荧光检测系统的制作方法

专利名称：荧光检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于在样品中氣良荧光材料和检测荧光的方法和设备。
背景技术：
已开发了供定性和定量测量使用的各种光学检测系统。 一种常用的系统涉及使用荧光化合物作为与目标相关联的标签，该目标如聚合sm式反应(PCR)扩增的反应产物。当用适当^L频率的光照射时，已确认许多化合物呈现出荧光。例如， 荧光素被波长约为490 nm的光激发，并发射波长约为520 nm的光。^Ut 和发射波长之间的差距允许通过参考发射波长观察和定性或定量测量荧 光。一种常规荧光读取系统使光穿过使激发波长光透射的一带通滤光器， 穿过样品，穿过^L射波长光透射的第二带通滤光器，并到ii^r测器。在 该经典系统中，多个样品诸如通过使用传送装置来穿梭式就位以便依次读 取。为了加速此过程，开发了可替选的步进系统(例如，参见美国专利 No. 6， 015， 674 )，或者提供多个发光二极管以及光纤网络，以同时执行若 干测试(例如，参见美国专利No.6， 597， 450)。尽管这些类型的系统另_有 用的，但它们产生了降低系统灵敏度的光学;W^噪声，并且由于将光学系 统头移动到样品或将样品移动到光学系统头所花费的时间，它们需类*相当 多的时间来测量所有的样品。光纤器件系统迅逸受与光纤器件的4吏用相关 联的信号的衰减，这也降低了灵敏度。

发明内容
本发明提供了用于在样品中^Ut和检测荧光的i殳备和方法。在一个实施例中，4!供了用于保持多个样品的样品保持器以及光学集管(optical manifold),该光学集管具有用于多个样品中的每一个的单 独的亂良源和单独的光敏接收器。在另一个实施例中，光学集管仅包含亂良源，且光敏接收器与样品保 持器相联结。在另一个实施例中，光学集管仅包含光敏接收器，且激发源与样品保 持器相联结。在另一个实施例中，未提供光学集管，且氣《源和光敏接收器均位于 样品保持器中。本发明允许无需使用移动部件并且无任何光学机械干扰或电子干扰 地快速激发并测量荧光。它呈现出优异的信噪比，这允许其对非常低水平 的荧光差异ii行区分。本发明的这些和其它特征将从以下描述和所附权利要求中变得更完 全地显而易见，或者可以通过如下面所阐述的本发明的实践而习知。


为了进一步阐明本发明的上述和其它优点和特征，将参考在附图中图 示的本发明的特定实施例来提供本发明的更具体描述。应当理解，这些附 图仅描绘了本发明的典型实施例，因此不应视为对其范围的限制。4^H吏用 附图用另外的特性和细节来描述和解释本发明，在附图中图l是包括光学集管、样品保持器和光敏接收器的一个实施例的示意图。图2是包括光学集管、样品保持器和光^t接收器的另一个实施例的示 意图。图3是包括光学集管、样品保持器和光Jlt接收器的另一个实施例的示 意图。图4是包括光学集管、样品保持器和光^t接收器的另一个实施例的示 意图。图5描绘了其中结合有激发源和光敏接收器的样品保持器。 图6描绘了样品保持器和光学集管，该样品保持器具有常规96井板 的配置，该光学集管具有96个样品保持器中的每一个所联结的激发源和 光敏接收器。图7是描绘与光学集管、样品保持器和光敏接收器相结合的控制器的 一个实施例的示意图。图8是描绘与光学集管、样品保持器和光敏接收器相结合的控制器的 另一个实施例的示意图。图9是根据本发明的检测系统的可替选实施例的示意图。图10描绘了在PCR的最初7个循环期间的荧itiL光度。图11描绘了在没有DNA扩增的情况下，在PCR热循环器的最初7个 循环期间的荧; UL光度。图12示出了使用常规样品^ft对于黑色不透明PCR瓶，在PCR的最 初7个循环期间的噪声的荧光iL复。
具体实施方式
本发明提供了一种用于在单个样品或诸如常规96井板中的样品阵列 中测量少量荧光的光学系统。本发明的一个特征^l在^tiL/发射期间没有 M移动或光学部件的共享，从而导致了非常快速的读取，并避免了因光 学M移动引起的灵4t^损失。本发明的一个实施例描绘在图1中，其图示了一种用于实践本发明的 配置。图1图示了靠近由样品井支座38A保持的样品瓶22而定位光学集 管20。样品瓶22包含样品24，样品24可包含待使用荧光进行定性或定 量检测的物质。光学集管20被提供有产生氣t频率光的氣t源26。 ^JC带通滤光器 28使^JL频率光通过。激发源26和激发带通滤光器28被布置成使得^JL频率光将照射样品 24。发射带通滤光器30位于样品24上方，使得它将被来自样品中荧光材 料的发射所照射。适当的光敏接收器32接收穿itiC射带通滤光器30的光。尽管也可使用其它配置，但是目前优选地，激发源和光敏接收器应设 定为偏轴的，以便形成与PCR井中的目标液体基本符合的光线轨迹。已发
现偏离7 JLA合适的。当然，根据这里的教导，普通技术人员应理解其它 配置也是可以的。图2图示了一种用于保持样品的不同方法。不同于示出使用样品瓶的 图l，图2示出了使用可保持适当体积的样品的凹窝34。根据这些教导， 对普通技术人员而言，使用其它结构代替凹窝将是显而易见的。图3图示了图1中的部件的可替选几何布置。在图3中，集管36A 支撑样品井22上方的光^t接收器32和带通滤光器30，并且样品井支座 38B配备有氣吏源26和氣发带通滤光器28。图4类似于图3，但是激发源和亂t带通滤光器位于集管36B中，并 JU1射带通滤光器30和光敏接收器32位于样品井支座38C中。图5描绘了本发明的一个可替选实施例，其省略了单独光学集管的使 用，图5示出了在样品井支座38D中结合激发源26和光敏接收器32的一 种方式。与其它实施例一样，图5的实施例亦可包括氣发带通滤光器26 和发射带通滤光器30。由于在样品保持器中结合这些部件的成本，优选 地，样品保持器组件应是可再次使用的，并且为了实现容易地处置样品， 优选地，应将样品保持器而不是凹窝或其它非可处置的样品容器配置为容 纳样品瓶22。在图5中，激发源和光敏接收器被描绘为彼此成一直线。 根据il^的教导，普通技术人员应理解，其它配置也会提供本发明的优点。适当的^L源包括LED和激光二极管。目前优选地，^Jt源应提供高 的发光度，该发光度优选地在约7000到25， 000毫烛光功率的范围内。亦 优选地，激发源应具有小于约20度的^t束，以便无需会聚光学器件就 可提供高效的发射。适当的光敏接收器包括硫化镉光敏电阻器、PIN二极管、光敏晶体管 或能够检测氣t频率光的其它器件。本领域普通技术人员还应理解，可能不需要带通滤光器，或者提供其 它结构代替带通滤光器来去除非期望的光，或者光源的光是所需波长的单 色光。可以添加其它结构如聚焦光学器件，但是在上述配置中已发现通常不 必要单独的光学器件。图1-5示出了与单个样品相关联的各种光学部件配置。本发明的优点 之一是能够同时处理大数目的样品。图6图示了将图1的基本配置用于常 规96井板40的每个样品井。il^图6中通过提供配备有^JC源26、激
发带通滤光器28、发射带通滤光器30和光敏接收器32的96个不同组合 的集管42来完成，所述96个不同组合与96个样品井相关联。图6的配 置适合于与PCR或ELISA读取器或其它多个样品必需物相结^g^吏用。图6 的配置能够无任何光学机械干扰或电子干扰地在仅几毫秒内读取常规96 井板的96个井中的每一个。集管是非常坚固的和高度可靠的，从而使得 其适合于便携式实验室i殳备。图7示意性地描绘了控制器系统的一个实施例.提供DC电源44来给 多个歉义源26供电。提供一个或多个继电器46来使多个氣发源26中的 每一个工作。计算机或可编程逻辑控制器(未示出)或其它控制器按需要 接通和关断激发源。可在某些配置中使用单个继电器46来同时激活所有 的氣5l源，或者可对于每一个氣义源使用单独的继电器。使用在上面针对各部件分配的相同标号，还在图7中示出了光学^Ut 部件的示意图示出激发源26与激发带通滤光器28相结合，以便将^JL 光引导到样品瓶22中。发射带通滤光器30和光敏接收器32接收来自样 品的荧光发射光。来自光敏接收器的数据优选地被传递到相应的放大器 48，放大器48放大来自对应光^t接收器的信号。可以设想典型的光^t接 收器将产生^^信号，在这样的情形下，优选地，每个放大器应具有可调 节的增益，使得可以执行校准以确保每个光敏接收器/放大器組合为I^ 的分析提供可比较的数据，从而在校准情况下虑及了可能存在于系统部件 之间的差异。来自放大器48的信号M送到复用设备50，复用设备50与钟控设 备52配合工作来控制来自各放大器的多个输入之间的切换，并JUt送信 号到计算机的模拟输入54，其中宽a使用术语"计算机"来包括能够 执行此功能的可编程逻辑控制器或其它结构的使用。图8描绘了控制系统的另 一个实施例，说明了各种控制器系统可以有 利地与上述光学部件相结^^1。图8示出了来自计算机的模拟输出56， 模拟输出56连接到用于驱动激发源26的放大器58。用作激发源的LED 呈现与所施加电压成比例的亮度。这允许计算机或控制器响应于所需灵敏 度而控制用作激发源的LED的强度，或可替选地，解决校准要求。 一种校 准方法是使用已知浓度的标准化荧光材料，并校准每个通道，直至每个 通道产生相同的测量输出为止。各种方法可用于执行此校准例如，可分 别调节放大器的增益或调节亂t源的强度，或者可以在计算机处进行调 节。在图8的实施例中，优选地，光4t接收器应具有通常称为"雪崩式" 接收器的类型，其指的是当荧光材料的发射发光度达到特定水平时，从全 "断"状态改变为全"通"状态的接收器。导致光^t接收器改变为"通" 状态所需的施加电压可被用作荧光量的度量。例如，如果将光敏接收器移 到"通"状态需要相对大的电压(高强度氣义源)，则在样品中仅产生少 量荧光。反之亦然如果似目对小的电压就导致光^t接收器的激活，则这 暗示了大量荧光产生.导致光lt接收器改变为"通"状态所需的电压的测 量允许了定量确定样品中荧光材料的量。非线性放大器58可被有利地用于放大来自光敏接收器32的信号。优 选地，放大器58应具有可变增益调节能力，以允许它们在各种情况下更 加有用。移位寄存器60用于监测至计算机或控制器的输入62的多个l 信号之一。在此配置中，数字"时钟"信号64可用于导致移位寄存器60 在来自各光敏接收器的多个输入之间切换，使得所有通道被计算机读取。图9示意性地描绘了高增益、低噪声电光系统的一个实施例。示出此 系统具有两个样品瓶22以;Mi关联的光学部件，尽管应理解，有用的系 统可包括仅单个样品或4艮多样品。激发源26和氣&带通滤光器28枕故置成以便将^JL射引导到样品 瓶22内的样品上。示出发射带通滤光器30与光敏电阻器70相组合，光 敏电阻器70是能够从微小的荧光光子发射源产生高电子增益的灵敏的光 敏电阻器。当使用荧光素作为荧光材料时，优选的光敏电阻器具有高阻抗 硫化镉类型，其证明对荧光素发射波M良好的光电响应。与光敏电阻器70相联结的是高阻抗降电阻器72，它们的组合甚至在 低光水平的情况下，也允许产生相对大的电信号。滤波电容器74的包括 通过提供分';5W径来阻止射频(RF)电噪声的放大，来抑制电子射频(RF) 干扰。线性放大器76被提供有增益调节，以便允许多个电光电路彼此平 衡。图9的光电系统被提供有由计算机控制的门控继电器78和DC电源 44。线性放大器76的输出有利地传到模拟门控复用器80，模拟门控复用 器80又连接到数字门信号82和计算机的模拟输入84。线性放大器还提 供与模拟门控复用器80相匹配的阻抗。模拟复用器提供了一种装置，通 过该装置，管理计算机可以每几亳秒对多个线性放大器输出的所有输出进 行采样和读取，管理计算机优选地是供图9的实施例使用的可编程逻辑控 制器。 已经发现，与常M明样品^f目比，黑色不透明超低荧光样品瓶的使 用允许检测更低水平的荧M射。不希望被理论束繂，认为常规逸明瓶壁 中微小的热感应变化对背景荧光的变化有贡献。实验室中常见的为了标识 而稍微染色的瓶也常常是高荧光的，这已^U1现增加了噪声并且降低了灵 敏度。图9的实施例提供与光电倍增管(PMT)的光灵歉变类似的光灵敏 度。其可感测很低光水平的小变化，并且不需要机械步进^l来在少于一 秒内读取96个包含荧光材料的样品瓶。此实施例的另一优点在于每个光 敏电阻器占据仅约9mm x 9mm的空间，其仅是PMT所需空间的量的一 小部分。此实施例的又一优点在于其使用低电压，而PMT通常需要1000 伏或更高的电压。图9的实施例的另一优点是能够将其与使用聚合Sm式反应(PCR) 的扩增的监测相结M用，该监测是通过在PCR过程的很早期监测荧光 的差异来进行的。在常规系统中，最初5个PCR循环常常被认为是"零" 基线，因为在这些循环期间不能成功检测到DNA生长。由于噪声，在常 规系统中，直到第20个循环才可以可靠皿察到DNA扩增。已经发现， 图9的实施例可以在循环5和循环7之间检测到正的DNA扩增。对于一 些应用，早检测到DNA扩增允i械用较少的热循环。图10图示了荧光探头的发光输出，其当DNA为双股时处于其最高 水平，而当DNA为单股时处于其最低水平。双股DNA的稳定生长由退 火阶鼠表端处的不断增大的照度峰来指示。在变性阶段期间，当所有双股 DNA转变回单股DNA时，发光度暂时降低。当连续的退火阶ISJC生时， 发光度返回并达到不断更高的水平，并且更多的DNA产生。此系统允许 精确观察PCR过程中的生化M速率。知道PCR过程中的^JL速率在该 过程的预测和优化中是很有用的。更复杂的观M是可以的。例如，在PCR循环的变性部分期间，降 低的发光度的对数曲线产生。相反，当退火发生时，检测到对数增大的荧 光。对于用在PCR实践中的传统热循环器，本发明的灵氣变可能不完全 有用，但是，与通过引用B结合于此的标题为"RapidThermocycler"、 提交于2004年11月18日、并且与本申请有共同受让人的共同未决的专 利申请号10/991,746中所公开的新颖的热循环器相组合，本发明是尤其有 用的。这是因为常规热循环器在不同阶段之间的过渡时间通常为约45秒，并且这些延长的过渡时间趋向于消除或扭曲所观察的曲线。为了得到较好 的结果，阶段之间的过渡时间应优选地减少至仅几秒钟。常规热循环器还遭受显著的热噪声，在"Rapid Thermocycler"申请的热循环器中，热噪 声得以减小。图11图示了当没有发生扩增时的PCR读数。由于荧光探头当暴露于 恒定照度时的固有衰减，峰的斜率不断下降。当将没有附着物的化学上纯 的荧光素暴露于探头时，观察到相同的衰减。观察到持续暴露于强激发光 源的衰减速率是每秒约0.02 % 。在本发明中观察到的荧it^光度衰减与由 于DNA的增长而引起的发光度增"M目反地起作用。此现象用于将DNA 的增长和不增长之间的发光度差异扩大。在循环1到循环3期间，荧光信 号的衰减使样品发光度降低的程度可超过与DNA的增长相关联的发光度 增大的程度。但是，在循环4及其后的循环中，与DNA的增"M目关联的 发光度增大#^总发光度增大。此后，DNA增长的二元性压倒了荧光信 号衰减。图12比较了透明热塑性瓶与黑色不透明瓶的使用。通过使用黑色不 透明瓶，常规透明样品瓶的背景信号可被几乎完全消除。当背景荧光保持 最小时，由于信噪比提高，电光信号可被更高地放大。对于需要检测低水 平荧光变化的应用，超低荧光瓶非常有助于减小噪声。当可能有害的生物试剂的定性PCR检测对时间敏感时，低水平荧光 检测是有用的。统计上特定检测所需的时间量从当使用常规荧光PCR检 测系统时的近一小时或更长减少到当将本发明与上面援引的共同未决的 申请中描述的快速热循环器相组M用时的15分钟或更短。本发明提供了非常有用且快速的荧光光学读取器系统，其能够无需任 何移动部件并且无任何光学机械干扰或电子千扰地在仅几亳秒内读取96 井板的每个井。该系统提供了优异的信噪比，这允许其用于区分非常低水 平的荧光差异。本发明的系统颇为紧凑并JUL够坚固，以使其不仅在实验 室应用中而且在意图用在现场中的便携式设备中都是实用的。在不背离本发明的精神或必要特征的情况下，本发明可以按其它特定 形式来实施。所述实施例在所有方面应视为仅说明性的而非限制性的。因 此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前面的描述来指示。落入权利 要求的等同内容的含义和范围内的所有变化将包括在权利要求的范畴内。
权利要求
1.一种用于检测荧光的系统，包括用于保持多个样品的样品保持器，所述多个样品中的至少一些可包含荧光材料；多个激发源，所述多个样品中的每一个用一个激发源，所述多个激发源能够激发所述荧光材料；多个光敏接收器，所述多个样品中的每一个用一个光敏接收器，所述多个光敏接收器能够当所述荧光材料被激发时检测来自所述荧光材料的荧光发射；光学集管，用于与所述样品保持器相结合来保持每个激发源和每个光敏接收器，使得每个激发源的工作将激发所述对应样品内的任何荧光材料，并将由所述对应光敏接收器来检测。
2. 如权利要求l所述的系统，其中每个激发源和所述对应光敏接收 器为偏轴的，以^t^限定从^JL源到所述样品并回到所i^应光敏接收器 的光线抓逸的同时，彼此非常靠iafc装配。
3. 如权利要求l所述的系统，其中每个激发源和对应光敏接收器偏 离轴7度。
4. 如权利要求l所述的系统，还包括所述光^t接收器中的每一个所 联结的放大器。
5. 如权利要求4所述的系统，其中所逸故大器中的每一个被提供有 可调节增益控制。
6. 如权利要求l所述的系统，其中所述激发源的照度与所施加的电 压成比例，并且还包括所述多个激发源中的每一个的可变电压控制。
7. 如权利要求l所述的系统，其中所述光敏接收器中的每一个包括 雪崩式接收器。
8. 如权利要求l所述的系统，还包括用于依次从所述多个光敏接收 器向记录设M送数据的控制器。
9. 如权利要求l所述的系统，其中所述样品保持器被配置成容纳多 个样品瓶。
10. 如权利要求l所述的系统，其中所述样品保持器包含多个用于保持样品的凹窝。
11. 如权利要求l所述的系统，其中所述光敏接收器包括高阻皿化 镉光敏电阻器，并且还包括用于产生电信号的高阻抗降电阻器。
12. 如权利要求ll所述的系统，还包括用于抑制电子射频干扰的滤 波电容器。
13. —种用于检测荧光的系统，包括 用于保持多个样品的样品保持器；多个亂t源，所述多个样品中的每一个用一个氣发源； 多个光^t接收器，所述多个样品中的每一个用一个光^t接收器；光学集管；所述光学集管被配置用于与所述样品保持器相结合来保持所述多个 激发源或所述多个光敏接收器二者之一，且所述样品保持器被配置成保持 所述多个激发源或所述多个光敏接收器二者中的另一个，使##个激发源 的工作将激发所述对应样品内的任何荧光材料，并将由所述对应光敏接收
14. 如权利要求13所述的系统，其中所述光学集管保持所述多个激 发源，且所述样品保持器保持所述多个光敏接收器。
15. 如权利要求13所述的系统，其中所述光学集管保持所述多个光 敏接收器，且所述样品保持器保持所述多个激发源。
16. 如权利要求13所述的系统，还包括所述光敏接收器中的每一个 所联结的放大器。
17. 如权利要求14所述的系统，其中所述放大器中的每一个被H:供 有可调节增益控制。
18. 如权利要求13所述的系统，其中所述激发源的照度与所施加的 电压成比例，并且还包括所述多个激发源中的每一个的可变电压控制。
19. 如权利要求13所述的系统，其中所述光敏接收器中的每一个包 括雪崩式接收器。
20. 如权利要求13所述的系统，还包括用于依次从所述多个光敏接 收器向记录设M送数据的控制器。
21. 如权利要求13所述的系统，其中所述样品保持器被配置成容纳 多个样品瓶。
22. 如权利要求13所述的系统，其中所述样品保持器包含多个用于 保持样品的凹窝。
23. 如权利要求13所述的系统，其中所述光敏接收器包括高阻抗硫 化镉光敏电阻器，并且还包括用于产生电信号的高阻抗降电阻器。
24. 如权利要求13所述的系统，还包括用于抑制电子射频干扰的滤 波电容器。
25. —种用于检测荧光的系统，包括 用于保持多个样品的样品保持器；多个激发源，所述多个样品中的每一个用一个激发源；多个光敏接收器，所述多个样品中的每一个用 一个光^t接收器；所述样品保持器被配置用于保持所述多个激发源和多个光^t接收器， 使^^个氣义源的工作将救t所述对应样品内的伶河荧光材料，并将由所 ^f应光敏接收器4t^测。
26. 如权利要求25所述的系统，其中所述光敏接收器包括高阻M 化镉光敏电阻器，并且还包括用于产生电信号的高阻抗降电阻器。
27. 如权利要求25所述的系统，还包括用于抑制电子射频干扰的滤 波电容器。
28. —种用于在多个样品中检测荧光的方法，包括 提供多个样品；为所述多个样品中的每一个4^供激发源； 为所述多个样品中的每一个提供光敏接收器； 激活每个激发源；并且 测量每个光敏接收器的输出。
29. —种用于荧光监测使用聚合im式反应的扩增的方法，包括下列 步骤提供黑色不透明〗氐荧光样品瓶； 执行所述聚合im式反应；并且在所述样品瓶内样品的所述聚合酶链式反应的过程中，使用荧光检测 系统来监测荧itiL射。
全文摘要
公开了用于在样品中激发和检测荧光的设备和方法。在一个实施例中，提供了用于保持多个样品的样品保持器以及具有所述多个样品中的每一个的激发源、光敏接收器或二者的光学集管。在另一实施例中，所述光学集管仅包含所述激发源或光敏接收器二者之一，且所述激发源和光敏接收器二者中的另一个与所述样品保持器相联结。此系统允许无需使用移动部件并且无任何光学机械干扰或电子干扰地快速激发并测量荧光。它呈现出优异的信噪比，这允许其对非常低水平的荧光差异进行区分。
文档编号G01N21/64GK101166966SQ200580046269
公开日2008年4月23日 申请日期2005年12月20日 优先权日2005年1月7日
发明者丹文·雷·罗伯茨, 小威廉·D·比克莫尔 申请人:高级分子系统公司