专利名称：鞘氨醇激酶-1介导的单核细胞化学引诱蛋白-1基因的基因表达调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴别、监测和Y吏用调节鞘氨醇激酶-1生物活性的化 合物的方法。具体地说，本发明的方法涉及包含鞘氨醇激酶-1、凝血 酶或单核细胞化学引诱蛋白-1的信号转导。
背景技术：
血管内皮曾经被认为在血管-组织间室之间提供被动性屏障功 能，现在被公认为在维持正常止血和协调对伤害的组织应答方面起 主要作用。当血管系统同血液的细胞组分以及由于脱粒而释放的蛋 白接触时，同在轻微炎症或血栓形成事件中一样，在急性伤害期当 中发生内皮与广i普刺激物接触增加。在被认为存在于糖尿病或动脉 粥样硬化中的更持久血管系统活化的情况下，与提高的脂质接触、 高血糖和剪切力改变在调节内皮病理生理学的刺激物的相互作用方 面还存在另 一种水平的复杂性。内皮刺激导致众多生物活性介导物 的释放以及促进血小板和白细胞粘附和迁移的内皮表面分子的改 变，改变了血管完整性和血管反应性。
鞘氨醇激酶(SK)是新近发现的脂质激酶家族，从进化上讲在人、 小鼠、酵母和植物中是保守的(Nava等，F五^S丄e". 2000， 473:81-84)。 近期已由人和小鼠中克隆出两种SK同种型SK1和SK2 (Liu等,/说o/ C/ ew. 2000, 275(26):19513画20)。 SK1和SK2在动力学特性、组织分 布和发育表达模式上不同，提示可能不同的调节和功能作用(Fukuda等，说oc/2em说o/ /2;A i^y Cowmw ., 2003, 309:155-160)。 SK在众多细 胞类型中表达，包括人血管内皮细胞和血管平滑肌细胞(VSMC)(Xu 等，Atherosclerosis 2002， 164:237-43; Ren等，World J. Gastroenterol. 2002, 8:602-7)。 SK催化由鞘氨醇形成鞘氨醇-l-磷酸(SlP)。
SIP是一种在胞外和胞内均调节不同生物过程的生物活性脂质。 例如，SIP减轻已知为程序性细胞死亡或凋亡有效诱导物的细胞毒性 神经酰胺的产生(Maceyka等，5"c/j/w/'ca " 5/o; /2>^,'ca爿cto fSSA -A/o/ecw/ar Ce〃说o/ogy o/Xz^/cfe, 2002, 1585:193-201)。而且，业已 表明，SIP在以三磷酸肌醇(IP3)非依赖性方式释放胞内钙储存(Mattie 等，C7ze附.1994， 269:3181-3188)、活化转录因子如CREB (Coussin等，5/oc/2em尸/2ammc0/, 2003, 66:1861-1870)和AP-l (Su等， / 说o/C/^m 1994,269:16512-16517)、增加炎症相关蛋白的表达(Xia等, 尸rac 爿cad [/&4, 1998, 95:14196-14201)和刺激有丝分裂发生 (Auge等， /編O e附.1999, 274:21533-21538)方面直接或间接起作 用。最近，已表明S1P信号转导在动脉粥样硬化损害的发病机理中 起重要作用，但S1P是致动脉粥样硬化的还是抗动脉粥样硬化的仍 有待研究(Xu等，Acta Pharmacol Sin 2004, 25:849-954)。
业已描述了 SK活化在众多细胞类型中处于几个不同受体家族下 游。例如，SK参与由促炎细胞因子受体如TNF-oc受体介导的信号转 导途径(Xia等，出处同上)。SK还参与其它受体家族的信号转导途径， 所述受体家族例如为受体酪氨酸激酶(即VEGF或PDGF受体)(Wu等, (9"coge"e 2003, 22:3361-3370; Meyer zu Heringdorf等，F五5S 1999,461:217-222;和Hobson等，Sc/e"ce 2001, 291:1800-1803)、高 亲和性FcsRI受体(Choi等，M/fwre 1996， 380:634-636)和GPCR (即毒 蕈碱(Meyer zu Heringdorf等，出处同上)和SIP受体。
凝血酶是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，在止血和血栓形成中 均发挥核心作用(参见综述Srivastava等，A^of i " Wev. 2005年1月； 25(l):66-92)。血栓形成在发达国家是最常见的单一死因，其具有异
常凝结和血小板聚集的特征。 一些衰弱征兆自身以心肌梗塞、中风、 深静脉血栓形成和肺栓塞形式表现出来。实际上，美国心脏协会估
计在美国全部死亡的54%可归因于心血管疾病。血栓形成相关并发 症单在美国每年就导致约2百万人死亡。即便不是大多数，也有许 多血栓形成事件可通过使用合适的初级抗血栓形成治疗来防止，几
乎所有的复发情况都可通过使用合适的二级治疗来防止。止血是一 种在血管损伤事件中抵御不受控的出血的复杂过程，可通过血管损
伤、组织损伤或在血流中存在异物而被活化。止血作用机制包括(a) 被损伤血管的血管痉挛；(b)形成短期血小板栓；(c)形成强血纤维蛋 白凝块(血栓)；和(d)凝块分解(血纤维蛋白溶解)。
已知凝血酶的主要功能在于通过其在凝结途径中已充分表征的 作用维持止血。凝血酶将纤维蛋白原蛋白酶剪切为血纤维蛋白肽A 和B,并产生纤维蛋白。纤维蛋白形成在血管伤害后防止血液流失的 纤维蛋白凝块(血栓)。所述凝块随后在伤口愈合时由纤维蛋白溶解系 统(血纤蛋白溶解)去除。凝血酶除了在凝结过程(即形成凝块的过程) 最后一步的关键作用之外，还在启动抑制途径下调凝结过程并活化 纤维蛋白溶解系统方面起关键作用。凝结活化的增加可产生严重的 血栓栓塞性疾病，例如血栓形成。
凝血酶还被指为是组织损伤的细胞应答中的关键介导物，其通 过已知为蛋白酶活化受体(PAR)的七跨膜G蛋白偶联受体新家族活化 血小板、血管细胞、成纤维细胞和免疫细胞(丁1^16 ,(^//"0^附.2000, 46:1260-1269)。凝血酶诱导粘附分子表达，增加血管通透性、血管生 成以及细胞因子和生长因子的释放，并促进血管调节素如一氧化氮 和前列腺素的释放。凝血酶的大部分细胞应答都归因于PAR-1 (Derian 等，EXPERT OPINION ON INVESTIGATIONAL DRUGS, 2003, 12(2):209-21)。但是，已鉴别出两种另外的凝血酶反应性受体PAR-3 (Z^/tora等，Nature, 1997, 386:502-506)和PAR隱4 (Xu等，PNAS 1998， 95:6642-6646)。还已鉴别出在此GPCR家族中的凝血酶不敏感受体
PAR-2,其在血管内皮上表达(Bohm等，历0c/7ew / 1996, 314 (Pt 3:1009-1016),在活化时介导许多和PAR-1类似的生物过程。凝血酶 信号转导途径抑制剂已变成当前血栓形成和其它疾病的治疗研究的 主要目标。
不同报告提示，SK在不同细胞类型中或者参与或者不参与凝血 酶信号转导途径。例如，已报道SK活化参与凝血酶诱导的小鼠肥大 细胞的IL-6分泌(Gordon等，Cell Immunol. 2000年11月1日；205(2): 128-35)。但是，在用卩H]-鞘氨醇标记的完整人血小板中，用凝血酶 刺激不影响卩H]-S1P形成(Yang等，J Biochem (Tokyo). 1999年7月； 126(1):84-9)。最近，已报道在豚鼠的肠肌层神经胶质中PAR-2的活 化经涉及鞘氨醇激酶活化的信号转导机制导致胞内钩增加(Garrido等, J A^wrac/ e附.2002年11月；83(3):556-64), PAR國2是一种由胰蛋白 酶和肥大细胞类胰蛋白酶活化4旦不由凝血酶活化的GPCR。有趣的 是，同一报道表明，在豚鼠的肠肌层神经胶质中，PAR-1的活化经 不涉及鞘氨醇激酶活化而涉及》痔脂酶C活化的信号转导机制导致胞 内钩增加，PAR-1是一种由凝血酶活化的GPCR。
单核细胞化学引诱蛋白-1 (MCP-1)是一种C-C趋化因子，对在 生理和病理生理条件下募集单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞起关 键作用。MCP-1的趋化作用由趋化因子受体CCR2介导(Boring等，>/. C7/". /騰对.1997, 100: 2552-2561)。 MCP國1在各种组织中表达，例如 内皮、支气管、上皮、平滑肌细月包、巨噬细胞等(Antoniades等,尸racWw/ 爿cad S" OX4， 1992, 89:5371-5375; Lyonaga等，Z/i/w P^/zo/， 1994, 25:455-463; Car等，爿w Ji e^/r O" C"^ Me《1994, 149:655-659)。
MCP-1涉及各种炎性疾病的病理发生，所述疾病包括受感染组 织的单核细胞/巨噬细胞浸润。MCP-1的水平在类风湿性关节炎患者 的滑液和血清中和在患有胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的大鼠滑液中 升高(Koch等，C"w. /面f. 90， 1992: 772-779; Ogata等，/.涵o/. 1997, 182: 106-114)。动物模型的数据支持MCP-1在类风湿性关节炎发展
中的必需作用。例如，在CIA大鼠中，给予抗MCP-1的中和单克隆 抗体减轻关节胂胀和巨噬细胞侵袭；在小鼠MRL-// r关节炎模型中， 注射显性失活形式的MCP-1防止关节炎症和骨破坏的发生(Ogata等, 出处同上；和Gong等，/, 5xp Met/. 1997, 186: 131-137)。 MCP-1是治 疗严重炎性疾病的潜在治疗标靶，包括类风湿性关节炎和慢性阻塞 性月巿病。
近期研究已揭示，MCP-1表达增加在血管疾病的发病机理中起 核心作用(Charo等，Ooz/Wo" /^^fln:/ . 2004; 95: 858)。在由血液向 早期动脉粥样硬化病灶中募集单核细胞、血管成形术后出现内膜增 生以及血管生成和血栓形成方面，MCP-1已被指为是关键作用物。 没有MCP-1或CCR2的转基因小鼠显示出对经实验诱发的动脉粥样 硬化的部分抗性(参见例如Yla-Herttuala等，尸rac. 爿cat/. Sc/' 1991, 88: 5252-5256; Boring等，Atowre, 1998, 394: 894-897)。
另外， 一些研究已将MCP-1与慢性阻塞性肺病(de Boer等，尸W/ o/. 2000, 190: 619-626; Traves等，2002, 772orax 57: 590-595)和中风后的 局部缺血性组织损伤(Hughes等，J. CereZ). B/ood F/ow M""Z). 2002, 22: 308-317)关联起来。
用于抑制MCP-1生物活性的化合物可在众多疾病领域提供治疗 利益。业已表明，抗MCP-1基因治疗是抗MCP-1相关性心血管疾病 的有用且可行的策略(Kitamoto等，五x/ ert Caraf/ova化77je广2003 年9月；1(3):393掘)。例如，用MCP-1的显性失活抑制剂转染骨 骼肌在大鼠中抑制由慢性抑制 一 氧化氮合成诱发的动脉粥样硬化变 化。此基因治疗在载脂蛋白E敲除小鼠中抑制动脉粥样硬化的出现、 进行和不稳定化。该策略还在大鼠、兔和猴中降低球嚢损伤后的再 狭窄，在兔和猴中降低支架植入后的新生内膜形成(Kitamoto,出处同上)。
其它生物物质，包括抗体和抑制肽，也已被开发用于治疗MCP-1相关性疾病。例如，阻断MCP-1与CCR2结合的单克隆抗体正用
于类风湿性关节炎的II期临床实验(Charo等，出处同上)。但是，尽 管进行了深入筛选，但仍没有可在临床上使用的CCR2受体的小分 子拮抗剂(Daly等，M/c腦.簡/Wo". 2003年6月；10(3-4): 247-57)。 因此，需要开发治疗MCP-1相关疾病的新治疗剂的新策略。
发明概述
现在已发现鞘氨醇激酶-1 (SK1)由经Par-l的凝血酶和肿瘤坏死 因子a活化。血栓形成或炎症刺激物对SK1的活化诱导单核细胞化学 引诱蛋白-1 (MCP-1)基因的表达。通过SK1活性抑制剂或特异性降 低SK1基因表达的siRNA降低SK1活性抑制SK1诱导的MCP-1基
因表达。
在一个一般方面，本发明^提供一种测定细胞中的鞘氨醇激酶-1 生物活性的方法，其包括测定所述细胞的单核细胞化学引诱蛋白-1 基因的表达水平的步骤。
在另一个一般方面，本发明提供一种监测给予受试者的化合物 的效力的方法，其中预期所述化合物增加或降低所述受试者细胞中 的鞘氨醇激酶-1生物活性，所述方法包括以下步骤a)检测所述受试 者的单核细胞化学引诱蛋白-1基因的表达水平；和b)比较步骤a)中 测定的表达水平和给予所述化合物之前所述受试者中的单核细胞化 学引诱蛋白-1基因的表达水平。在一个具体实施方案中，所述方法 的步骤(a)包括检测所述受试者的生物样品中单核细胞化学？ 1诱蛋白-1 的量的步骤。
本发明的另 一个一般方面是一种鉴别增加或降低鞘氨醇激酶-1 生物活性的化合物的方法，其包括以下步骤a)使鞘氨醇激酶-l反应 性系统与含缓冲液和测试化合物的溶液接触，其中所述鞘氨醇激酶-1 反应性系统包含鞘氨醇激酶-1或其功能衍生物，以及其表达受单核 细胞化学引诱蛋白-1基因的调节序列控制的基因；b)检测所述鞘氨醇 激酶-1反应性系统中其表达受单核细胞化学引诱蛋白-1基因的调节
序列控制的基因的表达水平；和c)根据其与其中鞘氨醇激酶-l反应
性系统仅与緩冲液接触的对照相比增加或降低所述表达水平的能力 鉴别所述化合物。
在该方面的一个具体实施方案中，所述方法还包括以下步骤d) 使鞘氨醇激酶-1与溶液接触，所述溶液含由以上步骤c)鉴别的化合 物以及包含鞘氨醇和腺苷三磷酸的緩冲液；e)检测由所述鞘氨醇产生 的鞘氨醇-l-磷酸的量；和f)根据其与其中鞘氨醇激酶-l仅与緩冲液 接触的对照相比增加或降低由鞘氨醇生产鞘氨醇-l-磷酸的能力鉴别 所述化合物。
本发明的另一个一般方面是一种增加或降低细胞中的单核细胞 化学引诱蛋白-1基因表达的方法，所述方法包括以下步骤增加或 降低所述细胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性，使得所述单核细胞化学 引诱蛋白-1基因的表达分别被增加或降低。
本发明的另 一个一般方面是一种抑制细胞中的凝血酶信号转导 的方法，所述方法包括以下步骤降低细胞中的鞘氨醇激酶-1生物 活性，使得所述凝血酶信号转导得以抑制。
本发明还提供在受试者中治疗或预防与凝血酶信号转导途径相 关的疾病或与MCP-1生物活性或基因表达增加相关的疾病的方法。 这些方法包括以下步骤降低所述受试者中的鞘氨醇-l-磷酸的生物 活性，使得所述疾病得以治疗或预防。在具体实施方案中，这种疾 病是血栓形成或动脉粥样硬化。
附图简述
图1图示了微阵列分析的结果。分析揭示了凝血酶信号转导和 鞘氨醇激酶的关联，MCP-1基因表达响应于两种刺激物凝血酶和 TNF-a被诱导，所述诱导在于剌激前加入DMS的条件下被抑制。
图2表明，根据Taqman定量RT-PCR的检测，设计的siRNA 显示出对其各自的人SK同种型的特异性。
图3表明，特异性抑制SK-1消除了 TNFa或凝血酶对MCP-1 的诱导在hSK-l特异性siRNA存在下MCP-1的诱导受到抑制，但 在hSK-2特异性siRNA或对照非沉默siRNA存在下未受抑制。
图4表明，MCP-1分泌为PAR-1依赖性机制，需要鞘氨醇激酶活性。
图5表明，PAR-1介导的凝血酶对MCP-1的诱导需要hSKl， 但不需要hSK2:凝血酶/PAR-l介导的MCP-1诱导在hSKl特异性 siRNA存在下受到抑制，但在hSK-2特异性siRNA或对照非沉默 siRNA存在下未受抑制。
图6表明，诱导的HMVEC的MCP-1分泌需要NF-kB活性。 图7表明，SIP受体活化不介导MCP-1的诱导。
发明详述
后文提及的所有出版物都通过引用结合到本文中。除非另有限 定，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域 一般技术人员的通常理解相同的含义。
本文使用的术语"包含"、"含有"、"具有"和"包括"以 其开放的、非限制性的含义使用。
以下是在本说明书中有时使用的一些缩写
ATP =腺苷三磷酸；
bp:碱基对；
cDNA-互补DNA;
DMS-二曱基鞘氨醇；
ELISA =酶联免疫吸附测定；
FLIPR=焚光成像板读数器；
GPCR-G蛋白偶联受体；
hSK =人鞘氨醇激酶；
kb-千石威基对；IOOO个碱基对；
MCP-1 -单核细胞化学引诱蛋白-l;
NF-kB-核因子kB;
nt-核苷酸；
PAGE =聚丙烯酰胺凝胶电泳；
PAR-蛋白酶活化受体；
PCR-聚合酶链反应；
RT-PCR =逆转录聚合酶链反应；
SlP-鞘氨醇-l-磷酸；
SDS-十二烷基硫酸钠；
siRNA-小干扰RNA;
SSC-氯化钠/柠檬酸钠；
SK卜鞘氨醇激酶-1;
TNFa-肿瘤坏死因子ot;
UTR-非翻译区。
多肽或核酸的"活性"、"生物活性"或"功能活性"指多肽 或核酸分子发挥的活性，其按照标准技术在体内或体外测定。此活 性可为直接活性，例如离子通道活性。其还可以与笫二种蛋白或底 物相关联，或为对于第二种蛋白或底物的酶活性，例如，凝血酶的 丝氨酸蛋白酶活性或SK的脂质激酶活性。蛋白的生物活性还可为间 接活性，例如由所述蛋白与一种或一种以上其它蛋白或分子的相互 作用介导的细胞信号转导活性，所述相互作用包括但不限于以多步、 连续方式发生的相互作用。
本文使用的"生物样品"指含细胞或组织物质或由其组成的样 品，例如分离自受试者的细胞或生物流体。"受试者"可为已成为 治疗、观察或实验目标的哺乳动物，例如大鼠、小鼠、猴或人。生 物样品的实例包括例如痰、血、血细胞(例如白细胞)、羊水、血浆、 精液、骨髓、组织或细针活检样品、尿、腹膜液、胸膜液和细胞培 养物。生物样品还可包括组织切片，例如为组织学用途而获取的冷
冻切片。测试生物样品是已成为分析、监测或观察目标的生物样品。 对照生物样品可为测试生物样品的阳性或阴性对照。对照生物样品 常常包含与测试生物样品相同类型的目标组织、细胞和/或生物流体。 在具体的实施方案中，生物样品是"临床样品"，其是来源于 人类患者的样品。生物样品还可被称为"患者样品"。测试生物样 品是已成为分析、监测或观察目标的生物样品。对照生物样品可为 测试生物样品的阳性或阴性对照。对照生物样品常常包含与测试生 物样品相同类型的目标组织、细胞和生物流体。
"细胞"指适合于检测方法灵敏度的至少一个细胞或多个细胞。 适于本发明的细胞可为细菌，但优选为真核细胞，最优选为哺乳动 物细胞。"内皮细胞"是薄的扁平细胞，可作为层状物存在于体腔、 血管和淋巴管表面内部，形成内皮。业已确认，"内皮细胞"的细 胞系可在培养基中体外保持。内皮细胞系的实例包括但不限于成人
孩bk管内皮细胞(HMVEC)、 HUV-EC-C、人主动脉内皮细胞(HAEC)。 "克隆"是通过有丝分裂来源于单个细胞或共同祖先的细胞群。 "细胞系"是衍生出克隆扩充的细胞并能够在体外稳定生长很多代 的原初细胞。
"基因，，是参与产生肽、多肽或蛋白以及编码这些蛋白物质的 mRNA的DNA节段，包括编码区、编码区之前的非编码区("5' UTR") 和之后的非编码区("3' UTR")。"基因，，还可包含在各个编码节段 ("外显子")之间的插入非编码序列("内含子")。"启动子"指参 与RNA聚合酶的结合以启动基因转录的DNA调节序列。启动子经 常在基因转录起始位点的上游("5'")。"调节序列"指可控制基因 表达的基因部分。"调节序列"可包括启动子、增强子和其它表达 控制元件，例如聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点(用于细菌表达)和/ 或操作子。"增强子"指可以距离或方向依赖性方式调节基因表达 的DNA调节序列。"编码区，，指通过三联体碱基密码子编码用于对 应多肽翻译的氨基酸以及起始和终止信号的基因部分。
"基因表达微阵列分析"指其中探针寡核苷酸的"微阵列"与 目标核酸样品接触的测定，所述目标核酸样品例如为耙样品，例如
特定组织类型的聚腺苷酸化mRNA或其逆转录物。参见例如Nees等, (2001)， Cwr Owcer Z>wg 7brge"， 1(2): 155-75。接触在杂交条件下进 行，去除未结合核酸。所获得的杂交核酸模式提供了有关测试样品 的遗传镨的信息。基因表达分析可同时检测成千上万基因的表达， 提供有关基因相互作用和功能的广泛信息。基因表达分析可用于各 种用途，例如鉴别基因表达、关联基因表达和具体表型、筛选疾病 易感性以及鉴别特定因子对细胞基因表达的影响，例如在毒性测试 中。本文使用的"微阵列"指基质，例如大致平的基质，如生物芯 片或基因芯片，其具有大量聚合分子，这些聚合分子在空间上分布 于基质表面上，并与基质表面稳定締合或固定在基质表面上。示例 性的微阵列形式包括寡核苦酸阵列和点阵列。关于基因表达微阵列 分析的方法是本领域技术人员已知的。参见例如Yang等，(2002)， 細3(8): 579-88的综述或美国专利第6,004,755号，该专利公 开了关于使用DNA微阵列进行定量基因表达分析的方法。
"单核细胞化学引诱蛋白-l基因"、"MCP1"或"MCP-1基 因"各自均指编码单核细胞化学引诱蛋白-1的基因，MCP-1基因(l) 在严格杂交条件下与同人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸检索号 NM—002982)编码区具有约60%以上核苷酸序列同一性的核酸分子特 异性杂交；(2)编码同人MCP-1蛋白(NCBI蛋白检索号NP_002973) 具有约60%以上氨基酸序列同一性的蛋白；或(3)编码能够结合抗体 的蛋白，所述抗体针对本文描述的人MCP-1蛋白产生，例如为多克 隆抗体或单克隆抗体。
"MCP-1基因，，可在严格杂交条件下与同人MCP-1 cDNA(NCBI 核苷酸检索号NM—002982)编；马区具有约65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上核*酸序列同一性的核酸分子特异性杂交。在 其它实施方案中，MCP-1基因编码的蛋白与人MCP-1蛋白(NCBI蛋
白检索号NP—002973)具有约65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90% 或95%以上的氨基酸序列同一性。示例性的"MCP-1基因"包括用 于人MCP-1的结构和功能多态性的基因，以及其在其它动物如大鼠 (即NCBI核苷酸检索号NM—03"30)、小鼠(即NCBI核苷酸检索号 NM一011333)、猪、狗和猴中的直系同源物。"多态性"指在群体中 的个体当中的特定基因座上的一组遗传变体。
"单核细胞化学引诱蛋白-l" 、 "MCP1" 、 "MCP-1"或"MCP-1 蛋白"各自均指为C-C趋化因子的蛋白，其在生理和病理生理条件 活化下均募集单核细胞、巨噬细胞或T淋巴细胞。MCP-1 (l)与人 MCP-1蛋白(NCBI蛋白检索号NPJ)02973)具有约60%以上的氨基 酸序列同一性；(2)结合针对人MCP-1 (NCBI蛋白检索号NP—002973) 产生的抗体，例如多克隆或单克隆抗体；或(3)由在严格杂交条件下 与核酸分子特异性杂交的多核苷酸编码，所述核酸分子具有的序列 与人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸检索号NM—002982)编码区具有约 60%以上的核苷酸序列同 一性。
在某些实施方案中，MCP-1与人MCP-1 (NCBI蛋白检索号 NP—002973)具有约65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上 的氨基酸序列同一性。示例性的MCP-1包括人MCP-1，其包括在NCBI 蛋白4企索号NP—002973中所示的人MCP-1蛋白的结构和功能多态 性。MCP-1还包括人MCP-1在其它动物如大鼠(即NCBI蛋白检索号 NP—113718)、小鼠(即NCBI蛋白检索号NP—035463)、猪、狗和猴
中的直系同源物。
"鞘氨醇激酶-l基因"、"SK1基因"或"SphKl基因"各自 均指编码鞘氨醇激酶-1的基因，SK1基因(l)在严格杂交条件下与同 人SK1 cDNA (NCBI核苷酸检索号NM—021972)编码区具有约60% 以上核苷酸序列同一性的核酸分子特异性杂交；(2)编码同人SK1蛋 白(NCBI蛋白检索号NPJ)68807)具有约60%以上氨基酸序列同一 性的蛋白；或(3)编码能够结合抗体的蛋白，所述抗体针对本文描述
的人SK1蛋白产生，例如为多克隆抗体或单克隆抗体。
"SKI基因"可在严格杂交条件下与同人SKI cDNA(NCBI核 苷酸检索号NM—021972)编码区具有约65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上核苷酸序列同一性的核酸分子特异性杂交。在其它实 施方案中，SKI基因编码的蛋白与人SKI蛋白(NCBI蛋白检索号 NPJ)68807)具有约65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上 的氨基酸序列同一性。示例性的"SKI基因，，包括用于人SKI的结 构和功能多态性的基因，以及其在其它动物包括大鼠(即NCBI核苷 酸检索号NM—133386)、小鼠(即NCBI核苦酸检索号NM—011451)、 猪、狗和^ff美中的直系同源物。
"鞘氨醇激酶-l" 、 "SKI" 、 "SphKl"或"SKI蛋白"各自 均指在活化时能够催化由脂质鞘氨醇形成鞘氨醇-l-磷酸(SlP)的蛋 白。
"SKI" (l)与人SKI蛋白(NCBI蛋白检索号NPJ)68807)具有 约60%以上的氨基酸序列同一性；(2)结合针对人SK1 (NCBI蛋白检 索号NPJ)68807)产生的抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体；或(3) 由在严格杂交条件下与核酸分子特异性杂交的多核苷酸编码，所述 核酸分子具有的序列与人SKI cDNA (NCBI核苷酸检索号 NM—021972)编码区具有约60%以上核苷酸序列同一性。
在某些实施方案中，"SKI"与人SKI (NCBI蛋白检索号 NPJ)68807)具有约65o/o、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上 的氨基酸序列同一性。示例性的SKI包括人SKI,其包括在NCBI 蛋白4企索号NP_068807中所示的人SKI蛋白的结构和功能多态性。 SKI还包括人SKI在其它动物如大鼠(即NCBI蛋白检索号 NP—596877)、小鼠(即NCBI蛋白检索号NP—035581)、猪、狗和猴
中的直系同源物。
"SKI功能衍生物"是来源于SKI的蛋白，其仍具有SKI生物 活性，即由鞘氨醇形成SIP。 SKI功能衍生物的实例包括但不限于含SKI的催化结构域的截短SK1，或含SKI催化结构域和其它蛋白氨 基酸序列的SKI融合蛋白。
"SKI活化刺激物"是可活化SK1生物活性的任何刺激物。SKI 在活化时催化由鞘氨醇形成S1P。各种SKI活化剌激物在众多细胞 类型中经涉及不同受体家族的信号转导活化SK1。在一个实施方案 中，SKI由促炎细胞因子(如TNFa)经促炎细胞因子受体(如TNFa受 体)活化。在另一个实施方案中，SKI由受体酪氨酸激酶如VEGF或 PDGF受体传导的信号活化。在再另一个实施方案中，SKI由高亲和 性FcsRI受体传导的信号活化。而且，SKI由GPCR如毒蕈碱受体、 SIP受体或PAR传导的信号活化。例如，本文发现凝血酶是经涉及 PARI的信号转导活化SKI的SKI活化刺激物。
"蛋白酶活化受体"、"PARI" 、 "PAR-l" 、 "Par-l"或"PAR-1 蛋白，，各自均指为七跨膜G蛋白偶联受体的蛋白，在凝血酶信号转 导途径中用作凝血酶的细胞受体。其还叫做凝结因子II受体。其通 过蛋白酶剪切活化。
"PARI" (l)与人PARl蛋白(NCBI蛋白检索号NPJ)01^!3)具 有约60%以上的氨基酸序列同一性；(2)结合针对人PARI (NCBI蛋 白检索号NP—001983)产生的抗体，例如多克隆抗体或单克隆抗体； 或(3)由在严格杂交条件下与核酸分子特异性杂交的多核苷酸编码， 所迷核酸分子具有的序列与人PARI cDNA (NCBI核苷酸检索号 NM—001992)编码区具有约60%以上的核普酸序列同 一性。
在某些实施方案中，"PARI"与人PAR1 (NCBI蛋白检索号 NP—001983)具有约65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%或95%以上 的氨基酸序列同一性。示例性的PAR1包括人PARl,其包括在NCBI 蛋白检索号NP_001983中所示的人PARI蛋白的结构和功能多态 性。Pari还包括人PARI在其它动物如大鼠(即NCBI蛋白检索号 NP—037082)、小鼠(即NCBI蛋白检索号NP—034299)、猪、狗和猴 中的直系同源物。
"信号转导"是过程级联，其中胞外信号与细胞表面上的受体 相互作用，引起第二信使水平的改变，并最终实现细胞机能的改变。
"凝血酶信号转导"指其中胞外信号为凝血酶的信号转导。在 一个实施方案中，"凝血酶信号转导"是过程级联，其中凝血酶结
合细胞表面上的PAR-1、 PAR-3或PAR-4受体，引起笫二信使如4丐、 环化AMP或S1P水平的改变，并最终实现细胞机能的改变。细胞机 能的改变可为凝血酶参与的任^T细胞过程的改变。例如，凝血酶信 号转导可导致凝结、针对组织损伤的细胞应答、粘附分子表达、血 管通透性、血管生成以及细胞因子和生长因子的释放等改变。
"核酸序列"或"核苷酸序列"指在聚合物中脱氧核糖核苷酸 或核糖核苷酸残基以单链或双链形式的排列。核酸序列可由以下碱 基的天然核苷酸和/或由合成类似物组成胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧 啶、鸟嘌呤和尿嘧啶；分别缩写为T、 A、 C、 G和U。
术语"寡核苷酸"指长度相对短的单链DNA或RNA序列，例 如少于100个残基长。对于许多方法来说，长约16-25个核苷酸的寡 核苷酸是有用的，尽管有时可j吏用超过约25个核苷酸的较长寡核苷 酸。 一些寡核苷酸可用作合成互补核酸链的"引物"。例如，DNA 引物可与互补核酸序列杂交，以在使用DNA聚合酶的反应中启动互 补DNA链的合成。寡核苷酸还可在几种核酸检测方法中用于杂交， 例如在RNA印迹或原位杂交中。
"多肽序列"或"蛋白序列"指氨基酸残基在聚合物中的排列。 多肽序列可由20个标准天然氨基酸连同稀有M酸和合成氨基酸类 似物组成。4交短的多肽一般称为肽。
"分离的"或"纯化的"蛋白或其生物活性部分基本上不含得 到蛋白的细胞或组织源的细胞物质或其它杂蛋白，或在化学合成时 基本上不含化学前体或其它化学物质。表述"基本上不含细胞物质" 包括其中蛋白与分离出其或重组产生其的细胞的细胞组分分离的蛋 白制品。因此，基本上不含细胞物质的蛋白包括具有少于约30%、
20%、 10%或5%(干重)的异源蛋白(本文也称为"杂蛋白")的蛋白制 品。当蛋白或其生物活性部分重组生产时，优选其还基本上不含培 养基，即培养基占蛋白制品体积少于约20%、 10%或5%。当蛋白通 过化学合成产生时，优选其基本不含化学前体或其它化学物质，即 该蛋白与参与合成其的化学前体或其它化学物质分离。因此，此蛋 白制品具有少于约30%、 20%、 10%、 5% (干重)的目标多肽以外的 化学前体或化合物。
分离的生物活性多肽可具有几种不同的物理形式。分离多肽可 以全长的初生多肽或未加工多肽存在，或者以部分加工的多肽或加 工多肽的组合存在。全长初生多肽可通过导致形成全长初生多肽片 段的特异性蛋白酶剪切事件进行翻译后修饰。片段或物理结合的片 段可具有与全长多肽相关的生物活性；但是，与单个片段相关的生 物活性程度可变化。分离的或大致纯化的多肽可为由分离核酸序列 编码的多肽，以及由例如化学合成方法合成的多肽，和与生物物质 分离的多肽，然后使用常规蛋白分析或制备方法纯化至允许其按照 本文所述方法使用的程度。
"重组体"指已使用分子生物学技术修饰得与其天然状态有些 不同的核酸、由核酸编码的蛋白、细胞或病毒颗粒。例如，重组细 胞可包含在天然(非重组)形式的细胞中不存在的核苷酸序列，或者可 表达在不同情况下会异常表达、不充分表达或根本不表达的天然基 因。重组细胞还可包含存在于天然形式细胞中的基因，其中所述基 因通过人工方法修饰并再导入细胞中。该术语还包括含内源核酸的 细胞，所述内源核酸已被修饰，但没有由细胞中去除核酸；这种修 饰包括例如通过基因置换和位点特异性突变获得的修饰。
"重组宿主细胞"或"重组细胞"是其中已导入重组DNA序列 的细胞。可使用任何合适的方法将重组DNA序列导入到宿主细胞中， 包括例如电穿孔、磷酸钙沉淀、孩￡注射、转化、粒子轰击和病毒感 染。重组DNA可整合或不整合(共价连接)入构成细胞基因组的染色
体DNA中。例如，重组DNA可保持在游离型元件如质粒上。或者， 就稳定转化或转染的细胞而言，重组DNA已整合入染色体中，以便 其通过染色体复制由子细胞遗传。这种稳定性由稳定转化或转染细 胞建立含外源DNA子细胞群组成的细胞系或克隆的能力来证实。重 组宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，包括细菌如大肠杆菌、真菌 细胞如酵母、哺乳动物细胞如人、牛、猪、猴或啮齿动物源的细胞 系，以及昆虫细胞，如果蝇和蚕来源的细胞系。还要理解的是，术 语"重组宿主细胞"不仅指具体的所指细胞，而且指此细胞的子代 或潜在子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在后代中发生， 所以这种子代实际上可能与亲代细胞不完全相同，但仍包括在本文 使用的术语范围内。
本文使用的"有效连接"指两个核酸序列之间的功能关系。例 如，控制编码序列表达(例如转录)的启动子序列有效连接至该编码序 列。有效连接的核酸序列可为连续的，以许多启动子序列为代表， 或者可为非连续的，例如对于编码抑制子蛋白的核酸序列而言。在 重组表达载体中，"有效连接的"往往意指目标编码序列以允许编 码序列表达的方式连接至调节序列，例如在体外转录/翻译系统中或 当载体导入到宿主细胞中时在宿主细胞中。
"载体"或"构建物"指异源核酸可处于其中或插入其中的核 酸分子。某些载体可导入到允许载体复制或允许由载体或构建物编 码的蛋白表达的宿主细胞中。载体通常具有选择标记(例如编码允许 药物抗性的蛋白的基因)、复制起点序列和允许插入异源序列的多克 隆位点。载体通常是基于质粒的，由小写字母"p"后接字母和/或数 字的组合命名。本文公开的起始质粒是可市售获得的，在未受限基 础上可公开获得，或者可通过应用本领域已知的方法由可用质粒构 建。可按照本发明使用的许多质粒和其它克隆和表达载体是众所周 知的，本领域技术人员容易获得。而且，技术人员可容易地构建许 多适用于本发明的其它质粒。技术人员由本发明公开内容显而易见
这些质粒以及其它载体在本发明中的特性、构建和使用。
"序列"指单体在聚合物中存在的线性顺序，例如氨基酸在多 肽中的顺序或核苷酸在多核苷酸中的顺序。
本领域已知的"序列同一性或相似性"是两个或多个多肽序列 或两个或多个多核苷酸序列之间的关系，可通过比较序列来测定。 在两个或多个核酸序列或两个或多个多肽序列之间的关系的范围 内，本文使用的"同一性"分别指在序列最优比对和分析时相同的 核苷酸或氨基酸残基的百分率。为了将查询序列与例如人SK1的氨
基酸序列(NCBI蛋白检索号NP—068807)对比，查询序列与人SK1 最佳比对，获得在全长人SK1中的最佳局部比对。
分析可人工进行，或使用序列比较算法进行。对于序列比较， 通常一个序列用作参比序列，查询序列与其对比。当使用序列比较 算法时，将测试序列和参比序列输入计算机，如果需要的话指定亚 序列坐标，并指定序列算法程序参数。
例如可通过使用Needleman & Wunsch, J MoL Biol., 48:443 (1970) 的同源性比对算法进行待比较序列的最佳比对。进行Needleman & Wunsch分析的软件可通过Institut Pasteur (France)生物软件站点 http:〃bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/needle.html 乂>开获；f寻。 NEEDLE程序使用Needleman-Wunsch全局比对算法来获得两个序列 在考虑其全长时的最佳比对(包括空位)。同一性根据报告的比对区(包 括长度中的任何空位)内两个序列之间的相同匹配百分率计算。还提 供相似性得分，其中相似性根据报告的比对区(包括长度中的任何空 位)内两个序列之间的匹配百分率计算。标准比较使用EBLOSUM62 矩阵(对于蛋白序列)和EDNAFULL矩阵(对于核苷酸序列)。空位开 放罚分是在建立空位时减去的分数；默认设置使用10.0的空位开放 罚分。对于空位延伸，将罚分加至空位中各个碱基或残基的标准空 位罚分；默认-没置是0.5。
杂交也可用作指示两个多核苷酸彼此基本相同的测试。共有高
度同 一性的多核苷酸在严格杂交条件下将彼此杂交。"严格杂交条
件"具有本领域已知的含义，如在Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 笫二版,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)中所描述的。示例性的严格杂交条件 包括在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45。C杂交，接着用0.2x SSC 和0.1% SDS在50-65'C进行1次或多次漂洗，这取决于杂交多核苷 酸共有互补性的长度。
"报告基因"指编码报告基因产物的核酸序列。正如本领域所 知，报告基因产物通常可通过标准方法容易地检测。示例性的适宜 报告基因包括但不限于编码萤光素酶(luc)、 (3-半乳糖苷酶(lacZ)、绿 色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、 p-葡糖醛酸酶、新霉 素磷酸转移酶和鸟嘌呤黄嘌呤转磷酸核糖基酶的基因。
#及增*4'爭錄SA7活^的化会錄^浴^f ^妓力^/介才法
在一个一般方面，本发明提供一种测定细胞中的SKI生物活性 的方法。此方法包含测定细胞中的MCP-1基因表达水平的步骤。
在另一个一般方面，本发明提供一种监测给予受试者的化合物 的作用的方法，其中预期所述化合物增加或降低所述受试者细胞中 的鞘氨醇激酶-1生物活性。这种方法包括检测所述受试者细胞中的 单核细胞化学引诱蛋白-1基因的表达水平的步骤。所述化合物可给 予所述受试者，用于治疗或预防各种病理状况，例如心血管疾病、 动脉粥样石更化、糖尿病、中风、自身免疫和炎性疾病、变应性疾病 如皮炎、T辅助细胞-l相关疾病、慢性阻塞性肺病、哮喘、细胞增殖 疾病如癌症、神经退4b性疾病或血栓形成。
取自受试者的生物样品可用于测定所述受试者细胞中的MCP-1 基因表达水平。技术人员已知的任何合适方法都可用于获得生物样 品。例如，可由MCP-1主要于该处表达的上皮获得生物样品，即经 针式活检。生物样品还可由血液或血浆获得。
在某些实施方案中，细胞中MCP-1基因的表达水平可通过检测 所述细胞中该基因的mRNA量来测定。生物样品中特定基因的mRNA 量可使用许多技术来检测。例如，mRNA可通过使生物样品与能够 特异性检测mRNA的化合物或物质接触来检测。经常使用能够与 mRNA特异性杂交的标记核酸探针。例如，对人MCPl mRNA特异 性的核酸探针可为全长人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸检索号 NM—002982)或其部分，例如在严格杂交条件下可与人MCPl mRNA 杂交的、至少长15、 30、 50、 100、 250或500个核苷酸的寡核苷酸。 在严格杂交条件下，对人MCPl mRNA特异性的核酸探针仅与该 mRNA杂交，但不与存在于测试生物样品中的其它mRNA物质杂交。 对本发明有用的核酸探针包括能够在严格杂交条件下与人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸检索号NMJ)02982)杂交的探针。
另一种测定生物样品中特定基因的mRNA量的技术是定量实时 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。基因如人MCP-1基因的互补DNA (cDNA)可经逆转录由所述样品制备。cDNA可使用能够在严格杂交 条件下与MCP-1 cDNA杂交的寡核苷酸引物经PCR扩增。试剂盒是 市售可得的，有利于RT-PCR,例如Applied Biosystems (Foster City， CA) 的"One-Step RT-PCR Master Mix Reagent"试剂盒。
在过去的十年当中，原位杂交已广泛用于研究特定基因的mRNA 物质在细胞或组织的特定区室中的分布和表达。用于原位杂交测定 的核酸探针类型包括不同长度的单链寡核苷酸、单链RNA探针 (riboprobe)或双链cDNA序列。探针可特异性地针对任何已知的表达 核酸序列设计。许多不同的放射性同位素和非同位素标记可市售获 得，可用于原位杂交。关于原位杂交方法的综述，参见McNicol等, (1997)， 涵o/ 182(3): 250-61。其它测定生物样品中特定基因的 mRNA量的有用技术包括DNA微阵列分析、点印迹和RNA杂交。
在某些实施方案中，生物样品中MCP-1基因的表达水平可通过 ^^测该基因编码的多肽量来测定。细胞由MCP-1基因表达MCP-1蛋
白，随后将MCP-1蛋白分泌到细胞外。因此，在本发明的具体实施 方案中，以受试者的血液或血浆样品中的MCP-1量检测所述受试者 细胞的MCP-1基因表达水平。
可通过使生物样品与能够特异性检测蛋白的化合物或物质接 触，检测生物样品中该蛋白的量。例如，检测MCP-1蛋白的优选物 质是能够特异性结合所述多肽的一部分的抗体。在一个优选方法中， 偶联可检测标记的MCP-1蛋白特异性抗体用于检测MCP-1蛋白。抗 体可为多克隆抗体或单克隆抗体。可使用全抗体分子或其片段(例如 Fab或F(ab')2)。抗体可通过专业实验室获得。例如，可在相对短的 时间量程内开发针对MCP-1蛋白特异性的合成舦序列的抗体，使得 研究这些目标靶的灵活度更高。
检测多肽如MCP-1蛋白的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、 蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光以及免疫化学。实施这些方法的 细节可见于例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 笫二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989))。
另外，活体人器官中的MCP-1基因表达水平可通过定量非侵入 性方法测定，例如正电子发射断层(PET)成像(Sedvall等，(1988) 尸矽c/jo; / w附aco/. 5W% 5:27-33)。例如，可将痕量的Pa9蛋白结合放 射性示踪剂静脉内注射入受试者中，在受试者的褐色脂肪组织、肝 脏、心脏、肾脏、肌肉或其它器官中放射性标记的分布可被成像。PET 成像以及其它定量非侵入性成像方法的程序是本领域技术人员已知 的(参见Passchier等，(2002)MeAo血27:278的综述)。
逸舍增》/7成'聲瓶SW ;^/4^化^參付浴;^的放力浙定试浙盆
通常用最优方案，可获得完整测定试剂盒，其中包括检测MCP-1基因表达水平必需的所有试剂。因此，本发明还描述了监测给予受 试者的化合物作用的试剂盒，其中预期所述化合物增加或降低所述
受试者细胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性。此试剂盒优选包含适于密 封保持在至少一个容器中的分区存放的载体。所述载体还包含能够
检测生物样品中的MCP-1多肽或MCP-1 mRNA的试剂以及测定所 述样品中的多肽量或mRNA量的方法。所述试剂盒还可包含可测定 并与包含的测试样品对比的对照样品或 一 系歹，j对照样品。试剂盒的 各组分可封装在单个容器中，不同容器连同说明一起全部在单独包 装中，所述试剂盒用于测定包含增加或降低受试者中的MCP-1活性 的化合物的治疗是有效的还是无效的。
对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可包含例如(l)结合MCP-1 的第一抗体(例如附着于固体支持体的抗体)；和任选的；(2)结合MCP-1
或所述第一抗体的不同的第二抗体，其缀合可检测物质；(3)作为阳 性对照的基本纯化的MCP-1;和(4)用于将由生物样品检测的MCP-1 量与评价化合物的效力关联起来的说明。例如，基于抗体的试剂盒 可包含特异性结合人MCP-1 (NCBI蛋白检索号NP—002973)、大鼠(即 NCBI蛋白检索号NP—113718)或小鼠(即NCBI蛋白检索号 NP一035463)、猪、狗和猴的MCP-1的抗体。所述抗体可为多克隆抗 体或单克隆抗体。可使用技术人员已知的任何合适方法开发所述抗 体。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒例如可包含寡核苷酸 和说明，所述寡核苷酸例如为标记的寡核苷酸，在严格杂交条件下 与MCP-1基因的mRNA杂交，所述说明用于将由生物样品检测的 MCP-1基因表达量与评价化合物的效力关联起来。例如，所述试剂 盒可包含在严格杂交条件下与人MCP-1 cDNA (NCBI核苷酸检索 号NM—002982)杂交的标记寡核苷酸或其互补物。或者，所述试剂 盒可包含用于由MCP-1基因的mRNA逆转录和扩增核酸分子的引物 对。例如，所述试剂盒可包含用于由人或其它动物如大鼠、小鼠、 猪、狗和猴的MCP-1基因的mRNA扩增核酸分子的引物对。 蕃^/乂#》"戈犖錄5《/ ^務活^的^冷錄^i法
为SK1靶基因的MCP-1基因的鉴别还允许开发用于鉴别增加或 降低SK1生物活性的化合物的新筛选方法或测定。因此，本发明的 另一个一般方面涉及鉴别增加或降低鞘氨醇激酶-1生物活性的化合 物的方法。这些方法包括鉴别改变MCP-1基因的基因表达水平的化 合物。
化合物鉴别方法可使用常^L实验室方法或以适于高通量的测定 实施。术语"高通量"指允许容易地同时筛选多个样品的实验设计， 可包括机器人操作能力。高通量测定的另一个期望特征是为减少试 剂使用而优化或为实现目标分析而最小化操作数量的实验设计。测 定方法的实例包括96-孔或384-孔平板、悬浮液滴(levitating dr叩let) 和用于液体处理实验的"芯片实验室"樣i通道芯片。如本领域人员 所知，随着塑料模具和液体处理装置小型化进展，或随着设计出改 良的测定装置，能够使用发明的测定更有效地筛选更大量的样品。
用于筛选的候选化合物可选自众多化学类别，优选选自有机化 合物类。尽管候选化合物可为大分子，但优选所述候选化合物是小 分子有机化合物，即所具有的分子量超过50并小于2500的化合物。 候选化合物具有 一个或多个对与多肽结构性相互作用必须的化学官 能团。优选的候选化合物具有至少一个胺基、羰基、羟基或羧基， 优选具有至少两个这种官能团，更优选具有至少三个这种官能团。 候选化合物可包含用 一个或多个以上例举的官能团取代的环碳或杂 环结构部分和/或芳族或聚芳族部分。候选化合物还可为生物分子，
例如肽、糖、脂肪酸、甾醇、类异戊二烯、噪呤、嗜啶、以上物质 的衍生物或结构类似物或其组合等。在所述化合物是核酸的情况下， 所述化合物优选为DNA或RNA分子，尽管也设想了具有非天然键 或亚基的修饰核酸。
候选化合物可由各种来源获得，包括合成或天然化合物的文库。
的方法，包括表达随机化寡核苦酸、合成有机组合文库、随机肽的 噬菌体展示文库等。候选化合物还可使用任何本领域已知的组合文
库法的众多方案获得，包括生物文库、空间可寻址平行固相或液
相文库、需要去巻积的合成文库法、"一珠一化合物"文库法和使
用亲和层析选择的合成文库法(参见例如Lam (199"， ^ "c朋cer Z>wg D饥12:145)。或者，可利用或者可常规生产为细菌、真菌、植物和 动物提取物形式的天然化合物文库。另外，天然和合成生产的文库 和化合物可通过常规化学、物理和生物化学方法常规修饰。
此外，已知的药理物质可进行定向或随机的化学修饰，例如酰 化、烷基化、酯化、酰胺化等，以生产所述物质的结构类似物。候 选化合物可随机选择，或者可基于结合和/或调节SK1生物活性的现 有化合物。例如，候选物质的来源可为基于已知的SK1活化剂或抑 制剂的分子文库，其中化合物的结构在该分子的一个或多个位置被 改变，以包含更多或更少的化学部分或不同的化学部分。为建立类
随机的或定向和随机的置换和/或添加的组合。
各种其它试剂也可包含在混合物中。这些试剂包括诸如盐、緩 沖剂、中性蛋白(例如白蛋白)和变性剂的试剂，其可用于促进最佳的 蛋白-蛋白和/或蛋白-核酸结合。这种试剂还可降低反应组分的非特异 性或背景相互作用。还可使用其它提升测定效率的试剂，例如核酸 酶抑制剂、抗微生物剂等。
分子文库合成方法的实例可见于本领域，例如载于Zuckermann 等，(1994), /Mo/. C/ ew. 37:2678。化合物文库可制备在溶液中(例如 Houghten (1992),历oto:/m,々j^y 13:412-421)、或珠上(Lam (1991), Atowe 354:82-84)、芯片上(Fodor (1993), A^f似re 364:555-556)、细菌 中(美国专利笫5,223,409号)、孢子上(美国专利笫5,571,698号)、质 粒中(Cull等，(1992), Prac. A^/. ^cad 89:1865-1869)或噬菌体 上(参见例如Scott和Smith (1990), &/e"ce 249:386-390)。
在一个实施方案中，本发明提供一种鉴别增加或降低SKI生物 活性的化合物的方法，所述方法包括以下步骤
a) 使SKI反应性系统与含緩冲液和测试化合物的溶液接触，其 中所述SK1反应性系统含SK1或其功能衍生物，以及其表达受MCP-1 基因的调节序列控制的基因；
b) 检测SKI反应性系统中其表达受MCP-1基因的调节序列控 制的基因的表达水平；和
c) 根椐其与其中SKI反应性系统仅与緩沖液接触的对照相比增 加或降低所述表达水平的能力鉴别所述化合物。
"SK1反应性系统"在其最广泛意义上使用，指例如通过TNFa 对SKI刺激有响应的单一细胞、组织和复杂的多细胞生物，例如哺 乳动物。在一个实施方案中，SKI反应性系统是为内源SKI和内源 MCP-1基因天然宿主的动物、组织或细胞。例如，内皮细胞如 HMVEC、 HUVEC或HAEC都是可用于本发明的天然SKI反应性系 统。SKI反应性系统还可为SKI的重组宿主细胞。技术人员已知的 任何合适方法都可用于获得这种具有重组SKI的SKI反应性系统。 例如，SKI反应性系统可通过将编码功能性SKI的外源DNA导入 MCP-1基因的天然宿主细胞中构建。这种SKI反应性系统的MCP-1 基因的表达水平可通过使用同上所述的方法通过SKI反应性系统的 MCP-1基因的mRNA或蛋白的量来检测。
在另一个实施方案中，SKI反应性系统包含功能性SKI蛋白和 由MCP-1基因的调节序列控制的报告基因。所述报告基因包含MCP-l 基因的调节序列和有效连接的报告基因编码序列。这种系统允许响 应于SKI调节物来转录调节报告基因。因此，SKI的生物活性可通 过报告基因活性间接检测。例如，当萤光素酶(luc)基因用作报告基因 时，可由SKI反应性系统的生物发光量检测SKI生物活性。其它报 告基因包括但不限于编码绿色荧光蛋白(GFP)、 (3-半乳糖苷酶(lacZ)、 氯霉素乙酰转移酶(cat)、 P-葡糖醛酸酶、新霉素磷酸转移酶和鸟噪呤
黄噪呤转磷酸核糖基酶的基因。报告基因的生物活性可容易地检测。 试剂盒可市售获得，有利于报告基因活性的检测。
技术人员已知的任何合适方法都可用于构建含与MCP-1基因的
调节序列有效连接的报告基因编码序列的核酸。MCP-1基因的调节 序列包括与MCP-1基因天然关耳关并控制MCP-1基因的基因表达的任 何核苷酸序列。优选地，所述调节序列包含转录因子NF-kB和AP-1 的结合位点。
在一个优选实施方案中，在寻找降低SK1生物活性的化合物时， 本发明的方法进一步包括使SK1反应性系统与SK1活化刺激物接触 的步骤，之后是检测系统中的基因表达的步骤。SK1活化刺激物可 在所述系统接触测试化合物之前、同时或之后与SK1反应性系统接 触。
例如，降低SK1生物活性的化合物可使用包含以下步骤的方法 鉴别
a) 使内皮细胞与测试化合物接触；
b) 使所述内皮细胞与SK1活化刺激物(例如TNFa或凝血酶)接
触；
c) 检测所述内皮细胞的MCP-1的表达水平；和
d) 根据其与对照相比降低MCP-1基因表达的能力鉴别所述化合物。
其中步骤a)可在步骤b)之前、之后或同时进行。 在一个具体实施方案中，本发明的方法还包括以下步骤在SK1
功能性测定中证实由上述化合物鉴别方法的步骤c)鉴别的候选化合
物。这种功能性测定包括以下步骤
a) 使SK1与含候选化合物和緩冲液的溶液接触，所述緩沖液含 鞘氨醇和ATP;
b) 检测由鞘氨醇产生的鞘氨醇-l-磷酸的量；和
c) 根据其与其中SK1仅接触缓沖液的对照相比增加或降低由鞘
氨醇生产的鞘氨醇-1 -磷酸的能力证实所述候选化合物。
表达SK1基因的宿主细月包(重组的或天然的)可用于所述功能性 测定。优选地，大致純化地SK1或其功能衍生物可用于所述功能性 测定。
源，MC尸-7差^或i^-才法
作为SK1靶基因的MCP-1的鉴别允许开发调节细胞中的MCP-1基因表达的新方法。调节细胞中的MCP-1基因表达直接调节细胞 产生的MCP-1量，最终实现涉及MCP-1的细胞机能的变化。因此， 本发明的另一个一般方面涉及增加或降低细胞中的MCP-1基因表达 的方法。这种方法包含以下步骤增加或降低细胞中的鞘氨醇-l-磷 酸的生物活性，使得所述单核细胞化学引诱蛋白-1基因的表达分别 被增加或降低。
业已表明，MCP-1表达缺失在几种动脉粥样硬化模型中提供了 抗动脉粥样硬化损害发展的持续保护作用(Gosling等，《/ /"ve^， 1999,103:773-778;和Gu等，Mo/Ce〃， 1998, 2:275-281)。因此，本发 明提供一种在受试者中治疗或预防动脉粥样硬化的方法，所述方法 包括以下步骤降低所述受试者细胞中的鞘氨醇-l-磷酸的生物活性， 从而治疗或预防所述受试者中的动脉粥样硬化。相似的方法可用于 治疗或预防通过调节MCP1基因表达可治疗或预防的其它疾病或病 症。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤给予细胞增加或 降低SK1生物活性的化合物，即增加或降低SK1催化由鞘氨醇形成 S1P的能力的化合物。这种化合物的实例包括二曱基鞘氨醇(DMS)。 此化合物还可使用同上所述的化合物鉴别方法鉴别。
在另一个实施方案中，所述方法包括增加或降低细胞中的SK1 基因表达的步骤。在一个实施方案中，当需要降低SK1的表达或生 物活性时，可使用反义分子降低细胞中SK1基因的表达。
反义型策略的原则是基于以下假设基因表达的序列特异性抑 制可通过mRNA和互补反义物之间的胞内杂交实现。然后，杂合RNA 双链体的形成可千扰靶mRNA (例如SKI基因的耙mRNA)的加工/转 运/翻译和/或稳定性。杂交是发生反义作用必需的。反义策略可用于 各种方法，包括使用反义寡核苷酸、注射反义RNA和反义RNA表 达载体转染。与有义链的反义杂交诱导的表型作用基于标准变化， 所述标准例如为蛋白水平、蛋白活性;险测和耙mRNA水平。
反义核酸可与把基因的完整编码链互补，或仅与其一部分互补。
非编码区("5'和3' UTR")是侧接编码区的5'和3'序列，没有翻译成 氨基酸。优选地，所述非编码区是用于靶基因的转录或翻译的调节 区。
反义寡核苷酸例如可为取自SK1 cDNA互补序列的长约15、 25、 35、 45或65个或更多个核苷酸。优选所述序列为至少18个核苷酸 长，以便实现与耙mRNA序列的足够强的退火，以阻止所述序列翻 译。(Izant等,1984, Ce〃， 36:1007-1015; Rosenberg等,1985,淑廳, 313:703-706)。反义核酸可使用本领域已知的方法使用化学合成和酶 连接反应构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可使用天然核苷 酸或者各种修饰的核香酸化学合成，所述各种修饰的核苷酸设计用 于增加所述分子的生物稳定性，或增加反义和有义核酸之间形成的 双链体的物理稳定性，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的 核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、 5-溴尿嘧咬、5-氯尿嘧，定、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰 胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基乙基氨基曱基-2-硫尿嘧啶、 5-羧曱基氨基曱基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、(3-D-半乳糖基Q核苷、肌 苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-曱基鸟嘌呤、l-曱基肌苷、2,2-二曱基鸟 。票呤、2-曱基腺嘌呤、2-曱基鸟嘌呤、3-曱基胞嘧啶、5-曱基胞嘧啶、 N6-腺。票呤、7-曱基鸟噪呤、5-曱基氨基曱基尿嘧啶、5-曱氧基氨基
曱基-2-硫尿嘧啶、P-D-甘露糖基Q核苷、5'-曱氧基羧曱基尿嘧啶、5-曱氧基尿嘧啶、2-曱基硫代-N6-异戊烯基腺"票呤、尿嘧啶-5-氧乙酸 (v)、 wybutoxosine、假尿嘧咬、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-曱基-2-硫尿 嘧啶、2-硫尿嘧咬、4-硫尿嘧啶、5-曱基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸曱 酯、尿嘧啶-5画氧乙酸(v)、 5-曱基-2-硫尿嗜啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙 基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。反义核酸分子可为CC-异头 核酸分子。CC-异头核酸分子与互补RNA形成特异性的双链杂合体， 其中，与通常的P-单元相反，所述链彼此平行排列(Gaultier等，(1987) M/c/e/c ^c/<* i^y. 15:6625-6641)。所述反义核酸分子还可包含2'-o-甲 基核糖核苷酸(Inoue等，(1987)^/"￡,^67^^& 15:6131-6148)或嵌合 RNA-DNA类似物(Inoue等，(1987) i^ASZ^". 215:327-330)。
或者，还可使用核酸已如上所述以反义方向亚克隆入其中的表 达载体以生物学方法生产反义核酸。反义表达载体可为重组质粒、 噬菌粒或减毒病毒形式，其中反义核酸在高效调节区控制下生产， 其活性可由载体导入其中的细胞类型来确定。为实现反义分子的足 量胞内浓度，优选其中反义核酸分子处于强pol II或pol III启动子控 制下的载体构建物。关于使用反义基因调节基因表达的论述，参见 Weintraub等，(1985, 7>emfe ,'" Ge"e"c 巻1(1)， 22-25页)。
通常，反义核酸通过微注射、脂质体嚢化给予受试者，或通过 由具有反义序列的载体表达原位产生。反义核酸分子给予途径的实 例包括在组织部位直接注射。反义核酸可连接入病毒载体中，所述 病毒载体当导入宿主细胞中时介导反义核酸的转移。合适的病毒载
体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱渗病毒、痘苗病毒、 脊髓灰质炎病毒等。或者，反义核酸分子可被修饰，以靶向选定细 胞，然后系统给予。例如，对于系统给予，例如可通过将反义核酸 分子连接至结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体来修饰反义分子， 以使它们特异性结合在选定细胞表面上表达的受体或抗原。
一旦进入细胞内，反义核酸分子就与编码SK1蛋白的细胞mRNA
和/或基因组DNA杂交或结合，由此例如通过抑制转录和/或翻译抑 制表达。杂交可通过常规核苷酸互补性实现，形成稳定双链体，或 者例如对结合DNA双链体的反义核酸分子的情况，通过在双链螺旋 体大沟中的特异性相互作用实现。
在一个优选实施方案中，所述方法包括使用小干扰RNA (siRNA)。当细胞中存在对应于基因的双链RNA (dsRNA)时，许多生 物具有通过称为RNA干扰的过程沉默基因表达的机制。使用dsRNA 降低特定基因活性的技术首先使用蠕虫秀丽线虫(C. e/eg"似)开发，称 为RNA干扰或RNAi (Fire等，(1998), Atowe 391: 806-811)。自此之 后RNAi已被发现在许多生物体中有用，最近已扩展到哺乳动物细胞 (参见Moss, (2001), C"〃历o/ 11: R772-5的综述)。当表明RNAi涉及 21-25个核苷酸的小RNA产生时，取得了重要进展(Hammond等，(2000) 7\towe 404: 293-6; Zamore等，(2000) CW/ 101: 25-33)。这些小干扰RNA 或siRNA首先可来源于开始该过程的较大dsRNA,与最终降解的靶 RNA互补。siRNA自身用各个末端的短悬垂形成双链。它们起引导 RNA的作用，引导所述輩巴在亙补区中单独裂解(Elbashir等，(2001) Ge腦Dev 15: 188-200; Zamore等，(2000) Ce〃 101: 25-33)。
在治疗方法中可使用含与SEQ ID NO: 1、 3或5所示核苷酸序 列互补的约21-25个核普酸的siRNA。生产siRNA的方法是本领域 技术人员已知的。例如，WO0175164 A2描述了由体外系统生产长 21-23个核苷酸的siRNA的方法，并使用此siRNA干扰细胞或生物 体中的基因的raRNA。 siRNA还可使用稳定表达系统由哺乳动物在 体内制备。例如，最近报道了称为pSUPER的载体系统，其引导哺 乳动物细胞中的siRNA合成(Brummelkamp等，(2002) Sc/e"ce 296: 550-3)。使用siRNA降低细胞中的基因表达的实例示于实施例3。
在一个具体实施方案中，本发明提供一种在内皮细胞中降低单 核细胞化学引诱蛋白-1基因表达的方法，所述方法包括以下步骤
(a)将靶向待降解SK1基因mRNA的siRNA导入内皮细胞中；
(b)在一定条件下保持在(a)中产生的细胞，于所述条件下在细胞 中发生SKI基因mRNA的siRNA干扰。
可使用和本文描述的用于反义核酸的类似方法将siRNA导入细 胞中。
在另一个实施方案中，当需要细胞中的MCP-1基因表达增加时， 所述方法包含将能够表达SKI基因的核酸分子导入该细胞中的步 骤。
作为一个实例，首先可将编码SKI基因的DNA分子克隆入逆 转录病毒载体中。所述载体表达靶基因可由其内源启动子驱动，或 由逆转录病毒长末端重复序列驱动，或者由某些靶细胞特异性的启 动子驱动。然后可将载体导入到细胞中，以在细胞中成功表达靶基 因。优选可将基因以细胞可使用的形式传递入细胞中，以编码足量 蛋白来提供有效功能。逆转录病毒载体由于其高感染效率和稳定的 整合和表达而经常是优选基因传递载体。或者，可通过非病毒技术， 包括使用配体-DNA缀合物或腺病毒-配体-DNA缀合物的受体介导的 把向DNA转移、脂转染膜融合或定向微注射，将编码靶基因的DNA 分子转移到细胞中。这些方法及其变更方法适于活体外以及体内基 因治疗。适合与本发明方法一起使用的基因治疗分子方法学程序描 述于Gene Therapy Protocols, Paul D. Robbins编辑,Human press, TotowaNJ, 1996。
实施活体外基因治疗的方法概述于美国专利第5,399,346号，还 概述于该专利的文件史中提交的展示文献，所有这些文献都是公开 可获得的文件。 一般来说，基因治疗可包括将基因的功能拷贝体外 导入到受试者细胞中，并将遗传工程的细胞返回到所述受试者中。 基因的功能拷贝处于调节元件的有效控制之下，所述调节元件允许 所述基因在遗传工程细胞中表达。众多转染和转导技术以及合适的 表达载体对本领域一般技术人员来说是众所周知的，其中一些描述 于PCT申请WO95/00654。体内基因治疗使用载体，例如腺病毒、
逆转录病毒、疸苗病毒、牛乳头瘤病毒和疱渗病毒，如E-B病毒。 基因转移还可使用需要体外感染的非病毒方法实现。这种方法可包
括磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合。靶向脂质体对将 DNA传递入细胞中也可能有益。
在治疗当中，给予个体的本发明核酸分子的有效量可根据各种 因素而变化，所述因素包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别 和身体状况；待治疗疾病的严重性；给予途径；患者的肾功能和肝 功能；以及患者使用的具体核酸分子。基因治疗方面的专业医师或 兽医可确定和处方预防、对抗或阻止疾病进展所需的有效量。获得 处于产生效力而无毒性的浓度范围中的最佳精度需要基于针对靶点 的核酸分子利用度动力学的方案。这包括涉及基因治疗的核酸分子 的分布、平衡和消除的考虑因素。
本文公开的基因治疗可以以常规测试限定的适宜剂量单独使 用，以便获得MCP-1活性的最佳增加或降低，同时使任何潜在的毒 性最小。另外，可能需要共给予或依次给予其它物质。当将几种物 质组合时调整给予剂量，以获得期望作用。这些不同物质的剂量可 独立地优化并组合，以获得其中病况比任一种物质单独使用时减轻 得更多的协同结果。
源，凝j&^Tf #, ^才法
作为SK1活化刺激物的凝血酶的鉴别允许开发一种调节细胞中 的凝血酶信号转导的新方法，最终实现涉及凝血酶的细胞机能的改 变。因此，本发明的另一个一般方面涉及增加或降低细胞中的凝血 酶信号转导的方法。这种方法包含以下步骤增加或降低细胞中的 鞘氨醇-l-磷酸的生物活性，使得所述信号转导分别被增加或降低。 所述方法可用于治疗或预防与凝血酶信号转导相关的疾病或障碍。
如上文所述，使用增加或降低SK1的催化活性的化合物，或使 用核酸技术如反义技术、siRNA或表达载体等，可调节细胞中的鞘
氨醇-l-磷酸的生物活性。
以下的实施例阐述本发明，但不限制本发明。
实施例1
HMVEC中基因表达的cDNA微阵列研究
在致力于快速评价SKI在内皮细胞功能中的潜在全面作用的过 程中，在没有和有SKI抑制剂DMS的情况下，在HMVEC中实施 cDNA微阵列分析。通过以下两个受体亚型刺激细胞G蛋白偶联受 体，该蛋白酶活化受体(PAR)家族用凝血酶作为激动剂；和用TNF-a 作为激动剂的细胞因子受体。
鉴别出在其中一种实验条^f牛下被诱导或抑制的总共138个基因。 将没有或有DMS时受刺激细月包的倍数变化结果沿着两个轴作图，由 此产生点印迹，以观察检测到超出选定阈值的基因(图1)。这些分析 表明，鞘氨醇激酶与通过凝血酶受体产生的信号有关联，这是以前 从未观察到的事件。然而，先前研究已证实SK通过细胞因子受体、 受体酪氨酸激酶和其它GPCR活化，这是首个这种实例，由此，SK 是内皮细胞中选择性的凝血酶介导事件所必需的。而且，先前的数 据已表明了粘附分子如E-选择蛋白或VCAM的表达对hSK活性的 依赖性，凝血酶刺激的HMVEC也需要hSK活性来诱导这些分子。 回顾微阵列结果，我们选择一个转录物炎性蛋白单核细胞化学引诱 蛋白-1 (MCP-1)作为目标，该转录物受两种受体类型诱导，似乎由 DMS下调。如图1所示，MCP-l响应于两种配体凝血酶和TNF-a被 诱导，并在刺激前加入DMS的情况下被抑制。
材料r人凝血酶购自American Diagnostica, Inc. (Stamford, CT)。 TNF-a购自R&D Systems, 二曱基鞘氨醇(DMS)和鞘氨醇-l-磷酸得自 Avanti， PAR肽在J&J内部制备，MCP-l ELISA试剂盒(Hycult Biotechnology), Bayl 1-7092、 GF109203和PD98059得自Calbiochem。
细胞培养一成人微血管内皮细胞(HMVEC)(Cambrex)在EGM完
全培养基(Cambrex)中培养。所有研究都使用第3代至第6代之间的 细胞。
樣l阵列研究 一将成人孩l血管内皮细胞(HMVEC)(Cambrex)接种入 培养物(5% FBS)中，在没有或有鞘氨醇激酶有效抑制剂DMS (10 iliM) 的情况下用凝血酶(100 nM)或TNF-a (20 ng/ml)刺激。在刺激4小时 后，分离RNA (Tri-Reagent， Bio國Mol) ， ^f吏用RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen) 进行DNA酶处理和清洗。使用Agilent 2100 Bioanalyzer检验RNA 纯度，之后对RNA进行cDNA微阵列分析。
在本研究中使用含3563个cDNA克隆的cDNA微阵列。在基因 表达研究中，使用两种类型的重复生物重复和技术重复。收集双 份生物样品用于最初微阵列分析的各个实验条件。另外，使用技术 重复，以便所有样品都以一式三份在单独的微阵列上进行分析。各 个样品的樣i阵列数据基于技术重复进行异常值剔除，基于技术重复 和生物重复这二者进行标准化。标准化由单个样品中杂交重复实验 之间的初始标准化，以及其后覆盖研究中所有样品的次级标准化组 成(Shaw等，JMo/M/cra6/'o/ 5,o&c/ "o/, 2003, 5:105-122)。根据经验估 计每个样品的背景杂交水平，以便为样品中的各个克隆指定没有检 出和有检出。没有在两个强度看起来似乎都没有的治疗和对照条件 之间进行比较。在清洗并随后标准化之后，计算各个治疗对其指定 对照的单一比率。为测量基因表达模式，基因必须在17个表现出倍 数变化比率增加或降低至少1.5的比率之外具有一个比率。另外，对 标准化数据使用T统计量，以寻找在0.05显著性水平有差异的基因。 使用windows版的S-PLUS 6.1 (Insightful Corporation, Seattle, WA)检 测显著性基因。
Chen等公开了在内皮细胞中SKI介导TNFoc诱导的MCP-1基 因表达(Chen等，爿w.丄尸—o/肠W Cz>—拜o/, 2004, 287:H1452-58)。
实施例2
SK-1的特异性抑制消除HMVEC中MCP-1的诱导
尽管已表明DMS以较低浓度抑制SK活性，在较高浓度时其还 可影响蛋白激酶C家族成员以及酪蛋白激酶的活性。因此，使用小 干扰RNA (siRNA)通过专一靶向SK家族成员(具体地说是人SKI或 SK2)选择性抑制SK。在将荧光素加入siRNA的3'末端的情况下，我 们能够观察到接近100%的siRNA转染效率。根据Taqman定量RT-PCR的检测(图2)，设计的siRNA显示出对其各自的人SK (hSK)同 种型的特异性。当检测hSKl转录物时，观察到仅hSKl特异性siRNA 抑制hSKl表达，而hSK2特异性siRNA和对照非沉默siRNA对hSKl 表达模式没有作用。同样，在检测hSK2转录水平时，只有hSK2特 异性siRNA影响hSK2表达，而hSKl特异性siRNA和对照非沉默 siRNA不影响hSK2表达。因此，设计的siRNA显示出对预定輩巴的 特异性，在hSK家族成员之间没有交叉反应性。
为更直接地鉴别哪种hSK同种型参与HMVEC的MCP-1转录 物诱导，使用hSKl特异性siRNA、 hSK2特异性siRNA或对照非沉 默siRNA重复进行;^阵列分析，然后用凝血酶刺激(数据未显示)，随 后通过定量RT-PCR检验(图3)。凝血酶介导的HMVEC活化导致 MCP-1转录物的诱导，如先前用微阵列分析观察到的一样(图1)。在 存在hSKl特异性siRNA时，MCP-1的诱导被抑制，而在存在hSK2 特异性或对照非沉默siRNA时，MCP-1诱导未受影响。
siRNA转染效率和沉默能力的评价一设计并合成小干扰RNA (siRNA), 它们耙向 hSKl — SEQ ID NO: 1 (AAGAGCTGCAAGGCCTTGCCC)或 hSK2 — SEQ ID NO:2 (AACCTCATCCAGACAGAACGA)转录物中的任一个序列，以及在 人基因组中没有序列靶的对照非沉默siRNA —SEQ ID NO:3 (AATCTCCGAACGTGTCACGT)(Qiagen)。寡核苷酸在有义链的3'末 端缀合荧光素，这利于通过荧光共聚焦显^[效镜(LSM 510， Zeiss)观察
转染效率。将HMVEC接种入培养基(4x103细胞/孔)中，按照生产商 的说明(Transmessenger, Qiagen)在6孑L板中用1.6 jig siRNA转染，5 小时后获取共聚焦图象。分离用于实验研究的RNA， DNA酶处理， 并使用得自Applied Biosystems的预先i殳计引物进行定量RT-PCR分 析，以检测hSKl、 hSK2、 MCP-1和对照18S转录物的转录水平。 或者，DNA酶(Promega)处理单个实验条件下的RNA,如上所述提 交进行cDNA微阵列分析。
定量RT-PCR—使HMVEC过夜培养，用凝血酶(IOO nM)刺激， 之后分离RNA，并进行DNA酶处理。按照生产商的说明(Applied Biosystems)进行TaqMan⑧定量RT-PCR三重测定，作为对孩t阵列分 析的检验。每个检测器的平均量对18S检测器的平均量标准化。
实施例3
HMVEC中的PAR表达受限于PAR-1、 PAR-2和PAR-4
为丝氨酸蛋白酶的凝血酶可作用于许多底物，但我们感兴趣的 是PAR活化的凝血酶活性。迄今为止，有4个已鉴别的人PAR，我 们想通过进行RT-PCR分析确定HMVEC中的PAR表达谱。RT-PCR 结果表明，HMVEC表达凝血酶敏感的PAR-1和PAR-4，以及凝血 酶不敏感的、胰蛋白酶敏感的PAR-2。在我们的测定条件下，RT-PCR 不能扩增第三种凝血酶敏感受体PAR-3的预期条带，提示HMVEC 不表达PAR-3或以非常低的水平表达PAR-3。
RIzECR—培养HMVEC,分离RNA (TriReagent-BioMol),随后 进行DNA酶处理，并使用RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen)清洗。使用 富含GC的PCR试剂(Invitrogen)和Superscript II逆转录酶(Invitrogen) 进行RT-PCR。结果通过紫外凝胶电泳显现，并获取图象(Polaroid)。
实施例4
HMVEC的PAR-1依赖性MCP-1蛋白分泌受DMS抑制
凝血酶通过受体PAR-1介导其对细胞的初级响应。因此，我们 通过ELISA研究了 DMS预处理HMVEC是否抑制PAR-1特异性活 化肽TFLLRN (PAR-1-AP)的作用。
将HMVEC接种入培养物中，用凝血酶(100 nM)或各种浓度的 PAR活化肽刺激。24小时后，我们使用ELISA检测分泌到上清液中 的MCP-1。如图4所示，在用凝血酶刺激细胞时，MCP-1蛋白分泌 被放大，超过了未刺激细胞的分泌。而且，只有PAR-1-AP刺激HMVEC 的MCP-1分泌，而根据在条件培养基中的检测，PAR-2特异性活化 肽(PAR-2-AP: SLIGRL)和PAR-4特异性活化肽(PAR-4-AP: AYPGKF) 均不调节分泌的MCP-1水平。如先前使用MCP-1转录物水平所证实 的，在用凝血酶或PAR-1激动肽刺激前用DMS预处理HMVEC抑 制MCP-1蛋白的分泌。
MCP-1 F丄TSA—将HMVEC接种入96孔培养皿(2x103细胞/孔) 的培养物中，在完全生长培养基中生长24小时。用对照非沉默siRNA 或hSKl或hSK2的siRNA在无血清Opti-MEM (Gibco)中转染细胞4 小时。然后让细胞在含10% FBS的培养基中生长24小时，此后使细 胞在0.5% FBS培养基中血清々几俄过夜。随后用含0.5% FBS的新鲜 培养基刺激细胞，并在不同实l^条件下再温育24小时。有指示时， 将细胞与特异性化合物抑制剂预温育20分钟，然后刺激。收集上清 液，通过ELSIA (Cell Sciences)分析。
实施例5
把向hSKl的SiRNA降低PAR-1诱导的MCP-1分泌
我们的研究表明了 hSKl在凝血酶介导的MCP-1表达诱导中的 作用。因此，我们测试了 hSKl特异性siRNA阻断凝血酶和PAR-l-AP 刺激的HMVEC的MCP-1蛋白分泌的能力。
用siRNA (1.6吗)、hSKl特异性siRNA、 hSK2特异性siRNA 或对照非沉默siRNA转染HMVEC。 48小时后，用凝血酶(IOO nM)、 PAR-1-AP (300 iliM)或PAR-4-AP (600 )nM)刺激细胞。进行ELISA, 以检测分泌入细胞上清液中的MCP-1。如图5所示，在没有hSKl 表达时，如hSKl特异性siRNA转染细胞所呈现的(箭头)，增加水平 的MCP-1分泌被抑制。而且，基础水平的MCP-1蛋白分泌似乎也受 到影响，因为未受刺激或用PAR-4-AP刺激的细胞中的MCP-1蛋白 分泌水平比hSKl特异性siRNA转染细胞有所下降。
实施例6
凝血酶/PARl或TNF-a介导的MCP-1蛋白分泌需要hSK和NF-kB
二者的活性
为进一步表征受刺激的HMVEC的MCP-1蛋白分泌的信号转录 要求，使用 一组特定细胞信号转导组分的抑制剂。该组抑制剂包含hSK 活性抑制剂(DMS)、 NF-kB活性抑制剂(BAY11-7092)、 PKC活性抑 制剂(GF109203x)和ERK抑制剂(PD98059)。
将HMVEC过夜培养，用hSK抑制剂(DMS 10 ^M)、 NF-kB抑 制剂(Bayll-7092 10 jiM)、 PKC抑制剂(GF109203x 1 )iiM)或Erk抑制 剂(PD98059 10 fiM)预处理，然后用凝血酶(IOO nM)、 PAR-1-AP (TFLLRN 100 nM)或凝血酶(O.l ng/ml)刺激。在刺激后24小时进行 ELISA，以检测MCP-1分泌量。如图6所示，我们通过ELISA再次 证实，hSK活性是凝血酶和PAR-1介导的MCP-1表达所必需的。而 且，我们观察到，和用NF-kB抑制剂预处理一样，NF-kB活性也是 MCP-1表达的先决条件，Bayl 1-7092消除所有激动剂诱导的MCP-1 蛋白分泌。尽管NF-kB活性是HMVEC的MCP-1分泌所必需的，但 我们发现，Erk活性不是必需的，因为用PD98059预处理细胞对分 泌水平没有影响。采用GF109203x的PKC抑制具有中间作用。
实施例7 S1P受体不参与MCP-1分泌
最近，已披露的数据提示，hSK活化产物鞘氨醇-l-磷酸可由活 化细胞释放。因为S1P是称为S1P受体的新GPCR家族的配体，所 以我们检验了由于HMVEC上的自分泌/副分泌S1P释放而产生的 MCP-1表达潜力。
将HMVEC过夜培养，用hSK抑制剂(DMS 10 fiM)、 NF-kB抑 制剂(Bayl 1-7092 10 )、 PKC抑制剂(GF109203x 1 ^M)或Erk抑制 剂(PD98059 10jiM)预处理，然后用5jimSlP刺激。实施ELSIA,以 检测分泌的MCP-1蛋白水平。如在图7中所示，外部加入S1P活化 S1P受体后24小时，分泌的MCP-1水平不变化。外部加入S1P没有 增加MCP-1蛋白。因此，我们排除了 S1P受体在HMVEC的hSK依 赖性MCP-1释放中的作用。
权利要求
1.一种用于测定细胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性的方法，所述方法包括测定所述细胞的单核细胞化学引诱蛋白-1基因的表达水平的步骤。
2. —种监测给予受试者的化合物的效力的方法，其中预期所述 化合物增加或降低所述受试者细胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性，所 述方法包括以下步骤a. 检测所述受试者的单核细胞化学引诱蛋白-1基因的表达水 平；和b. 比较步骤a)中测定的表达水平和给予所迷化合物之前所述受 试者中的单核细胞化学引诱蛋白-1基因的表达水平。
3. 权利要求2的方法，所述方法还包括由所述受试者获得生物 样品的步骤，其中由所述生物样品测定单核细胞化学引诱蛋白-1基 因的表达水平。
4. 权利要求3的方法，其中所述受试者的生物样品包括血液或 血浆。
5. 权利要求2的方法，其中通过检测所述受试者中单核细胞化 学引诱蛋白-1基因的mRNA量测定所述单核细胞化学引诱蛋白-1基 因的表达水平。
6. —种监测给予受试者的化合物的效力的方法，其中预期所述 化合物增加或降低所迷受试者细胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性，所 述方法包括以下步骤a. 由所述受试者获得测试生物样品，其中所述测试生物样品包 括所述受试者的血液或血浆；b. 检测所述受试者的测试生物样品中单核细胞化学引诱蛋白-1 的量；和c. 比较步骤a)中测定的单核细胞化学引诱蛋白-l的量和所述受 试者的对照生物样品中的单核细胞化学引诱蛋白-1的量，其中所述 对照生物样品在给予所述化合物之前获得。
7. —种用于监测给予受试者的化合物的效力的试剂盒，其中预 期所述化合物增加或降低所述受试者细胞中的鞘氨醇激酶-1生物活 性，所述试剂盒包含a. 在严格杂交条件下与单核细胞化学引诱蛋白-I基因杂交的核 酸探针；和b. 用于将由所述受试者检测的单核细胞化学引诱蛋白-1基因表 达水平与所述化合物的效力关耳关起来的说明。
8. —种用于监测给予受试者的化合物的效力的试剂盒，其中预 期所述化合物增加或降低所述受试者细胞中的鞘氨醇激酶-1生物活 性，所述试剂盒包含a. 与单核细胞化学引诱蛋白-1特异性结合的抗体；和b. 用于将由所述受试者检测的单核细胞化学引诱蛋白-1的量与 所述化合物的效力关联起来的i兌明。
9. 一种鉴别增加或降低鞘氨醇激酶-1生物活性的化合物的方 法，所述方法包括以下步骤a. 使鞘氨醇激酶-1反应性系统与含緩冲液和测试化合物的溶液 接触，其中所述鞘氨醇激酶-1反应性系统包含鞘氨醇激酶-1或其功 能衍生物，以及其表达受单核细胞化学引诱蛋白-1基因的调节序列 控制的基因；b. 检测所述鞘氨醇激酶-1反应性系统中其表达受单核细胞化学 引诱蛋白-1基因的调节序列控制的基因的表达水平；和c. 根据所述化合物与其中所述鞘氨醇激酶-1反应性系统仅与所 述緩冲液接触的对照相比增加或降低所述表达水平的能力鉴别所述 化合物。
10. 权利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反应性系统是 动物、组织或细月包。
11. 权利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反应性系统包含所述系统内源性表达的鞘氨醇激酶-1。
12. 权利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反应性系统包 含由导入到系统中的外源DNA分子重组表达的鞘氨醇激酶-1 。
13. 权利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反应性系统包 含内源性单核细胞化学《I诱蛋白-1 。
14. 权利要求9的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1反应性系统包 含其表达受单核细胞化学引诱蛋白-1基因的调节序列控制的报告基 因。
15. 权利要求14的方法，其中所述报告基因选自绿色荧光蛋白 (GFP)基因、(3-半乳糖苷酶(lacZ)基因、萤光素酶(luc)基因、氯霉素乙 酰转移酶(cat)基因、p-葡糖醛酸酶基因、新霉素磷酸转移酶基因和乌嘌呤黄嘌呤转磷酸核糖基酶基因。
16. 权利要求9的方法，所述方法在权利要求9的步骤(b)之前 还包括使鞘氨醇激酶-1反应性系统与鞘氨醇激酶-1活化刺激物接触 的步骤。
17. 权利要求16的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1活化刺激物是 凝血酶或肿瘤坏死因子ot。
18. —种鉴别增加或降低鞘氨醇激酶-1生物活性的化合物的方 法，所述方法包括以下步骤a. 使内皮细胞与测试化合物接触；b. 使所迷内皮细胞与凝血酶或肿瘤坏死因子a接触；c. 检测所述内皮细胞的单核细胞化学引诱蛋白-1基因的表达水 平；和d. 根据所述化合物与其中所述内皮细胞不与测试化合物接触的 对照相比增加或降低单核细胞化学引诱蛋白-1基因表达的能力鉴别 所述化合物，其中步骤(a)可在步骤(b)之前、之后进行或与步骤(b)同时进行。
19. 权利要求9的方法，所述方法还包括以下步骤d. 使鞘氨醇激酶-1与溶液接触，其中所述溶液含由权利要求9 的步骤(c)鉴别的化合物以及包含鞘氨醇和腺苷三磷酸的緩冲液；e. 检测由鞘氨醇产生的鞘氨醇-l-磷酸的量；和f. 根据所述化合物与其中所述鞘氨醇激酶-1仅与所述緩冲液接 触的对照相比增加或降低由鞘氨醇生产鞘氨醇-l-磷酸的能力证实所 述化合物。
20. 权利要求19的方法，其中所述鞘氨醇激酶-1是大致纯化的。
21. —种增加或降低细胞中的单核细胞化学引诱蛋白-1基因表 达的方法，所述方法包括以下步骤增加或降低所述细胞中的鞘氨 醇激酶-1生物活性，使得所述单核细胞化学引诱蛋白-1基因的表达 分别被增加或降低。
22. 权利要求21的方法，所述方法包括将化合物给予所述细胞 的步骤，所述化合物增加或降低鞘氨醇激酶-1由鞘氨醇形成鞘氨醇-l-磷酸的催化活性。
23. 权利要求21的方法，所述方法包括将化合物给予所述细胞 的步骤，所述化合物增加或降^f氐所述细胞中的鞘氨醇激酶-l的表达。
24. 权利要求23的方法，所述方法包括以下步骤a. 将耙向待降解的鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA导入所 述细胞中；b. 将在(a)中产生的细胞保持在一定条件下，在所述条件下于所 述细胞中发生鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA干扰。
25. 权利要求21的方法，其中所述细胞是内皮细胞。
26. —种在受试者中预防动脉粥样硬化的方法，所述方法包括以 下步骤降低所述受试者中的鞘氨醇激酶-1生物活性，使得动脉粥 样硬化得以预防。
27. 权利要求26的方法，所述方法包括将化合物给予所述受试 者的步骤，其中所述化合物降低鞘氨醇激酶-1由鞘氨醇形成鞘氨醇-l- 磷酸的催化活性。
28. 权利要求21的方法，所述方法包括将化合物给予细胞的步 骤，其中所述化合物降低所述细胞中的鞘氨醇激酶-1的表达。
29. 权利要求28的方法，所述方法包括以下步骤a. 将靶向待降解的鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA导入受 试者细胞中；b. 将(a)中产生的细胞保持在一定条件下，在所述条件下于所述 细胞中发生鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA干扰。
30. —种在受试者中治疗动脉粥样石更化的方法，所述方法包括以 下步骤降低所述受试者中的鞘氨醇激酶-1生物活性，使得动脉粥 样硬化得以治疗。
31. 权利要求30的方法，所述方法包括将化合物给予所述受试 者的步骤，其中所述化合物降低鞘氨醇激酶-1由鞘氨醇形成鞘氨醇-l-磷酸的催化活性。
32. 权利要求30的方法，所述方法包括将化合物给予所述细胞 的步骤，其中所述化合物降低所述细胞中的鞘氨醇激酶-1的表达。
33. 权利要求32的方法，所述方法包括以下步骤a. 将靶向待降解的鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA导入受 试者细胞中；b. 将(a)中产生的细胞保持在一定条件下，在所述条件下于所述 细胞中发生鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA干扰。
34. —种抑制凝血酶信号转导的方法，所述方法包括以下步骤 降低所述细胞中的鞘氨醇激酶-1生物活性，使得凝血酶信号转导被 抑制。
35. 权利要求34的方法，其中所述信号转导途径涉及蛋白酶活 化受体-1。
36. 权利要求34的方法，所述方法包括将化合物给予所述受试 者的步骤，其中所述化合物降j氐鞘氨醇激酶-l由鞘氨醇形成鞘氨醇-l- 磷酸的催化活性。
37. 权利要求34的方法，所述方法包括将化合物给予所述细胞的步骤，其中所述化合物降低所述细胞中的鞘氨醇激酶-1的表达。
38. 权利要求37的方法，所述方法包括以下步骤a. 将靶向待降解的鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA导入受 试者细胞中；b. 将(a)中产生的细胞保持在一定条件下，在所述条件下于所述 细胞中发生鞘氨醇激酶-1基因mRNA的siRNA干扰。
39. —种在受试者中预防血栓形成的方法，所述方法包括降低所 述受试者中的鞘氨醇激酶-1生物活性的步骤，使得血栓形成得以预 防。
40. —种在受试者中治疗血栓形成的方法，所述方法包括降低所 述受试者中的鞘氨醇激酶-1生物活性的步骤，使得血栓形成得以治 疗。
全文摘要
本发明涉及鉴别、监测和使用调节鞘氨醇激酶-1生物活性的化合物的方法。
文档编号G01N33/50GK101103123SQ200580046621
公开日2008年1月9日 申请日期2005年11月16日 优先权日2004年11月16日
发明者A·伯纳尔, C·K·德里安 申请人:詹森药业有限公司