至安全点360。在控制-引发点358之前的温度较快速地提高到一个点，在该点下聚合反应被引发，和然后聚合反应非常缓慢地，因为有较少空间位阻和有丰富的单体进行反应。在安全点360，该空间位阻提高和单体的量减少，温度能够被提高以便引起更多交联，和驱使聚合反应完成。在柱的表面上的温度提高速率将随聚合反应混合物的组成和整体材料的所需特性而变化，但在控制-引发点和安全点之间一般低于5摄氏度/小时和在达到安全点之后一般大于15摄氏度/小时。
在图19中显示了具有中心纵轴374的柱372(有热敏电阻380足够接近它以测量它的温度)以及位于外表面378和中心纵轴中间的想象的同心柱376(有热敏电阻382足够接近它以便在柱中的这一四分之一处测量它的温度)的不完全的纵向剖视图。外表面的温度是通过任何加热或冷却设备加以控制的，但是在优选实施方案中该设备是水浴，其温度可以通过任何设备如热敏电阻384来测量。
横穿柱372的温度分布图370是按照在一种温度梯度聚合反应模式中表现出的那样来显示。在这一温度梯度聚合反应模式中，柱的外侧温度被维持在与柱中心处的温度相同的温度下，两温度可通过控制在柱的外表面上的温度而逐渐地提高。正如温度分布图370所说明，有一种温度，在该温度下该外侧温度是以缓慢速率提高以控制该反应速率达到一种水平(该水平维持放热的生成速率基本上与热散逸相同)以及该外部温度随着在外侧表面上的增长速率(与在中心处的增长速率相等)而缓慢地提高，在该同心圆柱体上有一个低点。该低点应该维持在外部温度的2.5度之内和优选在1度之内，以获得均匀性。考虑到在控制-引发点和安全点之间在柱中的放热，温度的逐渐提高在部分地补偿凝胶效应和希望维持良好聚合速率以获得均匀的聚合物，减少聚合反应所需的时间。
图21是在温度-时间调节的柱中具有下列色谱条件的分离色谱图(a)样品(1)核糖核酸酶A，(2)细胞色素C和(3)溶菌酶；(b)柱通过在40-60℃的梯度温度下在24小时中进行聚合反应和然后在60℃下进一步固化12小时所制备的WCX(250×35mm I.D.)；(c)流动相缓冲剂A10mM磷酸盐缓冲剂，pH＝7.6，缓冲剂B在缓冲剂A中1M NaCl，pH＝7.6，梯度在4CV中20-50％B，然后在0.8CV中50-100％B；流速50ml/分钟。
在本说明书中描述的可渗透的聚合物可以具有一种以上的合适构型。一种构型具有为一些目标应用所需要的分离-有效开孔尺寸分布。通常，它包括为分离提供高表面积的在至少一个方向上低于300nm的小的分离-有效开孔，和供大部分的流动相通过的几乎没有或没有提供分离作用的大的不规则开孔(如大于500nm)。优选，分离-有效开孔的尺寸是50-200纳米和更大的不规则开孔对于中等压力和低压分离而言是2-5微米和对于高压分离而言是0.6-2微米。分离-有效开孔尺寸分布和不规则特征尺寸分布能够通过生孔剂、单体、引发剂的类型和量，以及聚合温度、时间和压力来控制。在一个实施方案中，该单体不仅选择具有所需的官能度，而且有助于通过改变聚合动力学和聚合物结构来改进柱效率，这导致更理想的分离-有效开孔尺寸分布。处于相同的目的而选择单体的比率。生孔剂的类型和量在仔细的研究之后为了产生所需的分离-有效开孔尺寸分布而选择。在聚合反应过程中压力的使用和选择对于所需的分离-有效开孔尺寸分布的产生和贯穿整个柱的分离-有效开孔尺寸分布的均匀性是特别重要的。它还防止在通常的密封或敞开的聚合反应中遇到的不规则空隙和壁通道的形成。
已经发现，微孔隙的形成能够通过在聚合反应过程中使用压力和通过其它聚合条件和试剂的小心调节来急剧减少或防止。从具有分离-有效开孔的这一聚合物的扫描电子显微镜(SEM)研究中已经发现，聚合物颗粒形态类似于一些形式的珊瑚。该珊瑚状聚合物是由互连的波纹状颗粒(它显然通过增生来生长)形成的。这些颗粒的内部是无孔的。表面是高度波纹状的和含有极大数量的小的开放浅槽(有各种尺寸的开口)。在这些聚合物当中的一种的SEM研究中，颗粒是有短的开孔深度的核-壳结构。在单个颗粒中没有通孔的这些不平常的波纹状聚合物结构和核-壳颗粒结构大大地改进了整体料的容量(与普通的无孔的分离介质相比)，同时避免了在颗粒或珠粒内部包含大量的微孔隙和中孔隙的常规大孔隙介质中的质量传递问题。这些结构与在文献中公开的具有通孔的所谓“灌流珠粒(Perfusion Beads)”或整体料明显不同。当内力倾向于溶胀或膨胀聚合物时，通过施加压力或通过保持体积抵抗膨胀来调理在一些柱中的颗粒聚集物将导致堆叠的一般平的或巢状的构型，而不是所聚集的基本上圆形的颗粒聚集物。
在本发明中的整体料兼顾了在无孔颗粒填料中的高分辨率和大孔隙填料的高容量的优点，同时避免它们的问题。这些波纹状颗粒可以利用增生作用从被单体和活性低聚物溶胀和包围并与其它聚合物核并合在一起的聚合物核生长。这些颗粒互相聚集并且通过交联来增强。通过防止样品分子捕获在微孔隙中和颗粒内部的孔隙中(根据理论模型，它们是区带扩展的主要原因之一)，这一结构大大地改进柱效率。颗粒、聚集物或簇的尺寸能够精细地调节得更均匀，并且分离-有效开孔尺寸分布能够通过压力的小心控制以及以上讨论的其它因素的选择来改进，以实现高分辨率分离。
在液相色谱法中更亲水性化合物的令人满意的分离常常要求起始流动相是100％水，没有有机溶剂。这一类型的分离不能利用以非常疏水性的纯苯乙烯/二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸酯和它们的含有C4，C8，C12和C18的衍生物为基础的反相介质实现到令人满意的程度。该聚合物在具有低的有机溶剂含量的含水流动相中收缩。该收缩导致在柱壁和聚合物介质之间的空隙空间，这在色谱中导致所谓的“壁通道化”。结果，样品和流动相绕过该介质并穿过壁通道而不是穿过该介质。样品没有保留或部分地保留，导致对于每一种纯样品有多个峰。
在一个实施方案中，通过首先让纯水或盐液体混合物通过介质使该介质最大程度地收缩，然后用活塞配件压缩该介质直至在壁和聚合物介质之间的空隙空间被密封为止，从而避免管壁效应。活塞由螺母配件(nut fitting)固定在合适的位置。配件示于图3和4中。壁空隙的收缩和密封能够通过首先减少柱的反压和然后提高柱的反压来检测。这一方法可以防止在分离过程中“壁通道化”的形成。在一个实施方案中，聚合物在纯水中收缩，然后用PEEK活塞配件压缩。在本发明的另一个实施方案中，聚合物在1mol/l NaCl液体混合物中收缩，然后用PEEK活塞配件压缩。
在高度极性的环境中，在聚合物表面上线性聚合物链以及C4，C8，C12，C18的链皱缩到表面上，导致在样品分子和介质表面之间的差相互作用。同样，该床非常微弱地被流动相润湿，归因于在介质和流动相的极性上的极端差异。在样品和固定相之间的质量传递和相互作用是非常差的，它导致低的柱效率和分辨率。通过提高聚合物基质的亲水性，同时维持为样品保留和分离所需的疏水性，可以减少这些问题和“壁通道化”问题。
聚合物基质在聚合物重复单元中含有亲水性官能团如羟基，酰胺，脲或亲水性结构部分。该聚合物可以被水润湿和溶胀，归因于聚合物基质的亲水性。聚合物介质的表面仍然含有高度疏水性的聚苯乙烯链，或C4，C8，C12和C18链，以便在反相色谱中有疏水性相互作用。聚合物在水中的收缩被减少或完全地防止，这也解决了壁通道化的问题。该亲水性能够通过含有亲水性结构部分的单体的直接共聚合反应，或通过聚合物的改性以引入亲水性结构部分来得到改进。
在本发明的一个实施方案中，亲水性甲基丙烯酸羟基乙基酯与苯乙烯和二乙烯基苯共聚合，以防止“壁通道化”和疏水性相互作用链在水中的皱缩。在本发明的一个实施方案中，硬脂基丙烯酰胺与甲基丙烯酸硬脂基酯和二甲基丙烯酸乙二醇酯共聚合。亲水性单体的添加也会减少在反相柱中的蛋白质变性。在一个优选的实施方案中，丙烯腈与苯乙烯和二乙烯基苯共聚合。随着亲水性单体的亲水性的增加，聚合物越来越多地溶胀。用含有亲水性结构部分的聚合物构成的反相分离介质在含水和不含水的液体混合物中都将溶胀。这会增大反相分离介质在含水流动相中的适用性。
原地聚合能够用于制备任何尺寸和形状的柱。在一个实施方案中，制备了具有75微米的内径的圆柱形的毛细管柱。在另一个实施方案中，制备具有4.6mm ID的柱。在另一个实施方案中，制备具有88mmID的柱。在另一个实施方案中，制备100微米-700微米的横截面的方形毛细管柱。在另一个实施方案中，制备具有3mm厚度和1cm内径的聚合物盘。在另一个实施方案中，制备具有1cm外径和4.6mm内径的环形(donut)整体料。在另一个实施方案中，制备具有100微米内径凹槽的微芯片柱。
疏水性相互作用色谱需要非常亲水性的分离介质兼有适度的疏水性。在具有较低疏水性碳链或聚合物链的基质的亲水性进一步提高之后，反相介质能够被转化为疏水性相互作用介质。
正相色谱需要亲水性介质，它的表面完全地被亲水性官能团覆盖。聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)中的环氧基的水解在现有技术中用于获得正相分离介质。通过含有亲水性官能团如羟基和酰胺的亲水性单体的原地直接聚合来制备正相分离介质。在一个实施方案中甲基丙烯酸羟基乙基酯与交联剂如EDMA共聚合，获得正相介质。在本发明的一个实施方案中，柱硬件是用玻璃纤维增强的聚丙烯圆筒。
根据现有技术制备的反相整体式介质具有极低的容量和在分离过程中被压缩。通过提高介质的交联密度，来提高液相色谱介质的载荷容量和介质的刚性。通过在聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)整体料中使用更高数量的交联剂如二乙烯基苯来提高交联密度。在本发明的一个实施方案中，100％的交联剂是二乙烯基苯(80％纯度，这是工业上可获得的最高纯度级别)。容量比现有技术中制备的整体料高六倍。在加压的聚合反应下制备的高容量整体料具有高分辨率以及高容量。在本发明的一个实施方案中，使用在全部单体中90％的二乙烯基苯(80％纯度)。在另一个实施方案中，使用在全部单体中80％的二乙烯基苯(80％纯度)。
改进介质的刚性和分辨率的另一个方法是提高柱中的总聚合物密度。通过提高在混合物中的总单体含量，来提高总聚合物含量。通过提高在聚合反应混合物中的总单体含量，柱的分辨率同样得到改进。分离-有效开孔尺寸和它的分布受到在聚合反应混合物中总单体浓度的高度影响。在本发明的一个实施方案中，46wt％的总单体用于改进介质的刚性和分辨率。
在现有技术中制备的整体式介质具有差的分辨率、低的分离速度、低的刚性和极低的容量。现有技术的整体式聚甲基丙烯酸酯型弱阴离子交换剂是通过聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)用净二乙基胺改性来制备的。它在水中广泛地溶胀，并且不能在高流速下使用。这一介质具有极低的刚性并且在大于6cm/分钟的流速下是不稳定的。在试验过程中柱的反压保持不断提高。提供了改进亲水性介质的刚性的两种方法。
首先，介质的刚性能够通过提高聚合物基质的交联密度来改进。在低交联密度下，有大量的非交联的线性聚合物链，这些链被水所溶剂化并且延伸到溶剂中。由于这一高度溶剂化，聚合物基质膨胀。在聚合物中聚合物基质的膨胀使得分离-有效开孔的尺寸和在互连颗粒之间的间隙空间都变窄。孔隙度也减少。这些导致高的反压。高度溶剂化的多孔聚合物具有柔软凝胶的特性。在压力下，柔软聚合物能够容易地被压缩和导致更高的压力。压力的提高将进一步压缩该介质和导致甚至更高的压力。压力提高和压缩的循环使得现有技术的整体料无法用于高速分离中。
在交联密度提高之后，可溶胀的线性聚合物链缩短和该溶胀减少。具有分离-有效开孔的聚合物变成更加刚性。具有分离-有效开孔的结构维持在含水溶剂中。高孔隙度和更大的分离-有效开孔尺寸能够用高度交联的聚合物基质获得，它允许使用更高的流速但没有该压缩和压力提高的有害循环。通过使用高流速能够实现高速度分离。
在本发明的一个实施方案中，离子交换剂的交联密度通过使用70％交联剂，二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，来大大地改进。在优选的实施方案中，EDMA的量是50％。在另一个优选实施方案，EDMA的量是60％。EDMA比它的包含离子交换基团的共聚物是更疏水性的。通过提高EDMA的量，聚合物基质的亲水性降低。这导致溶胀的减少和改进刚性。当在水相中聚合物的高刚性是高度希望的时，这是使用更加疏水性交联剂而不是亲水性交联剂的附加优点。
其次，聚合物分离介质的刚性和柱效率同时通过在本发明中的受控改性来改进。甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)在被改性含有离子交换官能团之前是疏水性的。在现有技术的整体式弱阴离子交换剂(WAX)中的GMA通过与净二乙基胺在60℃下反应3小时来改性。净二乙基胺能够溶胀聚合物和扩散到聚合物颗粒中以接近GMA环氧基团。这一改性反应不仅改性了在聚合物的分离-有效开孔表面上的GMA结构部分而且改性了在聚合物基质内部的那些。在改性之后，含有离子交换官能团的亲水性结构部分与在分离-有效开孔内部和外部的疏水性骨架互相掺混。这一非选择性的改性使得整个聚合物基质在水中广泛地溶胀，同时一些疏水性骨架在分离-有效开孔的表面上暴露。在分离开孔的表面上的疏水性碎片能够在离子交换色谱分离过程中导致次级疏水性相互作用，这会导致区带变宽。
在聚合物颗粒的表面上GMA的受控改性能够使得颗粒的内部部分更具疏水性和在水中更低的溶胀。在表面GMA的改性之后，颗粒的表面变得更加亲水性和吸引水分子。那些更具疏水性的骨架退缩到聚合物颗粒的内部部分中与颗粒的更疏水性核相伴，并且在色谱分离过程中摆脱非常极性的缓冲剂环境。这会提高表面被亲水性离子交换基团的覆盖并且防止从次级疏水性相互作用引起的区带变宽。受控的表面改性是通过在较低温度下在含水的液体混合物中的催化改性反应来实现的。该催化剂优选是酸或能够原地产生质子的试剂。
在本发明的优选实施方案中，二烷基胺盐酸盐用作催化剂。该盐液体混合物是非常极性的并且具有低的溶胀疏水性聚合物的倾向。该离子性催化剂倾向于滞留在液体混合物中，而不是扩散进入到非常疏水性的内部基质中。较低的反应温度减少聚合物的可溶胀性。二乙基胺可能扩散进入到聚合物基质中，但是，二乙基胺与GMA在低温下的反应是非常缓慢的和不重要的。在本发明的一个实施方案中，二烷基胺盐酸盐催化剂是二乙基胺盐酸盐。在本发明的另一个实施方案中，该催化剂是三甲基胺盐酸盐。在本发明的一个实施方案中，反应温度是25℃。在本发明的另一个实施方案中，改性温度是30℃。
用于合成整体式弱阳离子交换剂的现有技术方法是以膜、珠粒和凝胶为基础的并且它们中的任何一种都不能直接用于整体柱的原地制造过程中。下面描述制备弱阳离子交换剂的七种方法。在这些方法中的全部改性反应是通过在选择的温度下将改性液体混合物连续地泵送通过该柱来进行的，或在试剂被泵入该柱中之后试剂被密封在柱内部并且在加热浴或烘箱中加热。
第一种方法是聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)(PGMAEDMA)用氯乙酸盐的两步骤改性。在文献中氯乙酸钠已经用于改性甲基丙烯酸羟基乙基酯型材料以获得羧酸基团。为了利用以上反应来改性整体料，在GMA中的环氧环首先通过使用1M H2SO4含水液体混合物进行水解来打开，从而获得羟基。在第二步骤中，氯乙酸盐与聚合物中的羟基偶联，使得羧基连接于聚合物上。这一反应由强碱如氢氧化钠来催化。反应温度是40-80℃，优选50-70℃。反应时间是1-24小时，优选低于六小时。在本发明的一个实施方案中，通过将5M氢氧化钠含水液体混合物泵送通过该整体柱在60℃下进行改性反应2小时。这一介质的容量不是理想的，虽然柱效率是良好的。该容量能够通过更长的反应和更高的反应温度来提高。然而，由于在聚合物中酯的水解副反应，分离介质变柔软。因为交联剂EDMA同样水解，交联密度降低。
第二种方法是采用乙醇酸作为试剂，一步法改性在聚合物中的GMA而获得羧基官能团。乙醇酸与PGMEDMA在40℃到90℃的温度下反应1-24小时。这一反应是自催化的反应，因为乙醇酸本身是催化剂。反应能够由其它更强的酸如三氟乙酸(TFA)来催化。反应是简单的，但是弱阳离子交换剂的容量是低的，归因于平行的副反应。环氧环能够由作为副反应的水解反应所打开。为了防止这一反应，使用不含水的溶剂。优选，使用含有质子的溶剂。在本发明的一个实施方案中，在包含TFA催化剂的甲酸中的乙醇酸液体混合物在80℃下被泵送通过该柱达3小时。
第三种方法是PGMEDMA采用乙醇酸和氯乙酸盐的双改性。双改性反应有几个优点。首先，它们全部能够在含水液体混合物中进行。其次，两个反应步骤都得到希望的产物。第三，在第一步骤中的副反应形成了为第二步骤改性所需的官能团。第四，双改性反应的条件能够比单一反应更温和而获得相同的或更高的容量，同时避免骨架(它维持基质的刚性)的水解。在本发明的一个实施方案中，第一个反应是在含有TFA作为催化剂的乙醇酸含水液体混合物中进行和第二个反应是氯乙酸盐利用NaOH含水液体混合物所进行的取代反应。
第四种方法是乙醇酸和氯乙酸盐的一釜式(one-pot)反应。代替双后续反应，两试剂在反应过程中一起被投入到液体混合物中。与乙醇酸的反应是碱催化的而不是酸催化的。这一方法具有第三种方法的优点，但是具有更低的容量，归因于在水中由乙醇酸实施的碱催化开环反应的较低反应性。
第五种方法是丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的水解反应。酯基的水解得到羧基官能团。PGMEDMA膜或珠粒的直接水解是现有技术中已知的。然而，所得介质不具有良好的容量或分离作用。在我们的工作中发现，分辨率和容量两者能够通过混杂亲水性和疏水性丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯来显著改进。水解反应是更有效的，因为水分子能够扩散进入到颗粒表面并更好地润湿该表面，归因于丙烯酸酯的亲水性结构部分。反应能够由酸和碱两者催化，如TFA或NaOH含水液体混合物。在本发明的一个实施方案中，制备聚(甲基丙烯酸甲酯-共-甲基丙烯酸羟基乙基酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)和水解它以获得弱阳离子交换剂。在本发明的另一个实施方案中，聚(甲基丙烯酸羟基乙基酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)被水解。在本发明的另一个实施方案中，PGMEDMA首先被酸水解和然后在第二步骤中由碱水解。在这一方法中获得的弱阳离子交换剂是比较软的，归因于骨架交联剂的水解。
第六种方法是丙烯酸或甲基丙烯酸的直接共聚合反应。在一个步骤中酸的直接共聚合反应得到弱阳离子交换剂。这一方法大大地简化该制备方法。弱阳离子交换剂的容量比改性方法更高，但仍然不理想。酸性单体与交联用单体的比率是2％到30％，优选5％到15％。由于有更高含量的酸单体，容量是更高的但介质是更软的。该直接聚合方法适用于整体膜、柱、芯片、管或在现有技术中已知的任何形式的制备。
第七种方法是直接共聚合和受控改性的结合。在本发明中已发现，这一结合导致高的容量，同时维持介质的刚性。所得介质能够用于使用高流速的高通量分离。由丙烯酸或甲基丙烯酸的直接聚合所实现的改进容量达到了极限值，归因于含有高含量的酸的介质的柔软性。该酸性单体无规地聚合和分散在整个这些基质中。这些酸在缓冲剂中转化成盐并导致介质在含水的流动相中广泛地溶胀。同时，疏水性骨架由碳链组成和酯在表面上暴露，从而导致在离子交换色谱分离过程中的次级疏水性相互作用。这导致区带变宽和拖尾。疏水性表面能够进一步改性以便变成亲水性，同时改进容量。控制的改性可以改进介质的容量和亲水性，同时防止介质的软化。过度改性的介质导致除了在表面上的改性之外还有在颗粒内部的改性。正如在弱阴离子交换剂的制备中所讨论的，在颗粒内部的改性会导致高度的溶胀(封锁分离-有效开孔)或形态的变化(导致压力提高和压缩的有害循环)。在本发明的一个实施方案中，弱阳离子交换剂是通过在第一步骤中丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯(MMA)和EDMA的共聚合反应，和在第二步骤中甲基丙烯酸甲酯的水解来制备的。MMA的水解是碱催化的并且因为非常亲水性的丙烯酸盐的存在而加速，丙烯酸盐是在丙烯酸与NaOH反应之后该丙烯酸的转化产物。
将直接聚合和改性相结合的这一方法适用于全部亲水性聚合物载体的制备，该载体同时需要高数量的官能团和该基质的刚性。它适用于制备整体单块管或柱，整体单块膜，整体单块毛细管和芯片或不同形式的任何其它整体料，以及聚合物颗粒，凝胶，膜或任何其它类型的聚合物分离介质。尤其，整体单块膜的分辨率和容量能够用这一方法来改进。该改进能够通过原地方法或通过离线方法来实现。由直接聚合获得的整体料或珠粒能够通过将反应液体混合物泵送通过填充柱或膜，或通过将它们浸入到改性液体混合物中来改性。该珠粒能够悬浮于该改性液体混合物中。通过使用这一方法，可以开发大容量的强阴离子交换剂(SAX)和强阳离子交换剂(SCX)。
制造整体单块强阴离子交换剂的现有技术方法是以膜、珠粒和凝胶为基础的，不适用于整体式强阴离子交换柱的制造。下面提供了原地制备整体式强阴离子交换柱的三种方法。
方法一是高度刚性聚合物和表面的受控改性的结合。PGMEDMA用三甲基胺盐酸盐的改性已经用于获得膜和珠粒型强阴离子交换剂。当反应用于整体式强阴离子交换剂的制备时，所得介质是柔软的和不能用于高速分离。如在本发明中制备整体式弱阴离子交换剂那样，该刚性以两种方式进行改性高交联密度和受控的改性反应。
用于SAX的基础聚合物通过使用更高的交联用单体与官能化单体的比率来进行配制，以便含有高的交联密度。交联剂的量提高到高于聚合物中全部单体的50％。在本发明的一个实施方案中，使用全部单体中60％的EDMA。该生孔剂和它们的比率经过选择，以便在较低压力下提供最佳的分辨率。
受控的改性是通过PGMEDMA的催化胺化作用来实现的。催化剂能够是现有技术中已知的任何碱。在本发明的一个实施方案中，三甲基胺用作催化剂。催化剂的量是液体混合物的1％-50％(体积)，优选10％和30％(体积)。反应温度是10℃到60℃，优选20℃-50℃。反应时间是10分钟-24小时，优选1-4小时。所选择的催化反应相比颗粒的内部更多地改性该颗粒的表面，导致该介质能够在高流速下使用。在本发明的一个实施方案中，反应是在40℃下进行3小时。
方法二是含有季胺的单体或它们的能够原地产生季胺的中间体的直接共聚合。在本发明的一个实施方案中，含有季胺的官能化单体是2-(丙烯酰氧基乙基]三甲基铵甲基硫酸盐(ATMS)。聚合物具有高交联密度。交联用单体在全部单体中的比率是50％-70％。在本发明的一个实施方案中，使用60％的EDMA。ATMS的量是2％-20％，优选5％-15％。构成该单体的剩余部分的第三单体优选是亲水性单体如HEMA，虽然疏水性单体同样能够使用。
方法三是在方法二和一中显示的直接聚合和受控的表面改性的结合。由方法一获得的强阴离子交换剂是刚性的和具有高分辨率。然而，它具有非理想的容量。方法二改进该容量但不充分，且有较低的分辨率。直接聚合和受控的表面改性的结合使得容量翻一倍并且改进分辨率和回收率。蛋白质的回收率得到改进，因为表面完全被亲水性蛋白质良性基团覆盖。次级疏水性相互作用(它是较低蛋白质回收率的主要原因)减到最少。生孔剂进行研究和选择以提供所需的流速。在本发明的一个优选的实施方案中，丁二醇、丙醇和水的结合物用作生孔剂。聚合反应混合物和条件经过配方设计可以在所需流速下提供最佳的分辨率。
制备整体式强阳离子交换剂的现有技术方案是以膜、珠粒和凝胶为基础的，并且无法过渡到整体式强阳离子交换柱的原地制造中。下面提供了原地制备整体式强阳离子交换柱的三种方法。
方法一是通过可溶于有机溶剂中的强碱催化，用丁烷磺内酯或丙烷磺内酯改性PGMEDMA。通过使用NaOH液体混合物作为催化剂，PGMEDMA用丙烷磺内酯的改性已经用于制备膜或珠粒型强阳离子交换剂。反应是两相反应，因为丙烷磺内酯不溶于NaOH含水液体混合物中。两相反应混合物不能被泵送通过该柱来进行该改性。几个途径已经用来进行改性反应。
途径一是两步骤改性反应，其由在第一步骤中介质用强碱如叔丁醇钾活化和随后用丁烷磺内酯进行亲核开环反应所组成。丁烷磺内酯是优选的，因为在室温下它是液体和丙烷磺内酯是固体。叔丁醇钾是优选的，因为它比它的钠对应物具有更高的溶解度。溶剂是试剂的良溶剂如二甲基砜(DMSO)。改性液体混合物必须是均匀的，以便被泵送通过供原地改性用的柱。途径二是由活化和改性两个步骤组成的一釜式反应。强碱和丁烷磺内酯两者可溶于强溶剂中。液体混合物被泵送连续通过该柱或在选择的温度下密封几个小时。反应温度优选是80和120℃。在本发明的一个实施方案中，使用90℃。在本发明的另一个实施方案中，使用120℃。
方法二是含有强阳离子交换基团的单体的直接聚合。在本发明的优选实施方案中，2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)用作含有磺基的官能化单体。AMPS的量是2％到20％，优选5％到15％。与第一种方法相比，这一聚合物的容量大大地改进。聚合反应混合物经过配制可以在所需流速下提供最佳的分辨率。
方法三是直接聚合和受控改性的结合。在本发明的一个实施方案中，AMPS与GMA和EDMA共聚合。聚合物通过在方法1中所述的受控改性来进一步改性。与方法1和2相比，容量和分辨率两者都大大地改进。EDMA的量优选是50％到70％。AMPS的量优选是2％到15％。剩余的单体是GMA。在本发明的另一个实施方案中，AMPS与HEMA和EDMA共聚合。生孔剂进行研究和选择以提供所需的流速。聚合反应混合物和条件经过改进可以提供高分辨率和高速色谱分析。
已发现含羟基的聚合物基质经受控改性而含有为SCX所需的磺基通过使用下面的方法非常有效。在这一方法的一个实施方案中，在共聚物基质中的甲基丙烯酸缩水甘油酯被水解以含有两个羟基。这些羟基进一步用氯磺酸改性。在这一方法的另一个版本中，该改性是用氯磺酸的吡啶盐液体混合物进行的。第一种方法示于图20的反应式1和2中，和这一方法的第二版本示于图20的反应式3中。
由原地聚合法制备供有效色谱分离用的大直径整体柱是非常困难的任务，归因于由放热的聚合反应所形成的聚合物的热隔离效应。已发现，热传递是足够快速的以防止聚合反应温度的非均匀性，只要在整体料的中心与该整体料的表面之间的最短距离(本文中定义为半径)是低于8mm，这取决于柱硬件的材料。
减少聚合反应热问题的制备大直径的整体柱的一种技术是使用多阶段的聚合反应。在这一技术中，在聚合反应的各阶段中所得聚合物整体料具有至多8mm的半径，如果聚合反应的模具是由传热良好的材料制成的话。这通过首先制备具有低于8mm的半径的柱和然后使用它们作为第二阶段聚合反应的填料来实现的，其中在填料和柱壁之间的聚合反应液体混合物的半径也低于8mm，和在填料之间的距离低于2mm。在这一研究中发现，在填料之间聚合反应液体混合物的厚度低于2mm对于聚合反应温度的变化有不明显的影响。多个细的聚合物柱被填充到大直径的柱中，然后填充第二阶段聚合反应混合物。该柱用普通的配件密封，以便允许在聚合反应过程中加压。然后将大直径柱放入到温度受控的加热浴或烘箱中以进行第二阶段聚合反应。通过以上对于加压或未加压的聚合反应所公开的方法来制备细柱。在第一阶段聚合反应中制备的细的整体柱优选在没有洗涤和进一步改性的情况下保存。第二阶段聚合反应的聚合反应混合物与第一阶段聚合反应的聚合反应混合物相同或不同，这取决于介质的类型。
在这一方法中，具有低于8mm的半径的细柱能够是固体棒，圆盘，中空管(圆柱体壁的厚度低于8mm)，或膜。上述细柱的形状能够是现有技术中已知的任何形状，如圆形，矩形，三角形，等等。可以想到，该填料能够是在本说明书的关于填料的节段中描述的其它颗粒。
在本发明的一个实施方案中，使用具有5mm半径的多个细柱。在本发明的一个优选的实施方案中，具有50mm×10mm I.D.的尺寸的整体式聚合物棒条用作填料。在本发明的另一个优选实施方案中，具有10mm×34mm I.D.的尺寸的整体式聚合物棒条用作填料。在本发明的另一个优选实施方案中，具有各种内径和外径的整体式聚合物圆柱体用作填料。
制备大直径的柱的另一个技术是使用先前描述过的温度-时间调节。在使用这一技术时，已经制备了弱阳离子柱和强阴离子柱，并且从这些结果可以理解，其它类型的柱能够同样用温度-时间调节来制备。制造弱阳离子柱的一种方法包括以下步骤将包含1份GMA和4-6份的MMA和10-14份的EDMA和引发剂的聚合反应混合物加入到容器中，然后温和地摇振混合物，直到混合物变成均匀液体混合物为止。然后将生孔剂添加到该均匀液体混合物中并摇振它，直至新混合物是均匀的为止，从而形成聚合反应液体混合物。聚合反应液体混合物通常在此时被脱气，并用该聚合反应液体混合物填充柱。当然该液体混合物能够最初通过使用该柱作为用于混合该聚合物混合物的容器或容器的一部分来制备。聚合反应液体混合物在温度-时间调节条件下在柱中进行聚合反应以形成填料，该填料然后被洗涤以除去生孔剂。
对于一些类型的柱，该柱优选包括进一步对聚合反应液体混合物施加压力的设备。在这些实施方案中，在该柱被密封和聚合反应被引发之后，按照先前描述的那样将压力施加于聚合反应混合物。在一个实施方案中，该聚合反应混合物在从控制-引发点(具有35-45℃的数值)起始的梯度温度下聚合和在12小时内逐渐提高到安全点，然后在55-65℃的温度下固化24小时。在另一个实施方案中，该聚合反应混合物在35℃到45℃的温度下聚合72小时，然后在55℃到65℃的温度下固化24小时。
类似地，通过将包含2-4份的GMA和2-4份的ATMS和7-11份的EDMA和引发剂的聚合反应混合物加入到容器中，温和地摇振混合物直到混合物变成均匀液体混合物为止，将生孔剂称重加入到均匀液体混合物中并摇振它直到新混合物是均匀的以形成聚合反应液体混合物，将液体混合物脱气，用该聚合反应液体混合物填充柱，然后在柱中在温度-时间调节条件下聚合该聚合反应液体混合物以形成填料，来制备强阴离子柱。该填料然后可以被洗涤以除去生孔剂。
与在弱阳离子交换剂的制备中一样，该柱可以包括对聚合反应液体混合物施加压力的设备，进一步包括密封该柱和对聚合反应混合物施加压力的步骤。在一个实施方案中，该聚合反应混合物在从控制-引发点(具有35-45℃的数值)起始的梯度温度下聚合和在12小时内逐渐提高到55-65℃的安全点，然后在55-65℃的温度下固化24小时。在另一个实施方案中，该聚合反应混合物在35℃到45℃的温度下聚合72小时，然后在55℃到65℃的温度下固化24小时。
毛细管柱的特性也能够通过以上描述的程序来改进。一种方法是选择生孔性溶剂的适宜结合物，以便在有和没有压力的情况下产生分离介质。选择具有适宜极性和对聚合物有适宜溶剂化能力的溶剂能够导致得到没有微孔隙或小孔隙(能够影响该柱的分离效率)的多孔聚合物载体。在聚合反应过程中压力的施加将进一步改进该介质的均匀性和避免微孔隙的形成。在一个实施方案中，用包括氯代环己烷和1-癸醇的溶剂结合物在有和没有120psi压力的情况下制备内径320微米的毛细管柱，从而产生不包含微孔隙或小孔隙(导致样品分子的差的质量传递)的整体式多孔聚合物载体。在另一个实施方案中，包括1-乙基己酸和矿物油的溶剂结合物已经用于在有和没有压力的情况下制备不包含微孔隙的整体式多孔材料。
X-射线、UV-vis的使用能够大大地改进毛细管的特性。X-射线能够以低能量和以低强度损失穿透材料。X-射线能够在几乎没有强度损失的情况下穿透毛细管。增感剂或闪烁剂能够吸收由溶剂有效地传递的X-射线能量并在该液体混合物中均匀地发射出荧光或磷光。均匀的荧光和磷光能够被引发剂吸收，引发剂然后在聚合反应液体混合物中均匀地引发聚合反应。这导致了包括整体式分离介质和颗粒的多孔聚合物载体的多孔结构的均匀性。这大大地改进了整体式毛细管的柱效率。使用X-射线作为能源的低温聚合导致缓慢的聚合速率，这归因于较低的聚合温度。精细调节X-射线的强度和能量导致所希望的聚合速率，从而导致均匀的分离介质的形成。在聚合反应过程中使用X-射线、闪烁剂/增感剂、具有合适溶剂化能力的溶剂和压力能够导致没有微孔隙或小孔隙(具有与样品分子类似的尺寸)的分离介质的形成，从而导致大大地改进的特性。在一个实施方案中，毛细管柱通过使用X-射线作为能源来制备。在另一个实施方案中，微芯片柱通过用X-射线作为能源来制备。
适宜地选择反射指数非常接近于聚合物的反射指数的那些溶剂可以使得在很小的光强度损失下让光穿过毛细管，这已知为克里斯欣森效应并且前面描述过。具有消感应吸收作用的引发剂的使用允许UV-vis光穿过毛细管柱，有可以忽略的强度损失。光在聚合反应液体混合物中是均匀的。均匀的光的吸收导致聚合反应的均匀引发，这不同于在不考虑克里斯欣森效应和消感应吸收作用的情况下由加热所促进的引发或UV-vis引发的聚合反应。这会导致在液体混合物中均匀聚合反应的形成。结果，能够形成更均匀的多孔结构。这导致毛细管柱的更加改进的特性。将以上方法与具有良好溶剂化能力的溶剂相结合，加压的聚合反应能够导致不包含微孔隙或小孔隙的均匀介质的形成，对柱性能没有影响。在一个实施方案中，毛细管柱通过使用UV-可见光来制备。在另一个实施方案中，微芯片柱通过使用UV-vis光来制备。
实施例下列非限制性实施例用于举例说明本发明，但在下列实施例中各变量的许多其它值能够根据对于可预测的结果的叙述来选择概况通常，在下列实施例中每一类型的介质的制备包括三个主要步骤，它们是(1)聚合物基质的制备；(2)聚合物基质的改性以含有所需的官能团；和(3)介质的表征。
首先，制备的主要步骤包括几个子步骤，它们是(1a)通过改变单体、生孔剂和引发剂的类型和量对聚合反应混合物进行配制；(1b)由真空和氦气吹扫将聚合反应混合物脱气；(1c)具有不同直径和管材的空柱的组装件作为模具，常常该柱的一端用盖子或塞子密封；(1d)用聚合反应混合物填充该柱；(1e)用盖子或特别设计的配件密封该模具的另一端，以便在聚合反应过程中增加压力；(1f)在具有一个开放端的模具中预热该液体混合物(如果使用玻璃柱的话)和使用包括液压、空气压力或机械压力在内的各种压力源施加所选择的压力；(1g)将模具放置于处在所选择温度下的温度受控的加热浴或烘箱中；(1h)聚合持续各种长度的时间；(1i)在聚合之后从加热浴中取出该柱并用柱配件替代该密封盖或加压设备，以便让洗涤液泵送通过；和(1j)用有机溶剂和/或水洗涤该柱。
其次，该改性方法包括(2a)用各种类型和量的反应物和催化剂配制改性反应混合物；(2b)将大于5个柱床体积的改性液体混合物泵送通过该柱并密封它，或连续地泵送更多的液体混合物；(2c)在温度受控的加热浴中在各种温度和时间下进行该改性反应；和(2d)用有机溶剂和水洗涤该柱。
该柱通过使用各种方法来表征，其中包括液相色谱分离、孔隙度测定法、BET表面积测量、扫描电子显微镜法、紫外光谱和目视观察。液相色谱法表征包括在不同速度下的各种模式的分离。通常使用的设备、工艺和方法已描述在特定实施例之前的下文中。
聚合反应液体混合物的脱气聚合反应混合物通过使用超声波脱气器，利用由水吸气器产生的真空进行脱气5分钟。在此之后吹扫该液体混合物至少20分钟。
稳定化和调理方法在改性反应之后的洗涤步骤之后，离子交换柱进行稳定化和调理程序。强阴离子交换剂的玻璃柱(100×10mm I.D.)的稳定化和调理程序是如下处于pH 7.6的0.01mol/l Tris.HCl缓冲剂的流速在1分钟中从0ml/分钟到20ml/分钟线性地提高，然后保持0.5分钟。该压缩液体在2分钟中利用梯度改变为在同一缓冲剂中的1mol/l NaCl，然后保持0.5分钟。有PEEK内衬层的不锈钢柱的稳定化和调理程序与以上的相同，只是最高流速是5ml/分钟而不是20ml/分钟。其它离子交换柱的程序取决于所允许的最高流速。
表征程序1.用液相色谱法(LC)分离的表征1a.LC表征方法1蛋白质和肽的液相色谱法分离流动相流动相A(或缓冲剂A)阴离子交换色谱法0.01M Tris.HCl(pH 7.6)阳离子交换色谱法0.01M磷酸钠(pH 7.0)反相色谱法在水中0.15％三氟乙酸(TFA)流动相B(或缓冲剂B)离子交换色谱法在缓冲剂A中1M NaCl反相色谱法在乙腈(ACN)色谱法中0.15％ TFA，样品阴离子交换色谱法0.6mg/ml肌红蛋白，1mg/ml伴清蛋白，1mg/ml卵清蛋白和1mg/ml胰蛋白酶抑制剂。
阳离子交换色谱法1mg/ml伴清蛋白，1mg/ml卵清蛋白和1mg/ml胰蛋白酶抑制剂。
蛋白质的反相色谱法1.5mg/ml核糖核酸酶A，0.5mg/ml细胞色素C，1.5mg/ml BSA，0.9mg/ml碳酸酐酶，1.5mg/ml卵清蛋白。
肽的反相色谱法33g/ml Met-脑菲肽，Let-脑菲肽，血管紧张肽II，泡蛙肽，P物质样品制备将8ml的缓冲剂A填充在15ml有刻度的塑料样品管中；称重合适量的蛋白质样品并将其加入到这一样品管中；用盖子密封该管并温和地翻转该管直至全部蛋白质溶解为止；添加更多的缓冲剂液体混合物直至达到了在样品管上10ml刻度为止。
柱通过根据以下程序的蛋白质分离来表征该柱与Isco 2350双泵送系统连接。泵A含有0.01mol/l Tris.HCl缓冲剂(缓冲剂A)和泵B含有在缓冲剂A中的1mol/l NaCl(缓冲剂B)。在使用之前流动相用氦气吹扫脱气20分钟以上。该UV检测器设定在0.05灵敏度和对于蛋白质分离设定在280nm波长(对于肽分离设定在214nm)。样品注入的体积是20微升。该柱首先利用20个柱床体积的缓冲剂B进行清洗和然后利用15个柱床体积的缓冲剂A对于4.6mm I.D.柱在3ml/分钟下(对于10mm I.D.柱在10ml/分钟下)调理。该分离是以20个柱床体积利用从0％到50％缓冲剂B的梯度，对于4.6mm I.D.柱在3ml/分钟的流速下和对于10mm I.D.柱在10ml/分钟的流速下来实现的。
1b.LC表征方法2离子交换剂的结合容量测量离子交换柱的结合容量是通过前沿分析来测量的。该柱用20个柱床体积的缓冲剂B清洗，然后用15个柱床体积的缓冲剂A调理。通过将在缓冲剂A中的5mg/ml浓度BSA或溶菌酶液体混合物(对于阴离子交换剂和反相色谱使用BSA，和对于阳离子交换剂使用溶菌酶)泵送通过该柱，直至洗脱剂的吸收没有进一步增加为止，随后用100％缓冲剂A清洗未吸附的蛋白质，从而使得该柱用样品蛋白质饱和。结合于柱上的蛋白质利用从0％到50％缓冲剂B的梯度被洗脱20个柱床体积。洗脱的蛋白质被收集在样品管形瓶中以及蛋白质浓度由UV分光光度计在280nm下测定。该柱的总结合容量是通过将所收集的蛋白质的浓度乘以收集体积来计算的。
1c.LC表征方法3疏水性相互作用色谱该柱针对蛋白质的疏水性相互作用色谱来表征。含有核糖核酸酶、细胞色素C、溶菌酶、牛血清白蛋白和碳酸酐酶(在0.01M Tris.HCl缓冲剂液体混合物中1，0.3，0.2，1和0.5mg/ml，pH 7.0)的蛋白质混合物利用在0.01mol/l Tris.HCl缓冲剂(pH 7.6)中的0.5mol/lNaCl到同一缓冲剂的15分钟梯度在1ml/分钟的流速下进行分离。
1d.LC表征方法4通过沉淀-再溶色谱法的聚合物分子量测定表征方法6用于使用沉淀/再溶色谱法的聚合物分子量测定。七个聚合物标准物(Mp12,900；20,650；34,500；50,400；96,000；214,500；982,000)利用在甲醇中的从15％到80％THF的6分钟梯度在2.6ml/分钟的流速下进行分离。将聚合物标准物以56mg/ml的总浓度溶于50％THF(甲醇中)溶液中。注入体积是20FI。
1e.核苷酸的LC分离Pd(A)12-18的样品(在水中2.4mg/ml)利用在缓冲剂A中的从30％到60％缓冲剂B的梯度(A＝20％乙腈和80％20mmol/l磷酸钠；B＝在A中1mol/l NaCl)在1ml/分钟的流速下进行分离。
1f.核苷酸用阴离子交换剂的LC分离AMP、ADP和ATP的样品(在水中分别0.4，0.8，0.8mg/ml)按照在LC表征方法1中所说明，以在缓冲剂A中的0到50％缓冲剂B的梯度进行分离。
编号实施例实施例1聚合反应液体混合物制备如下称量1.2g的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，0.80g的二甲基丙烯酸亚乙基酯(EDMA)(聚合反应混合物1)和0.02g的2，2＝-偶氮二异丁腈(AIBN)加入到20ml样品管形瓶中并温和地摇振该混合物直到变成均匀液体混合物为止；称量2.55g的环己醇(CHOH)和0.45g的十二烷醇(DODOH)加入到这一液体混合物中并摇振它直到它变成均匀的为止。如在脱气程序中所述，聚合反应混合物进行脱气。
空的不锈钢柱(4.6mm内径和50mm长度)，它的一端由图4中所示的加压设备来密封，用这一液体混合物填充，直到该柱填满为止。在不锈钢螺帽(它是在同一图中所示的柱的最初盖子)中所装的PEEK栓塞用于密封该柱的另一端。图3的设备连接到注射泵。水用作介质以产生120psi的压力。在柱中没有空气。然后将该柱直立放置于60℃的水浴中并保持20小时。在聚合后，该柱从水浴中取出和冷却到室温。
在释放压力之后图3的设备从注射泵上脱离。图3的设备被打开，然后小心地从该柱上移开。白色聚合物延伸到该柱的外部。聚合物的长度被发现比在该柱和图3的设备内部的聚合反应液体混合物的高度短大约2mm。聚合物的这一延伸部分用刀片除去。该柱然后被安装最初HPLC柱接头配件。该柱连接到HPLC泵和用乙腈在0.5ml/分钟下于45℃洗涤20分钟。
该接头配件从柱的一端上脱离，然后通过经由另一端将10ml/分钟乙腈泵送进入到该柱中来将介质从柱中压出。聚合物介质的壁表面发现是光滑的。聚合物的顶部是平的。
实施例1的对比版本聚合反应液体混合物制备如下(1)称量1.2g的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，0.80g的二甲基丙烯酸亚乙基酯(EDMA)(聚合反应混合物1)和0.02g的2，2-偶氮二异丁腈(AIBN)加入到20ml样品管形瓶中，并温和地摇振该混合物直到变成均匀液体混合物为止；和(2)称量2.55g的环己醇(CHOH)和0.45g的十二烷醇(DODOH)加入到这一液体混合物中并摇振它直到它变成均匀的为止。用以上脱气程序将聚合反应液体混合物脱气。
空的不锈钢柱(4.6mm内径和50mm长度)，它的一端由在不锈钢螺帽(它是该柱的最初盖子)中所装的PEEK-栓塞密封。该柱用以上液体混合物填充直到它填满为止。将PEEK-栓塞小心地放置在柱的顶部上然后用另一个螺帽密封。在柱中应该没有空气。然后将该柱直立放置于60℃的水浴中并保持20小时。在聚合后，该柱从水浴中取出和冷却到室温。
将PEEK-栓塞脱离，在柱中观察到白色聚合物。该柱然后被安装最初HPLC柱接头配件。该柱连接到HPLC泵和用四氢呋喃(THF)在0.5ml/分钟下洗涤20分钟。
该接头配件从柱的一端上脱离，然后通过经由另一端将10ml/分钟乙腈(ACN)泵送进入到该柱中来将介质从柱中压出。介质的壁表面发现含有许多小的不规则凹陷。
使用不同的单体制备其它柱。在聚合物棒条的壁表面上发现不规则空隙。拍取这些棒条中的两个和在压力下制造的一个棒条的照片，并示于图7中。
实施例1的替代版本按照实施例1的程序，只是使用不同的聚合反应混合物，其具有不同比例和官能化单体和交联剂的结合物。所使用的官能化单体包括甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，甲基丙烯酸2-羟基乙基酯(HEMA)，甲基丙烯酸甲酯(MMA)，2-(丙烯酰氧基乙基)三甲基铵甲基硫酸盐(ATMS)，丙烯酸(AA)，2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)，甲基丙烯酸硬脂基酯(SMA)，甲基丙烯酸月桂酯(LMA)，甲基丙烯酸丁酯(BMA)，苯乙烯(ST)和4-乙基苯乙烯(EST)。所使用的交联用单体(交联剂)包括二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，二乙烯基苯(DVB)。使用不同比例的官能化单体、交联用单体和生孔剂。该生孔剂包括不同的醇，如环己醇，十二烷醇，癸醇，1-十六烷醇，丁醇，丙醇，异丙醇，乙醇，甲醇，1，4-丁二醇，和其它如甲苯，N，N-二甲基乙酰胺，乙腈，1，2-二甲氧基乙烷，1，2-二氯乙烷，邻苯二甲酸二甲酯，2，2，4-三甲基戊烷，1，4-二烷(dixane)，2-甲氧基乙醇，1，4-丁二醇，间二甲苯，邻苯二甲酸二异丁酯，四(乙二醇)二甲醚，四(乙二醇)，聚(丙二醇)(F.W.1000)，聚(丙二醇)单丁基醚(F.W.340，1000，2500)。所使用的引发剂包括2，2-prime-偶氮二异丁腈(AIBN)和苯甲酰基过氧化物。
对于单体和生孔剂的结合物之中的每一种，制备柱、检验和表征。
在几种压力条件下用各聚合反应混合物制备几个柱。该压力条件包括(1)在聚合反应过程中该柱通向大气；(2)在聚合反应过程中该柱被密封；(3)使用氮气作为气体，用直接施加于聚合反应混合物的气体对柱施加压力；和(4)橡胶、塑料和金属活塞中的每一种与聚合反应混合物接触，然后从弹簧、液压、气体压力施加压力或通过使用如上所述的设备或改进设备向下以螺纹拧活塞来施加压力，当采用机械力如弹簧时。
结果是(1)对于有大气压力的情况，在高百分比柱的表面上有不连续性。柱效率和分辨率不可再现；(2)对于该柱被密封的压力条件，更高百分比的柱在表面上有不连续性，柱效率和分辨率不可再现；(3)对于施加气体压力的柱，该柱的顶端表面是柔软的和不规则的，和壁表面是光滑的。分离色谱图具有较好的可再现性。洗脱峰比不施加压力时更尖锐；和(4)当使用活塞时，可再现性是很高的，而且分辨率比以上所使用的全部方法都好。
实施例2如实施例1，聚合反应液体混合物用下列制备2.0g GMA，2.5g2-(丙烯酰氧基乙基)三甲基铵甲基硫酸盐(ATMS，80％)，6.0g EDMA，7.5g 1，4-丁二醇，6.75g丙醇，0.75g水和0.1g AIBN。
空的玻璃柱(10mm内径和100mm长度)，它的一端由图4中所示的加压设备来密封，填充该液体混合物直到该柱填满为止。将在同一图中所示的PEEK螺帽中所装的TEFLON-栓塞用来密封该柱的另一端。图4的设备连接到注射泵。在柱中没有空气。然后将该柱直立放置于60℃的水浴中并保持15分钟。然后该柱通过使用水作为介质的注射泵加压到120psi，然后保持20小时。在聚合后，该柱从水浴中取出和冷却到室温。
在释放压力之后图4的设备从注射泵上脱离。图4的设备被打开，然后小心地从该柱上移开。发现聚合物棒条的高度比在该柱内部的聚合反应液体混合物的高度短4mm。该柱然后被安装最初HPLC柱接头配件。该柱连接到HPLC泵和用乙腈在2ml/分钟下于45℃洗涤20分钟。
该接头配件从柱的一端上脱离，然后通过经由另一端将10ml/分钟乙腈泵送进入到该柱中来将介质从柱中压出。聚合物介质的壁表面发现是光滑的。聚合物的顶部是平的。
实施例2的替代版本按照实施例2的方法，只是压力和施加压力的方法有变化。在聚合反应过程中使用不同的恒定压力。所使用的压力包括80psi，150psi，180psi，200psi，240psi和300psi。这些柱的反压是不同的。聚合物结构的扫描电子显微镜检查揭示了这些聚合物的颗粒尺寸也是不同的。
在聚合反应过程中，将压力的分阶段梯度施加于聚合反应混合物。该梯度是如下5min从10psi以4psi/分钟增加，10min以2psi/分钟增加，20min以1psi/分钟增加，30min以0.8psi/分钟增加，和然后在1小时内将压力提高到180psi。在聚合反应过程中180psi的最终压力保持20小时。
2小时之久的从15psi到180psi的线性梯度用于在聚合反应的早期阶段中为该反应加压。在聚合反应的剩余部分中，180psi保持另外18小时。
所有这些柱通过泵送入在三甲基胺含水液体混合物(50％体积)中的0.45g/ml三甲基胺盐酸盐的5ml液体混合物来改性。该柱被密封和然后在40℃的水浴中加热3小时。紧接着在改性之后它们用20个柱床体积的水进行洗涤。这些柱经历如上所述的柱床稳定化和调理。它们如以上对于离子交换剂的LC表征方法那样进行表征。这些柱的反压、颗粒尺寸和分离分辨率全部随加压方法而变化。
也使用不同的聚合时间。如在实施例2中那样制备柱，只是聚合反应时间是44小时而不是20小时。
用仅仅一个压力源，使用十个通道支管，并行制备十个柱。所制备的柱具有比单个制备过程更好的可再现性。
颗粒的聚合物形态和内部结构用扫描电子显微镜(SEM)检查。发现，这些颗粒的内部结构是无孔的，而不是像在现有技术中已知的其它整体式介质中是多孔的。
实施例3如实施例1和2，用下列液体混合物制备两个柱17.5g DVB，19.8g四(乙二醇)，10.2g四(乙二醇)二甲醚，和0.18g AIBN。在用乙腈洗涤之后，该柱进一步用20个柱床体积的水在16ml/分钟的流速下进行洗涤。在两端的手工定位的活塞被压缩到该柱中。该柱然后用含有0.15％三氟乙酸的乙腈洗涤，并由LC表征方法1a和1b来表征。与在对比实施例中制备的柱相比，这些柱对于蛋白质和肽分离的分辨率大大地改进。该容量高了5倍。这些柱的反压是低的。用从100％水起始(含有0.15％TFA)的流动相梯度实现了高分辨率。在这些柱中没有发现管壁效应。在对比实施例的柱中蛋白质和肽从柱中预先洗脱出来，这由于在水相中的管壁效应。
实施例的对比版本用下列试剂如实施例1的对比实施例那样制备聚合反应液体混合物3ml苯乙烯，2ml二乙烯基苯，7.5ml十二烷醇和0.5g AIBN。该柱用反相蛋白质和肽分离来表征，描述为LC表征1a和1b。
实施例3的替代版本用生孔剂、含有不同碳链长度的不同单体、不同量的总单体含量、不同的引发剂和不同收缩性溶剂的不同结合物来重复实施例3。
所使用的生孔剂包括含有C1-C12的醇，N，N-二甲基乙酰胺，乙腈，1，2-二甲氧基乙烷，1，2-二氯乙烷，邻苯二甲酸二甲酯，2，2，4-三甲基戊烷，1，4-二烷，2-甲氧基乙醇，1，4-丁二醇，甲苯，间二甲苯，邻苯二甲酸二异丁酯，四(乙二醇)二甲醚，四(乙二醇)，聚(丙二醇)(F.W.1000)，聚(丙二醇)单丁基醚(F.W.340，1000，2500)。一些所述溶剂的结合物同样得到高分辨率的柱。醇和它们的结合物能够提供大通道供流动相以低反压流过，同时提供高分辨率。该分辨率能够同样地用其它良溶剂来微调。
所使用的单体包括甲基丙烯酸丁酯和甲基丙烯酸硬脂基酯，还有生孔剂的以上结合物。一个柱是用下列聚合反应液体混合物制备的7g SMA，10.5g DVB，19.5g乙醇，13.0g丁醇和0.18g AIBN。另一个柱是用下列聚合反应液体混合物制备的7g甲基丙烯酸月桂酯(LMA)，1g HEMA，12g EDMA，30g十二烷醇和0.2g AIBN。另一个柱是用下列聚合反应液体混合物制备的7g甲基丙烯酸丁酯(BMA)，1gHEMA，12g EDMA，3g水，16.5g丙醇，10.5g 1，4-丁二醇和0.2g AIBN。含有不同碳链长度的这些单体的结合物提供不同的疏水性和相互作用，它对于具有不同的疏水性和特性的样品提供高分辨率和回收率。例如，甲基丙烯酸丁酯型介质用于更疏水性蛋白质的分离和甲基丙烯酸硬脂基酯型介质能够用于更亲水性蛋白质、肽或低聚核苷酸的分离。
不同的单体与交联剂的比率也可用于调节选择性和分辨率。一个柱用下列聚合反应液体混合物制备1.05g SMA，0.7g DVB，3.25g乙醇和0.018g AIBN。
还使用不同的引发剂。柱通过使用下列聚合反应液体混合物来制备10ml二乙烯基苯(80％纯度)，30ml十二烷醇，10ml苯乙烯和0.20g苯甲酰基过氧化物。
还使用不同的聚合时间。如实施例3中那样制备柱，只是聚合反应时间是44小时而不是20小时。
不同的极性溶剂用来在压缩之前收缩聚合物。如实施例3中那样制备柱，然后在水洗涤之后用20个柱床体积的1M NaCl洗涤。在盐洗涤之后，手工定位的活塞被压缩到该柱中。当0.1M NaH2PO4(pH 4.0)用作该起始流动相时，该柱没有显示管壁效应。
在填料聚合之后，用不同的洗涤用液体混合物和不同的催化剂在含水液体混合物的存在下在有和没有压力的情况下以及用不同的压力，来重复这些实验。在各情况下，当不施加压力时，在外壁上有不连续性，和在表征之后，缺少可再现性和色谱图的峰是较不突出的，当在用含水液体混合物洗涤进行溶胀之后不施加压力时。
在多种压力(低压和高压)下进行试验，其中包括60psi(磅/平方英寸)和120psi和600psi，都获得良好的结果。可以相信，所需压力的量将随柱的直径和具体的聚合反应混合物而变化，但是在全部情况下都能够在极低压力下获得令人满意的结果。压力的上限是柱壁和配件的强度。
压力的量也会影响分离-有效开孔的尺寸，因此该压力应该与所需要的分离-有效开孔尺寸、分离-有效开孔尺寸的分布和柱的可再现性一起进行选择。
实施例4如实施例2那样用下列液体混合物制备柱9g的甲基丙烯酸缩水甘油酯，9g的二甲基丙烯酸亚乙基酯，0.18g，21.6g的环己醇和6.3g的十二烷醇。聚合物的长度发现比该柱内部的聚合反应液体混合物的高度短大约7mm。该柱然后被安装最初的柱配件。该柱连接到HPLC泵和用乙腈在4ml/分钟下于45℃洗涤20分钟。该柱进一步如下改性将含有570mg三甲基胺盐酸盐，24ml二乙基胺和6ml水的液体混合物在2ml/分钟的流速下泵入这些柱中达18分钟。这些柱然后被放入在30℃的水浴中达3小时。各柱用100ml水洗涤。该柱进一步用0.01mol/l Tris.HCl缓冲剂(pH 7.6)在4ml/分钟的流速下洗涤30分钟。该柱通过稳定化和调理方法来实施稳定化和调理。在洗涤之后，最初柱配件的活塞被压缩。柱反压是大约360psi，在这一缓冲剂中在10ml/分钟的流速下。该柱按如上所述的LC表征方法进行表征。
实施例5通过混合1g苯乙烯，1g二乙烯基苯(DVB)(80％二乙烯基苯和20％乙基苯乙烯(EST))，3g十二烷醇和0.02g AIBN制备聚合反应液体混合物。
该液体混合物由N2吹扫20分钟进行脱气，然后填充到不锈钢柱(50×4.6mm i.d.)中，它的一端用在该柱配件的螺帽内的PEEK栓塞密封。该柱的另一端用另一个PEEK栓塞密封。它在水浴中在70℃下聚合24小时。该柱安装最初的柱配件和然后用THF在1ml/分钟的流速下洗涤10分钟，之后将它用于蛋白质的分离。该柱的反压在10ml/分钟的流速下是大约230psi。在10ml/分钟的乙腈流速下聚合物的压缩是大约2.9mm。该柱用于反相蛋白质和肽分离，与LC表征方法1a和1b一样。
实施例5的替代版本如实施例5中那样制备另一个柱，但是有更高的总单体含量。聚合反应液体混合物含有1.2g苯乙烯，1.2g二乙烯基苯，和2.6g十二烷醇和0.024g AIBN。柱的反压在10ml/分钟乙腈的流速下是220psi和聚合物的压缩仅仅是0.9mm。更高的总单体含量使得柱有更低的可压缩性。
如实施例4中那样制备不同直径(包括22mm，15mm，10mm，8mm，2.1mm，1mm，542微米，和320微米)的柱。还制备了具有10mm×2.1mm内径的尺寸的较短柱。这些柱通过LC表征方法用反相蛋白质分离来表征，但是在与柱直径对应的相同的流速下。原地聚合方法适用于具有不同直径的柱。它对于较小直径柱或微流体通道是特别有用的，因为不涉及到其它填充步骤。
实施例6根据实施例5制备另一个柱。
该柱装有含有活塞的最初柱配件并用乙腈在1ml/分钟的流速下洗涤10分钟。该柱进一步用水洗涤10分钟。在两端的活塞被压缩到该柱中。该柱通过LC表征方法来表征。聚合物在水中被活塞压缩和在压缩之后由该活塞保持避免了由于聚合物在水中的收缩引起的管壁效应。
实施例6的替代版本如实施例5那样用下列液体混合物制备另一个柱1.8g二乙烯基苯，0.2g的苯乙烯，2.3375g十二烷醇，0.6625g甲苯，0.02g的AIBN和3.0g的十二烷醇。全部试剂通过使用吸气器由真空脱气五分钟，随后用氦气吹扫20分钟，之后称量。将聚合反应液体混合物填充到不锈钢柱(50×4.6mm i.d.)中，它的一端由在螺帽中所含的PEEK栓塞密封。该柱的另一端用另一个PEEK栓塞密封。它是在水浴中在66℃下聚合24小时。该柱装有含有活塞的最初柱配件并用乙腈在1ml/分钟的流速下洗涤10分钟。该柱进一步用水洗涤10分钟。在两端的活塞被压缩到该柱中。该柱通过LC表征方法来表征。较高含量的交联剂改进了该容量。这一版本的柱具有比根据实施例6制备的一些其它柱大3倍以上的容量。
用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱10ml二乙烯基苯(80％纯度)，10ml苯乙烯和0.20g苯甲酰基过氧化物。
该聚合反应液体混合物由N2吹扫20分钟。将聚合反应液体混合物填充到不锈钢柱(50×4.6mm i.d.)中，它的一端由在螺帽中所含的PEEK栓塞密封。该柱的另一端用另一个PEEK栓塞密封。它是在水浴中在70℃下聚合24小时。该柱装有最初柱配件并用四氢呋喃在1ml/分钟的流速下洗涤10分钟。如在LC表征方法中所述的，它通过反相蛋白质和肽分离来表征。不同的引发剂如苯甲酰基在制造整体式介质时也是有效的。
如以上实施例那样地制备较小尺寸的不锈钢柱(50×2.1mm i.d.)和PEEK柱(50×4.6mm i.d.)并进行表征。
实施例7如在实施例6那样，用下列液体混合物制备柱二乙烯基苯，0.2g的甲基丙烯酸羟基乙基酯和0.02g的AIBN。它是在水浴中在70℃下聚合24小时。该柱装有含有活塞的最初的柱配件。它用乙腈在1ml/分钟的流速下洗涤10分钟，然后用水和在0.01mol/l Tris.HCl缓冲剂(pH 7.6)中的0.5mol/l NaCl洗涤。与在LC表征方法中一样，该柱通过反相蛋白质分离来表征。
实施例7的替代版本根据以上程序制备柱和进行表征，只是甲基丙烯酸羟基乙基酯和二乙烯基苯的重量改变为0.4g和1.6g。
根据以上程序制备另一个柱和进行表征，只是甲基丙烯酸羟基乙基酯和二乙烯基苯的重量改变为1g和1g。
如在实施例7中那样用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.8g二乙烯基苯，0.16g苯乙烯，0.04g的甲基丙烯酸羟基乙基酯，和0.02g的AIBN。
在聚合之后，该柱装有含有活塞的最初的柱配件。它用乙腈在1ml/分钟的流速下洗涤10分钟，然后用水和在0.01mol/l Tris.HCl缓冲剂(pH 7.6)中的0.5mol/l NaCl洗涤。该柱用活塞压缩，由蛋白质和肽的反相分离表征，与在LC表征方法中一样。
实施例8空的注射器圆筒(用于Combiflash色谱法的70×12mm内径Redisep圆筒，从Isco，Inc.，4700 Superior Street，Lincoln，NE 68504获得)在一端密封并填充下列聚合反应液体混合物1.6g甲基丙烯酸羟基乙基酯，6.4g二乙烯基苯，89mg AIBN，12g十二烷醇，用N2脱气20分钟。圆筒的尖端用阻塞针(blocked needle)密封。该圆筒在水浴中在70℃下加热24小时。它连接到HPLC泵和用THF在1ml/分钟的流速下洗涤30分钟。它然后用于酚类化合物的正相和反相分离。
实施例9聚合反应液体混合物制备如下(1)称量1g的甲基丙烯酸羟基乙基酯，1g的二甲基丙烯酸亚乙基酯和0.02g的AIBN加入到20ml样品管形瓶中，并温和地摇振该混合物直到变成均匀液体混合物为止；和(2)称量1g的环己醇和2g的十二烷醇加入到这一液体混合物中并摇振它直到它变成均匀的为止。全部试剂通过使用吸气器由真空脱气五分钟，随后用氦气吹扫20分钟，之后称量。
空的不锈钢柱(4.6mm内径和50mm长度)，它的一端由图4中所示的设备来密封，填充这一液体混合物，直到该柱填满为止。在不锈钢螺帽(它是柱的最初盖子)中所装的PEEK栓塞用于密封该柱的另一端。图4的设备连接到注射泵。水用作介质以产生120psi的压力。在柱中应该没有空气。然后将该柱直立放置于60℃的水浴中并保持20小时。在聚合后，该柱从水浴中取出和冷却到室温。该柱连接到HPLC泵和用干燥THF(由分子筛干燥)在0.5ml/分钟下洗涤20分钟。该柱用于药物的正相分离。
实施例9的替代版本如在实施例9中那样用下列聚合反应液体混合物制备柱0.5gGMA，0.5g HEMA，1g EDMA，1.8g环己醇，1.2g十二烷醇，0.02g AIBN。
在THF洗涤之后该柱用水在0.5ml/分钟的流速下洗涤20分钟。将10ml的1.0mol/l硫酸水溶液泵送通过该柱。该柱用柱栓塞密封，然后在80℃的水浴中放置3小时。它们在改性反应之后用20ml水洗涤和在用正相分离操作表征之前进一步用干燥THF洗涤。
另一个柱用下列聚合反应液体混合物制备1g甲基丙烯酸缩水甘油酯，1g二甲基丙烯酸亚乙基酯，2.4g环己醇，0.6g十二烷醇，0.02g AIBN。
在THF洗涤之后该柱用水在0.5ml/分钟的流速下洗涤20分钟。将10ml的1.0mol/l硫酸水溶液泵送通过该柱。该柱用柱栓塞密封，然后在80℃的水浴中放置3小时。它们在改性反应之后用20ml水洗涤和在用正相分离操作表征之前进一步用干燥THF洗涤。
实施例10如在实施例3中那样，用含有0.7g甲基丙烯酸月桂酯(LMA)，0.1gHEMA，1.2g EDMA，3g十二烷醇和0.02g AIBN的聚合反应液体混合物制备不锈钢柱(50×4.6mm i.d.)。
实施例10的替代版本用含有0.8g甲基丙烯酸月桂酯(LMA)，1.2g EDMA，3g十二烷醇和0.02g AIBN的聚合反应液体混合物制备柱。用含有0.175g甲基丙烯酸硬脂基酯(SMA)，1.575g DVB(80％纯度)，3.25g 1-十六烷醇和0.018mg AIBN的聚合反应液体混合物(形成具有SMA/DVB比率＝10/90的混合物)制备另一个柱。用含有0.7g SMA，1.05g DVB，3.25g辛醇和0.018g AIBN的聚合反应液体混合物(以提供40/60SMA/DVB的比率)制备另一个柱。
用含有1.05g SMA，0.7g DVB，3.25g乙醇和0.018g AIBN的聚合反应液体混合物(提供60/40SMA/DVB的比率)制备另一个柱。
用含有0.7SMA，1.05g DVB，1.95g乙醇，1.30g丁醇和0.018gAIBN的聚合反应液体混合物(提供40/60SMA/DVB的比率)制备另一个柱。
与以上一样，通过使用十四烷醇，癸醇，辛醇，己醇，丁醇，丙醇，乙醇和甲醇和它们的结合物作为生孔性溶剂来制备其它的柱。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.7SMA，1.05g DVB，2.925g乙醇，0.33g甲醇，0.33g异丙醇和0.018gAIBN，提供40/60SMA/DVB的比率。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.7gSMA，1.05g DVB，2.6g乙醇，0.33g甲醇，0.33g丙醇，0.33g丁醇和0.018g AIBN，提供40/60SMA/DVB的比率。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.7gSMA，1.05g DVB，2.762g乙醇，0.33g甲醇，0.33g丙醇，0.33g丁醇，0.33g己醇和0.018g AIBN，提供40/60SMA/DVB的比率。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.7gSMA，1.05g DVB，2.435g乙醇，0.33g甲醇，0.33g丙醇，0.33g丁醇，0.33g己醇，0.33g辛醇和0.018g AIBN，提供40/60SMA/DVB的比率。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.05gDVB，3.08g乙醇，0.0.16g乙基酯和0.018g AIBN。该柱与在实施例10中同样地用于肽分离，提供40/60SMA/DVB的比率。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.75gDVB，3.25g十二烷醇和0.018g AIBN。该柱与在实施例10的第一个版本同样地用于肽分离。与以上同样地，用含C1-C12的醇制备一系列柱并用肽分离表征。
与以上同样地，通过使用下列生孔剂代替十二烷醇来制备一系列的柱异丙醇，N，N-二甲基乙酰胺，乙腈，1，2-二甲氧基乙烷，1，2-二氯乙烷，邻苯二甲酸二甲酯，2，2，4-三甲基戊烷，1，4-二烷，2-甲氧基乙醇，1，4-丁二醇，甲苯，间二甲苯，邻苯二甲酸二异丁酯，四(乙二醇)二甲醚，四(乙二醇)，聚(丙二醇)(F.W.1000)，聚(丙二醇)单丁基醚(F.W.340，1000，2500)。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.75gDVB，2.925g异丙醇，0.325g 1，4-丁二醇和0.018g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.75gDVB，2.275g异丙醇，0.975g 2-甲氧基乙醇和0.018g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.75gDVB，2.60g异丙醇，0.65邻苯二甲酸二甲酯和0.018g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.75gDVB，2.7g四甘醇，0.3g二甘醇和0.018g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.75gDVB，2.7g四(乙二醇)，0.3g甘油和0.018g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.75gDVB，1.98g四(乙二醇)，1.02g四(乙二醇)二甲醚，和0.018g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1.75gDVB，1.98g四(乙二醇)，1.02g四(乙二醇)二甲醚，和0.018g AIBN。
实施例11柱(50×4.6mm内径，不锈钢，它是50mm长度和4.6mm内径)如实施例1中那样地用含有1g甲基丙烯酸甲酯(MMA)，1g EDMA，1.8g环己醇，1.2g十二烷醇和0.02g AIBN的聚合反应液体混合物制备。该柱连接到HPLC泵，然后依次用THF和水在0.5ml/分钟的流速下洗涤20分钟。
该柱进行水解反应，如下(1)2ml 6mol/l NaOH在0.5ml/分钟的流速下被泵送通过该柱；和(2)该柱用两个柱栓塞密封和然后在80℃的水浴中放置1小时。它用20ml水在0.5ml/分钟的流速下洗涤，并用蛋白质分离和如在LC表征方法中所述的结合容量测量来表征。
实施例11的替代版本如实施例11那样地，用下列聚合反应液体混合物制备柱0.1g丙烯酸(AA)，0.9g甲基丙烯酸甲酯(MMA)，1g EDMA，3g十二烷醇和0.02g AIBN。该柱的容量在水解之前和之后进行测量。水解前的容量是大约10mg溶菌酶/ml柱体积。在水解以后它是大约30mg。
如实施例11那样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.2g AA，0.8g MMA，1g EDMA，3g十二烷醇和0.02g AIBN。该柱的容量与在表征方法11中同样地进行测量。水解前的容量是大约27mg溶菌酶/ml柱体积。在水解以后它是大约50mg。
如实施例11那样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.3g AA，0.7g MMA，1g EDMA，3g十二烷醇和0.02g AIBN。该柱的容量在水解之前和之后进行测量。水解前的容量是大约43mg溶菌酶/ml柱体积。在水解以后该容量大于60mg。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.4gAA，0.6g MMA，1g EDMA，3g十二烷醇和0.02g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.1gAA，0.9g丙烯酸叔丁基酯，1g EDMA，3g十二烷醇和0.02g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.3gAA，0.3g MMA，1.4g EDMA，3g十二烷醇和0.02g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.2gAA，0.7g MMA，0.1g HEMA，1g EDMA，2.85g十二烷醇，0.15g环己醇和0.02g AIBN。与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.4g AA，1.6g DVB，3g十二烷醇和0.02g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱1gGMA，1g EDMA，2.4g环己醇，0.6g十二烷醇，0.02g AIBN。在如实施例11中的碱催化水解反应之前，该柱如在实施例9的替代版本中那样地进行酸催化开环反应。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.5gGMA，0.5g HEMA，1g EDMA，1.8g环己醇，1.2g十二烷醇，0.02g AIBN。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.2gAA，0.6g MMA，0.2g GMA，1g EDMA，3g十二烷醇和0.02g AIBN。在如同上述的在碱催化的水解反应之前，该柱进行酸催化开环反应。它进一步用下列液体混合物水解在5M NaOH溶液中0.25M氯乙酸钠，在60℃下6小时。
与以上同样地，用下列聚合反应液体混合物制备另一个柱0.2gAA，0.5g MMA，0.1g GMA，1.2g EDMA，2.55g十二烷醇，0.45g环己醇和0.02g AIBN。它通过在5M NaOH溶液中的0.25M氯乙酸钠在60℃下水解6小时。
与在如上所述的LC表征方法中同样地，所有这些柱进行床稳定化和压缩方法，并用蛋白质分离和结合容量测量来表征。
实施例12如实施例1中那样地用下列聚合反应液体混合物制备柱(PEEK衬层的不锈钢，50×4.6mm内径)3g GMA，3g EDMA，6.9g环己醇，2.1g十二烷醇和0.06g AIBN。
该柱首先在酸性条件下用开环反应来改性。五个柱床体积的0.5M硫酸水溶液的液体混合物被泵送通过这些柱。该柱被密封和然后在50℃的水浴中加热4小时。在改性之后它用20个柱床体积的水进行洗涤。
该柱进一步用醚化反应改性。五个柱床体积的含有20g氯乙酸钠，20g NaOH和64ml水的液体混合物被泵送通过该柱。该柱用柱栓塞密封，然后在60℃的水浴中加热2.5小时。与在稳定化和调理方法中同样地，它用水洗涤，稳定化和调理。该柱与在LC表征方法中同样地进行表征。
实施例12的替代版本用不同的改性方法进行实施例12。
如在实施例12中那样制备的柱通过利用下列液体混合物的开环反应来进行改性水中的6mol/l乙醇酸和0.5M TFI，达到3小时。
另一个柱用以上开环反应和水解反应(在5M NaOH液体混合物中于60℃下2.5小时)来改性。
另一个柱首先用含有40g乙醇酸，60ml 0.5M三氟乙酸(TFA)的液体混合物由开环反应改性2小时。它进一步用含有20g ClCH2COONa和60ml 5M NaOH的液体混合物改性3小时。
实施例13如实施例2那样地，用下列液体混合物制备三十个柱12g AA，30g MMA，6g GMA，72g EDMA，27g环己醇，153g十二烷醇和1.2g AIBN。这些柱通过使用连接到一个注射泵的三个支管(以便在聚合反应过程中获得120psi压力)，由同时的平行合成来制备。在聚合之后，聚合物由注射器活塞(约9mm i.d.)从柱中排挤出来供下列应用。
来自以上步骤的一个聚合物棒条被修剪得具有约8mm直径的更小尺寸。它被裁切成1cm厚度圆盘。这些圆盘用作第二阶段聚合反应的填料以制备另一个柱。将1.8ml液体混合物填充到玻璃柱(100×10mmi.d.)中，它的一端由图3中所示的加压设备密封。六个聚合物圆盘一个接一个地被填充到柱中。所有这些圆盘应该由液体混合物覆盖。特氟隆塞子用来密封该柱的另一端。该加压设备连接到注射泵，后者用于以恒定压力模式对聚合反应液体混合物施加120psi压力。该柱在60℃的水浴中加热20小时。在聚合后，该柱从水浴中取出。在释放压力之后加压设备从注射泵上脱离。加压设备被打开并趁该柱仍然温热时慢慢地从该柱上脱离。该柱依次用20个柱床体积的乙腈和水在1ml/分钟的流速下洗涤。与在稳定化和调理方法中同样地，它进行稳定化和调理。该柱用在5M NaOH中的0.25mol/l氯乙酸钠于60℃下改性6小时。它与在LC表征方法中同样地进行表征。
实施例13的替代实施例使用两阶段聚合方法，以聚合物棒条作为填料，制备另一个柱(100mm×35mm ID，玻璃)。该柱在一端用TEFLON栓塞密封。柱的另一端连接到N2罐。聚合反应在120psi和60℃下进行20小时。
实施例14用下列液体混合物制备八个短的聚合物棒条(10mm×34mm ID)8g丙烯酸，20g甲基丙烯酸甲酯，4g甲基丙烯酸缩水甘油酯，48g二甲基丙烯酸乙二醇酯，102g十二烷醇，18g环己醇和0.8g AIBN。在120psi N2压力下制备聚合物棒条。该棒条用作填料，以用于通过使用与在实施例12中同样的两阶段聚合方法进行大直径长柱的制备。玻璃柱(100mm×35mm ID)用短柱填充，和进行与以上相同的聚合反应。柱的一端用特氟隆栓塞密封，和另一端与N2罐相连。在120psi压力和60℃下进行聚合反应20小时。该柱用20个柱床体积的乙腈和水洗涤。它进行水解反应，如下在5M NaOH中的0.25M氯乙酸钠，在60℃下6小时。该柱与如上所述的LC表征方法同样地进行表征。
实施例15如在实施例1中那样地，用下列液体混合物制备柱(PEEK衬层的不锈钢，50mm×4.6mm ID)4g GMA，4g EDMA，2.8g十二烷醇，9.2g环己醇和0.08g AIBN。
该柱首先通过1M H2SO4液体混合物在40℃下水解3小时。在水解后，该柱通过将5个柱床体积的在DMSO中的5％叔丁醇钠液体混合物泵送通过该柱和在90℃的水浴中加热1小时而活化。然后它用含有20％的活化液体混合物和80％的丁烷磺内酯的液体混合物在80℃下改性20小时。
实施例15的替代版本与在实施例15中同样地制备柱，只是使用丙烷磺内酯代替丁烷磺内酯。
与在实施例15中同样地制备另一个柱，只是改性和活化温度是油浴中的120℃而不是90℃。
如在实施例15中那样地用下列液体混合物制备另一个柱4gHEMA，4g EDMA，9.4g十二烷醇，2.6环己醇和0.08g AIBN。它与在实施例15中同样地进行改性。
如在实施例1中那样地，用下列液体混合物制备另一个柱0.55gGMA，1.2g EDMA，0.25g 2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)，0.48g NaOH，0.5g水，1.86g丙醇，0.64g丁二醇和0.02g AIBN。
通过与以上同样的方法由AMPS直接共聚合，但进一步用在实施例15中描述的改性方法来进一步改性，制备另一个柱。
用描述在LC表征方法中的强阳离子交换的蛋白质分离和结合容量测量来表征所有这些柱。
实施例16如实施例1中那样地，用下列聚合反应液体混合物制备柱45ml四甲氧基硅烷，100ml的0.01mol/l乙酸水溶液，9g脲和11.5g聚(环氧乙烷)(MW 10000)。这一液体混合物是通过将这一混合物在冰浴中搅拌30分钟来制备的。聚合反应是在600psi压力下和在40℃下在柱中进行24小时。该柱然后用20ml水在0.5ml/分钟的流速下洗涤，然后泵入5ml的0.01mol/l含水氢氧化铵液体混合物。该柱被密封并在120℃下保持3小时，随后用乙醇洗涤。
实施例17抑制剂如甲基醚氢醌或叔丁基邻苯二酚(catecol)在使用之前通过蒸馏或正相色谱法从单体中除去。
与实施例1中同样地制备聚合反应液体混合物，但是用下列聚合反应液体混合物240mg对-三联苯，800mg AIBN，16g苯乙烯和16g二乙烯基苯(80％)，26.4g矿物油，和21.6g 2-乙基己酸。
空的玻璃柱(10mm内径和100mm长度)，它的一端由图4中所示的加压设备来密封，填充该液体混合物直到该柱填满为止。将在同一图中所示的PEEK螺帽中所装的TEFLON-栓塞用来密封该柱的另一端。聚合反应混合物在111kVp的X-射线管电压下，以600R/小时的剂量暴露于X-射线72小时。所获得的柱进一步加热到70℃保持2小时。然后该柱用己烷洗涤，随后用己烷/丙酮(50/50)，丙酮，乙腈洗涤，分别以20个柱床体积使用各溶剂。
在释放压力之后图4的设备从注射泵上脱离。图4的设备被打开，然后小心地从该柱上移开。发现聚合物棒条的高度比在该柱内部的聚合反应液体混合物的高度短4mm。该柱然后被安装最初HPLC柱接头配件。该柱连接到HPLC泵和用乙腈在2ml/分钟下于45℃洗涤20分钟。
所制备的柱进一步用20个柱床体积的水洗涤，然后用活塞压缩以除去空隙体积。该柱然后使用描述在1a中的LC表征方法来表征。色谱图示于图9。
实施例17的替代版本与在实施例17中同样地，用下列混合物在玻璃柱(35mm内径×100mm长度)中制备另一个柱30g苯乙烯，30g二乙烯基苯，38.05g矿物油和22.18g 2-乙基己酸，0.518g对-三联苯和1.31g AIBN。该柱分别用20个柱床体积的乙腈和水洗涤。它用LC表征方法1a进行表征。分离示于图9中。
与在实施例17中同样地制备另一个柱。该配件从柱的一端上脱离，然后通过经由另一端将10ml/分钟乙腈泵送进入到该柱中来将介质从柱中压出。该分离介质在真空中在50℃下干燥24小时之后通过使用SEM和水银孔度计进行孔隙度测定研究。
与在实施例17中同样地，通过使用较大直径的玻璃柱(35mm内径×100mm长度)制备另一个柱。该柱用在TEFLON螺帽中所装的两个TEFLON栓塞来密封，而不是用在图4中的设备来密封。聚合物从该柱中排挤出来并与以上实施例中同样地加以干燥。聚合物进行SEM和孔隙度测定研究。
与在以上实施例中同样地，通过使用大直径柱(35mm×100mm)但使用下列聚合反应液体混合物来制备另一个柱240mg对-三联苯，800mg AIBN，3.2139g苯乙烯，28.8088g二乙烯基苯(80％纯度)，37.4060g 1-十二烷醇，13.25g甲苯。
与在以上实施例中同样地，通过使用大直径的柱(35mm×100mm)但使用下列聚合反应液体混合物来制备另一个柱将240mg对-三联苯和800mg AIBN溶于32.0034g二乙烯基苯(80％)的单体混合物中。在该单体混合物中添加31.6926g四甘醇，16.3224g四甘醇二甲醚。
与在以上实施例中同样地，在图12-15中所述的聚合物外壳内制备另一个柱。聚合反应液体混合物含有73.2g二乙烯基苯，73.4g苯乙烯，85.2g矿物油，60.8g 2-乙基己酸，0.882g对-三联苯和2.94g AIBN。在柱的中心的聚合反应温度大约与在柱的边缘上的温度相同。在4天的110kV X-射线辐射聚合反应之后，单体转化几乎完全。完全反应是以热的方式达到的，因为进一步的放热没有显著的不良影响。
已经制备了使用不同的闪烁剂，光引发剂，单体和生孔性溶剂的许多其它柱。所使用的生孔性溶剂包括其它烷烃如辛烷，醇如甲醇，丙醇和环己醇，醚如四氢呋喃，二烷，低聚物如四甘醇，四甘醇二甲醚。所使用的光引发剂包括2-氯噻吨-9-酮，4，4’-双(二甲基氨基)二苯甲酮，4，4’-双(二乙基氨基)二苯甲酮，菲醌，二苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)膦氧化物和偶氮二异丁腈(AIBN)。所使用的闪烁剂除了包括对-三联苯和ZnSe之外，还包括2，5-二苯基唑(PPO)，2-苯基-5-(4-联苯基)1，3，4-二唑(PBD)，2-(1-萘基)-5-苯基唑(á-NPO)。所使用的单体除了包括甲基丙烯酸缩水甘油酯，二甲基丙烯酸乙二醇酯，苯乙烯，二乙烯基苯，乙基苯乙烯之外，还包括丙烯腈，甲基丙烯酸丁酯。
在图9中显示了以下物质的混合物在两个不同直径的柱中的分离色谱图(1)Met-脑啡肽；(2)Leu-脑啡肽；(3)血管紧张肽；(4)泡蛙肽；和(5)P物质，在具有10mm和35mm的直径和65mm的长度的柱中由X-射线辐射引发的聚合反应所制备的聚(DVB-共-St)整体柱上；流动相(A)有0.15％(v/v)TFA的水；梯度在A中10-40％B，以7个柱床体积，对于I.D.柱在5ml/分钟的流速下和对于35I.D.柱在50ml/分钟的流速下检测在214nm的UV。
在图10中显示了紫外线或可见光聚合反应装置150的俯视图，该装置具有静止顶面152，旋转顶面156，连接到静止的承载表面152上和栓扣在旋转表面156上的承载元件157以使其旋转，以及四个荧光灯支座154A-154D。可见或紫外线荧光灯插入这些支座中。
在图11中显示聚合反应装置150的侧剖视图的略图，显示该从动构件156借助发动机159相互地旋转以旋转聚合反应装置162。四个灯之中的两个166D和166B被显示安装在灯支座154D和154B上和在长形灯166D和166B的底端上的相应支座。活塞164用来在聚合反应过程中在162处为聚合反应混合物增压。风扇158协助冷却聚合反应装置以及在覆盖材料、侧边和灯上的反射涂层将光反射回到该容器162的光引导壁中。借助于这一排列，灯166A-166D(166B & 166D示于图11中)使光冲击聚合反应混合物，以便引发和控制聚合反应。进行较大直径柱的聚合反应，同时在溶剂和被分析物的流动方向上在沿着该柱的所有位置上维持在最终填料中的径向均匀性。该灯可以根据需要开和关以控制温度梯度，这样在光和温度的结合下按照受控方式进行聚合反应以获得均匀性。
在图12中显示了主要地使用X-射线辐射的供聚合用的装置170的简化正视图，该装置具有防辐射柜172，门174，上窗176，支座178和容器180(含有在182处的反应混合物)。活塞184可以在一些实施方案中用于为反应混合物182增压。在该装置170中，X-射线或其它合适辐射如γ射线可用来以安全方便方式控制在聚合反应容器中的反应。
在一些实施方案中，通过经由管道186施加空气以使活塞184按照以上关于其它实施方案所述的方式向内移向反应混合物182，从而通过活塞184施加压力。在优选实施方案中，装置170是类似于微波炉的小型用户友好的柜式X-射线系统，这在于它具有门和装配在柜上的控制器。它使用低电压水平并能够由个人紧挨着该柜安全地操作，因为它具有低穿透力，然而穿透力对于大柱是足够的。它适合于本发明的聚合反应，因为以上描述的方法使用所添加的物质来协助聚合反应，如光引发剂，发荧光溶剂，或生孔剂，X-射线增感剂和/或闪烁剂。这一装置允许聚合反应的X-射线控制以及其它装置如图10和11的那些装置允许聚合反应的其它辐射控制，因此允许了例如借助于辐射将聚合反应控制到某一点并且使用热量完成聚合反应以减少时间和还避免破坏性压头(head)增长。
在图13中显示了反应容器180的俯视图，它具有反应物进入口200，冷却剂流体入口203，冷却剂出口205，壳体204和满溢出口202。冷却剂优选是水。提供了用于供应空气的开口206，该空气对填料182(图14)施加压力使之向着在212处的聚合反应混合物(图14)移动。在通过翻转容器180放置反应混合物之后经由开口200提供热电偶，同样能够将栓塞插入其中。以这一排列，如果需要的话反应混合物可以在压力下被辐射并在轴向上接受X-射线以便进行聚合反应的引发和控制。水作为冷却剂流过它，这样辐射和压力的结合能够控制热梯度并改善在最终的色谱填料或载体中的均匀性。
在图14中显示了沿着图13的交叉线14-14截取的剖视图，其中显示了透明X-射线辐射窗192，冷却水的口202，反应物的入口200，热电偶215和它的导体218和销(按照该序列)，空气压力口206(用于移动该栓塞182对在212处的反应混合物加压)，用于接收反应物混合物的在212处的反应物接纳壳体，当容器180用作柱时在色谱分析过程中分配溶剂和被分析物的在213处的第一分配板以及在聚合后在212处的柱中分离之后用于接收溶剂和被分析物的第二分配板215。以这一排列，辐射穿过该窗口192来控制反应物的聚合反应。这可以在由栓塞182施加的压力下进行。
在图15中显示了沿着图13的线15-15截取的聚合反应容器180的剖视图，其中显示了活塞182，用于对活塞182施加压力以便为在212处的反应物加压的气隙210，同时它由X-射线辐射和由贮器190中的流水所冷却。
从以上描述可以理解，包括生孔剂或溶剂的聚合反应混合物在辐射的控制下聚合成多孔填料。对于这一目的，应该有至少一种物质，其由辐射引发进行聚合反应。一些物质可以发射出影响其它物质的辐射线，进而引发或促进聚合反应。对于这一目的，辐射混合物应该包括至少一种单体，至少生孔剂或溶剂和实现聚合反应的物质。X-射线可仅与单体一起使用来制备载体。如果包括生孔剂或溶剂，该载体可以是多孔的。该X-射线是特别安全的一种辐射类型并且在形成聚合物载体时具有宽的应用。该辐射可以引起聚合反应或辐射物质如溶剂，后者然后进一步发射出可以导致聚合反应的引发或促进的能量。
实施例18均聚物、聚合物树脂和多孔聚合物载体已经通过使用110kV X-射线辐射来制备。在玻璃管形瓶和柱中制备聚合物。将在苯乙烯中含有1％AIBN和0.1％对-三联苯的聚合反应混合物按照在脱气方法中所述进行脱气并填充到1ml小玻璃管形瓶中。该管形瓶用螺帽密封。该管形瓶使用111kVp功率以600R/小时X-射线进行曝光两天。在打破管形瓶的玻璃之后，获得了管形瓶的形状的刚性的本体聚苯乙烯聚合物。
实施例18的替代版本根据以上方法制备均聚甲基丙烯酸缩水甘油酯。
根据以上方法通过使用液体混合物聚合反应制备均聚苯乙烯。在含有1％的AIBN和0.1％的对-三联苯的甲苯中的50％苯乙烯在600R/小时X-射线下聚合两天。按照以上对于辐射所述的相同条件，在聚合之后获得聚苯乙烯。
通过使用1∶1比率的苯乙烯和二乙烯基苯，根据以上方法制备聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)树脂。聚合反应混合物含有0.9g苯乙烯，0.9g二乙烯基苯，17mg AIBN，5.7mg对-三联苯。在聚合之后获得聚合物树脂。在与以上对于辐射所述的相同条件下，在5小时的聚合反应之后发生胶凝化。
通过使用1∶1比率的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，根据以上方法制备聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)树脂。聚合反应混合物含有0.9g GMA，0.9gEDMA，17mg AIBN，5.7mg对-三联苯。在聚合之后获得聚合物树脂。在与以上对于辐射所述的相同条件下，在5小时的聚合反应之后发生胶凝化。
通过使用1∶1比率的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)，根据以上方法制备聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)多孔载体。聚合反应混合物含有0.45g GMA，0.46g EDMA，0.91g环己醇，20mg AIBN，1.5mg对-三联苯。在聚合之后获得多孔聚合物。在与以上对于辐射所述的相同条件下，在6小时的聚合反应之后发生胶凝化。
通过使用含有0.45g苯乙烯，0.45g二乙烯基苯(80％纯度)，0.91g环己醇，20mg AIBN，6.5mg对-三联苯，根据以上方法制备聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)多孔载体。在聚合之后获得多孔聚合物。在与以上对于辐射所述的相同条件下，在4.5小时的聚合反应之后发生胶凝化。
实施例19具有不同内径(包括75微米，100微米，200微米，250微米，320微米，530微米和700微米)的二氧化硅毛细管用1M氢氧化钠液体混合物在烘箱中在90℃下改性2小时。该毛细管然后用60柱体积的去离子水和丙酮洗涤。它通过经由该柱吹扫的氮气被干燥20分钟。毛细管填充硅烷化液体混合物，其含有在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的50％(v/v)甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酯和0.02％(w/v)氢醌。在毛细管的两端被密封之后，它在烘箱中在100℃下加热约10小时，然后用DMF和丙酮洗涤。在洗涤之后，毛细管用氮气吹扫来干燥。
用在表1中所列的各种组分的组成，与实施例1中所述同样地制备聚合反应液体混合物。
各改进的毛细管(通常15～20cm)填充以上聚合反应液体混合物。毛细管的两端分别地密封在两个1.8mL小玻璃管形瓶中，后者也填充了聚合反应液体混合物。特氟隆和石蜡膜(parafilm)用于双重密封该管形瓶的盖子。在各管形瓶中保留约500微升的空白空间和毛细管的端部位于该管形瓶的一半高度处。通过使用相同的密封管形瓶来制备两个到四个柱。通过将顶部管形瓶直立夹持，该毛细管垂直地悬挂在表1中所列的某些温度下的水浴中20小时。在聚合之后，该整体式毛细管柱用约20柱体积的有机溶剂洗涤，通常为乙腈，有时为己烷(当矿物油用作生孔剂时)。
该柱用LC表征方法1a在3，5和10微升/分钟的流速下表征。实现了大的分辨率。
表1.聚合反应液体混合物组成和聚合反应条件。
实施例19的替代版本与以上实施例中同样地，用下列聚合反应液体混合物制备整体式毛细管柱40g BMA，2.6g EDMA，3.8g 1-丙醇，1.6g 1，4-丁二醇，0.6g水和0.04g AIBN。聚合反应是在60℃下进行的。该柱通过使用微量分析的液相色谱系统，用LC表征方法1a来表征。该流速是5微升/min。实现了蛋白质的优异分离。
利用BMA/EDMA比率的变化(1/3到3/2)和不同的生孔剂浓度(1-丙醇相当于总反应混合物的34-39wt％，而1，4-丁二醇相当于20-15wt％)来合成许多其它聚(丙烯酸酯)型毛细管整体料。
与在实施例19中同样地，用下列聚合反应混合物制备另一个柱2.2g DVB，1.3g苯乙烯，0.9g丙烯腈，4.7g矿物油，0.8g甲苯和0.044gAIBN。聚合反应温度是75℃。这一类型的许多其它柱是用从0到50％的在聚合物基质中丙烯腈含量的变化来制备的。该聚合物显示了提高的亲水性但有不同的蛋白质的保留性能。与在实施例19中同样地，用下列聚合反应混合物制备另一个柱0.8g GMA，2.4g EDMA，0.8gATMS，3.1g 1-丙醇，2.6g 1，4-丁二醇，0.3g水和0.04g AIBN。聚合反应在60℃下进行20小时。在聚合之后，在柱中的生孔性溶剂用乙腈洗掉。然后它们填充改性液体混合物，它是TMA和水的1∶2体积比的混合物且含有0.45g/ml TMA HCl。改性是在40℃下进行4小时。
实施例20与在实施例1中同样地，但用下列混合物制备聚合反应液体混合物3.2154g丙烯酸，8.0026g甲基丙烯酸甲酯，1.6064g甲基丙烯酸缩水甘油酯，19.2055g二甲基丙烯酸乙二醇酯，43.8952g 1-十二烷醇，9.0017g环己醇，320mg二苯基(2，4，6三甲基(苯甲酰基)膦氧化物。聚合反应混合物超声波处理5分钟，然后倾倒在柱中，它的一端由TEFLON盖子密封，然后该柱用另一个特氟隆盖子密封。聚合反应曝光于寻常的吊灯达7天。柱用20个柱床体积的乙腈，然后用20个柱床体积的水洗涤。该柱用色谱法表征。
实施例20的替代版本与以上实施例同样地，用下列混合物制备尺寸10cm×1cm ID的玻璃柱2.5074g甲基丙烯酸缩水甘油酯，2.5003g二甲基丙烯酸乙二醇酯，7.5003g对二甲苯，和58.2mg二苯基(2，4，6三甲基(苯甲酰基)膦氧化物。聚合反应混合物曝光于寻常的吊灯达24小时。在另一个2ml管形瓶中进行相同的聚合反应达24小时。单体转化率是92％。
在管形瓶中用下列聚合反应混合物制备均聚甲基丙烯酸缩水甘油基酯10g GMA和0.1g二苯基(2，4，6三甲基(苯甲酰基)膦氧化物。液体混合物曝光于寻常的吊灯达24小时。在3小时后聚合物胶凝化。获得非常透明的聚合物。
在管形瓶中用下列聚合反应混合物制备均聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)10g GMA，10g二甲苯和0.1g二苯基(2，4，6三甲基(苯甲酰基)膦氧化物。液体混合物曝光于寻常的吊灯达24小时。在3小时后聚合物胶凝化。获得透明的聚合物。
在图16中显示了用于聚合形成色谱柱的装置220，它具有温度读出装置222，为该柱控制热传递的设备224和热控制设备226。在优选实施方案中热传递装置224是水浴(柱浸入其中)，但能够是用于将热量引入到柱中的任何其它合适设备，如烘箱或辐射加热器或电加热器等等。它装有温度测量装置如热电偶，它们被插入聚合反应混合物中以连续地监测这些柱的温度横截面，从而通过在单个柱内的温度测量装置的读数之间的对比，检测出在该柱的不同位置上的任何温度梯度或温度不连续性。全部这些柱可以如此精确地监测，但是在一些情况下当聚合反应混合物是相同的和柱的尺寸是相同的时则监测很少的柱，或对于非常可预测的聚合反应，没有柱被监测但是聚合反应混合物温度特性的过去历史可以利用作为替代。
在图16中，为了举例说明的目的显示了六个柱228A-228F，因为任何合适数量都可以使用。柱228D被显示具有从其延伸的三个导体230A-230C。导体的一端连接到温度测量装置和另一端连接到温度读出装置222，以提供温度变化的分布和检测在它们之间的任何差异。类似地，其它柱以示意图方式显示具有从它们中延伸出的导体并且希望代表能够监测温度横截面的从任何数量热电偶引出的任何数量的导体。通常两个导体是足够的，其中一个在柱的中心和另一个接近该柱的壁。
在优选实施方案中热控制设备226是加热器232，它可以是浸入该水浴中的电加热器，虽然能够使用其它类型的加热器(由它们的相应设备控制)。加热器控制器234，它在优选实施方案中是用于控制该加热器的电能来源，和温度测量装置336，它在优选实施方案中是浸入水浴中的恒温设备。温度读出和控制器240，它可以按照恒温器的方式被连接到该加热器控制器234，但是至少读出在柱的环境如水浴中的温度。也可以包括水循环系统，如果需要的话它能够以受控方式改变水来冷却该水浴。温度读出装置222包括三个读出装置，它们可以是在三个点上记录温度的任何类型的长条纸记录器或数字记录器的形式。还包括比较检测器，以便利用指示有放热存在的预定数量，确定三个点中的任一个是否与任何其它点偏离。一种此类设备显示在242处和另一个一般性地在244处标明。各测量装置的温度另一方面可以由操作员各个地读取，在此时根据需要进行任何温度调节。
在图17中显示了具有柱壁346的柱228D的不完全的、示意性的视图，该柱填充了聚合反应混合物348并在其中插入了三个温度测量装置壁测量装置350A，在柱的中心的测量装置350B，和处在该中心和壁的中间的测量装置350C。这些设备可以位于任何合适位置上，以提供一种分布，使得可以检测在径向上该柱的温度梯度。该热电偶连接到它们的相应导体230A，230B和230C以便为温度测量装置242指示温度。
以这一排列，在水浴中的该柱被升温到可使聚合反应有足够交联的某温度但维持低于自维持温度，在该自维持温度下聚合反应放出的热量足够以失控方式继续进行聚合反应，产生越来越多的热量来加速反应和再产生更多的热。该热量是分步骤引入的，这维持了恒定的温度横截面以避免在柱的横截面中在不同速率下发生聚合反应。
聚合反应可以在一种温度下发生，该温度是通过该类型的柱的过去历史确定的或从柱内的温度测量装置中的温度读数确定。另一方面，随着聚合反应进行，在没有进入温度失控区域的情况下能够容忍不同的温度值并且可以安全地使用更高的温度，以便为柱提供所需要的特性。按照这一模式，水浴的温度可以在一种温度下维持一段时间，然后提高到另一种温度。可以使用一系列的此类步骤。
实施例21在75mm长×35mm内径的柱中，用下列混合物制备供蛋白质分离用的弱阳离子交换柱36.01g EDMA，3.01g GMA，15.01g MMA，6.09g丙烯酸，0.94g AIBN，85.67g 1-十二烷醇和10.57g环己醇。聚合反应在40℃的水浴中进行72小时，随后在60℃下进行聚合反应24小时。该柱用10个柱床体积的乙腈在45℃和300psi的恒定压力下洗涤。该柱由液相色谱法表征并实现了良好的蛋白质分离。
实施例22用下列混合物制备具有75mm长度×35mm内径的弱阳离子交换柱36.02g EDMA，3.03g GMA，15.03g MMA，6.08g丙烯酸，0.93g AIBN，85.64g 1-十二烷醇和10.53g环己醇。
该柱在40℃下聚合72小时，随后在60℃下聚合24小时。使用10个柱床体积的乙腈在45℃和300psi的恒定压力下洗涤生孔剂。实现良好的蛋白质分离。
实施例23用下列混合物制备35mm内径、100mm长的弱阳离子柱12.81g丙烯酸，32.01g MMA，6.40g GMA，76.83g EDMA，176.04g 1-十二烷醇，16.00g环己醇和1.96g AIBN。
在水浴中在40℃到60℃的温度下进行聚合反应12小时，然后在60℃下进行24小时。在首先12小时中温度线性地从40℃提高到60℃。该柱用10个柱床体积的乙腈在45℃和300psi的恒定压力下洗涤。
实施例24用装有下列混合物的35mm内径和300mm长度的柱壳体制备弱阳离子交换柱12.81g丙烯酸，32.01g MMA，6.40g GMA，76.83g EDMA，176.04g 1-十二烷醇，16.00g环己醇和1.96g AIBN。
在温度从40℃线性提高到60℃的情况下进行聚合反应12小时，然后在60℃下进行24小时。与以上实施例中同样地洗涤该柱。实现良好的蛋白质分离。
实施例25在装有下列混合物的35mm内径、300mm长度的柱壳体中制备弱阳离子交换柱18.05g丙烯酸，45.06g MMA，9.21g GMA，108.13g EDMA，238.52g 1-十二烷醇，31.56g环己醇和3.1g AIBN。
混合物在40℃下聚合72小时，随后在60℃下聚合24小时。如上所述该柱进行洗涤并实现良好的蛋白质分离。
实施例26用下列混合物制备具有75mm长×35mm内径的尺寸的强阴离子交换柱8.11g GMA，24.09g EDMA，8.07g ATMS，28.06g 1-丙醇，29.14g 1，4-丁二醇，3.05g水和0.48g AIBN。
混合物在40℃下聚合72小时，随后在60℃下聚合24小时。该柱由液相色谱法表征并实现了良好的蛋白质分离。
实施例27用下列混合物制备具有35mm内径和75mm长度的尺寸的强阴离子交换柱8.0317g GMA，24.0089g EDMA，8.0295g ATMS，27.0134g 1-丙醇，30.0176g 1，4-丁二醇，3.0344g水和0.6177g AIBN。它在40℃下聚合72小时，随后在60℃下聚合12小时。该柱由液相色谱法表征并实现了良好的蛋白质分离。
实施例28具有35mm内径和300mm长度的尺寸的强阴离子交换柱通过使用下列混合物聚合得到强阴离子交换柱25.66g GMA，76.81g EDMA，25.64g ATMS，96.04g 1-丙醇，86.49g 1，4-丁二醇，9.62g水和1.99g AIBN。
混合物以40℃到60℃的线性进展来聚合24小时，然后在60℃下保持12小时。它经历从10psi到150psi的逐渐增加的压缩作用达12小时。该柱由液相色谱法表征并实现了良好的蛋白质分离。
实施例29用下列混合物制备具有35mm内径和100mm长度的尺寸的用于肽分离的柱100.06g DVB，108.77g TEG，41.26g TEG-DME和1.27g AIBN。
混合物在40℃到60℃聚合12小时，然后在60℃下聚合24小时，其中从10psi到150psi的线性增加的压缩作用保持4小时。该柱由液相色谱法表征并实现了良好的肽分离。
实施例30与在实施例2中相同地，用下列聚合反应混合物在具有34mm内径和25cm长度的柱中制备多孔整体式聚合物12.81g AA，32.01gMMA，6.40g GMA，76.83g EDMA，176.04g 1-十二烷醇，16.00g环己醇，1.96g AIBN。该柱在150psi压力和25℃下聚合48小时，然后在60℃下聚合24小时。
它连接到HPLC泵和分别用20个柱床体积的THF和水洗涤。
该柱用6mol/l NaOH在80℃下进行水解反应1小时。它用20个柱床体积的水洗涤，并用蛋白质分离和在LC表征方法中所述的结合容量测量来表征。
实施例30a的替代版本如在实施例30中那样地制备柱，只是在24小时中有40℃到60℃的聚合温度的程序控制线性梯度。它然后在60℃下固化另外12小时。
与在以上实施例中同样地，用相同的温度梯度制备具有4.6mm直径和5cm长度的柱。
与在以上实施例中同样地，用相同的温度梯度制备具有10mm直径和10cm长度的柱。
实施例31如在实施例21中那样地，用下列聚合反应液体混合物制备具有34mm直径和25cm长度的柱78.80g的EDMA，38.46g的GMA，11.91g的AMPS，11.72g的4.9M NaOH含水液体混合物，12.44g水，162.23g的1-丙醇，38.79g的1，4-丁二醇和1.97g的AIBN。该柱分别用20个柱床体积的乙腈和水洗涤。该聚合物进一步在0.5MH2SO4中在60℃下水解3小时，然后用10个柱床体积的去离子水洗涤。这一水解的聚合物进一步用下列程序来改性该柱用5个柱床体积的干燥乙腈预洗涤，以除去在柱中的水。5个柱床体积的改性剂在250psi的恒定压力下被泵送通过该柱。改性反应在60℃下进行3小时。在反应后，改性剂用5个柱床体积的0.5M H2SO4从柱中洗涤，随后用另外10个柱床体积的超纯(nanopure)水洗涤。该改性剂按照以下程序制备将含有10％吡啶的乙腈在冰浴中冷却至低于10℃，然后将等量的氯磺酸逐渐地添加到冷却了的液体混合物中。在整个制备过程中，液体混合物的温度被控制低于室温。
实施例31a的替代版本如在实施例31中那样地制备柱，只是在24小时中有40℃到60℃的聚合温度的程序控制线性梯度。它然后在60℃下固化另外12小时。
与在以上实施例中同样地，用相同的温度梯度制备具有4.6mm直径和5cm长度的柱。
与在以上实施例中同样地，用相同的温度梯度制备具有10mm直径和10cm长度的柱。
如在实施例31中那样地，只是使用下列聚合反应混合物来制备柱78.80g EDMA，38.46g GMA，11.91g AMPS，13.89g的4.9M NaOH含水液体混合物，6.22g水，140.85g 1-丙醇，32.02g1，4-丁二醇和1.97g AIBN。
从以上叙述可以理解，本发明的新型整体式固体载体具有几个优点，例如(1)以优于现有技术的方式提供色谱图；(2)它能够简单地和廉价地制造；(3)它对于一些分离操作提供比现有技术的分离更高的流速，因此减少了一些分离的时间；(4)它对于一些分离过程在比一些现有技术方法更低的压力下提供高分辨率分离；(5)它通过降低柱的成本，为一次性柱提供高分辨率；(6)它能够容易地制造出许多不同形状的柱，例如用于环形色谱分析的环形柱，并且以任何尺寸制得，尤其小尺寸，如用于微芯片和毛细管和用于采用整体式可渗透的聚合物尖端的质谱注射器；(7)它快速地分离小的和大的分子；(8)它能够为许多方法提供出众的分离介质，其中尤其包括萃取，色谱，电泳，超临界流体色谱法和催化用的固体载体，TLC和集成的CEC分离或化学反应；(9)它能够为某些已知的可渗透的整体式分离介质提供更好的特性；(10)它为具有均匀的分离-有效开孔尺寸分布的大直径柱的制备提供了新途径；(11)它提供分离介质，在高度含水流动相中没有管壁效应和具有改进的柱效率；(12)它改进了分离有效因子；和(13)它减少了在反相柱中溶胀和收缩的问题。
虽然以一些特殊性描述了本发明的优选实施方案，但是在以上教导的启发下，在本发明中的许多变化是可能的。因此，可以理解，在所附权利要求的范围内，本发明能够在具体描述的方式以外实施。
权利要求
1.色谱系统，包括样品注射器；至少一个色谱柱，它具有柱壳体和在柱壳体内的填料，该填料被定位以接收来自样品注射器的样品的至少一种可渗透的整体式聚合物；与色谱柱连通的为该至少一个色谱柱供应溶剂的溶剂系统，从而在该至少一个色谱柱中样品被分离成它的组分；所述至少一个柱壳体包括具有柱内壁表面的柱壳体壁；和接收来自所述色谱柱的流体的公用设备，其特征在于与柱壁的内表面接触的具有光滑的壁但没有不连续性的至少一种可渗透的整体式聚合物的、温度-时间调节的填料。
2.根据权利要求1的色谱系统，其特征在于该至少一个色谱柱包括在该至少一种可渗透的整体式聚合物的、温度-时间调节的填料的相应一种填料中的相应温度测量设备。
3.根据权利要求1或权利要求2的色谱系统，其特征在于该至少一种可渗透的整体式聚合物的、温度-时间调节的填料包括二乙烯基苯。
4.根据权利要求1或权利要求2的色谱系统，其特征在于该至少一种可渗透的整体式聚合物的、温度-时间调节的填料包括带有疏水性表面基团的甲基丙烯酸缩水甘油酯。
5.根据权利要求1或权利要求2的色谱系统，其特征在于该至少一种可渗透的整体式聚合物的、温度-时间调节的填料包括脲甲醛。
6.根据权利要求1或权利要求2的色谱系统，其特征在于该至少一种可渗透的整体式聚合物的、温度-时间调节的填料包括二氧化硅。
7.根据权利要求1-6中任何一项的色谱系统，其特征在于该柱壳体是玻璃。
8.根据权利要求1-7中任何一项的色谱系统，其特征在于该至少一个可渗透的整体式聚合物的、温度-时间调节的填料是尺寸补偿的。
9.进行色谱分析的方法，包括以下步骤将样品加入到色谱柱中，该色谱柱具有柱壳体和聚合物整体式填料，该聚合物整体式填料基本上没有由放热所导致的不均匀的孔隙尺寸；和将溶剂供应到色谱柱中，从而样品在色谱柱内被分离成它的组分，其特征在于该聚合物整体式填料是温度-时间调节的。
10.根据权利要求9的进行色谱分析的方法，其特征在于将样品加入到具有柱壳体和聚合物整体式填料的色谱柱中的步骤包括将样品加入到尺寸补偿的色谱柱中的步骤。
11.根据权利要求9或10的方法，其特征在于将样品加入到具有柱壳体和聚合物整体式填料的色谱柱中的步骤包括将样品加入到包括乙烯基的可渗透的整体式聚合物填料中的步骤。
12.根据权利要求9或10的方法，其特征在于将样品加入到具有柱壳体和聚合物整体式填料的色谱柱中的步骤包括将样品加入到包括脲甲醛的可渗透的整体式聚合物填料中的步骤。
13.根据权利要求9-12中任何一项的方法，其特征在于将样品加入到具有柱壳体和聚合物整体式填料的色谱柱中的步骤包括将样品加入到包括二氧化硅聚合物的可渗透的整体式聚合物填料中的步骤。
14.色谱柱，包括具有柱内壁的色谱柱支撑体和在所述柱壁内的具有分离-有效开孔的可渗透的整体式聚合物填料，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料是在有温度-时间调节的情况下由聚合反应形成的具有横截面均匀性的聚合物。
15.根据权利要求14的色谱柱，其特征在于该分离-有效开孔的尺寸至少部分地由聚合反应过程中的压力控制。
16.根据权利要求14或15的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料具有光滑的壁并且通过压力进行尺寸补偿。
17.根据权利要求14-16中任何一项的色谱柱，其特征在于在该可渗透的整体式聚合物填料内基本上没有孔隙和该可渗透的整体式聚合物填料具有光滑的壁。
18.根据权利要求14-17中任何一项的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料在该填料的壁中不具有通道化开孔。
19.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料主要地由甲基丙烯酸酯形成。
20.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料主要地由带有疏水性表面基团的甲基丙烯酸酯形成。
21.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料主要地由脲甲醛形成。
22.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料主要地由二氧化硅形成。
23.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料主要地由甲基丙烯酸缩水甘油酯的聚合物和二甲基丙烯酸亚乙基酯的聚合物按照1∶1到2∶1的重量比形成。
24.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料主要地由甲基丙烯酸缩水甘油酯的聚合物和二甲基丙烯酸亚乙基酯的聚合物按照3∶2的重量比形成。
25.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料包括二乙烯基苯和苯乙烯按照3∶1到9∶1的比率的混合物作为其主要组分。
26.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该可渗透的整体式聚合物填料包括二乙烯基苯和苯乙烯按照4∶1的比率的混合物作为其主要组分。
27.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该柱含有35wt％-80wt％的二乙烯基苯。
28.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该柱含有64wt％的二乙烯基苯。
29.根据权利要求14-18中任何一项的色谱柱，其特征在于该柱包括其内部有温度测量设备的聚合物填料。
30.根据权利要求14-29中任何一项的色谱柱，其特征在于具有大于10mm的直径。
31.根据权利要求14-30中任何一项的色谱柱，其特征在于每平方毫米的孔隙体积以及在该柱的纵轴方向上每平方毫米的孔隙开孔的平均尺寸从一个位置到另一个位置没有变化，和变化率不超过5％。
32.制造色谱柱的装置，包括适于在聚合反应过程中容纳聚合反应混合物的温度受控的反应室，其特征在于用于改变聚合反应过程中的温度的设备，从而该聚合反应混合物是温度-时间调节的。
33.根据权利要求32的制造色谱柱的装置，其特征在于用于对在所述温度受控的反应室中的所述聚合反应混合物加压的设备。
34.根据权利要求33的装置，其特征在于该用于加压的设备是利用可移动元件加压的设备。
35.根据权利要求34的装置，其特征在于该可移动元件具有光滑的表面，当在聚合反应过程中施加压力时，该光滑表面定位以接触该聚合反应混合物。
36.制造色谱柱的装置，包括适于在聚合反应过程中容纳聚合反应混合物以形成填料的温度受控的反应室；用于将水溶液加入到填料中的含水处理设备；和用于对所述填料加压以减少填料中的空隙的设备，其特征在于该温度受控的反应室包括用于温度-时间调节的设备。
37.根据权利要求36的装置，其特征在于用于对填料施加辐射的辐射设备；和用于控制该辐射的控制设备。
38.一种方法，包括以下步骤将聚合反应混合物加入到柱壳体中，其特征在于采用低温聚合和高温聚合的结合在柱壳体内聚合该聚合反应混合物的步骤。
39.根据权利要求38的方法，其中将聚合反应混合物加入到柱壳体中的步骤包括将聚合反应混合物加入到具有至少10mm直径的柱壳体中的步骤。
40.一种方法，包括以下步骤将聚合反应混合物加入到柱壳体中，其特征在于聚合反应混合物包括含有磺基的官能化单体；和直接聚合该混合物以得到强阳离子交换剂。
41.根据权利要求40的方法，其特征在于将聚合反应混合物加入到柱壳体中的步骤包括以下步骤水解在聚合反应混合物中的聚合物和用氯磺酸改性在水解该聚合物的步骤中所形成的羟基。
42.根据权利要求40或41的方法，其特征在于将聚合反应混合物加入到柱壳体中的步骤包括以下步骤水解在聚合反应混合物中的聚合物和用氯磺酸的吡啶盐溶液改性在水解该聚合物的步骤中所形成的羟基。
43.制造整体式色谱柱的方法，包括制备聚合反应混合物的步骤，其特征在于在温度-时间调节的条件下进行聚合反应，从而温度梯度得到控制以防止在整体式色谱柱中的空间横截面变化。
44.根据权利要求43的方法，其特征在于聚合反应在压力下进行，从而施加足够的压力以防止由于聚合反应过程中的收缩作用，由真空导致形成空隙。
45.制造整体式色谱柱的方法，包括以下步骤制备包括生孔剂的聚合反应混合物，其特征在于用温度-时间调节来进行聚合反应以形成聚合物填料；洗涤聚合物填料以除去生孔剂，其中填料倾向于溶胀；和施加压力以防止聚合物填料的溶胀和除去空隙。
46.制造强阴离子柱的方法，包括以下步骤混合GMA、ATMS、EDMA、引发剂和生孔剂以形成聚合反应混合物；在柱中聚合该混合物，其特征在于混合物在温度-时间调节的条件下进行聚合以形成填料。
47.根据权利要求46的方法，其特征在于聚合该混合物的步骤包括以下步骤在从低温的控制引发点起始到逐渐地提高温度到安全点的梯度温度下进行聚合，和在更高温度下进行固化，其中避免了温度失控和获得了充分的聚合和交联。
48.根据权利要求46或权利要求47的方法，其特征在于聚合该混合物的步骤包括以下步骤在从35-45℃的控制引发点起始到逐渐地提高温度到安全点的梯度温度下进行聚合，和在更高温度下进行固化。
49.根据权利要求46-48中任何一项的方法，其特征在于聚合该混合物的步骤包括以下步骤在从控制引发点起始到逐渐地提高到安全点的梯度温度下进行聚合，和在更高温度下进行固化。
全文摘要
在柱壳体中制备可渗透的聚合物整体式材料。在一个实施方案中，通过利用来自外部源的热量在低温如40摄氏度(这取决于混合物和柱的尺寸)下开始聚合反应，然后在更高温度如60摄氏度下继续进行，从而聚合形成了可渗透的聚合物整体式材料。在聚合反应开始时的温度是足够低的以便不引起放热失控条件和避免高的反应热，高的反应热将防止横穿该柱的横截面有基本上恒定的温度。在足够单体消耗之后使用更高的温度和位阻干扰增加，因此聚合反应是足够缓慢的以避免反应产生的热量足够的高而在孔隙尺寸的均匀性上引起明显减少。
文档编号G01N30/56GK101035602SQ200580034250
公开日2007年9月12日 申请日期2005年8月2日 优先权日2004年8月6日
发明者S·谢, M·徐, R·W·阿灵顿 申请人:迪奥尼斯公司