Wnt蛋白及癌症的检测与治疗的制作方法

专利名称：：Wnt蛋白及癌症的检测与治疗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肝癌的检测与治疗。
背景技术：
：肝细胞癌(HCC)是肝脏主要的原发性恶性肿瘤。虽然已经鉴定了病毒病原学因素，但是肝癌形成期间导致胂瘤发展的分子机制在很大程度上仍然未知。蛋白的Frizzled家族由IO个或更多个七跨膜蛋白组成，这些蛋白起Wnt蛋白受体的作用。Wnt/Frizzled信号传导网络影响多种生物学过程，其范围从细胞命运决定到细胞迁移和增殖。卩-联蛋白是在细胞-细胞粘着中发挥作用的多因子蛋白，其参与增强4丐粘着蛋白及a-联蛋白与肌动蛋白细胞骨架的连接。当缺乏Wnt/Frizzled信号传导时，卩-联蛋白通过与糖原合酶激酶(GSK)-3(3的相互作用被磷酸化，并形成与轴蛋白和腺瘤性结肠息肉蛋白(adenomatouspolyposiscoliprotein,APC)的复合物。随后，卩-联蛋白被靶向来由泛蛋白蛋白酶体系统降解。相反，Wnt配体与其Frizzled受体的结合通过抑制GSK-3卩酶促活性稳定细胞内的p-联蛋白。然后，(3—联蛋白易位到纟田月包核中，与高速泳动族(highmobilitygroup)结构域因子，如Tcf/Lef联合。该复合物与生长调节及细胞迁移相关基因的转录上调有关。发明概述本发明部分基于下述发现，即Wnt3、8b和11是Frizzled7的配体，其通常在HCC中，例如在乙肝病毒(HBV)相关的HCC中在mRNA和蛋白水平过度表达。过度表达Frizzled7的肝癌细胞显示出细胞移动性和迁移增强。过度表达似乎为肝细胞转化的多步过程中的早期事件，因此，Frizzled7及Wnt3、8b和11是肝癌治疗中新的分子靶标。因此，在一方面，本发明纟是供了鉴定抗癌剂的方法。该方法包4舌择选与包含Wnt3、Wnt8b或Wnt11蛋白的氨基酸序列或其FZD结合片段的多肽结合的测试化合物，和任选的测定测试化合物是否能够(i)降低细胞中Wnt/FZD7信号传导，U)降低肝癌细胞移动性，(iii)降低肝癌细胞中卩-联蛋白的积聚；或(iv)在体外或体内治疗肝癌；其中能够达到(i)到(iv)中至少一项的测试化合物是抗癌剂。在一些实施例中，选择测试化合物可以包括提供包含Wnt3、Wnt8b或Wnt11蛋白的氨基酸序列或其i《D结合片段的多肽，将所述多肽与测试化合物接触，检测所述多肽与测试化合物之间的结合；和如果所述测试化合物和多肽结合，选择所述测试化合物。与测试化合物结合的多肽可以是(i)天然存在的多肽，(ii)重组多肽，(iii)在细胞表面表达的多肽，或(iv)分离的多肽。当多肽包含Wnt3蛋白的氨基酸序列时，所述多肽可以包含SEQII〕NO:8到12中的任一序列。当所述多肽包含Wnt8b蛋白的氨基酸序列时，所述多肽可以包括SEQIDNO:5到19中任一序列。当多肽包含Wnt11蛋白的氨基酸序列时，所述多肽可以包含SEQIDNO:22到26中任一序列。在某些实施例中，所述多肽包含SEQID:7到27中任一序列以及至少一个非Wnt序列。测试化合物可以选自下组多肽、核糖核酸、小分子(如小有机分子)和脱氧核糖核酸。通过本文所述的鉴定癌症试剂的方法鉴定的抗癌剂包括，但不限于，抗Wnt抗体，如单克隆抗体，FZD7受体，FZD7受体的Wnt结合片段和其它结合Wnt的化合物。通过这些方法鉴定的抗癌剂可以^^用于治疗癌症，例如肝癌。此外，通过这些方法鉴定的抗癌剂可以一皮用于制备用以治疗肝癌或降低患者中肝癌细胞移动'性的药物。另一方面，本发明包括鉴定候选抗癌剂的方法。该方法包括(a)提供第一多肽，所述第一多肽(i)含有FZD多肽(如FZD7多肽)或其片段；和(ii)显示与Wnt(如Wnt3、8b或11)结合的能力；(b)提供第二多肽，所述第二多肽(i)含有Wnt多肽(如Wnt3、8b或11多肽)或其片段；和(ii)显示与FZD(如FZD7)结合的能力；(c)在存在测试化合物的条件下使第一和第二多肽接触；和(d)比较存在测试化合物时第一与第二多肽的结合水平和不存在测试化合物时的结合水平，其中存在测试化合物时与不存在时相比结合水平下降表明测试化合物是候选的抗癌剂。该方法可以进一步包括(e)确定候选抗癌剂是否能够(i)降低细胞中Wnt/FZD7信号传导；(ii)降低癌细胞移动性；(iii)降低癌细胞中p-联蛋白的积聚；或(iv)在体外或体内治疗癌症；其中能够达到(i)至(iv)中至少一项的候选物是抗癌剂。所述测试化合物可以选自下组多肽、核糖核酸、小分子(如小有机分子)和脱氧核糖核酸。Wnt多肽可以包括，如SEQII)NO:8到12,15到19和/或22到26。FZD多肽可以包括，如S1:QII)N():l，2和/或3。在某些实施例中，第一多肽是包含FZX)多肽(如FZD7多肽)的第一融合蛋白，所述FZD多肽与(i)转录因子的转录激活结构域或(ii)转录因子的DNA结合结构域融合；第二多肽是含有Wnt多肽(如Wnt3、8b或11多肽)的第二融合蛋白，所述Wnt多肽与(i)转录因子的转录激活结构域或(ii)转录因子的DNA结合结构域融合，其中FZD多肽与和Wnt多肽融合的结构域不同的结构域融合；并根据转录因子的重构(reconstitution)检测第一和第二多肽的结合。通过本发明所述方法鉴定的抗癌剂(和/或候选抗癌剂)可以被用于治疗癌症，例如肝癌。此外，通过本发明所述方法鉴定的抗癌剂(和/或候选抗癌剂)可以被用于制备用以治疗癌症，例如肝癌的药物。另一方面，本发明提供了确定细胞(如肝细胞)是否是癌细胞，或者有成为癌细胞的风险的方法。该方法包括(a)提供测试细胞(如肝细胞)；(b)确定与对照细胞相比，是否该细胞的FZD7和/或Wnt3表达水平较高，和/或FZD8和/或Wm11表达水平较4氐；和(c)如果与对照细胞相比，测试细胞的FZD7和/或Wnt3表达水平较高，和/或测试细胞的FZD8和/或Wnt11表达水平较低，则将测试细胞分类为(i)癌细胞或(ii)有成为癌细胞的风险。当该方法包括确定细胞的FZD7和/或Wnt3表达水平时，该方法可以进一步包括(c)确定测试细胞的FZD8和/或Wnt11表达水平是否低于对照细胞，其中更低的FZD8和/或Wnt11表达水平指示测试细胞是癌细胞，或者有成为癌细胞的风险。当该方法包括确定细胞的FZD8和/或Wnt11表达水平时，该方法可以进一步包括(c)确定测试细胞的FZD7和/或Wnt3表达水平是否高于对照细胞，其中较高的FZD7和/或Wnt3表达水平指示测试细胞是癌细胞，或者有成为癌细胞的风险。另一方面，本发明提供确定患者是否患有癌症或有患有癌症的风险，例如测试的组织样本是否来自患有癌症或冇患有癌症的风险的患者的方法。该方法可以包括(a)提供从患者获得的测试组织样本(例如肝脏组织，如胂瘤的或肺瘤周围的肝脏组织)，和(b)确定与AM建康个体中获得的可与之比较的组织样本相比，测试组织样本中FZD7和/或Wnt3的表达水平是否4交高，和/或FZD8和/或Wnt11的表达水平是否较低，其中测试组织样本中较高的FZD7和/或Wnt3表达水平和/或较低的FZD8和/或Wnt11表达水平指示样本来自于患有癌症或有患有癌症的风险的患者。当该方法包括确定FZD7和/或Wnt3表达水平时，该方法可以进一步包括(c)确定测试组织样本中FZD8和/或Wnt11表达水平是否低于从健康个体获得的组织样本，其中较低的FZD8和/或Wntll表达水平指示样本来自患有癌症或有患有癌症的风险的患者。当该方法包括确定FZD8和/或Wnt11表达水平时，该方法可以进一步包括(c)确定测试组织样本中'，ZD7和/或Wnt3表达水平是否高于从健康个体获得的组织样本，其中较高的FZD7和/或Wnt3表达水平指示患者患有癌症或有患有癌症的风险。在本发明所述的所有方法中，确定FZD7、FZD8、Wnt3或Wnt11的表达水平可以包括例如使用Northern印迹分析或RT-PCR分析确定细胞中FZD7、FZD8、Wnt3或WntllmRNA的量。在其它实施方式中，确定表达水平可以包括例如卩吏用抗Wnt抗体，如与SEQIDNO:7或80结合的抗体确定细胞中FZD7、FZD8、Wnt3或Wntl1蛋白的量。另一方面，本发明包括治疗患者中癌症(如肝癌)的方法。该方法包括向患者施用有效量化合物，所述化合物降低患者表达FZD7的细胞中的Wnt/FZD7信号传导，并且任选对表达FZD7的细胞不是致命的。在一个实施方式中，所述化合物是降低患者中h'ZD7和/或Wnt3表达和/或增加患者中Wntll表达的化合物。在另一个实施方式中，所述化合物是在患者中与Wnt3、Wnt8b、Wnt11、FZD7或FZD8结合的化合物。所述化合物可以是，例如反义寡核苷酸，包含在生理条件下与Wnt核苷酸序列杂交的核苷酸序列的双链RNA(dsRNA),分离的FZD7受体或其Wnt3结合片段，编码Wnt多肽(如Wntl1多肽)或FZD7的截短形式(如缺少FZD7的胞内和/或跨膜结构域的FZD7形式)的遗传构建体，和/或抗FZD和/或抗Wnt抗体(如抗Wnt3抗4本)。所述化合物可以通过任何途径施用，例如通过施用到患者肝脏。在某些实施方式中，所述化合物是与SEQIDNO:7或80结合的抗体。在另一实施方式中，所述化合物是含有SEQII)NO:81、82或83的siRNA。另一方面，本发明包括降低癌细胞(如肝癌细胞)移动性的方法。该方法包括施用给细胞有效量的能够降低细胞中WntZFZD7信号传导的化合物，所述化合物任选对细胞是不致命的。在一个实施方式中，所述化合物是降低患者中FZD7和/或Wnt3表达和/或增加患者中Wntll表达的化合物。在另一实施方式中，所述化合物是与患者中Wnt3、Wnt8b、Wnt11、FZD7或FZD8结合的化合物。所述化合物可以是，例如反义寡核普酸，包含在生理条件下与Wnt核苷酸序列杂交的核香酸序列的双链RNA(dsRNA)，分离的FZD7受体或其Wnt3结合片段，编码Wnt多肽(如Wntl1多肽)或FZD7的截短形式(如缺少FZD7的胞内和/或跨膜结构域的FZD7形式)的遗传构建体，和/或抗FZD和/或抗Wnt抗体(如抗Wnt3抗体)。所述化合物可以通过4壬^T途径施用，例如通过施用给患者肝脏。在某些实施方式中，所述化合物是与SRQIDNO:7或80结合的抗体。在另一实施方式中，所述化合物是含有SEQ1DNO:81、82或83的siRNA。另一方面，本发明包括降低表达FZD7的细胞中Wnt/FZD7信号传导的化合物在制备(i)治疗肝癌的药物或(ii)降低肝癌细胞移动性的药物中的用途。任选的，所述药物对于表达FZD7的细胞是不致命的。在一个实施方式中，所述化合物是降低患者中FZD7和/或Wnt3表达和/或增加患者中Wntll表达的化合物。在另一实施方式中，所述化合物是与患者中Wnt3、Wnt8b、Wnt11、FZD7或FZD8结合的化合物。所述化合物可以是，例如反义寡核苷酸，包含在生理条件下与Wnt核苷酸序列杂交的核苷酸序列的双链RNA(dsRNA)，分离的FZD7受体或其Wnt3结合片段，编码Wnt多肽(如Wntl1多肽)或FZD7的截短形式(如缺少FZD7的胞内和/或跨膜结构域的FZD7形式)的遗传构建体，和/或抗FZD和/或抗Wnt抗体(如抗Wnt3抗体)。一方面，本发明包括抗Wm抗体，例如抗Wnt3抗体，例如与SEQIDNO:7或氨基酸序列LRAKYSLFKPPTEKDL(SEQII)NO:80)结合的抗体。所述抗体可以包含在适于施用给患者的药物组合物中。另一方面，本发明包括本文所述的任一化合物在制备用于治疗或预防本文所述病症，例如癌症，例如肝癌的药物组合物中的用途。所述组合物可以根据本文所述的方法用于治疗癌症和/或降低癌细胞移动性的方法中。所述组合物可以是本文所述的任意形式，例如液体或固体组合物。在某些实施方式中，所述组合物是抗体，如抗Wnt抗体，如与SEQIDNO:7或氨基酸序列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQIDNO:80)结合的抗体。在另一实施方式中，所述化合物是siRNA,如含有核酸序列WNT3-1:5'-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3，(SEQII)NO:81)，額T3-2:5,-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3，(SEQIDN():82)，和/或WNT3-3:5，-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3，(SEQIDNO:83))的siRNA。本发明还包括本文所述的可用于检测Wnt蛋白的核酸(如下表1中所述的引物)。除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义都与本发的方法和材料，但是与本文所述的类似或等同的方法或材料也可以用于本发明的实践或测试。所有本文提及的出版物、专利申请、专利和其它参考文献都全文引入作为参考。如果发生沖突，以本说明书，包括定义为准。材料、方法和实施例仅是说明性的例证，不作为限制。本发明的其它特征和优点将通过下面的详细描述和权利要求显示。图1A是一组银染的二维SDS-PAGE凝胶的照片，其显示用肝素处理(Hep+)或不处理(Hep-)Huh7细月包后，Huh7细胞中分级的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的模式。来自肝素亲合层析的0.25MNaCl级分被分离到第一维的pH3-10非线性IPG凝胶和第二维的4-12%梯度NuPAGE凝胶上。来自未用肝素处理的级分的蛋白斑点(画圆圈；下文表示为"斑点1")显示表达增加。图1B是从斑点1获得的胰蛋白酶肽的质傳图。斑点1被切下，脱色，并用胰蛋白酶消化。在PBSII装置上分析肽质量。标记的峰(*)代表符合人Wnt-11肽计算得到的质量的肽。图1C是琼脂糖凝胶照片，该凝胶显示用RT-PCR在各种肝细胞癌细胞系中检测Wnt配体mRNA。在所有HCC细胞系中#全测到Wnt-3mRNA,在3个HCC细胞系中检测到Wnt-11mRNA而在Focus细胞中没检测到。通过RT-PCR没检测到其它WntmRNA。图2A是显示通过qRT-PCR在HCC细胞系中测定的Wnt3mRNA水平的条形图。采用18SrRNA水平作为内对照，将Wnt3和WntllmRNA水平表示为每10918SrRNA的拷贝数。HCC细胞系中Wnt3mRNA的表达水平(平均值士SE)为每10918SrRNA在HepG2中370.0±10.3，在Hep3B中381.3±12.7，在Huh7中95.2土6.3，和210.4士9.5个拷贝。图2B是条形图，显示通过qRT-PCR在HCC细胞系中测定的Wntl1mRNA水平。采用18SrRNA水平作为内对照，将Wntl1mRNA水平表示为每10918SrRNA的拷贝数。WntllmRNA表达水平为每10918SrRNA在HepG2中8,499.3±845,0，在Hep3B中290.9±40.1和在Huh7细胞中3.57±0.2个拷贝。通过qRT-PCR在Focus细胞中没能检测到Wnt11mRNA，这与常规RT-PCR的结果一致。图3A是显示人HCC组织中Wnt3mRNA表达的条形图。mRNA水平通过qRT-PCR测定。白条表示正常肝脏组织中的mRNA水平。黑条表示HCC组织中的mRNA水平。灰条表示相应的肿瘤周围组织的mRNA水平。实验一式两份进行，数据表示为平均值±SI)。77%的HCC和59%的肿瘤周围组织显示Wnt3mRN八表达水平高于正常肝脏组织的平均值±3SD。与相应的月中瘤周围组织相比，71%的HCC组织Wnt3mRNA表达水平增高。图3B是显示人HCC组织中WntllmRNA表达的条形图。该mRNA水平通过qRT-PCR测定。白条表示正常肝脏组织中的mRNA水平。黑条表示HCC组织中的mRNA水平。灰条表示相应的肿瘤周围组织的mRNA水平。实验一式两份进行，数据表示为平均^1±SD。41%的HCC组织显示表达水平甚至降低至低于正常肝脏组织的较低截止水平(cut-offlevel)，但是在肿瘤周围组织中没有一个显示降低(Fischer精确检验的P二.0036)。65%的成对样本还显示肿瘤与相应的肿瘤周围组织相比Wnt11mRNA表达减少。图3C是显示人HCC组织中FZD7mRNA表达的条形图。该mRNA水平通过qRT-PCR测定。白条表示正常/汗脏组织中的mRNA水平。黑条表示HCC组织中的mRNA水平。灰条表示相应的肿瘤周围组织的mRNA水平。实验一式两份进行，数据表示为平均值土SD。59%的HCC和肿瘤周围组织与正常肝脏组织相比显示FZD7mRNA表达增加。71%的成对样本显示肿瘤与相应的肿瘤周围组织相比FZD7mRNA的表达增加(Wilcoxon符号秩检验的P=.031)。图4A-4D是免疫组织化学染色的人HCC和肿瘤周围组织的照片(放大倍数x400)。图4A:阴性对照。图4B:(3-联蛋白染色的肿瘤周围组织。肝细胞显示典型的膜染色。图4C:卩-联蛋白染色的HCC组织，其显示|3-联蛋白的细胞核积聚。注意到核染色以及(3-联蛋白的细胞质染色增强。图4D:HCC组织，其不显示卩-联蛋白的细胞核或细胞质积聚。图5A是Western印迹的复合图，其显示Wnt3质粒转染对I-ICC细胞系中T-细胞因子(Tcf)转录活性的影响。用myc-标记的Wnt3质粒或pcDNA3.1/myc-HisA质粒，pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH,和卩-半乳糖苷酶质粒共转染Focus、Huh7和Hep3B细胞。转染后24小时，细胞血清饥饿24小时，然后用1%FBSMEM进行刺激。刺激后2小时和24小时收集细胞，进行Wnt3和(3-联蛋白的荧光素酶分析和Western印迹分析。采用兔多克隆抗Wnt3抗体的Western印迹分析显示转染后Wnt蛋白增加。用单克隆抗myc抗体验证多克隆抗Wnt3抗体的特异性。注意到Focus细月包中纟田胞的|3—联蛋白水平增高。使用Hsp90蛋白作为内上样对照。图5B是显示用Wnt3质粒转染后HCC细胞系中Tcf转录活性改变的条形图。转染后Focus细胞中Tcf转录活性与用对照质粒转染的Focus细胞相比增加了3倍。转染后Tcf转录活性在Huh7细/l包中略微降低，在Hep3B细胞中没有变化。白条表示用对照质粒(pcDN八)转染的细胞，黑条表示用Wnt3质粒转染的细胞。图6A是显示抗Wnt3抗体对HCC细胞系中Tcf转录活性的影响的条形图。接种HCC细胞到12孔平板中，用pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH和P-半乳糖苷酶质粒转染。细胞血清饥饿24小时，随后用含有抗Wnt3抗体(Wnt3-Ab;黑条)或对照抗体(10吗/ml)的1%FBSMEM培养纟田月包，孵育24小时后进行收集。使用正常的兔IgG作为对照抗体(C-Ab;白条)。用多克隆抗Wnt3抗体处理，Tcf的转录活性在Huh7中降低了60%，Hep3B中降低了26%，Focus细胞中降低了40%。图6B是显示siRNA对内源Wnt3mRNA表达的影响的条形图。浓度为10或100nM的对照siRNA和Wnt3siRNA(WNT3-3)被转染到HCC细胞中。转染后48小时，收集细胞，使用qRT-PCR测定Wnt3mRNA的表达水平。siRNAWnt3-3在100nM浓度下在所有三个细胞系中导致mRNA水平平均降低了50-60%。图6B代表了Hub7细胞中的这种效果。图6C是显示Wnt3siRNA对HCC细胞系Tcf转录活性的影响的条形图。给定浓度(nM)的Wnt3sillNA或对照siRNA在存在Tcf报道基因的条件下进行共转染。Tcf转录活性在Huh7中降低48.5%，在Hep3B中降低33%,在Focus纟田月包中降低43.5%。图7是细胞培养的照片，显示用抗Wnt3抗体处理的Focus细胞中伤口愈合延迟。将Focus细胞在6孔板中铺板。用无菌的塑料200)li1微量移液管尖端损伤铺满的单层细胞。随后用含有抗Wnt3Ab或兔IgG(对照抗体(CAb);10pg/ml)的培养基处理细胞，在不同的时间点拍照。用抗Wnt3Ab处理的Focus细胞显示伤口愈合延迟。这一效果在24h时最明显。在24h时，用CAb处理的细胞中大部分伤口被迁移的和/或增殖的细胞覆盖，但在用抗Wnt3Ab处理的细胞中伤口继续存在。图8A-8E显示了示例性FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8b和Wnt11人和小鼠氨基酸序列，包括推定的结合基序。发明详述本发明至少部分基于下述发现，即特定的Frizzled(FZD)蛋白，如FZD7和8与某些癌症，如肝癌相关，以及Wnt3,8b和11是Frizzled7的配体。因此，本说明书除其他内容之外提供使用Wnt和FZD蛋白、基因、FZD特异性抗体和探针诊断和治疗癌症以及筛选测试化合物治疗癌症的能力的方法。还公开了用于治疗癌症，如肝癌的化合物。I.核酸、蛋白、载体和宿主细胞术语"Frizzled"、"FZD"、"Frizzled蛋白"和"Frizzled受体"表示与果蝇Frizzled基因相关的哺乳动物蛋白家族，其在组织极性的发生中起作用。Frizzled家族含有至少10个哺乳动物基因。示例性的人Frizzled受体包括Frizzled1、Frizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5、Frizzled6、Frizzled7、Frizzled8、Frizzled9和Frizzled10。Frizzled受体涉及跨膜信号转导的动态模型，类似于具有氨基末端配体结合结构域的G-蛋白偶联的受体。术语"Wnt蛋白"、"Wnt配体"和"Wnt"表示与果蝇体节极性基因wingless相关的哺乳动物蛋白家族。在人类中，Wnt家族的基因通常编码38到43kDa的富含半胱氨酸的糖蛋白，其具有疏水信号序列和保守的天冬酰胺连接的低聚糖共有序列(参见例如Shimizu等，CellGrowthDiffer8:1349-1358(1997))。Wnt家族含有至少19个哺乳动物成员。示例性的Wnt蛋白包括Wnt-1、Wnt-2、Wnt-2b(也称为Wnt-13)、Wnt-3、Wnt-3A、Wnt-4、Wnt匿5A、Wnt陽5B、Wnt-6、Wnt-7A、Wnt-7B、Wnt-8A、Wnt-8B、Wnt-10A、Wnt-10B、Wm-ll、Wnt14、Wnt15和Wnt16。除Wnt配体外，已经分离了分泌的Frizzled相关蛋白(sFRP)的家族。sFRP似乎通过与i争膜Frizzled受体竟争与分泌的Wnt配体的结合作为Wnt信号传导的可溶性内源调制子发挥功能。sl.'RP可以通过结合蛋白并阻断与其细胞表面信号传导受体接近而对抗wm功能，或者它们也能够通过促进配体向Frizzled受体的递呈增强Wnt功能。术语"Wnt/FZD信号传导途径"表示由Frizzled受体，如FZI)7与一个或多个它的配体，如Wnt蛋白，如Wnt3、8b或ll之间的相互作用启动的胞内信号转导途径。通常，Wnt/FZD相互作用包括Wnt蛋白，如Wnt3、8b或11与Frizzled受体，如FZD7的结合，其导致信号转导途径的激活。在一些情况中，Wnt/Frizzled信号传导途径的激活导致下游Wnt和/或FZD可诱导基因的诱导作用。"下游Wnt/FZD调控的基因产物"是由于Wnt/FZD信号传导途径的信号传导的结果而被调控(如上调或下调)的蛋白或RNA。本发明包括某些FZD和Wnt核酸的用途。例如，本发明包括某些FZD7和8核酸的用途，例如编码图8A到8E所列的示例性人和小鼠FZD7(分别为SEQIDNO:1和3)和8(分别为SEQII)NO:4和6)受体的核酸。作为另一个实例，本发明包括某些Wnt3、8b和ll核酸的用途，例如编码图8A到8E所列的示例性人和小鼠Wnt3(分别为SEQIDNO:7和13)、8b(分别为SEQIDNO:14和20)和11(分别为SEQIDNO:21和27)蛋白的核酸。本发明中还包括某些FZD和Wnt核酸片段的用途，例如编码SEQIDNO:l、3、4、6、7、13、14、20、21或27的核酸序列的片#殳。FZD或Wnt核酸的片段分别编码FZD或Wnt多肽(如人或啮齿动物多肽)的至少一个有用片段，例如结合结构域(如CRD结构域)或其它有用的片段。例如，FZD核酸的有用片段可以编码具有结合活性的FZD受体片段，如对应于SEQIDN():3或5的片段。作为另一个实例，Wnt核酸的有用片段可以编码具冇结合活性的Wnl多肽片段，如对应于SEQIDNO:8到12、15到19和22到26的任何一个或多个的片段。本文所述的FZD和Wnt核酸包括RNA和DNA，其包括基因组DNA和合成(如化学合成的)DNA。核酸可以是双链或单链的。单链时，核酸可以是有义链或反义链。可以使用寡核苷酸类似物或衍生物(如肌苦或硫代磷酸核苷酸)合成核酸。例如可以使用该寡核苷酸制备具有改变的碱基配对能力或增强的核酸酶抗性的核酸。"分离的核酸"是结构不同于任何天然存在的核酸的结构或任何跨越超过三个分开的基因的结构的核酸。术语因此包括，例如(a)具有天然存在的基因组DNA分子的部分序列，但其侧面不是其天然所存在的生物基因组中该分子的部分的两侧的编码序列的DNA;(b)以^吏其载体或者原核生物或真核生物基因组I)NA中的核酸；(c)分开的分子，例如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，或限制性酶切片段；和(d)重组核苷酸序列，其为杂合体基因，即编码融合蛋白的基因的一部分。该定义明确排除了存在于(i)DNA分子，(ii)转染细胞；和(iii)细胞克隆的混合物中的核酸，例如存在于DNA库，如cDNA或基因组DNA库中的核酸。在一些实施方式中，本发明包括与FZD或Wnt核酸基本上同源的核酸序列的用途。与FZD或Wnt核酸"基本上同源"的核酸序列与编码SEQIDNO:1到27的任一序列的FZD或Wnt核酸序列有至少75%同源。例如，基本同源的核酸序列可与编码SEQIDNO:1到27任一的序列有至少约80%、85%、90%、95%、98%或至少约99%同源。为进行核酸比较，参照核酸序列的长度至少为50个核苷酸，但是也可以更长，例如至少60个核苷酸或更多核苷酸。本文中，使用在Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA90:5873-5877中？文进的Karlin和Altschul(19卯)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA87:2264-2268所示的算法确定两氨基酸序列或两核酸序列的"百分比同源性，，。该算法被引入Altschul,等(1990);J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序中。通过NBLAST程序，设定分值(score)=100，字长(wordlength)=12进行BLAST核苷酸;险索以获得与本发明所使用的FZD或Wnt核酸分子同源的核苷酸序列。通过XBLAST程序，设定分值(score)=50，字长(wordlength)=3进行BLAST蛋白检索以获得与参照多肽同源的氨基酸序列。为获4寻可—进4亍比專交的缺口比对(gappedalignments)，j吏用Altschul等，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389-3402中所述的GappedBLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，使用各程序(如XBLAST和NBLAST的缺省参数。参见互联网网址ncbi.nlm.nih.gov。本发明还包括在严格的杂交条件(如本文所定义的)下与完整的或一部分的编码SEQIDNO:1到27中任一的核苷酸序列，或者该核酸序列的补体杂交的核酸的用途。杂交的核酸的杂交部分长度通常至少为15(例如20、25、30或50)个核苷酸。杂交的核酸的杂交部分与一部分或完整的编码FZD或Wnt多肽的核酸序列，或与其补体有至少约75%(例如，至少80%、90%、95%或980/。)的同一性。本文所述类型的杂交核酸可以被用作诸如克隆探针、引物(如PCR引物)或诊断探针。寡核苦酸探针与核酸样本的杂交典型地在严格条件下进行。核酸双链或杂交体的稳定性被表示为解链温度或Tm，其为探针从靶DNA上解离的温度。使用该解链温度定义所需的严格条件。如果要被鉴定的序列其与探针相关并基本上相同，但不完全相同，可利用它首先建立最低温度，在该温度以及特定的盐(如SSC或SSPE)浓度下只发生同源杂交。然后，假定r/。的错配导致Tm降低rc，相应降低杂交反应中最终洗涤的温度(例如，如果搜寻与探针具有>95%同一性的序列，降低最终洗涤温度5。C)。实践中，每T/。错配Tm的变化可以在0.5。C到1.5。C之间。严格条件包括在68°C，5xSSC/5xDenhardt溶液/1.0%SDS中杂交，在室温，0.2xSSC/0.1°/。SDS中洗涤。中等严格条件包括在42。C,3xSSC中洗涤。改变盐浓度和温度的参数以获得探针和靶核酸之间最优水平的同一性。其它关于该条件的指导是本领域容易得到的，例如可参见Sambrook等,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;和Ausubel等.(eds.)，1995，CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)第2.10与编码SEQIDNO:1到27中任一的核苦酸序列杂交的核酸一皮认为是"反义寡核苷酸"。本发明还包括含有本文所述FZD和/或Wnt核酸的遗传构建体(如载体和质粒)，其可操作的连接于转录和/或翻译序列以允许表达，如表达载体。所选核酸，如编码FZD或Wnt多肽的DNA分子，当其以使得其它分子能够指导所选核酸的转录和/或翻译的方式被放置时，"可操作的连接于"另一核酸分子，如启动子。例如，可将所选核酸置于与其它核酸分子相邻的位置。本发明还包括含有本文所述FZD和/或Wnt核酸的工程细胞。例如，本发明包括转化的宿主细胞，即其中(或其祖先中)通过重组DNA技术导入编码FZD和/或Wnt多肽的核酸的细胞。包括原核和真核细胞，如哺乳动物细胞(如肝细胞)、真菌和细菌(如大肠杆菌)等。本发明中所包括的示例性类型的工程细胞示例是过量表达1;ZD7转基因的肝细胞。"过量表达FZD"的细胞是癌细胞和/或转基因细胞，其中特定FZD蛋白，如FZD7和/或8的表达分别是来自同样组织类型的非癌细胞或非转基因细胞中表达水平的至少约1.5倍，如至少约2、3、4或5倍。在一些实施方式中，细胞中FZD的表达可以与不同组织类型的非癌或非转基因细胞中的表达或不同组织类型的一组非癌或非转基因细胞进行比4交。此外，一种类型的FZD蛋白(如FZD7)的表达可以与同样细胞中其它FZD蛋白进行比较。确定特定基因表达水平的方法是本领部分。域公知的。这些方法包括，但不限于，RT-PCR、实时PCR和使用针对基因产物的抗体。本发明还包括某些FZD和Wnt多肽的用途。本发明中所使用的FZD多肽的实例是人和小鼠FZD多肽，例如分别如SEQIDNO:1和3，以及分别如SEQIDNO:4和6所示的多肽。本发明中所使用的Wnt多肽的实例是人和小鼠Wnt3、8b和11多肽，例如SEQIDNO:7、13、14、20、21和27中所示的多肽。本发明中所使用的还包括FZD和Wnt多肽的某些片段，例如SEQlDNO:l、3、4、6、7、13、14、20、21和27的片段。FZD和Wnt多肽的片段可以包括至少一个结合结构，或全长FZD和Wnt多肽的其它有用部分。例如，FZD和Wnl多肽的有用片段包括，但不限于，具有结合活性的片段(例如SHQIDNO:2、5、8至12、15至19和22至26)。术语"蛋白"和"多肽"都表示任何氨基酸链，不管其长度或翻译后的修饰(如糖基化或磷酸化)。因而，术语"Frizzled蛋白"、"Wnt蛋白"、"Frizzled多肽"和"Wnt多肽，，包括天然存在的全长分离蛋白，以及重组或合成产生的多肽，其对应于天然存在的全长蛋白，或者天然存在的或合成的全长多肽的片段。如上所述，术语"Frizzled多肽"和"Wnt多肽，，分别包括天然存在的或合成的FZD和Wnt多肽的生物学活性片段。蛋白的片段可以通过各种本领域技术人员已知的方法制备，例如重组、通过蛋白水解消化、或通过化学合成。多肽的内部或末端片段可以通过从编码所述多肽的核酸的一端(对于制备末端片段而言)或两端(对于制备内部片段而言)移除一个或多个核苷酸产生。该诱变的DNA的表达可以产生多肽片段。用"末端轻咬(end-nibbling)，，核酸内切酶进行消化可以产生编码一批片段的DNA。编码蛋白片段的DNA也可以通过例如随机剪切(randomshearing)、限制性消化、寡核苷酸的化学合成、使用聚合酶领域已知的技术，例如常规的Merrifield固相FMOC或t-Boc化学法化学合成。纯化或分离的化合物是组合物，其中至少60%的重量为目标化合物，如FZD多肽、Wnt多肽或抗体。例如，所述制品可以至少75%(如至少卯％、95%或甚至99%)的重量为目的化合物。纯度可以通过任何本领域已知的合适方法进^亍测定，例如柱层析、聚丙烯酰胺;疑月交电泳或HPLC分析。在某些实施方式中，FZD和Wnt多肽包括与天然存在的FZD和Wnt多肽的整个或部分基本上相同的序列。与本文所述的FZD和Wnt多肽序列"基本上同源"的多肽具有与SEQIDNO:1至27任一所示氨基酸序列至少65%(例如至少75%、80%、85%、90%、95%或99%，例如100%)同源的氨基酸序列(度量方法如本文所述)。为进行比较，参照FZD和Wnt多肽序列的长度可以为至少16个氨基酸，例如至少20或25个氨基酸。"保守的氨基酸取代"是指其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天门冬胺酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如甘氬酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性倒链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、P分枝的侧链(如苏氨酸、纈氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。本发明还包括融合蛋白(和编码该融合蛋白的核酸)的用途，其中FZD(如FZD7和/或8)或Wnt(如Wnt3、8b和/或11)多肽的一部分与不相关的多肽(如标记物多肽或融合配偶体)融合以产生融合蛋白。例如，所述多肽可以与六组氨酸标签或FLAG标签融合以便于纯化细菌表达的多肽，或者与血凝素标签或FLAG标签融合以便于纯化真核细胞中表达的多肽。本发明还包括诸如包含第一部分和第二部分的分离的多肽(和编码这些多肽的核酸)的用途，其中第一部分包括例如FZD或Wnt多肽，第二部分包括不相关的多肽，如免疫球蛋白恒定(Fc)区或者可检测的标记物。融合伴侣可以是，例如利于分泌的多肽，如分泌序列。这样的融合多肽典型地被称为前蛋白(preprotein)。宿主细胞可以切开分泌序列以形成成熟的蛋白。本发明还包括编码与多肽序列融合以产生无活性前蛋白的FZD和/或Wnt多肽。通过移除起失活作用的序列可以将前蛋白转变为蛋白的活性形式。II.4全测癌症的方法不被理论所局限，似乎各种FZD蛋白，如FZD7和8以及FZI)配体，如Wnt3和ll在癌症，如肝癌中是重要的。特别的，肝细胞似乎在转化过程的早期，如HCC发生之前过量表达FZD7和Wnt3。类似的，这样的细胞通常FZD8和/或Wnt11表达不足。Wnt3、8b和11似乎是FZ[〕7配体。因此，本发明提供了^^测癌细胞的方法，其有助于诊断患者中癌症的存在和严重程度(如肺瘤分级，胂瘤负荷等)，有助于确定患者的预后和评估患者对治疗的反应(例如在化疗方案期间或之后通过例如评估肿瘤负荷提供对治疗效果的度量)。检测可以基于对在癌细胞中差异表达(如与非癌细胞相比)的多核苷酸(如FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wnt11多核苷酸)的检测和/或对由在癌细胞中差异表达的多核普酸编码的多肽(如FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wnt11多肽)的检测。本发明的纟企测方法可以在体外或体内、在生物学样本，如分离的细胞和/或整个组织上进行。本文所采用的"生物学样本，，是生物学组织或液体样本，其含有核酸或多肽，如FZD7蛋白、多核苷酸或转录本。这样的样本包括，但不限于，从例如肝脏、肺、淋巴结、结肠、肖、胰腺、胆管、小肠和/或食道获得的组织。生物学样本还可以包括组织切片，例如活组织检查或尸检样本、为组织学目的而获得的冰冻切片、血液、血浆、血清、唾液、粪便、眼泪、粘液、胆汁、唾液、淋巴液、毛发、皮肤等。生物学样本还包括源自患者组织的外植体和原发的和/或转化的细胞培养物。生物学样本典型地从真核生物，例如灵长类动物，如黑猩猩或人；母牛；马；山羊；绵羊；狗；猫；啮齿类动物，如豚鼠，大鼠或小鼠；兔；鸟；爬形动物或鱼中获得。样本通常通过从动物中移出细胞样本获得，但也可以通过提供以前分离的细胞(例如由他人在其它时间和/或为其它目的所分离的)，或通过在体内进行本发明的方法来完成。还可以使用具有治疗或结果历史记录的存档组织。在一些实施方式中，提供通过测定细胞中转录本(如FZD7、8、Wnt3和/或Wnt11转录本)的表达4全测癌细/1包的方法，该转录本在癌细月包中差异表达(differentiallyexpressed)。多种已知的方法中的任一可用于通过mRNA与合适的杂交探针的杂交进行检测，其包括但不限于，检测转录本；通过使用特异的寡核苷酸引物的聚合酶链式反应检测转录本；以及使用合适的杂交探针的原位杂交。这些方法可用于检测和/或测量在癌细胞中差异表达的基因的mRNA水平。在一些实施方式中，该方法包括a)在允许杂交的条件下，将样本与对应于本文所述差异表达基因的多核苷酸接触；和b)若有的话，检测杂交。当与合适的对照相比时，检测到不同的杂交，指示样本中存在在癌细胞中差异表达的多核苷酸。合适的对照包括，例如不是癌细胞的样本，已知不包含在癌细胞中差异表达的多核苷酸的样本，以及与在癌细胞中差异表达的多核苷酸同"义，，(thesame"sense")的标记的多核苷酸的用途。允许杂交的条件是本领域已知的，并且已经在上文中进行了更详细的描述。检测也可以通过任何已知的方法完成，其包括但不限于，原位杂交、PCR(聚合酶链式反应)和/或RT-PCR(反转录-PCR)或已知技术的结合。本领域已知多种用于多核苷酸的标记和标记方法，其可以用于本发明的分析方法。杂交的特异性可以通过与合适对照的比较确定。通常含有本文所述多核苷酸的至少IO个核苷酸，至少12个核苷酸或至少15个连续核苷酸的多核苷酸，诸如具有本文所述序列的那些多核苷酸，可用于多种用途，例如用于^^测和/或测量在癌细胞中差异表达的多核苷酸的转录水平的探针或PCR引物。如本领域技术人员所了解的，探针可以被可检测地标记，并与例如含有固定的从测试样本获得的多核苷酸(如mRNA)的阵列(array)接触。可选的，所述探针可以固定在阵列上，所述测试样本被可4全测的标记。本发明方法的这些和其它变体的用途在本领域的技术范围内，并且在本发明的范围中。核普酸探针可用于检测对应于所提供的多核苷酸的基因的表达。在Northern印迹中，mRNA被电泳分离并与探针接触。作为与特定大小的mRNA类型的杂交检测探针。定量杂交的数量以确定相关的表达量。探针可用于与细胞原位杂交以检测表达。探针也可以用于在体内诊断性检测杂交序列。探针可以用放射性同位素或其它类型的可检测标记来标记，如生色团、荧光团和/或酶。核酸杂交分析的其它例子记载于WO92/02526和U.S.Pat.No.5,124,246中。PCR是另一种用于检测少量靶核酸的方式(参见，例如Mullis等,Meth.Enzymol.(1987)155:335;U.S.Pat.No.4,683,195;和U.S.Pat.No.4,683,202)。使用与靶核酸杂交的两条引物寡核芬酸开始反应。引物由本文所述多核苷酸内的序列或其3，和5'序列组成。通过标准PCR方法扩增靶序列后，扩增的靶核酸可以通过本领域已知的方法进行检测，例i口Southern印-迹。mRNA或cDNA也可以-通itSambrook等，"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(NewYork,ColdSpringHarborLaboratory,1989)中所述的4专统印-迹#支术(^口Southern印迹、Northern印迹等)进行检观'j(例如不通过PCR扩增)。通常，mRNA或使用聚合酶从mRNA产生的cDNA可以使用凝胶电泳进行纯化和分离，并转移到固相支持体，如硝化纤维上。可将固体支持物暴露于标记的探针，并洗涤以除去任何未杂交的探针。随后可检测含有标记探针的双链体。使用PCR扩增的方法可在来自一个或多个细胞的DNA上进行。聚合酶链式反应的使用记载于Saiki等(1985)Science239:487中，技术综述可以见于Sambrook等,"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(NewYork,ColdSpringHarborLaboratory,1989;pp.l4.2-14.33)中。扩增反应中可以包括可检测的标记。合适的可检测标记包括荧光染料(例如荧光素异硫氰酸盐(FITC)、若丹明、德克萨斯红、藻红蛋白、异藻青蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2',7'-二甲氧基-4'，5'-二氯-6-羧基荧光素、6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基-2',4,4'，5'，7,7'-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N,N，N'，N'-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA))、放射性标记(如"P、35S、31-1等)等。标记可以是两段系统(twostagesystem),其中多核苷酸与生物素、半抗原等结合，所述生物素、半抗原等具有高亲和力结合配偶体，如抗生物素蛋白、特异抗体等，其中结合配偶体与可检测的标记结合。所述标记可以与一个或全部两个引物结合。可选的，标记扩增中所使用的核苷酸库，从而将标记掺入到扩增产物中。在一个实施方式中，使用实时PCR评估表达水平。从目的样本中分离RNA。设计PCR引物以扩增特定目的基因。使用双标记的交光寡核苷酸探针测量PCR产物累积。探针用两种不同的荧光染料标记，5'端报道分子染料和3'端猝灭染料。选择与PCR扩增子中存在的内靶序列同源的寡核苷酸探针。当探针完整时，两种荧光团之间发生能量转移，荧光发射被猝灭。在PCR的延伸阶段期间，探针被Taq聚合酶的5'核酸酶活性切割。因此，报道分子不再接近捽灭分子，并测量发射强度的增加。下述实施例部分提供了使用实时PCR检测FZD表达的示例性方法。引物也可以用于其它方法，例如RT-PCR。这个分析提供了核酸的定量度量。在其它实施方式中，提供了通过检测被细胞差异表达的蛋白(如FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wnt1蛋白)的表达检测癌细胞的方法。多种已知方法都可用于检测，其包括但不限于使用例如在BL1SA和/或Western印迹方法中有用的结合化合物，如抗体或其抗原结合片段的方法。该抗体可以是多克隆或单克隆，并且可以用可检测标记物(如荧光团、发色团或同位素等)标记。在合适时，化合物可以附着于固相支持物，例如珠子、平板、滤纸、树脂等。确定化合物/靶复合物的形成可通过将所述复合物与和第一化合物(或复合物)特异性结合的另一化合物(如第二抗体)接触而进行。类似于第一化合物，另一化合物可以附着于固相支持物和/或能够用可检测标记物标记。进行本文所述检测方法所需的材料可以作为试剂盒的一部分提供。因此，本发明进一步提供用于检测生物学样本中在癌细胞中差异表达的多核苷酸(例如通过检测由差异表达的目的基因编码的mRNA)和/或其编码的多肽的存在和/或水平的试剂盒。使用这些试剂盒的程序可以由检验科、实验室、开业医生或私人个体进行。本发明用于检测由在癌细胞中差异表达的多核普酸编码的多肽的试剂盒可以包含与所述多肽特异性结合的部分，例如抗体。本发明用于检测在癌细胞中差异表达的多核苷酸的试剂盒可以包括与该多核苦酸特异性杂交的部分。试剂盒任选提供在程序中有用的附加组分，包括例如緩沖液、显影试剂、标记、反应表面、检测手段、对照样本、标准、说明书和解释性信息。本发明进一步涉及^^测/诊断哺乳动物(例如人)中肿瘤或前肿瘤病症的方法。本文中所使用的"诊断"通常包括确定患者的疾病或紊乱易感性、确定受试者目前是否为疾病或紊乱所侵袭，受疾病或紊乱侵袭的受试者的预后(例如鉴定转移前或转移癌状态，癌症的阶段，或癌症对治疗的反应性)和治疗度量(therametrics)(例如监测受试者的状况以提供关于治疗效果或功效的信息)。一个示例性检测/诊断方法包括(a)从哺乳动物(例如人)获得生物学样本(例如肝脏组织)，(b)一全测样本中FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wntll基因产物(如蛋白或mRNA)的存在，和(c)与对照样本比4交存在的FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wnt11基因产物的量。依照这个方法，在样本中存在增高水平的1'7D7和/或Wnt3基因产物和/或降低水平的I'7D8和/或Wntl1基因产物指示受试者患有肿瘤或前肿瘤病症，例如肝癌或发生肝癌的风险。依照本发明确定FZD7和/或Wnt3蛋白水平的增高和/或FZD8和/或Wnt11蛋白水平的降低使得能够鉴定可能从特定治疗中获益的患者。例如，筛选来自原发治疗后(postprimarytherapy)的受试者(例如已进行手术的受试者)的样本FZD7和/或Wnt3水平增高和Z或FZD8和/或Wnt11蛋白水平降低的存在，该水平是残余肿瘤组织的标志。类似的，检测(例如通过免疫荧光)手术移除的肿瘤切除位置周围的组织(例如肿瘤周围组织)，FZD7和/或Wnt3水平增高和/或FZD8和/或Wnt11水平降低(相对于周围组织)表示该组织中可能发生疾病或肿瘤切除的不完全。鉴定这种患者的能力使得根据特定患者的需要调整治疗成为可能。也可以监测进行非手术治疗，如化疗或放疗的受试者，从这些受试者中获得的样本中FZD7和/或Wnt3水平增高和/或FZD8和/或Wnt11水平降低指示需要继续治疗。熟练技术人员还能够理解，使用本文所述的方法可以进行以优化治疗方案为目的的癌症(例如肝癌)分级。III.鉴定能够治疗癌症的化合物的方法
技术领域：
：本发明提供筛选测试化合物治疗癌症，如肝癌的能力的方法。本文所述的"测试化合物"是能够用本文所述方法筛选的任何化合物。例如，测试化合物可以是，例如小有机或无机分子(M.W.少于1，000Da)。可选的或另外的，测试化合物可以是多肽(如具有随机或预定氨基酸序列的多肽或者天然存在的或合成的多肽)或核酸，例如DNA或RNA分子。测试化合物可以是天然存在的(例如草本或天然产物)或合成的，或者能够同时包括天然的和合成的组分。测试化合物可以具有少于每摩尔约10，000克，少于每摩尔5,OO()克，少于每摩尔1，000克或少于每摩尔约500克的分子式量。测试化合物可以是，例如任何有机或无机化合物(例如杂有机或有机金属化合物)、氨基酸、氨基酸类似物、多肽、肽模拟物(如拟肽)、寡肽(例如，长度从约5个到约25个氨基酸，优选长度从约10到20或12到18个氨基酸，优选12、15或18个氨基酸长)、核苷酸、核苷酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核糖核酸、脱氧核糖核酸、反义寡核普酸、核酶、糖、脂类(如神经鞘脂类)和/或脂肪酸或其任何组合。术语Wnt/FZD信号传导(如Wnt/FZD7信号传导)的"拮抗剂"或"抑制剂"表示，例如与Wnt蛋白(如Wnt3、8和/或11)和/或FZI)受体(如I'，ZD7)结合，和/或如已知的Wnt/1'，ZD信号传导分析(例如测定卩-联蛋白水平，由Tcf和Lef转录因子或其它下游Wnt/Frizzled调控的基因产物控制的癌基因表达)所测定的部分或完全阻断或抑制Wnt/FZD信号传导(如Wnt/FZD7信号传导)的化合物。抑制剂包括，例如Wnt或FZD蛋白的抗体(下述实施例部分描述了抗Wnt3抗体的一个实例)、Wnt或FZD蛋白的修饰形式、天然存在和合成的配体、拮抗剂、激动剂、抗体、小化学分子等。下文中详述了检测抑制剂或拮抗剂的分析。测试化合物文库在某些实施方式中，本发明的筛选使用测试化合物文库。"文库"是通过一个或多个起始组分的各种组合合成的化合物的集合(例如，以混合物或以物理分隔的个体化合物的形式)。至少一些化合物必须不同于文库中至少其它一些4匕合物。文库可以包"^舌，例如5、10、50、100、1000或甚至10,000、50,000、或100,000个或更多的不同的化合物(即，不是同一化合物的简单多重拷贝，虽然文库中的一些化合物可以重复或出现超过一次)。每种不同的化合物可以一定的数量存在，从而使得它的存在能够通过一些方式进行确定，例如能够用受体或合适的探针进行分离、分析和/或检测。使每种不同的化合物的存在能够被检测所需的实际数量由于所使用的实际程序而不同，并可以随分离、检测和分析技术的进展而改变。当化合物以基本上等摩尔量存在于混合物中时，例如每种化合物100皮摩尔的量通常可以被检测到。文库可以包括个体化合物的文库(例如，基本上以每孔单一类型化合物的方式存在，其通过平行合成或者poolandsplit-pool方法制备)和含有基本上等摩尔量的每种预期化合物(即其中没有单个化合物占优势)的混合物。每种库形式都能够鉴定分析中发现的活性化合物。测试化合物可以分别单独筛选或平行筛选。并行筛选的实例是大型化学品文库的高通量药物筛选。该候选化合物的文库可以产生或购买自例如ChembridgeCorp.,SanDiego,CA。可选的，在先试验和无对照证据可以暗示一种类型或类别的具有增高的潜能的化合物。可以设计和合成文库以含有该类化学品。组合文库的合成是本领域公知的，并且已经进行了综述(例如参见E.M.Gordon等，J.Med.Chem.(〗994)37:1385-1401;DeWitt，S.H.;Czamik,A.W.Acc.Chem.Res.(1996)29:114;Armstrong,R.W.;Combs,A.P.;Tempest,P.A.;Brown,S.D.;Keating,T.A.Acc.Chem.Res.(1996)29:123;Ellman,J.A.Acc.Chem.Res.(996)29:132;Gordon,RM.;Gallop,M.A.;Patel,D.V.Acc.Chem.Res.(1996)29:144;Lowe,G.Chem.Soc.Rev.(1995)309,Blondelle等TrendsAnal.Chem.(]995)14:83;Chen等.J.Am.Chem.Soc.(1994)116:2661;美国专利5,359,115，5,362,899和5,288,514;PCT出版物NO.WO92/10092,WO93/09668,WO91/07087,WO93/20242,WO94/08051)。化合物的文库可以根据多种方法制备，其中一些是本领域已知的。例如，可以以下述途径实施"split-pool"策略将功能化聚合支持物的珠子置于多个反应容器中；已知多种适于固相肽合成的聚合支持物，有些可以通过商业途径购得(例如参见，如M.Bodansky"PrinciplesofPeptideSynthesis",2ndedition,Springer-Verlag,Berlin(1993))。向每个等分试样的珠子中加入不同的激活氨基酸溶液，进行反应以产生多个固定的氨基酸，每个反应容器中一种。随后洗涤衍生的珠子的等分试样，"集中(pooled)"(即重组)，再次分开珠子的集合体(pool),将每个等分试样置于分开的反应容器中。随后将另一激活的氨基酸加入到每个珠子等分试样中。重复合成循环，直到获得预期的肽长度。可以随机选择每个合成循环中加入的氨基酸残基；可选的，可以选择氨基酸以提供"偏好的(biased)"文库，例如，文库中一定部分的抑制剂是非随机选择的，例如提供具有与能够与抗体，例如抗独特型抗体抗原结合位点相互作用的已知肽具有已知结构类似性或同源性的抑制剂。应当明白通过这种方法可以容易的产生多种肽的、肽模拟物的或非肽化合物。"split-pool"策略可以产生肽，如调制子的库，其能够用于制备本发明测试化合物的文库。在另一说明性合成中，通过1IobbsDeWitt等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909(1993))的方法创建"diversomer文库"。其它合成方法，包括Houghten的"茶叶袋(tea-bag)"技术(参见例如Houghten等，Nature354:84-86(1991))也可以用于合成本主题发明的化合物文库。可以筛选化合物的文库以确定是否文库中任何成员都具有所需活性，并且假如是这样的话，鉴定活性种类。筛选组合文库的方法已有记载(参见例如，Gordon等，JMed.Chem.,同上)。通过采用合适受体的亲合层析筛选可溶化合物文库以分离受体的配体，随后通过常规技术(例如质谱、NMR等)鉴定分离的配体。固定的化合物可以通过将化合物与可溶性受体接触进行筛选，优选的，可溶性受体与可被检测以指示配体结合的标记(例如，焚光团、比色酶(colorimetricenzymes)、放射性同位素、发光化合物等)结合。可选的，固定的化合物可以被选择性地释放，并且可以经由膜扩散以和受体相互作用。上面描述了用于筛选测试化合物文库的示例性分析。筛选方法
技术领域：
：本发明提供鉴定能够治疗癌症，如肝癌的化合物的方法。虽然申化合物被认为特异性的调制(1)Wnt/FZD信号传导(例如，通过结合FZD7、Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11多肽和/或减低(如防止)Wnt/FZD介导的转录)和/或(2)FZD7、FZD8、Wnt3和/或Wntl1的表达。在本发明的某些方面，通过(i)从测试化合物组中鉴定与1'7X)7、Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11多肽结合，调制(即增加或降低)FZD7及其配体(如Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11)间相互作用和/或调制(即增加或降低)FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8b和Z或Wnt11的转录和/或翻译的化合物；和可选的，(U)进一步测试这种化合物调制Wnt/FZD信号传导、降低癌细胞移动性、降低癌细胞中联蛋白积聚和/或在体外或体内治疗癌症的能力完成这种化合物的筛选。结合FZD7、Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11多肽，调制FZD7及其配体(如Wm3、Wnt8b和/或Wnt11)之间的相互作用，或调制FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8b和/或Wntll的转录和/或翻译的测试化合物在本文中表示为"候选抗癌剂"。被进一步检测和发现能够在体外或体内调制Wnt/FZD信号传导，降低癌细胞移动性，降低癌细胞中卩-联蛋白积聚和/或治疗癌症的候选抗癌剂被认为是"抗癌剂"。在本发明的筛选方法中，候选抗癌剂可以，但不是必需被测试以确定它们是否是抗癌剂。本发明的分析可以在生物学样本，完整细胞的制品和/或先体外后体内的无细胞系统中进行。在一方面，本发明包括筛选测试化合物以鉴定与FZD多肽，如FZD7多肽，和/或Wnt多肽，如Wnt3、8b和/或11多肽结合的化合物。通过可逆或不可逆的固定一个或多个测试化合物或Wnt或FZD多肽于基质，如96孔聚苯乙烯微量滴定板的孔表面，例如体外检测测试化合物与FZD或Wnt多肽的结合。固定多肽和其它小分子的方法是本领域公知的。例如，用FZD或Wnt多肽包被微量滴定板，其可通过将溶液中的多肽(通常以1-100jil体积中0.05到1mg/ml的浓度)加入到每个孔中，并在室温至37°C下温育平板一定的时间，例如().l至36小时进行。过剩的溶液从平板中摇除以除去未与平板结合的多肽，随后用水或緩沖液洗涤平板(一次或多次)。通常，多肽在水或缓冲液中。然后用没有结合多肽的緩沖液洗平板。为封闭平板上游离的蛋白结合位点，用与结合多肽无关的蛋白封闭平板。例如，可以使用Tris-HCL中2mg/ml浓度的300pl牛血清白蛋白(BSA)。合适的基质包括含有规定的交联化学的那些基质(例如塑料基质，如来自例如ComingCostarCorp.(Cambridge,MA)的聚苯乙烯、苯乙烯或聚丙烯基质)。如果需要，颗粒，如珠状的琼脂糖或珠状的琼脂糖凝胶可以用作基质。测试化合物随后可以被加入到包被的平板中，使其与FZD或Wnt多肽结合(如在37。C下进行0.5-12个小时)。然后如上所述的漂洗平板。技术人员将明白这个方法的许多变体都是可行的。例如，该方法可以包4舌用测试化合物包被基质，并向与基质结合的化合物中加入Wm或1'7D多肽。FZD或Wnt与第二化合物，如本文所述的测试化合物或与结合配偶体的结合(例如FZD7与Wnt3、8b和/或11的结合；下文将进一步详细讨i仑)可以通过多种本领域已知的方法进行4全测。例如，与FZD或Wnt多肽特异性结合的抗体(即，抗I:ZD抗体或抗Wnt抗体，如实施例部分所述的多克隆抗Wnt3抗体)可用于免疫分析。如果需要，抗体可以被标记(如菱光的或用放射性同位素)和直接检测(例如参见West和McMahon，J.CellBiol.74:264,1977)。可选的,第二抗体可用于检测(例如与抗FZD或抗Wnt抗体的Fc部分结合的标记抗体)。在可选的检测方法中，标记FZD或Wnt多肽(例如用放射性同位素、荧光团、发色团等)，并检测该标记。在又另一方法中，FZD或Wnt多肽制备为含有能够可视检测的蛋白，如绿色荧光蛋白(其可在UV光下进行检测)的融合蛋白。在另一可替换的方法中，制备多肽为含有具有可检测酶活性的酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、(3-半乳糖苦酶或葡萄糖氧化酶的融合蛋白。编码所有这些酶的基因已经被克隆并且能够被技术人员使用。如果需要，融合蛋白可以包括抗原或抗原决定簇，其能够通过使用常规方法用多克隆或单克隆抗体进行检测和测量。合适的抗原包括酶(如辣根过氧化物酶、^威性磷酸酶和(3-半乳#唐苷酶)和非酶多肽(例如血清蛋白，如BSA和球蛋白，和乳蛋白，如酪蛋白)。在鉴定与FZD或Wnt多肽结合的多肽(如试验多肽)的各种方法中，可以使用常规的蛋白/蛋白相互作用的双杂交体试验(参见，例如Chien等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9578,199〗；l'、iclds等，美国专利No.5,283,173;Fields和Song,Nature,340:245，1989;LeDouarin等,NucleicAcidsResearch,23:876,1995;Vidal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:10315-10320,1996;和White,Proc.Na化Acad.Sci.USA,93:10001-10003,1996)。通常，双杂交体方法涉及转录因子两个分开的结构域的重构。一个融合蛋白包括与转录因子(如Gal4)的反式激活域或DNA结合结构域融合的FZI)或Wnt多肽。另一融合蛋白包括第一融合蛋白中所含多肽的测试多肽或结合配偶体，该测试多肽或结合配偶体与转录因子的DNA结合结构域或反式激活域融合。FZD或Wnt多肽与测试多肽或结合配偶体的结合重构转录因子。通过检';贝"可操作的连接于与转录因子DNA结合结构域结合的DNA序列的基因(即报道基因)的表达，可检测转录因子的重构。实行各种双杂交体方法的试剂盒可以通过商业途径购买得到(例如从Clontcch;Palo八lto，C八)。在另一方面，本发明包括筛选测试化合物以鉴定调制FZD和Wnt多肽间蛋白-蛋白相互作用的化合物。Lepourcdet等，CancerCell5:91-102(2004)中记载了用于高通量筛选能够调制转录调节物间蛋白-蛋白相互作用的化合物的方法，其在此全文引入作为参考。通常，提供第一化合物。第一化合物是FZD(如FZD7)或Wnt(如Wnt3、8b或11)多肽或其生物学活性片段。提供的第二化合物不同于第一化合物，并且被标记。第二化合物是FZD(如FZD7)或Wnt(如Wnt3、8b或11)多肽或其生物学活性片段。提供测试化合物。将第一化合物、第二化合物和测试化合物互相接触。然后确定与第一化合物结合的标记的量。通过所结合标记评估的第一化合物和第二化合物之间蛋白-蛋白相互作用的改变指示测试化合物可用于调制FZD和Wnt多肽之间的蛋白-蛋白相互作用。在某些实施方式中，所提供的第一化合物附着于固相支持体。固相支持体包括，例如树脂(如琼脂糖和珠子)和多孔板。在某些实施方式中，所述方法在接触步骤之后含有洗涤步骤，从而将结合的和未结合的标记分开。在某些实施方式中，多种测试化合物与第一化合物和第二化合物某些实施方式中，每种测试化合物在单独的孔中与第一化合物和第二化合物接触。例如，所述方法可以筛选测试化合物的文库。测试化合物的文库已在上文中进行了详细的论述。文库可以包括，例如天然产物、有机化学品、肽和/或修饰的肽，其包括例如D-氨基酸、非常规氨基酸和N-取代的氨基酸。通常，所述库的形式适于在多孔板，例如96孔板中进行筛选。所述分析特别用于以多孔形式自动进行，其中许多步骤由计算机控制，通过自动机械装置运行。所述文库还可以其它形式使用，例如固定于固相支持体并可释放到微滴中的合成化学文库。在某些实施方式中，所述第一化合物是FZD7多肽或其片段，所述第二化合物是Wm多肽，例如Wnt3、8b或l]或其片段。在其它实施方式中，所述第一化合物是Wnt多肽，例如Wnt3、8b或11多肽或其片段，所述第二化合物是FZD7多肽或其片段。所迷第一化合物所附着的固相支持物可以是，例如琼脂糖珠子、SPA珠子(掺入闪烁体的微球)或多孔板。当进行的分析不含洗涤步骤时，例如在闪烁邻近分析(scintillationproximityassay)中，可以寸吏用SPAJ朱子。当进行的分析含洗涤步骤时，可以使用琼脂糖凝胶珠子。所述第二化合物可以用任何可检测的标记，例如放射性标记、焚光试剂、生物素、肽标签或酶片段进行标记。所述第二化合物还可以用1251或3H进行放射性标记。在某些实施方式中，与第一或第二化合物化学结合，或表达为第一或第二化合物的融合蛋白的酶的酶学活性可被用于检测结合的蛋白。还包括使用标准免疫学方法检测结合蛋白的结合分析。在某些其它实施方式中，通过与FZD或Wnt多肽共价连接的供体荧光团(例如与FZD或Wnt化学结合的荧光基团或表达为FZD或Wnt-GFP嵌合蛋白的绿色焚光蛋白(GFP)变体)和与基质蛋白共价连接的受体焚光团之间的荧光能量共振能量转移(FRET)检测Wnl和FZD多肽或其片段的相互作用，其中供体的放射光谱与受体的激发光i齊存在适当的重叠，从而在FZD和Wnt多肽的蛋白-蛋白相互作用导致荧光团紧密接近时产生有效的非放射的能量转移。在另一实施方式中，蛋白-蛋白相互作用通过酶，例如(3-半乳糖芬酶结构域的重构进行检测(参见Rossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:8405-8410(1997))。在又另一实施方式中，蛋白-蛋白相互作用通过细胞中FZD和Wnt多肽的适当嵌合构建体的荧光比率成像(Bacskai等，Science260:222-226(1993))，或通过应用FZD和Wnt多肽的适当构建体的双杂交试验的变体(Fearon等，ProcNatlAcadSciUSA89:7958-7962(1992);Takacs等，ProcNatlAcadSciUSA90:10375-10379(1993);Vidal等，ProcNatlAcadSciUSA93:10321-10326(1996))并加以调整用于高通量分析以冲全测抑制FZD/Wnt相互作用的化合物来进行评估。这些实施方式的优势在于确保了测试化合物的细胞渗透性。例如，在一个分析中，l''ZI〕或Wnt多肽或其片段^t吸附到L'丄ISA平板上。然后将FZD或Wnt多肽暴露于测试化合物，之后再暴露于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-结合配偶体融合蛋白，例如GST_FZD或-Wnt多肽融合蛋白接触。用山羊抗GST抗体、碱性磷酸酶(AP)-偶联的抗山羊IgG和AP底物检测结合的蛋白。干扰蛋白-蛋白相互作用的化合物在EUSA平板中产生降低的AP信号。在又另一方面，本发明提供鉴定调制(如增加或降低)FZD和/或Wnt多肽的表达的测试化合物的方法。方法包括将FZD和/或Wnt核酸与测试化合物接触，然后测量所编码FZD和/或Wnt多肽的表达。在有关的方面，本发明描述了鉴定调制(如增加或降低)FZD和/或Wnt多肽的表达的化合物的方法，其是通过测量存在测试化合物时或加入测试化合物后，FZD多肽在下列(a)掺入了包括FZD和/或Wnt核酸序列或其片段或等位基因变体在内的重组构建体的细胞系，或(b)天然选冲奪性表达FZD和/或Wnt的细胞群或细胞系中的表达，然后测量FZD和/或Wnt蛋白的表达而进行的。由于本文所述的FZD和Wnt核酸已经被鉴定，因此可以将它们克隆到各种宿主细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、细诺或真菌)中以在完整细胞中进行该分析。在某些实施方式中，编码FZI)和/或Wnt多肽的分离的核酸分子可以被用于鉴定在体内(例如，在生产FZD和/或Wnt的细胞中)调制(如增加或降低)FZD和/或Wnt表达的化合物。在这种实施方式中，培养表达FZD(如FZD7和/或8)和/或Wnt(如Wnt3、Wnt8b或Wntl1)的细胞,将暴露于测试化合物(或测试化合物的混合物),比较FZD和/或Wnt表达水平与除了没有暴露于一种或多种测试化合物以外其它都一样的细胞中FZD和/或Wnt的表达水平。可以使用标准的基因表达定量分析。可以使用本领域公知的方法测定FZD和Wnt的表达，例如通过Northern印迹PCR分析或RNAse保护分析，其使用本发明的核酸分子作为探针。其它实施例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或爽光激活细胞分类术(FACS)。存在测试化合物时表达水平与其不存在时表达水平的比较指示测试化合物是否调制1ZD和/或Wnt多肽的表达。在又另一方面，本发明提供使用对一种或几种转录/翻译组分的干扰敏感的细胞系统筛选测试化合物的方法。在某些实施方式中，所述方法包括鉴定千扰有关FZD和/或Wnt翻译准确性的步骤，例如在翻译期间保持正确读码框和在终止密码子终止翻译的候选化合物。该方法包括构建细胞，其中可检测的报道分子多肽只有在位于一个读码框中或在终止密码子处终止翻"^的正常过程被干扰时才产生。该方法进一步包括将细胞与测试化合物接触以斗全验它是否增加或降低报道分子多肽的产生。在另一实施方式中，所述细胞系统是无细胞提取物，所述方法包括在体外检测转录或翻译。选择条件使得通过向细胞提取物中加入转录调节物或翻译调节物增加或降低报道基因的转录或翻译。鉴定候选化合物的一种方法依赖于转录敏感的基因产物。该方法包括构建细胞，其中报道分子的产生在FZD和/或Wm核酸的细胞转录发生变化(即，增加或降低)的条件下改变(即，增加或降低)。特别的，报道分子由转录地连接于被构建和排列使得当FZD和/或Wnt码报道基因的基因序列可以，例如融合于编码转录敏感的基因产物的基因的部分或整个，和/或调控基因产物产生的遗传元件的部分或整个。因的转录。所述方法进一步包括将细胞与测试化合物接触，并确定测试化合物是否增加或降低细胞中报道分子的产生。可选的，鉴定候选化合物的方法可以依赖于翻译敏感的基因产物。该方法包括构建细胞，其中FZD和/或Wnt核酸的细胞翻i奪发生改变(即，增加或降低)。特别的，报道分子由翻译性连接于被构建和排列使得当FZD和/或Wnt核酸的转录改变时报道分子的产生也相对增加或降低的序列的核酸编码。编码报道分子的基因序列可以，例如融合于编码翻译敏感的基因产物的基因的部分或整个，和/或控制基因产物产生的遗传元件的部分或整个。可选的，翻译敏感的基因产物可以直接或间接刺激编码报道子的基因的翻译。所述方法进一步包括将细胞和测试化合物接触，并检测测试化合物是否增加或降低细胞中第一报道分子的产生。对于本文所述的这些和任何方法，可以使用多种报道基因，其中典型的报道基因提供可方便检测的信号(例如，通过光谱法)。作为示报道基因分子的实例包括但不限于P-半乳糖苷酶、转化酶、绿色荧光蛋白、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、P-葡萄糖醛酸酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖淀粉酶和放射性标记的报道基因。例如，报道基因分子的产生可以通过报道基因产物，例如P-半乳糖苷酶的酶活性进行测量。本文所述的任何方法都可以被用于高通量筛选大量测试化合物以鉴定候选抗癌剂。高通量筛选是指所述方法可以被用于相对容易和快速的筛选大量候选化合物。鉴定测试化合物为候选抗癌剂后，如果需要，化合物可以使用本领域已知的技术在体内或体外进一步测试以证实它是否是抗癌剂，即确定它是否能够在体外(例如，使用分离的细胞或无细胞系统)或体内(例如，使用动物，如啮齿动物，模型系统)调制Wnt/FZD信号传导；癌细胞移动性和/或FZD和/或Wnt表达。候选化合物的体外测试可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如涉及使用细胞，如野生型、癌症和/或转基因肝细胞的测试.监控Wnl/FZD信号传导、FZD和Wnt表达和癌细胞移动性的示例性分析，以及能够用于该分析的有用的细胞在下面的实施例部分中描述。可选的或另外的，候选化合物的体内测试可以通过本领域技术人员已知的方法进行。例如可以将一种或多种候选化合物施用给哺乳动物，如啮齿动物(如小鼠)或兔。本领域认可将这些动物模型系统用于测试潜在的药物试剂以确定它们在患者，如人类患者中的治疗效力。对于体内测试特别有用的动物是野生型动物或过量产生FZI)和/或Wnt多肽的非野生型动物(如小鼠)，例如过量表达FZD或Wnt转基因(如FZD7或Wnt3转基因)和/或显示FZD8和/或Wntl1多肽生产减少的动物。其它在体内分析中有用的动物是饲养来发生肝癌的动物。某些特别有用的发生肝癌的转基因小鼠在实施例部分描述，并且包括在本发明中。在典型的体内分析中，动物(如野生型或转基因小鼠)通过任何被认为适当的途径(例如通过注射)施用候选化合物的剂量。常规的方法和标准可以被用于监控动物的所需活性。如果需要，存在候选化合物时获得的结果可以与没有用测试化合物处理的对照动物中的结果进行比较。药物化学一旦确定目的化合物(或试剂)，可以采用药物化学的标准原理产生化合物的衍生物以进行另一轮测试。筛选具有改善的药理活性，例如效力、药物动力学、稳定性、溶解度和清除率的衍生物。在上述分析中导致化合物活性的部分(moieties)可以通过本领域通常使用的结构活性关系(SAR)检验进行描述。药物化学领域的普通技术人员可以修饰候选化合物或试剂的部分以及测定修饰对化合物或试剂效力的影响，从而生产具有增加效能的衍生物。例如，参见Nagarajan等(1988)J.Antibiot.41:1430-8。此夕卜，如果化合物(或试剂)的生化靶标已知或已经确定，耙标和化合物的结构可以为衍生物的设计和优化提供信息。用于该目的的分子建模软件可以通过商业途径购买得到(例如，MolecularSimulations,Inc.)。IV.抗体本发明描述了纯化或分离的抗体，所述抗体结合于，如特异性结合于I《D和/或Wnt多肽，即抗FZD和抗Wnt抗体。当抗体结合那个抗原，但较少识别和结合(例如，不识别和结合)样本中的其它分子时，所述抗体与特定抗原，如FZD7和/或8多肽"特异性结合"。本发明的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、人源化的或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段和使用Fab表达文库产生的分子。本发明中包括的一类抗体的实例是下面实施例部分所述的多克隆抗Wnt3抗体。生产多克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的。本文中，术语"抗体"表示含有至少一个，如两个重(H)链可变区(本文中简写为VH)，和至少一个，如两个轻(L)链可变区(本文中筒写为VL)的蛋白。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为"互补决定区"("CDR，，)，其散布在更加保守的称为"构架区"(FR)的区域之中。构架区和CDR的范围已有准确的定义(参见Kabat，E.A.,等(1991)SequencesofProteinsoflmmunologicalInterest,F〗fthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242,和Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.]96:901-917)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基端到羧基端按以下顺序排列FR1,CDRl，FR2,CDR2，FR3,CDR3，FR4。抗FZD或抗Wnt抗体可以进一步包括重4连和轻链恒定区，从而分别形成免疫球蛋白重和轻链。抗体可以是两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重和轻链通过例如二硫键相互连接。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包括一个结构域，CL。重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。抗体的"FZD结合片段"和"Wnt结合片段"表示全长抗体的一个或多个片段，其分别保留了分别与P'ZD或Wnt多肽或其部分特异性结合的能力。抗体多肽结合片段的实例包括，但不限于(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的一个臂上的VL和VII结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546);和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH由分开的基因编码，可以使用重组方法通过合成的连接体将它们连接，从而使它们能够成为单个蛋白链，其中VL和VH区域配对形成单价分子(已知为单链Fv(scFv);参见例如，Bird等(1988)Science242:423-426;和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。这种单链抗体也包含在术语抗体的"FZD结合片段，，和"Wnt结合片段"中。这些抗体片段可以通过使用本领域技术人员已知的常规技术获得。为产生抗体，可以使用多肽(或抗原片段(如多肽片段，其根据诸如高频率的带电残基的标准显示可能为抗原的)或这些多肽的类似物)，例如通过重组或肽合成技术(参见，例如SolidPhasePeptideSynthesis,同上；Ausubel等，同上)制备的多肽。通常，多肽可以如Ausubel等,同上中所述的与载体蛋白，如KLH偶联，与佐剂混合，并注入宿主哺乳动物。"载体"是稳定关联分子，和/或帮助或增强其转运或免疫原性的物质。例如，FZD或Wnt蛋白或其片段可以使用标准PCR技术产生，并克隆到pGEX表达载体中(Ausubel等，同上)。融合蛋白可以在大肠杆菌中表达，并使用谷胱甘肽琼脂糖亲合基质进行纯化，其如Ausubel等，同上中所述。通常，将FZD和/或Wnt多肽注入多种宿主。合适的宿主动物的实例包括兔、小鼠、豚鼠和大鼠。根据宿主种类，多种佐剂可以被用于增加免疫应答，其包括但不限于弗氏(完全和不完全的佐剂)、佐剂矿物凝胶，如氬氧化铝，表面活性物质，如溶血卯磷脂、聚氧丙烯多元醇(polyronicpoyo1)、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚、BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。这些过程导致产生多克隆抗体，即源自免疫动物血清的抗体分子的异种群体。抗体可以从获自宿主动物的血液中纯化，例如通过亲和层析法，其中FZD和/或Wnt多肽抗原被固定在树脂上。本发明还包括抗FZD和抗Wnt单克隆抗体。单克隆抗体(mAbs)是特异于特定抗原的抗体的同种群体，其能够通过使用FZD或Wnt多肽和标准杂交瘤技术制备(参见，例如Kohlcr等，Nature,256:495,1975;Kohler等，Eur.J.Immunol"6:511,1976;K()hler等，Bur.J.Immunol.,6:292,1976;Hammerling等,InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,NY,1981;Ausubel等，同上)。通常，使用通过培养物中连续细胞系生产抗体分子的任何技术生产单克隆抗体，例如Kohler等，Nature,256:495,1975,和美国专利No.4,376,110中所述的那些技术；人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，ImmunologyToday,4:72,1983;Cole等，Pr()c.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026，1983);和EBV-杂交瘤技术(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96，1983)。这些抗体可以是任何的免疫球蛋白类型，其包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。产生本发明mAb的杂交瘤可以在体外或体内培养。一旦产生，测试多克隆或单克隆抗体在免疫测定，如使用例如Ausubel等，同上中所述的标准-汰术的Western印迹或免疫沉淀反应分析中对FZD或Wnt多肽的识别，如特异性识别。与FZD或Wnt多肽(如FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8b和/或Wnt11)特异性结合的抗体在本发明中是有用的。例如，这些抗体可以被用于免疫测定以检测样本，如组织样本中的多肽，和/或调制FZD/Wnt信号传导(例如治疗癌症，如肝癌)。可选的或另外的，单克隆抗体可以重组产生，例如通过噬菌体展示，或者通过例如Ladner等美国专利No.5,223,409;Kang等国际公开No.WO92/18619;Dower等国际公开No.WO91/17271;Winter等国际公开WO92/20791;Markland等国际公开No.WO92Z15679;Brcitling等国际公开WO93/01288;McCarfcrty等国际公开No.WO92/01047;Garrard等国际公开No.WO92/09690;Ladner等国际公开No.WO卯/02809;Fuchs等(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hay等(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huse寺(1989)Science246:1275-1281;Griffths等(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkins等(1992)JMolBiol226:889-896;Clackson等(1991)Nature352:624-628;Gram等(1992)PNAS89:3576-3580;Garrad等(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboom等(1991)NucAcidRes19:4133-4137;和Barbas等(l99)PNAS88:7978-7982中所述的组合方法产生。抗FZD和抗Wnt抗体可以是全长的人抗体(例如在小鼠中制备的抗体，该小鼠被基因工程改造以产生来自人免疫球蛋白序列的抗体)，或非人抗体，例如啮齿动物(小鼠或大鼠)、兔、马、母牛、山羊、灵长类动物(例如猴子)、骆驼、驴、猪或鸟抗体。抗FZD和抗Wnt抗体可以是其中可变区或其部分，例如CDR可以在非人生物体，例如大鼠或小鼠中生成的抗体。抗FZD和抗Wnt抗体也可以是，例如嵌合的、CDR移植的或人源化的抗体。抗FZD和抗Wnt抗体也可以在非人生物体，如大鼠或小鼠中生成，然后修饰，诸如在可变构架或恒定区中，以降低在人体中的抗原性。开发用于产生"嵌合抗体"(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851,1984;Neuberger等，Nature,312:604,1984;Takeda等，Nature314:452,1984)的技术可以被用于剪切来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和来自具有适当生物学活性的人抗体分子的基因。嵌合抗体是其中不同部分来自于不同动物种类的分子，例如具有源自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些抗体。可选的，描述用于生产单链抗体的技术(美国专利4，946，778;和美国专利4,946,778和4,704,692)适合生产特异于1'，ZD或Wnt多肽的单链抗体。单链抗体是通过用氨基酸桥(bridge)连接Fv区域的重链和轻链片段，产生单链多肽而形成。识别和结合特定表位的抗体片段可以通过已知技术生成。例如，这些片段可以包括但不限于可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab')2片段和可通过还原F(ab')2片段的二硫键产生的Fab片段。可选的，可构建Fab表达库(Huse等，Science,246:1275，]989)以快速和容易的鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段。与FZD和/或Wnt多肽特异性结合的多克隆和单克隆抗体(或其片段)可以被用于，例如检测患者各种组织中FZD和/或Wnt的表达。例如，1'，ZD7和/或8多肽可以在生物组织或提取物的常规免疫测定中检测。合适的测定的实例包括，但不限于，Western印迹、b:USA、放射性免疫测定等等。V.药物组合物任何药学活性化合物、试剂、核酸、多肽或抗体(其都可以在此表示为"活性化合物")都可以掺入药物组合物。这样的组合物通常包括活性化合物和可药用的载体。"可药用的载体，，可以包括适于药学施用的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟试剂等等。额外的活性化合物也能够掺入到组合物中。药物组合物可以配制成剂型以适于其意定的施用途径。施用途径的实例包括肠道(例如口服和直肠)和非肠道，如静脉内(例如向肝的门静脉)、皮内、皮下、经皮、经粘膜和肺部施用。可以通过例如注射或手术期间的局部施用直接施用到肝脏。用于注射的溶液或悬浮液可以包括下列组分无菌稀释剂，如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙烯乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或尼泊金曱酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或二硫化钠；螯合试剂，如乙二胺四乙酸；緩冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张性的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。非肠道制剂可以装入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制得的多剂量小瓶。适于注射用的药物组合物包括无菌水溶液(当水溶时)或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。为静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorEL(BASF,Parsippany,NJ)、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并应该流质到使得能够容易的用注射器进行注射的程度。在制备和存储条件下它应该是稳定的，并且必须防止微生物，如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙辨乙二醇(polyetheyleneglycol)等等)及其合适的混合物。适当流动性的维持可以通过，例如使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况下保持必需的颗粒大小和使用表面活性剂。防止微生物作用可以通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟苯曱酸酉旨(parabens)、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞(thimerosal)等实现。在许多情况下，它优选包括等渗剂，例如糖、多元醇，如甘露醇或山梨醇和氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过包含延緩吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶实现。制备无菌可注射溶液可以通过将所需量的活'f生化合物掺入具有一种上面所列成分或其组合的适当的溶剂中，如果需要，随后再进行无菌过滤。通常，制备分散体是通过将活性化合物掺入含有基本分散介质和来自上面所列的那些所需的其它成分的无菌载体中。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是进行真空干燥和冻干，其产生来自前述无菌过滤的溶液的活性成分的粉末和任何其它所需成分。口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗性施用，活性化合物可以与赋形剂混合，以片剂、含片或胶嚢，如明胶胶嚢的形式使用。口服组合物也可以使用流体载体进行制备以用作漱剂。可以包含药学可接受的结合剂和/或佐药材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶嚢、含片等可以含有任意下述成分或类似性质的化合物粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖，崩解剂，例如褐藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes;松散剂，例如胶状二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或调味剂，例如薄荷、曱基水杨酸酯或橙调味剂。为通过吸入施用，化合物以气雾剂的形式递送，其来自加压容器或含有合适的推进剂，例如气体，如二氧化碳的分配器，或喷雾器。全身施用也可以通过经粘膜或经皮肤的方式。为经粘膜或经皮肤施用，在制剂中使用适于需渗透的屏障的渗透剂。该渗透剂通常是本领域已知的，例如为经粘膜施用其包括去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷剂或栓剂(例如，具有常规的栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)完成。为经皮肤施用，如本领域所公知的将活性化合物配制成软膏(ointment)、药骨(salves)、凝胶剂或享L齐寸。在一个实施方式中，活性化合物与防止化合物从体内快速排除的载体一起制备，例如控制释放的剂型，包括埋植剂和微胶嚢化的递送系统。使用可生物降解、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯(ethylenevinylacetate)、聚酐、聚乙醇酸、月交原、多正酯类(polyorthoesters)和聚乳酸。制备这些制剂的方法对于本领域纟支术人员而言是显然的。材冲十也可以从AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc购买得到。脂质体悬浮液可以用作可药用的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法进行制备，例如如美国专利No.4,522,811中所述的。将口服或胃肠外组合物配制成便于施用和剂量均一的剂量单位形式是有利的。本文所用的剂量单位形式表示物理分离的单位，其适合作为被治疗的受试者的单一剂量；每个单位含有计算产生所需治疗效果的预定质量的活性化合物和所需的药用载体。每种化合物的毒性和治疗效力可以通过标准的药学程序在细胞培养物或试验动物中测定，例如测定LD50(50%的群体的致死剂量)和ED50(在群体的50%中具有疗效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比率是治疗指数，它能够表示为比率LD50/ED50。优选显示高治疗指数的化合物。当使用显示毒性副作用的化合物时，需要小心设计递送系统，其将这些化合物靶向到染病的组织，如肝，以将对健康细胞的潜在伤害降到最小，从而降低副作用。从细胞培养分析和动物研究获得的数据可被用于制定在人体中使用的剂量范围。这些化合物的剂量优选处于循环浓度(circulatingconcentration)范围中，其包括具有很少或没有毒性。剂量在这个剂量范围中根据应用的剂量形式和采用的施用途径而改变。对于本发明方法中使用的任意化合物，可以首先通过细胞培养测定估计治疗有效的剂量。可以在动物模型中制定剂量以获得包括如细胞培养中所测定的IC50(即，获得症状的半最大抑制作用的测试化合物浓度)在内的循环血浆浓度范围。这些信息可以用于更准确的确定人体中的有效剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相层析进行测量。本文中所用术语"有效量"和"治疗有效"表示使用一段时间的本文所述化合物的数量或浓度(包括急性或慢性施用和定期或连续施用)，其在施用的情况下有效导致意订的效栗或生理学成果。对于本文所述的化合物，例如多肽的有效量(即有效剂量)的范围从约().O()l到500mg/kg体3t,例4口约0.01到50mg/kg体重，例如约0.1到20mg/kg体重。多肽可以在约1到10周之间，如在约2到8周，约3到7周之间，或约4、5或6周中每周施用一次。技术人员可知某些因子影响有效治疗患者所需的剂量和时间，其包括但不限于待治疗的患者的类型、疾病或紊乱的严重程度、以前的治疗、患者的综合健康情况和Z或年龄，和存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的化合物治疗患者可以包括单一治疗，或优选的包括系列治疗。至于抗体，部分人抗体和全长人抗体在人体中具有比其它抗体更长的半衰期。因此，更低的剂量和更低的施用频率是可能的。修饰，例如脂质化(lipidation)可用于稳定抗体和增强吸收和组织渗透。抗体脂质化的方法记载于Cmikshank等((1997)J.AcquiredImmuneDeficiencySyndromesandHumanRetrovirology14:193)中。如果化合物是小分子，示例剂量包括每千克受试者或样本重量毫克或微克量的小分子(例如，每千克约1微克到每公斤约500毫克，每公斤约100微克到每公斤约5毫克，或每公斤约1微克到每公斤约50微克。可进一步理解小分子的适当剂量取决于小分子调制表达或活性的能力。当将一个或多个这些小分子施用给动物(如人类)以调制FZD或Wnt多肽或核酸的表达或活性时，医生、兽医或石开究人员例如可以首先指定相对较低的剂量，然后增加剂量直到获得适当的反应。此外，应理解用于任何特定动物受试者的特定剂量水平取决于多种因素，其包括所使用的特定化合物的活性、受试者的年龄、体重、综合健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率、任何药物组合和待调制的表达或活性的程度。核酸分子(如FZD7，FZD8，Wnt3，Wnt8b和/或Wm11DNA)可以插入到载体中，用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部施用(参见，例如美国专利5，328，470)或通过定向(stereotactic)注射(参见，例如Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:3054-3057)递送到受试者中。基因治疗载体的药学制品可以包括在可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包含植入基因递送载体的緩释基质。可选的，当整个基因递送载体可以完整的从重组细胞例如逆转录病毒载体中产生时，药学制品可以包括一个或多个产生基因递送系统的细胞。下述实施例部分记载了潜在能够用于基因治疗方法的示例构建体。药物组合物可以和施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。VI.癌症及其治疗术语"癌症"表示具有自主生长能力的动物细胞。这种细胞的实例包括具有异常状态或情况的细胞，其特征为快速增殖的细胞生长。术语意指包括癌生长，例如肿瘤；致瘤过程、转移的组织和恶性转化的细胞、组织或器官，不论其组织病理学类型或侵袭阶段。还包括多种器官系统的恶性肿瘤，例如呼吸、心血管、肾脏、生殖、血液、神经、肝、肠胃和内分泌系统；以及腺癌，其包括癌症例如大部分结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺非小细胞癌、小肠癌和食道癌。"自然出现"的癌症包括任何不是通过移植癌细胞到受试者实验诱导的癌症，并且包括例如，自发出现的癌症、由于患者接触一种或多种致癌物而导致的癌症、由于插入转基因的致癌基因或敲除肺瘤抑制基因而导致的癌症，和通过感染，例如病毒感染导致的癌症。术语"癌"是本领域公知的，表示上皮或内分泌组织的恶性状态。该术语包括癌肉瘤，其包括由癌瘤性和肉瘤样组织组成的恶性肿瘤。"腺癌"表示源自腺状组织，或其中肿瘤细胞形成可识别的腺状结构的癌。术语"肝癌"(HCC)表示从肝细胞，肝脏的主要细胞类型发生的癌。术语"患者"在整个说明书中被用于表述动物、人或非人，啮齿动物或非啮齿动物，它们被依照本发明的方法进行治疗。预期进行兽类和人类的临床应用。术语"患者，，包括，但不限于鸟、爬行动物、两栖动物和哺乳动物，如人、其它灵长类动物、猪、啮齿动物，如小鼠和大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、母牛、马、猫、狗、绵羊和山羊。优选的受试者是人、农场动物(farmanimals)和家庭宠物，例如猫和狗。术语"治疗"在本文中用于表示延缓患有病症，如癌症的患者的发作、抑制、减轻其作用或延长其生命。可使用本发明的方法和组合物治疗的癌症除了别的以外包括，但不限于肝、胃、结肠、直肠、口/咽、食道、喉、胰腺、肺、小肠和胆管的癌症。被认为具有患癌症风险的个体可以明显的从本发明中获益，主要因为可以在出现肿瘤任何迹象前开始预防性治疗。"有风险"的个体包fe,例如通过如才聂入(consumption)，例如通过如"及入和/或損—耳又，以统计学上显示在易感个体中促进癌症的水平接触到致癌物质的个体。还包括接触病毒，如肝炎病毒，如乙肝病毒(HBV)的个体。还包括由于暴露于紫外线辐射、或他们的环境、职业和/或遗传而具有风险的个体，以及显示前癌症症状迹象的那些个体。类似的，在癌症的非常早期阶段或转移发生阶段(即，只有一个或少量异常细胞出现在个体身体中或个体组织的特定位点)的个体可以从这些预防性治疗中获益。技术人员了解，医生(或兽医，取决于要诊断的患者)可以使用本文所述的方法诊断患者患有癌症或具有患癌症的风险，其任选的使用附加的方法，例如评估患者的病史、进行其它诊断试验和/或通过使用成像技术。治疗患有癌症或具有患癌症风险的患者的一种策略是调制患者中的Wnt/FZD信号传导。目的是在信号传导太低的地方增加信号传导，在信号传导太高的地方降低信号传导。Wm/FZD信号传导的调制分成两个基本类型降低(即减少，如消除)Wnt/FZD信号传导，和当不足或没有活性时增加(即补充或提供)Wnt/FZD信号传导。Wnt/FZD信号传导是否应当被抑制或增加取决于预期的应用。Wnt/P'ZD信号传导可以使用本文所述的活性化合物(例如，抗Wm抗体、siRNAs、候选化合物和/或抗癌剂)进行调制。通过例如降j氐FZD7和/或Wnt3的表达和/或干扰FZD7和它的配体(例如，Wnt3、8b和/或11)之间的相互作用降低Wnt/FZD信号传导活性的化合物可以被用于例如治疗癌症，如肝癌。通过例如增加FZD8的表达增加活性的化合物也可以一皮用于例如治疗癌症，如肝癌。降低Wnt/FZD信号传导可以使用本领域已知的用于降低患者中特定蛋白表达的方法降低Wnt/FZD信号传导。例如，可以使用有效抑制内源FZD或Wnt基因，如FZD7或Wnt3基因表达的反义核酸。本文中，术语"反义寡核苷酸"或"反义"描述寡核苷酸，其为寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸、修饰的寡核糖核苷酸或修饰的寡脱氧核糖核苷酸，其在生理条件下与包含特定基因或该基因的mRNA转录本杂交，并因此抑制该基因的转录和/或该mRNA的翻i奪。设计反义分子使其通过与目标基因或转录本的杂交干扰靶基因(例如，编码FZD7或Wnt3、8b或11的基因)的转录或翻译。反义核酸可以包括与整个FZD或WntRNA或RNA的一部分互补的核苷酸序列。一方面，反义核酸需要足够长以便有效的的与FZD或WntRNA杂交。因此，最小长度为大约12到25个核苷酸。另一方面，当长度增加到超过约150个核苷酸时，抑制转录的效力仅有微小的增加，而将反义核酸导入靶细胞的困难将明显增加。因此，反义核酸的合适长度可以为乂人约15到约150个核苷酸，如20、25、30、35、40、45、50、60、70或80个核苷酸。反义核酸可以与FZD或WntmRNA的编码区或者FZD或WntmRNA的5，或3'非编码区或者两者互补。一种方法是设计反义核酸使其与FZD或WntmRNA翻译起始位点两侧的区域互补。基于本文所公开的序列，本领域技术人员能够容易的选择和合成大量适于本发明使用的反义分子的任意一个。例如，可以制备含有与FZD或WntmRNA互补并跨越其长度的一系列15-30个核苷酸的寡核苦酸的"基因步移(genewalk)"，随后检验FZD或Writ表达的抑制。可选的，可以在寡核苷酸之间留5-10个核苷酸的缺口以减少合成和测试的寡核芬酸的数量。可以例如根据售货方的说明例如使用商业购得的核酸合成仪化学合成反义核酸。可选的，可以使用重组DNA技术生产反义核酸。反义核酸可以只4參入天然存在的核苦酸。可选的，它可以掺入各种修饰的核芬酸或核苷酸类似物以增加它在体内的半衰期或增加反义分子与它的靶RNA之间形成的双链体的稳定性。核苦酸类似物的实例包括硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核普酸。给定靶标和序列的描述，生产合适的反义核酸属于本领域的常规技术。对于有关反义核酸的指导，参见例如Goodchild,"InhibitionofGeneExpressionbyOligonucleotides,"inTopicsinMolecularandStructuralBiology,Vol.12:Oligodeoxynucleotides(Cohen,ed.),MacM'illanPress,London,pp.53-77(1989)。反义寡核苷酸的递送可以通过本领域技术人员已知的任何技术完成。例如，为细胞培养物和/或先体外后体内的工作递送反义寡核苷酸可以通过标准方法，例如脂质体法或者只是通过加入能透过膜的寡核苦酸完成。为体内应用递送反义寡核苷酸可以例如通过在所选位点，如肝脏局部注射反义寡核苷酸实现。这个方法以前被证实可抑制牛皮癣生长和抑制细胞巨化病毒。参见例如，Wraight等，(2001).PharmacolTher.90(1):89-104;Anderson等，(1996)AntimicrobAgentsChemother40:2004-201l;和Crooke等，(1996)JPharmacolExpTher277:923-937。类似的，RNA干扰(RNAi)技术可以被用于抑制FZD或Wnt表达，另外的或可选的应用反义技术。例如，针对FZD或Wnt核酸的'J、千扰RNA(siRNA)双链体可被合成，并用于防止所编码的一个或多个蛋白的表达。下述实施例部分记载了示例性Wnt3siRNAs。另一个抑制Wnt/FZD信号传导的途径包括施用给患者化合物，例如候选化合物或抗癌剂，其与FZD多肽(例如1'7D7多肽)和/或它们的结合配偶体(例如Wnt2、8b和/或11)结合，从而防止两者之间的相互作用。这些化合物和试剂可以，例如与FZD多肽(例如与FZD多肽的CRD结构域)和/或与Wnt多肽(例如与Wnt多肽的结合结构域)以防止蛋白间相互作用的方式结合。这种候选化合物和抗癌剂可以使用本文所述的筛选方法鉴定。可以与Wnt多肽，例如Wnt3、8b和/或11结合的化合物的实例是FZD7受体或其截短的形式，和抗Wnt抗体(或其FZD结合片段)，例如下述实施例部分所述的抗Wnt3抗体。又另一个抑制Wnt/FZD信号传导的途径包括施用给患者编码突变(例如截短的)形式的FZD受体，如FZD7受体的载体(例如基因治疗载体)。掺入构建体的患者细胞中突变形式受体的表达可以干扰细胞中的Wnt/FZD信号传导。例如，可以使用编码分泌和可溶形式的FZD受体(例如FZD7受体)的构建体。靶细胞中这种构建体的表达将导致细胞分泌可溶形式的FZD受体，其将与Wnt多肽结合，使得它们不能与细胞表面的完整FZD受体结合。可选的或另外的，可以使用编码膜结合但无活性形式的FZD受体(即，无法行使一些由类似的野生型FZD受体行使的功能的突变FZD受体)的构建体。细胞中这种构建体的表达可以结合Wnt多肽或通过不涉及Wnt多肽的内在机制干扰Wnt/FZD信号传导。又另一个抑制Wnt/FZD信号传导的途径包括施用给患者编码Wntll多肽的载体(例如，基因治疗载体)，其是HCC中经典Wnt途径的抑制物。该载体可以源自不复制的线性或环形DNA或RNA载体，或来自自主复制的质粒或病毒载体。构建合适的表达载体的方法是本领域已知的，有用的材料可以通过商业途径购买得到。增加Wnt/FZD信号传导通过增加患者中FZD多肽(例如，FZD8多肽)和/或Wnt多肽(例如，Wnt3多肽)的表达可以在体内提供新的或补充的Wnt/FZD信号传导。例如，通过在生物体的细胞中表达含有编码FZD多肽(例如，FZD8多肽)和/或Writ多肽(例如，Wnt3多肽)的核苷酸序列的核酸构建体可以直接在生物体，例如人中产生FZD或Wnt多肽。为这个目的可使用任何适于转染目的生物体细胞的合适的表达载体。VII.转基因动物本发明还描述了发生肝癌和在它们的肝细胞中过量表达l''ZD7的转基因动物。这些动物代表用于研究肝癌和开发能够调制Wnt/I'7D信号传导和治疗癌症的治疗试剂的模型系统。转基因动物可以为，例如农场动物(猪、山羊、绵羊、母牛、马、兔等)、啮齿动物(例如，大鼠、豚鼠和小鼠)、非人灵长类动物(例如，狒狒、猴子和黑猩猩)和家庭宠物(例如，狗和猫)。可使用任何本领域已知的技术将转基因导入动物中以产生转基因动物的建立者系(founderlines)。这些技术包括，但不限于前核显微注射(美国专利No.4,873,191);逆转录病毒介导的向种系中的基因转移(VanderPutten等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA82:6148，985);向胚胎干细胞中的基因导向(Thompson等，Cell56:313,1989);和胚胎的电穿孑L(Lo，Mol.Cell.Biol.3:1803,1983)。特别有用的是Yang等(Proc.NatlAcac.Sci.USA94:3004-3009,1997)中所述的方法。为回顾可用于产生和评估转基因动物的技术，技术人员可参考Gordon(Intl.Rev.Cytol.115:171-229，1989)，并且可以从例如:Hogan等ManipulatingtheMouseEmbryo,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY,1986);Krimpenfort等(Bio/Technology9:86，1991)，Palmher等(Cell41:343，1985)，Kraemer等(GeneticManipulationoftheEarlyMammalianEmbryo,ColdSpringI-larborPress,ColdSpringHarbor,NY,1985),Hammer等(Nature315:680，1985)，Purcel等(Science:244:1281，1986),Wagner等(美国专利No.5,175,385)和Krimpenfort等(美国专利No.5,]75，384)获得其它指导。实施例本发明部分通过下述实施例进4亍举例说明，其不被一见为以任4可形式限制本发明。实施例1.鉴定天然Wnt配体对HCC生长的抑制方法勿應^面//S尸G的斜备和遞《艰腐潜^^的为、敛在10%FBS(Sigma,St.Louis,MO)MEM(Mediatech，Hemdon,VA，USA)中培育Huh7细胞至70%铺满。温育后24小时将培养基改变为0%FBSMEM,并在0.1%FBSMEM中使用或不使用肝素(50ug/ml)处理细胞12小时。用冰冷的PBS洗涤细胞5次，在Tris缓沖的盐水/m)TA中用结晶化的胰蛋白酶(20ug/ml)于冰上孵育细胞层10分钟。加入终浓度100ug/ml的大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶活性。通过4°C下400xg离心5分钟从胰蛋白酶消化产物(trypsinate)中除去被污染的细胞。对胰蛋白酶消化产物进行肝素琼脂糖层析。简要的，4。C下用肝素(4%)琼脂糖^朱子孵育胰蛋白酶消化产物过夜，并通过2000xg离心4分钟收集珠子，用20体积的PBS中的0.1MNaCl洗涤珠子。用PBS中的0.25、0.5、0.75和1.0MNaCl收集洗脱的级分。二举凝履*泳，嚴力潘化("/"-ge/d/geW/owJ#口應通过沉淀和用IPG緩沖液再水合制备来自肝素琼脂糖层析的分级样本以用于等电聚焦(IEF)。根据制造商的步骤使用ZOOMIPGRunner(Invitrogen,Carlsbad,CA)进行IEF。用样本再水合ZOOM条带(pH3-10)过^复，然后如下进4亍阶3夭式电压在牛线上升(stepvoltageramping)方法200V20分钟，450V15分钟，750V15分钟和2000V120分钟。对聚焦的凝胶进行SDS-PAGE,使用ZOOM凝胶(Invitrogen)作为第二维电泳。电泳后，使用SilverQuest银染试剂盒(Invitrogen)染色凝胶。从银染凝胶切下的蛋白斑点被脱色和干燥，然后用序列级别的改良的胰蛋白酶(Promega，Madison,WI)酶促消化。胰蛋白酶消化的肽一皮脱盐和用ZipTipcl8(Millipore，Bedford,MA)浓缩。浓缩的月夷蛋白酉争消化的肽^皮用于SENDProteinChip和使用PBSII(Ciphergen,Fremont,CA)进行肽作图。通过程序ProteinProspector中的数据库搜索工具MS-fit进行肽质量指纹鉴定，该搜索工具可从hUp:Z/prospector.ucsf.ecki获得。基于斑点在2-D凝胶上的位置对初始搜索进行若干限制物种=人，pi范围=6-9.5,质量范围=35—50kDa。用TRIzolReagent(Invitrogen)从HepG2、Hep3B、Huh7和Focus细胞系中提取总细胞RNA。釆用用于RT-PCR的第一链cDNA合成试剂盒(AMV)(RocheDiagNOtics,Indianapolis,IN)用随机六聚物(randomhexamers)和AMVRT从250ng的总RNA在20|al反应混合物中合成第一链cDNA。在热循环4义(M〕ResearchInc.,Waltham，MA)中使用50ng的cDNA和高保真PCRMaster(RocheDiagNOtics)进行PCR。每个Wnt配体的引物对列于下面表1中。每个引物的终浓度为250nM。在94°C初始变性4分钟之后，反应进行35个循环的下述热程序94°C30秒，55°C30秒，和72°C1分钟，然后在72°C下进行最后的延伸步骤10分钟。扩增产物在溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶上进行分析。^r-PO为Vf如上所述进行肝组织和HCC细胞系的总RNA提取和RT反应。为测定Wnt3、Wnt11和FZD7的mRNA表达水平，使用iCycleriQMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystem(Bio-Rad，Hercules,CA)用由SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)、400nM每种引物、和5ng来自未知样本的cDNA(相等的总RNA)组成的混合物进行qR丁-PCR。热循环条件包括初始步骤95。CIO分钟，然后是40个循环的95。C15秒，60°C30秒和72。C30秒。Wnt3、Wntl、FZD7和18SrRNA的？1物序列如下(1)Wnt3,5，-ACTTCGGCGTGTTAGTGTCC-3，(正向)(SHQ11)NO:68)和5,-CATTTGAGGTGCATG丁GGTC-3，(反向)(SEQ11)NO:69);(2)Wntll,5'-TTCCGATGCTCCTATGAAGG-3，(正向)(SEQIDNO:70)和5，-AGACACCCCATGGCACTTAC-3，(反向)(SL:QI[)NO:71);(3)FZD7,5'-GCCGCTTCTACCAC八G八CT-3，(正向)(SP:QIDNO:72)和5,-TTCATACCGCAGTCTCCCC-3，(反向)(SEQIDNO:73);(4)18SrRNA，5'-GGACACGGACAGGATTGACA-3，(正向)(SEQII)NO:74)和5,-ACCCACGGAATCGAGAAAGA-3，(反向)(SEQII)NO:75)。对于Wnt3而言，扩增子的大小为130bp，对于Wntll为133bp，对于FZD7为54bp，和对于18SrRNA为50bp。通过J.5%琼脂糖凝胶电泳和澳化乙锭对PCR产物显像后，切下PCR产物，克隆到pCR2.1栽体(Invitrogen)中。使用T7正向和M13反向引物进行双向测序。确认核苷酸序列之后，将每种PCR产物的10倍稀释物克隆到pCR2.1载体中制定实时PCR的标准。在与每个基因的标准曲线比较后，通过测量Ct值，随后标准化至18SrRNA,定量未知样本中Wnt3、Wntll和FZD7mRNAs的拷贝数。进行重复实验。l在和友ff""yl6的*备由于来自人Wnt3质粒C末端的22个氨基酸在原始质粒(22)中缺失，所以使用三轮基于人Wnt3序列的PC.R扩增将它延伸为全长序列，其中人Wnt3通过Hincim和F:coRI限制性酶切位点克隆到pcDNATM3.1/myc-HisA(Invitrogen)中。引物序列为5'-TAGTTAAGCTTACCATGGAGCCCCACCTGCTC-3'(正向)(SEQIDNO:76),向-l)(SEQIDNO:77)，向-2)(SEQIDNO:78)，ACA-3，(反向—3)(SEQIDNO:79)。制备针对合成肽的兔多克隆抗体，所述合成肽相当于人Wnt3的氨基酸259—274(25YRAKYSLFKPPTCRDL271)(S1':QI[)NO:80)。该肽序列与Wnt家族的其它成员或其它已知蛋白没有明显的同源性。抗体的特异性通过Western印迹分析验证，所述分析使用用myc标记的Wnt3质粒转染的HCC细胞系。Hep3B，Huh7和Focus细胞系生长于MHM中，该培养基补充有10%FBS和IX极限必需培养基非必需氨基酸溶液(Sigma)。因为p-联蛋白基因中的缺失突变(31),HepG2细胞被排除在外。根据生产商的指示使用LipofectAMINE2000(Invitrogen)或TransIT-LTl(Mims，Madison,WI)在70%铺满时进行转染试验。用pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH转染细胞后(32),使用LuciferascAssaySystem(Promega，Madison,Wl)分析Tcf转录活性。用卩-半乳糖苷S争活性作为转染对照对焚光素酶活性的原始数据进行标准化。实验一式三份的进行，重复三次以验证结果。77CC勿應『"di^4这的放^用pcDNA3.1/myc-HisA(对照质粒)或Wnt3质粒，pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH,和卩-半乳糖苷酶质粒转染HCC细胞。转染后24小时，用0%FBSMEM孵育细胞24小时，然后用1%FBSMEM进行刺激。在刺激后2小时和24小时收集细胞，进行Wnt3和)3-联蛋白的荧光素酶分析和Western印迹分析。在『wd我体的放果对于阻断试验，将细胞接种到12孔平板中，用如上所述的pSUPER8xTOPFLASH或pSUPER8xFOPFLASH和p-半乳糖芬酶质粒进行转染。血清饥饿24小日寸后，细胞用含有抗Wnt3Ab或对照Ab(10pg/ml)的1%FBSMEM温育，温育24小时之后进行收集。采用正常的兔IgG(Upstate，Waltham,MA)作为对照抗体。对照siRNA和Wnt3siRNA(WNT3-1:5,-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3，(SEQIDNO:81)，WNT3-2:5'-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3，(SEQIDN():82),WNT3-3:5，-GGCUUAUCUUUGCACAUGIJ-3，(SEQIDNO:83))购自Ambion(Austin,TX),以10或100nM的浓度，和pSUPKR8xTOPFL八SI1或pSUPLiR8xl'，OP「LASII和p--半乳糖芬fi争质粒一起，使用TransIT-LTl或DharmaFECT4(Dharmacon,Chicago,IL)转染入HCC细胞。转染后48小时，分別通过qRT-PCR和荧光素i酶分析检测Wnt3的mRNA表达水平和Tcf转录活性。逸錄在W"/J^"務口,奮合/^参询Focus细胞铺板于6孔平板中。用无菌的塑料200)il微量移液管尖端损伤铺满的单层细胞。然后用含有抗Wnt3Ab或兔IgG的培养基处理细胞，在不同时间点拍照。,曾《伊遊为、浙为提取总蛋白，将细胞在含有蛋白酶抑制剂(RocheDiagN()tics)的溶胞緩冲液(30mMTris,pH7.5,150mM氯化钠，1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS,10%甘油和2mMEDTA)中同质化并进行超声处理。使用BCAProteinAssayKit(Pierce,Rockford,IL)以BSA为标准确定蛋白浓度。等量的蛋白(150]ug)用12-15%SDS-PAGE分开，并转移到PVDF膜(PerkinElmer，Wellesley,MA)。膜用含有0.1%Tween20的Tris緩冲盐水中的5%BSA封闭，然后在4°C下用1:1000稀释的小鼠单克隆4元mycAb(SantaCmzBiotechnologyInc.,SantaCruz，CA)、1:200稀释的兔多克隆抗Wnt3Ab、1:1000稀释的小鼠多克隆抗(3-联蛋白Ab(TransductionLaboratories,SanDiego,CA)、或1:2000稀释的兔多克隆抗hsp90Ab(SantaCmzBiotechnologyInc.)培养过4艾。用含有0.1%Twcen20的Tris緩冲的盐水洗涤后，膜在室温下用1:10000稀释的第二HRP抗体温育1.5小时，并用化学发光成像WesternLightning(PerkinElmer)显像。乂//CC邀欢17对HCC和相匹配、未受累的、肿瘤周围(pcritumoral)肝组织得自南韩和南非。12对样本来自接受手术切除的韩国病人。12名患者中9个是男性，中位数年龄为52岁(范围从22岁-67岁)。11名患者是乙肝表面抗原(HbsAg)阳性，余下的一名患者的病因不明。7名患者(58%)具有潜在的肝硬化。5个肝组织来自因为结肠直肠癌向肝脏的单个转移而进行肝脏切除的韩国患者，该5个肝组织被用作正常肝组织的对照。4名患者是男性，中位数年龄为46岁(范围从37岁-57岁)。组织学检查在周围的肿瘤周围肝组织中没有显示任何病理。p_联蛋《的兌^i^织化学曱醛固定、石蜡包埋的切片在二曱苯中脱石蜡，并通过降低乙醇浓度再水合。将切片浸于10mM柠檬酸钠緩沖液(pH6.0)中，在微波炉中煮沸10分钟，室温冷却以恢复表位。随后根据生产商的指示使用UniversalDakoCytomationLSAB+Kit,Peroxidase(I)AKOCorp"Carpinteria，CA)处理载玻片。通过用3%过氧化氢和EndogenousAvidin/BiotinBlockingKit(ZymedLaboratoriesInc.,SouthSanFrancisco,CA)醉育阻断内源过氧化物酶、抗生物素蛋白和生物素的活性。切片在4。C下用1:500稀释的抗人p-联蛋白单克隆Ab孵育过夜。作为阴性对照，用PBS替换第一抗体。卩-联蛋白的表达模式根据核染色的存在分为两类。胂瘤组织中的细胞质染色也与肿瘤周围组织中的进行比4交。对"-农奢^差/^外i子-J的关'^为Vi通过Wong等(1)的方法并加以修改来分析P-联蛋白基因的外显子3突变。简要的，使用ExpandHighFidelityPCRSystem(RocheDiagNOtics)从来自HCC和周围的胂瘤周围组织的cDNA(50ng)扩增P-联蛋白基因外显子3的218bp片段。引物的序歹'J为5'-GATTTGATGGAGTTGGACATGG-3,(正向)(SHQIDNO:84)和5，-TGTTCTTGAGTGAAGGACTGAG-3，(反向)(SEQIDNO:85)。热循环条件包括94°C3分钟的起始变性步骤，然后是35个循环的95°C30秒，58°C30秒和72°C30秒。PCR产物显像后，将PCR产物克隆到pCR2.1载体(lnvitrogen)中，随后使用T7正向和M13反向引物测序。测序分析每个PCR产物的至少5个克隆。结果在细應屑—#定^紀体由于Wnt蛋白主要与细胞表面的ECM相联，尝试在Huh7中以联合的形式纯化包含一种或多种Wnt蛋白的细胞表面HSPG。通过胰蛋白酶制备的Huh7-HSPG被用于肝素-琼脂糖亲和树脂以进行预分级。洗脱的级分进行SDS-PAGE,并比较用肝素处理的和不用肝素处理的样本的蛋白带。从0.25MNaCl洗脱的级分中，在未用肝素处理的级分中可分辨出大约45kDa的蛋白带(未显示数据)。由于Wnt蛋白的预期分子量在35-45kDa的范围中，认为该蛋白带很可能包括Wnt蛋白。为定义该蛋白带，进行二维电泳。如图1A所示，有几个银染蛋白斑,与、，显示用肝素处理和不用肝素处理的样本间不f司蛋白表达水平。35-55kDa和pl5_9.5的蛋白斑点被认为是Wnt配体蛋白的候选物。研究在未用肝素处理的样本中上调的两个蛋白斑点，因为Wnt蛋白可以通过肝素处理释放。从银染的二维凝胶上切下的蛋白斑点被用于胶内消化，然后通过质语分析进行肽作图。数据分析显示九个肽与人Wntll蛋白相匹配，如图IB所示。为进一步确证这个发现，通过RT-PCR检测HCC细胞系中WntmRNA的表达，其使用19对特异于所有已知的人Wnt配体的引物。如图1C所示，全部19个被4全测的Wnt基因中，只有Wnt3和Wntl1mRNA在HCC细胞系中表达。通过RT-PCR没有4全测到其它已知的WntmRNAs。在HCC细月包系中鉴定了Wnt3和Wntl1后，使用定量实时RT-PCR(qRT-PCR)分析才企测HCC细胞系中mRNA的表达水平。HCC细胞系中Wnt3mRNA的表达水平(平均值士SE)为在HepG2中每10918S核糖体RNA(18SrRNA)370.0±10.3，在Hep3B中每10918S核糖体RNA381.3±2.7，在Huh7中每10918S核糖体RNA95.2±6.3，和每10918S核糖体RNA210.4士9.5个拷贝。WntllmRNA的表达水平为在HcpG2中每l()918SrRNA8，499.3土845.0，在Hcp3B中每10918SrRNA290.9±40丄和在Iiuh7细胞中每10918SrRNA3.57±0.2个拷贝。通过实时RT-PCR无法在Focus细胞中检测到WntllmRNA，这与常规RT-PCR的结果一致(图2B)。人//CC邀织中、W"〃/#口/'，ZD7m/《AM的43当将截止水平定义为正常肝组织中平均值士3SI)时，17个HCC中的13个(76.5%)和17个肿瘤周围组织中的10个(58.8%)与正常对照相比显示增高的Wnt3mRNA的表达水平。只有1个肿瘤周围组织与正常肝组织相比显示表达降低。17对样本中，12对(70.6%)显示肿瘤与相应的肿瘤周围组织相比Wnt3mRNA的表达增力口，但它不是统计学上显著的(Wilcoxon符号秩检验的P=.435)(图3A)。与Wnt3相反，17对配对样本中的11对(64.7%)显示肿瘤与相应肿瘤周围组织相比WntllmRNA的表达降低，其也不是统计学上显著的(Wilcoxon符号秩检验的P=.227)。然而，17个肿瘤组织中的7个(41.2%)显示表达水平降至甚至低于正常肝组织的较低截止水平，但是在肿瘤周围组织中没有一个降低(Fischer精确检验的P=.0036)。17个肿瘤组织中有5个(29.4%)显示与正常肝组织相比增高的WntllmRNA表达水平，而17个肺瘤周围组织中有9个(52.9%)显示与正常肝组织相比增高的Wntl1mRNA表达水平。HCC和肿瘤周围组织都在17个样本中的10个(58.8%)中显示与正常肝组织相比增高的FZD7mRNA表达(图3B)。17对成对样本中的12对(70.6%)显示肿瘤与相应的胂瘤周围组织相比FZD7mRNA的表达增高，这个差别是统计学显著的(Wilc函n符号秩检验的P=.031)(图3C)。免疫组织化学染色显示17个HCC组织中7个(41%)出现P-联蛋白的细胞核积聚。在周围的肿瘤周围组织中没有P-联蛋白的细胞核积聚(图4)。所有7个具有P_联蛋白细胞核积聚的样本也显示细胞质中卩-联蛋白的染色增强。没有卩-联蛋白细胞核积聚的IO个肿瘤组织中，1个样本显示与其相应的肺瘤周围组织相比(3-联蛋白的细胞质染色增加。通过测序分析，在17个HCC样本中的4个(23.5%)中发现(3-联蛋白基因的外显子3突变，但在周围的肿瘤周围组织中一个也没有。它们都是影响密码子35、37和45的单个错义突变(两个135S、一个S37C和一个S45F)。通过免疫组织化学染色显示|3-联蛋白细胞核积聚的7个样本中，有3个(42.9%)在负责卩-联蛋白磷酸化和遍在蛋白化的区域具有突变。在卩-联蛋白基因中具有突变(I35S)但没有P-联蛋白的细胞核积聚的一个样本在免疫组织化学染色中细胞质染色增强。余下的所有4个有p-联蛋白细胞核积聚但P-联蛋白基因没有4壬何突变的样本与成对的肿瘤周围组织相比FZD7mRN八水平增高。FZD7mRNA水平与正常肝组织的平均值相比也增加了7-74倍。^f旦是，Wnt3和/或Wntl1的mRNA表达水平与P-联蛋白的细胞核积聚无关。//CC勿應屑#『""d在这的放果为确定HCC中Wnt对经典Wnt途径的影响，在用Wnt3质粒转染后检测T细胞因子(Tcf)转录活性的改变。用Wnt3质粒转染导致mRNA和蛋白的表达水平都明显增加(未显示数据)，如图5A中所示。与对照相比，Focus细胞中Tcf的转录活性也显示增加约3倍，这在统计学上是显著的(P<0.01)。然而，Tcf转录活性在Hep3B细胞中没有改变，在Huh7细胞中甚至降低，特别是在刺激后24小时(图5B)。与这些结果相一致的是，正如Western印迹分析所显示的，用Wnt3质粒转染后Focus细胞中细胞卩-联蛋白水平增高，但是在Hep3B或Huh7细胞中则没有改变或降低(图5A)。遞d我减w'/M^乂,在『w-f传^然后，检测抗Wnt3Ab或siRNA对HCC细胞系中经典途径的抑制效果，因为与Focus细胞相比，Huh7和Hcp3B细胞中Tcf转录活性和细胞P-联蛋白水平的基线已经很高(图5)。用多克隆抗Wnt3Ab孵育导致Huh7中荧光素酶活性降低60%,Hep3B中降低26%,Focus细胞中降低40%(图6A)。为证实对经典途径的这一抑制效果，使用针对Wnt3的siRNA。首先，使用qRT-PCR分析评估在Huh7和Hep3B细月包中3种不同类型的siRNA的抑制效力。发现siRNAWm3-3最有效力(未显示数据)，其在100nM浓度时mRNA水平平均降低50-60%(图6B)。与mRNAs的这些降低相一致的是，Huh7中Tcl'转录活性也降低48.5%，在Hep3B中降低33%，在Focus细胞中降低43.5%(图6C)。因此，结论是Wnt3的抑制可以导致HCC细胞系中经典途径的抑制。//CCi砂應哞在『""治^f乂,務口#合的放果还研究Tcf转录活性的抑制是否能够导致HCC细胞行为的功能性改变。使用Focus细胞的伤口愈合分析显示用抗Wnt3Ab处理的细胞中伤口愈合延迟，这些改变在24h时最明显。在24h时，在用对照Ab处理的Focus细胞中大部分创伤被迁移的和/或增殖的细胞覆盖，但在用抗Wnt3Ab处理的细胞中它继续存在(图7)。这个研究分析了肝和HCCs中Wnt配体的表达模式。使用常规RT-PCR和qRT-PCR方法，发现大部分被检验的HCC细胞系表达Wnt3和WntllmRNA。也可以使用蛋白质组学技术在其蛋白水平证明Wntll的表达。与HCC细胞系中的这些观察相一致的是，在包括HCX在内的人肝组织中也证实了Wnt3和Wntl1mRNA的表达。在包括HCC和相应的肿瘤周围组织在内的人肝组织中确定Wnt3、Wntll和FZD7的表达沖莫式。肿瘤组织中FZD7的mRNA水平高于相应的肿瘤周围组织和正常肝组织中的水平。虽然HCC和肿瘤周围组织之间的Wnt3mRNA表达没有统计学上显著的差异，但是71%的HCC与它们对应的肿瘤周围组织相比显示增高的Wnt3表达。此外，77%的HCC和59%的胂瘤周围组织显示Wnt3mRNA表达水平高于正常肝脏组织中的平均值士3SD。这些发现表明Wm3的上调可以是肝癌形成期间的早期事件，和/或在肝脏炎症和坏死期间的肝细胞再生中起重要作用。此外，65%的成对HCC样本显示肿瘤与对应的肺瘤周围组织相比WntllmRNA的表达降低。41%的肿瘤组织显示Wntl1表达水平甚至降低至低于正常肝组织的较低截止水平。这些发现与Wnt1作为经典途径抑制剂的作用相一致。还发现Wnt3过表达激活了Focus细胞中的经典Wnt途径，其迹象是Tcf转录活性增加了3倍和细胞卩-联蛋白水平增高。然而，Hep3B细胞中Tcf转录活性没有改变，在Huh7细胞中甚至略微降低，即使Wnt3mRNA和蛋白的表达在转染后明显增高。多克隆抗Wnt3Ab或siRNA对Wm3的抑制降低了所有3种HCC细胞系中的Tcf转录活性。在具有最高基线Tcf转录活性的Huh7细胞中这些改变最为显著。此外，用抗Wnt3Ab处理Focus细胞抑制伤口愈合，这表明这种抑制的功能性结果是降低细胞迁移和增殖。在17个HCC组织中的8个(47%)中观察到P-联蛋白的细胞核和/或细胞质积聚，其中一半的例子具有卩-联蛋白基因突变。余下的4个具有(3-联蛋白积聚但没有突变的例子在肿瘤中具有明显增高水平的FZD7，这表明FZD7的上调直接关系到这些肿瘤中经典Wnt信号传导途径的激活。Wnt3或Wntll的表达水平与f3-联蛋白积聚或FZD7的表达水平都不相关。总之，在HCC细胞系和包括HCC组织在内的人肝组织中鉴定到Wnt3和Wntl1。与正常肝组织相比，HCC和肿瘤周围组织中的Wnt3mRNA表达水平都上调。HCC组织中WnU1mRNA表达下调。通过抗Wnt3Ab或siRNA抑制Wnt3导致经典Wnt信号传导途径的降低，并降低伤口愈合，但是Wnt3刺激增加Focus细胞中的Tcf转录活性。这些发现表明Wnt3是天然的Wnt配体，其与肝癌形成期间FZD7的过表达和经典Wnt信号传导途径的激活且不涉及(3_联蛋白突变有关。参考文献1.Davila,J.A.，Morgan,R.O.,Shaib，Y.,McGlynn，K.A.，和I':l-Serag,H.B.2004.HepatitisCinfectionandtheincreasingincidenceofhepatocellularcarcinoma:apopulation-basedstudy.Gastroenterology127:1372-1380.2.Du，S丄，Purcell，S,M.，Christian,J丄"McGrcw，L丄.，和Moon,R.T.1995.IdentificationofdistinctclassesandfunctionaldomainsofWntsthroughexpressionofwild-typeandchimericproteinsinXenopusembryos.MolCellBiol15:2625-2634.3.Liang,H.,Chen,Q.,Coles,A,H.，和erson,S丄，Pihan，G.，Bradley,A.，Gerstein，R.,Jurecic，R.,andJones,S.N.2003.Wnt5ainhibitsBcellproliferationandfunctionsasatumorsuppressorinhematopoietictissue.CancerCell4:349-360.4.Maye，P"Zheng,J.，Li,L.,和Wu,D.2004.MultiplemechanismsforWnU1-mediatedrepressionofthecanonicalWntsignalingpathway.JBiolChem279:24659-24665.5.Iozzo,R.V"Eichstctter，I.,和Danielson,K.G.1995.AberrantexpressionofthegrowthfactorWnt-5Ainhumanmalignancy.CancerRes55:3495-3499.6.Lejeune,S.,Huguet,E丄.，Hamby,A.,Poulsom,R.,和Harris,A丄.1995.Wnt5acloning,expression,andup-regulationinhumanprimarybreastcancers.ClinCancerRes1:215-222.7.Weeraratna,A.T.，Jiang,Y.,Hostetter，G"Rosenblatt,K.,Duray,R,Bittner,M.,牙口Trent,J.M.2002.Wnt5asignalingdirectlyaffectscellmotilityandinvasionofmetastaticmelanoma.CancerCell1:279-288.8.Kinzler，K.W.，和Vogelstein,B.1996.Lessonsfromhereditarycolorectalcancer.Cell87:159-170.9.Devereux，T.R.,Stern,M.C.，Flake,G.P.，Yu,M.C.，Zhang,Z.Q.,London,S丄,和Taylor,J.A.2001.CTNNB1mutationsandbeta-cateninproteinaccumulationinhumanhepatocellularcarcinomasassociatedwithhighexposuretoaflatoxinBl.MolCarcinog31:68-73.10.Hsu,H.C.,Jeng,Y.M.,Mao,T丄.，Chu,J.S.,Lai，P丄.，和Peng,S.Y.2000.Beta-cateninmutationsareassociatedwithasubsetoflow-stagehepatocellularcarcinomanegativeforhepatitisBvirusandwithfavorableprogNOis.AmJPathol157:763-770.11.Wong,C.M.,Fan,S.T.,和Ng，I.O.2001.beta-Cateninmutationandoverexpressioninhepatocellularcarcinoma:clinicopathologkandprogN()ticsignificance.Cancer92:136-145.12.Huang,H.，Fujii,H.,Sankila,A,,Mahler-Araujo，B.M.,Matsuda，M.,Cathomas，(i,和()hgaki,H.1999.Bcta-caleninmutationsarcfrequentinhumanhepatocellularcarcinomasassociatedwithhepatitisCvimsinfection.AmJPathol155:1795-1801.13.Laurent-Puig，P.,Legoix，R，Biuteau,().,Belghiti,J.，Franco,D.,Binot，F.,Monges,G.,Thomas,G.,Bioulac-Sage,R，和Zucman-Rossi,J.2001.Geneticalterationsassociatedwithhepatocellularcarcinomasdefinedistinctpathwaysofhepatocarcinogenesis.Gastroenterology120:1763-1773,14.Satoh,S.,Daigo,Y"Fumkawa,Y.,Kato,T"Miwa,N.,Nishiwaki:T"Kawasoe,T"Ishiguro,H.,Fujita,M"Tokino，T.，等2000.AX腿mutationsinhepatocellularcarcinomas,andgrowthsuppressionincancercellsbyvims-mediatedtransferofAXIN1.NatGenet24:245-250.15.Merle，R，delaMonte，S.，Kim,M.，Herrmann,M.,Tanaka，S.，VonDemBussche,A.,Kew,M.C.,Trepo，C.，和Wands,J,R.2004.Functionalconsequencesoffrizzled-7receptoroverexprcssioninhumanhepatocellularcarcinoma.Gastroenterology127:1110-1122.16.Merle,P.,Kim,M.,Herrmann,M.，Gupte,A.,Lefrancois,L.,Califano,S.,Trepo,C.，Tanaka，S.，Vitvitski，L.,Monte，S.D.，等2005.Oncogenicroleofthefrizzled-7/beta-cateninpathwayinhepatocellularcarcinoma.JHepatol.17.Lin，X.,和Perrimon，N.1999.DallycooperateswithDrosophilaFrizzled2totransduceWinglesssignalling.Nature400:281-284.18.Willert，K.,Brown,J.D.,Dancnberg,F…I)uncan，A.W.,Weissman,l丄.，Reya,T.,Yates,J.R.，3rd，禾口Nusse，R.2003.Wntproteinsarelipid-m()difiedandcanactasstemcellgrowthfactors.Nature423:448-452.19.Bradley,R.S.，和Brown,A.M.1990.Theprolo-oncogeneint-1encodesasecretedproteinassociatedwiththeextracellularmatrix.EmboJ9:1569-1575.20.Reichsman,I7.,Smith,L.，和Cumbcrledge,S.19%.Glycosaminoglycanscanmodulateextracellularlocalizationofthewinglessproteinandpromotesignaltransduction.JCellBiol135:819-827.21.Dh()ot,G.K.,Gustafsson,M.K"Ai,X.，Sun,W.，Standiford,D.M.:和Emerson,C.R,Jr.2001.RegulationofWntsignalingandembryopatterningbyanextracellularsulfatase.Science293:]663-1666.22.Roelink，H.，Wang,J,,Black,D.M.，Solomon,H.，和Nusse，R.1993.Molecularcloningandchromosomallocalizationto17q21ofthehumanWNT3gene.Genomics17:790-792.23.Shimizu,H.，Julius,M.A.,Giarre,M.,Zheng,Z.，Brown,A.M.,和Kitajewski,J.1997.TransformationbyWnifamilyproteinscorrelateswithregulationofbeta-catenin.CellGrowthDiffer8:1349-1358.24.Katoh,M.2001.MolecularcloningandcharacterizationofhumanWNT3.IntJOncol9:977-982.25.Gregorieff，A.，Pinto,D.，Begthel,H.，Destree，O.,Kielman，M.,和Clevers,H.2005.ExpressionpatternofWntsignalingcomponentsintheadultintestine.Gastroenterology129:626-638.26.Kirikoshi，H.，Sckihara,H.,和KaU)h,M.2001.MolecularcloningandcharacterizationofhumanWNTl1.JmJM()lMed8:65卜656.27.Zhu,H.,Mazor,M.,Kawan()，Y"Walker,M.M.,Leung,H.Y.，Armstrong,K.,Waxman,J.,和Kypta,R.M.2004.AnalysisofWntgeneexpressioninprostatecancer:mutualinhibitionbyWNT〗1andtheandrogenreceptor.CancerRes64:7918-7926.28.Smolich,B.D.,McMah()n，J.A.,McMahon,A.P.,和Papkoff，J.1993.Wntfamilyproteinsaresecretedandassociatedwiththecellsurface.MolBiolCell4:1267-1275.29.Cha，M.Y.,Kim,C.M.,Park,Y.M.,和Ryu，W.S,2004.HepatitisBvimsXproteinisessentialfortheactivationofWnt/beta-cateninsignalinginhepatomacells.Hepatology39:1683-1693.30.Veeman，M.T"Slusarski，D.C.，Kaykas，A.，I乂)uie，S.H.,禾口Moon,R.T.2003.Zebrafishprickle,amodulatorofnoncan()nicalWnt/Fzsignaling,regulatesgastruladonmovements.CurrBiol13:680-685.31.Carruba,G.,Cervello,M.,Miceli,M.D.,Farmggio,R.,Notarbartolo,M.,Virruso,L.,Giannitrapani,L.，Gambino,R.,Montalto,G.,禾口Castagnetta，L.1999.Truncatedformofbeta-cateninandreducedexpressionofwild-typecateninsfeatureHepG2humanlivercancercells.AnnNYAcadSci886:212-216.32.Korinek，V.,Barker,N.，Morin,RJ.，vanWichen,D.,deWeger,R.,Kinzler，K,W.,Vogelstein，B,，和Clevers,H.1997.Constitutivetranscriptionalactivationbyabeta-catenin-TcfcomplexinAPC-/-coloncarcinoma.Science275:1784-1787.<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>已经描述了大量本发明的实施方式。然而，应理解在不违背本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，其它实施方式在下述权利要求的范围中。权利要求1.鉴定抗癌剂的方法，该方法包括选择与多肽结合的测试化合物，所述多肽包含Wnt3、Wnt8b或Wnt11蛋白的氨基酸序列或其FZD结合片段，和检测测试化合物是否能够(i)降低细胞中的Wnt/FZD7信号传导；(ii)降低肝癌细胞移动性；(iii)降低肝癌细胞中β-联蛋白的积聚；或(iv)在体外或体内治疗肝癌；其中能够达到(i)到(iv)中至少一项的测试化合物是抗癌剂。2.权利要求l的方法，其中测试化合物的选择包括将测试化合物与多肽接触，所述多肽含有Wnt3、Wnt8b或Wnt11蛋白的氨基酸序列或其FZD结合片段；检测多肽与测试化合物间的结合；和如果所述测试化合物与多肽结合，则选择该测试化合物。3.权利要求1或2的方法，其中将所述多肽作为下列提供(i)天然存在的多肽；(ii)重组多肽；(iii)在细胞表面表达的多肽；或(iv)分离的多肽。4.权利要求1或2的方法，其中多肽包含Wnt3蛋白的氨基酸序列。5.权利要求4的方法，其中所述氨基酸序列含有SEQII)NO:8到12中任何一个和至少一个非Wnt序列。6.权利要求1或2的方法，其中所述多肽包含Wntl]蛋白的氨基酸序列。7.权利要求6的方法，其中所述氨基酸序列含有SEQIDNO:22到26中任《可一个和至少一个非Wnt序列。8.通过权利要求1-7任一项的方法所鉴定的化合物用于治疗肝癌。9.权利要求8的化合物用于治疗肝癌，其中所述化合物为(i)抗Wnt抗体；或(ii)FZD7受体或其Wm结合片段。10.通过权利要求1-7任一项的方法所鉴定的化合物在制备用于治疗肝癌或降低患者中肝癌细胞移动性的药物中的用途。11.与WnG、8b或11结合并由此降低患者细胞中Wnt/FZD7信号传导的化合物在制备用于治疗肝癌或降低患者中肝癌细胞移动性的药物中的用途。12.权利要求11的用途，其中所述化合物是抗Wnt3抗体。13.权利要求12的用途，其中所述抗Wnt3抗体与含有氨基酸序列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQIDNO:80)的多肽结合。14.降低Wnt3的表达并由此降低患者细胞中Wnt/FZD7信号传导的化合物在制备用于治疗肝癌或降低患者中肝癌细胞移动性的药物中的用途。15.权利要求14的用途，其中所述化合物是降低患者中Wm3表达的siRNA。16.权利要求15的用途，其中所述siRNA包含选自下组的序列WNT3-1:5'-GGAAAAAUGCCACUGCAUC-3'(SEQII)NO:81)、WNT3画2:5，-GGAGUGUAUUCGCAU(〕UAC陽3'(SEQIDNO:82)、和WNT3-3:5'-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3，(SEQIDN():83)17.鉴定候选抗癌剂的方法，该方法包含(a)提供第一多肽，所述第一多肽(i)含有FZD7多肽或其片段；和(ii)显示Wnt结合能力;(b)提供第二多肽，所述第二多肽(i)含有Wnt3、Sb或ll多肽或其片段；和(ii)显示FZD7结合能力；(c)在存在测试化合物的情况下，将所述第一和第二多肽接触；和(d)将存在测试化合物时第一与第二多肽之间结合的水平与不存在测试化合物时的结合水平进行比较，其中存在测试化合物时与不存在时相比结合水平下降表明测试化合物是候选的抗癌剂。18.权利要求17的方法，其进一步包含(e)确定候选抗癌剂是否能够(i)在表达FZD7的细胞中降低Wnt/FZD7信号传导；(ii)降低癌细胞移动性；(iii)降低癌细胞中卩-联蛋白的积聚；或(iv)在体外或体内治疗癌症；其中能够达到(i)至(iv)中至少一项的候选物是抗癌剂。19.权利要求17的方法，其中测试化合物选自下组多肽、核糖核酸、小分子和脱氧核糖核酸。20.权利要求17的方法，其中所述第一多肽是含有FZD多肽的第一融合蛋白，所述FZD多肽与(a)转录因子的转录激活结构域或(b)转录因子的DNA结合结构域融合；所述第二多肽是含有Wnt多肽的第二融合蛋白，所述Wnt多肽与(c)转录因子的转录激活结构域或(d)转录因子的DNA结合结构域融合，其中FZD多肽融合于与Wnt多肽所融合的结构域不同的结构域；并且根据转录因子的重构测定第一和第二多肽的结合。21.权利要求7的方法，其中所述第二多肽含有Wnt3多肽或其片段。22.权利要求17的方法，其中所述第二多肽含有SEQIDNO:8到12中任4可一个和至少一个非Wnt序列。23.权利要求17的方法，其中所述第二多肽含有Wmll多肽或其片段。24.权利要求17的方法，其中所述第二多肽含有SEQII〕NO:22到26中任何一个和至少一个非Wnt序列。25.通过权利要求17-24中任一项的方法所鉴定的候选抗癌剂或抗癌剂用于治疗癌症。26.通过权利要求17-24中任一项的方法所鉴定的候选抗癌剂或抗癌剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。27.检测肝细胞是否是癌细胞或具有成为癌细胞的风险的方法，该方法包含(a)提供测试肝细胞；(b)确定细胞的Wnt3表达水平是否高于对照细胞的Wnt3表达水平；和(c)如果测试细胞的Wnt3表达水平高于对照细胞的Wnt3表达水平，将测试细胞分类为癌细胞或具有成为癌细胞的风险。28.确定测试组织样本是否来自患有肝癌或具有患肝癌风险的患者的方法，该方法包含0)提供从患者获得的肝脏测试组织样本；和(b)确定测试组织样本中Wnt3的表达水平是否高于从健康个体中获得的可比较的组织样本中Wnt3的表达水平，其中测试样本中表达水平较高指示患者患有癌症或具有患癌症的风险。29.权利要求27或28的方法，其中确定Wnt3的表达水平包括确定测试细胞或测试组织样本中Wnt3mRNA的量。30.权利要求29的方法，其中使用Northern印迹分析或R'l'-PCR分析确定Wnt3mRNA的量。31.权利要求27或28的方法，其中确定Wnt3的表达水平包括确定测试细胞或测试组织样本中Wnt3蛋白的量。32.权利要求31的方法，其中使用抗体确定Wnt3蛋白的量。33.权利要求32的方法，其中抗体与氨基酸序列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQIDNO:80)结合。34.权利要求27或28的方法，其进一步包括确定测试细胞或测试组织的Wntll表达水平是否低于对照细胞或对照组织的Wntll表达水平，其中Wntll表达水平较低指示(i)测试细胞是癌细胞或具有成为癌细胞的风险，或(ii)患者患有癌症或具有患癌症的风险。35.权利要求28的方法，其中(a)中所提供的组织样本是肿瘤组织或肺瘤周围的组织。36.权利要求28的方法，进一步包含(c)确定测试组织样本中Wntll的表达水平是否低于从健康个体中获得的组织样本中Wntll的表达水平，其中Wntll的表达水平较低指示患者患有癌症或具有患癌症的风险。37.与氨基酸序列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQIDNO:80)结合的抗体。38.药物组合物，其含有权利要求37的抗体和可药用的载体。39.治疗患者中癌症的方法，该方法包括向患有癌症或具有患癌症风险的患者施用有效量的含有权利要求37的抗体的组合物。40.权利要求39的方法，其中所述癌症是肝癌。41.治疗患者中癌症的方法，该方法包括向患有癌症或具有患癌症风险的患者施用有效量的含有siRN八的组合物，所述siRNA含有选自下组的序列WNT3-1:5，-GGAAAAAUGCCACUGC八UC-3，(SEQIDNO:81),WNT3-2:5,-GGAGUGUAUUCGCAUCUAC-3，(SEQIDNO:82)和WNT3-3:5，-GGCUUAUCUUUGCACAUGU-3'(SEQ1DNO:83)。42.权利要求41的方法，其中所述癌症是肝癌。43.治疗患者中癌症的方法，该方法包括向患有癌症或具有患癌症风险的患者施用有效量的组合物，该组合物含有Wntl]多肽或编码Wntll多肽的遗传构建体。44.权利要求43的方法，其中将所述组合物直接原位施用于患者的肝脏。45.权利要求43的方法，其中所述癌症是肝癌。全文摘要本说明书除其它内容之外特别提供了使用Wnt和FZD蛋白、基因、FZD和Wnt特异性抗体和探针诊断和治疗癌症、以及筛选测试化合物治疗癌症的能力的方法。还公开了用于治疗癌症，如肝癌的化合物。文档编号G01N33/574GK101416058SQ200580039735公开日2009年4月22日申请日期2005年9月21日优先权日2004年9月21日发明者杰克·R·万兹,米兰·金申请人:罗德岛医院,终身合伙人