专利名称：：基于拉曼检测的流动血细胞计数器的制作方法
技术领域：
：本发明通常涉及流动血细胞计数器，具体涉及使用表面增强拉曼光镨学识别正进行计数的样品的移动式流动血细胞计数器。
背景技术：
：流动血细胞计数器是公知的测量细胞或微粒的某些物理和化学特征的工具，当细胞或微粒在悬浮液中移动并逐一通过感测点时，它通过感测细胞或微粒的某些光学特性来测量细胞或微粒的某些物理和化学特征。流动血细胞计数器广泛用于生物和医学领域。在典型的流动血细胞计数器中，使用鞘液内悬浮微粒的流体动力聚焦获得单列微粒流。接着光束逐一询问微粒。在大多数现代流动血细胞计数器中，光源是以特定波长发射相干光的激光器。各微粒与光束相互作用，通常各微粒产生的散射光和任何发射的荧光被收集。通过分析散射光，可确定例如细胞大小、形状和内部复杂性的物理特征。收集任何发射的荧光使得可通过荧光成分来检测的任何细胞成分或功能能得到查验。传统的流动血细胞计数器只检测弹性散射光(也称为"瑞利散射光")，其中不含关于微粒的原子或分子结构的信息。尽管这种流动血细胞计数器可识别大小和形状，但是它们不能区分大小相同、但存在化学差异的分子或细胞，除非分子或细胞已经加上了荧光标记。原则上，检测非弹性散射光(还称为"拉曼散射光")将能够进行细胞和分子的化学识别，因为各细胞或分子具有基于其化学结构的唯一的拉曼光谱。然而，拉曼散射的截面比瑞利散射的截面低大约15个数量级。这意味着在流动血细胞计数器中获得单个微粒的拉曼光谱远远超出了实用范围，因为缺少适当强的光源且缺少任何适当敏感的检测器。然而，通过称为表面增强拉曼散射的技术可显著增加拉曼截面，该技术中将分子或微粒置于与适当粗糙化的贵金属表面接触或者与贵金属胶态聚集体接触。在正确的条件下，表面增强拉曼散射截面可接近荧光发射的截面。对于流动血细胞计数器来"i兌，为了能够主要基于微粒的化学或分子结构识别单个微粒，需要这样一种装置及方法，该装置及方法可让微粒或细胞在血细胞计数器中处于产生足够大的表面增强拉曼散射截面的状况，使得当各微粒或细胞通过血细胞计数器感测点时可以从各微粒或细胞获得拉曼光谱。这种系统将能够单个地识别所有细胞或微粒，不管它们彼此在大小或形状上如何相似，无需荧光标注。
发明内容本发明涉及使流动血细胞计数器能够主要通过其化学或分子结构来识别单个微粒的方法和装置。在本发明的优选实施例中，当微粒流过流动血细胞计数器中的感测点时，通过获得微粒的拉曼光谱来完成化学识别，所述微粒可以是单独的细胞或分子。微粒与适当的贵金属胶体或胶态聚集体相締合，使得它们的拉曼散射截面被表面增强。接着通过能够产生流体动力聚束液流(focusedflowstream)的流体控制才莫块将微粒设置成单列，并且当微粒流过感测点时，光源照射各微粒。因为拉曼截面被表面增强，所以光源可以是常规的激光器。收集由微粒非弹性散射(拉曼散射)的光并利用适当的色散光学元件和适当的检测器来记录表面增强拉曼光谱。接着可分析表面增强拉曼光谱，以根据分子结构来识别微粒。在本发明的优选实施例中，通过超声波声裂法使细胞微粒与金或银胶粒相締合，与此同时在样本制备容器中包含金或银的胶态悬浮液。以下，参照附图对本发明的上述及其他方面进行更详细的描述。图1是基于拉曼检测的血细胞计数器的示范实施例的截面图。图2是基于拉曼检测的血细胞计数器的示范实施例的示意图。图3是本发明的可拆卸筒的示范实施例的示意图。图4是基于拉曼检测的血细胞计数器的示范实施例的血细胞计数器液流通路的截面图。图5是基于拉曼检测的血细胞计数器的示范实施例的照明和检测光学部件的示意图。具体实施例方式本发明的基于拉曼的血细胞计数器通过将无损、分子专用的拉曼光谱学与流动血细胞计数器的顺序观察单个分子的能力相结合来逐一地对样本内已识别微粒进4亍计数。实现基于拉曼的流动血细胞计数器的一个难点是拉曼散射具有非常低的截面，即在样本上聚焦的光束中只有很小比率的光子被拉曼(非弹性)散射。然而，通过表面增强拉曼散射技术可增加样本的有效拉曼截面，其中各分子与贵金属胶体或胶态聚集体相締合。这种締合可以通过例如贵金属胶态溶液中细胞的声裂法处理来实现。然后，可用流体动力聚焦的血细胞计数技术将制备的分子设置成单列，作为鞘液内的核心液流流动，为通过光源的单独询问作准备。如下面详细描述的，流体动力聚焦要求适当设计的通路中样本和鞘液的精确泵送和控制。强光源(优选激光源)可聚焦在血细胞计数器核心液流中流动的分子上，并且通过拉曼光谱学来收集、检测和分析非弹性散射光。对于分子识别来说，检测系统需要可提供分子的特征拉曼光谱的充分细节的适当的波长选择元件。现在参考附图详细讨论本发明的、具有在单个分子上执行基于拉曼检测的血细胞计数器的元件的示范实施例，在附图中尽量用相同标号表示相同的元件。图1是基于拉曼检测的流动血细胞计数器的示范实施例的截面图，该基于拉曼检测的流动血细胞计数器包括仪器外壳10、可拆卸筒12、加压模块14、控制电子部件16、照明光源18、源偏转光学部件20、源聚焦光学部件22、拉曼散射光收集光学部件24、光色散光学元件26和光检测元件28。图2是示范的、基于拉曼检测的移动式流动血细胞计数器的移动实施例的示意图，该基于拉曼检测的流动血细胞计数器包括下部32、上部30和可拆卸筒12，下部32具有电池34、照明光源18、照明偏转与准直光学模块38、控制电子部件16，上部30包括散射光检测与色散才莫块40、光检测元件28、手加压单元44、第一压力室72a、72b、72c、第二压力室74a、74b、74c、笫一组阀门76a、76b、76c和第二组阀门78a、78b、78c，可拆卸筒12包括样本供应腔管48、流体控制单元50、液流52、拉曼室61和废料容器54。可拆卸筒12基本上可用允许大规模制造或一次性使用的材料制成，例如模制塑料。图3是本发明可拆卸筒12的示范实施例的示意图，其中流体控制单元50包括超声源55、样本调节容器56、样本存储容器58、鞘液容器60、流量传感器62a、62b、62c、流体动力聚焦才莫块64、其中鞘液51环绕核心液流51的'液流通路52。样本可以脱机制备或者在才羊本调节容器56中制备。正如在例如Kneipp等人的标题为"采用金纳米微粒的单活细胞中的拉曼光谱术"("Surface-EnhancedRamanSpectroscopyinSingleLivingCellsUsingGoldNanoparticles",AppliedSpectroscopy,Volume56,number2,2002,pp.150-154)的文章中详细描逸的，增强分子的拉曼截面的样本制备技术的示例包括通过液相摄取(fluid-phaseuptake)或声裂法装载具有胶态金的细胞，该文章的内容通过引用而结合于本文。正如在例如Lendl等人的标题为"采用可交换微珠作为SERS活性的表面的基于流动分冲斤的表面增强4立曼光i普术"("FlowAnalysis-basedSurface-EnhancedRamanSpectroscopyEmployingExchangeableMicrobeadsasSERS-activeSurface",Appliedspectroscopy,Volume54,number7,2000,pp.1012-1018)的文章中所描述的，通过使分子附着在充满贵金属(铜、金、银、铀、钯和铱)胶体的微珠上，分子也可具有增强的拉曼截面，该文章的内容通过引用而结合于本文。正如在例如Kneip等人的标题为"使用表面增强拉曼光谦散射(SERS)的单分子才全测"("SingleMoleculeDetectionUsingSurfaceEnhanced-RamanScattering(SERS)",PhysicalReviewLetters,Volume78,number9,1997,pp.1667-1670)的文章中详细描述的，贵金属胶体还可制成聚合为适合于单个分子附着的簇，该文章的内容通过引用而结合于本文。还可使分子附着到充满和涂有贵金属胶体的微结构上，例如脂质体。分子本身也可涂以贵金属胶体。使细胞微粒与贵金属胶粒相締合的其他可能的方法包括(但不限于)将金属胶体手工注入单个细胞，并且将金属胶粒作为轰击粒子来处理以及将它们发射进细胞微粒中。在一优选实施例中，为了用于单个细胞的基于拉曼的血细胞计数法，样本调节容器56与超声源55相邻，该超声源该可由电子控制部件16来控制。样本调节容器56包括含有60nm的金纳米微粒的聚合簇的细胞支持、緩冲溶液。样本细胞一旦送入了緩冲溶液，超声波的短脉冲就会击穿细胞膜，使金胶体被细胞吸收。超声波一经停止，细胞膜通常在几秒内自退火。接着将制备的样本流体从样本调节容器56送进样本存储容器58。而后将样本流体送进流体动力聚焦才莫块64,它可以是设计成实施流体动力聚焦的射流液路，正如在例如2003年7月22日授予Cabuz等人的标题为"移动式流动血细胞计数术"("PortableFlowCytometery")的美国专利6,597，438中详细描述的，该专利的内容通过引用而结合于本文。流体动力聚焦使样本的分子落入液流通路52而形成一个被鞘液51包围的单列较长的核心液流53。鞘液51的速度最好约为核心液流53的速度的9倍。另外，鞘液51和核心液流53的速度保持得足够低以维持液流通路52中的层流。在优选实施例中，所需的鞘液和样本流体的速度由手工加压单元44通过压力室46b和46c连4妄到流体容器58和60以及流体流量传感器62b和62c来共同设置，所有这些借助于控制电子部件16在闭合的反馈回路中运作。手工加压单元44可以是例如带有单向阀的手动柱塞或球状物。在任一种情形中，最好将手工产生的压力供给第一压力室72a、72b和72c。接着设置了第一阀门76a、76b和76c,用以将第一室72a、72b和72c中的压力可控地向第二压力室74a、74b和74c释放。可在第二压力室74a、74b和74c中设置第二阀门78a、78b和78c，用以可控地在笫二压力室74a、74b和74c中排放压力。当相应的下游液流中的流体流动降到低于第一预定值时，通常包括可编程微处理器的控制电子部件16打开第一阀门76a、76b和76c,而当下游流体中的流体流动增加超过第二预定值时，控制电子部件16打开第二排气阀门78a、78b和78c。各阀门最好是静电控制微型阀门阵列，可单独寻址并可控。流体流量传感器62a、62b和62c最好是热风速计类型的流量传感器。包含设置成单列、并被鞘液51包围的样本微粒的流体动力会聚核心液流53流过液流通路52而进入拉曼室61。图4是基于拉曼检测的血细胞计数器的示范实施例的血细胞计数器液流通路的截面图，其中包括液流52、上部玻璃基板56和下部玻璃基板54、照明微透镜58、；险测微透镜60、源通过滤光片64和源吸收滤光片66、含有样本微津立的会聚核心液流53。图5是基于拉曼检测的血细胞计数器的示范实施例的照明和检测光学部件的示意图，其中包括照明光源18、源聚焦光学部件22、含有样本微粒68的会聚核心液流53、拉曼散射光聚光光学部件24、光色散光学元件26和光检测元件28。在一优选实施例中，拉曼室61包含玻璃基板56和54、液流通路52、微透镜58和60、源通过滤光片62、源吸收滤光片64和66。光源18发射的光通过射束偏振和准直光学部件38，作为准直光束射到微透镜58上。微透镜58使光聚焦穿过源通过滤光片62到达核心液流53中的微粒上。自核心液流42中的微粒被非弹性(拉曼)散射的光通过源吸收滤光片56并且通过微透镜60及偏转与鉴别光学部件40射向检测器28。光源18可以是具有适合于拉曼光语学的波长、功率和偏振的激光器或激光器阵列。现有技术的光源包括氩离子泵浦的掺钛蓝宝石激光器，它工作于830nm,提供200mW的功率，向下聚焦到样本上达到约2x105W/cm2。其他适当的光源包括工作于1064nm的掺钕的钇铝石榴石激光器和工作于632.8nm的氦氖激光器。垂直腔表面发射激光器(VCSEL)特别适合于移动式实现方式。VCSEL可工作于850nm至670nm范围的波长。10x10微米发射表面VCSEL通常具有大约lmW的功率，当聚焦到大约10微米的高斯光斑时产生大约1x1(^W/cm"的功率密度。任何适当的固态激光器均可用作光源18。光源18还可以是单光源，例如固态激光器和二极管激光器，它被可移动地连接到一个或多个步进电机，使得光源的側向位置或距核心液流53的距离或者这两者可被调节以取得最佳散射。这种可移动光源的焦距和/或侧向位移相对于核心液流53的调节可包括基于被核心液流53和鞘液51之间的折射率差异反射的光的反々贵环路。此调节反馈环路也可通过例如由跟踪或校准微珠反射或散射的光实现，所述樣O朱在核心液流中由所关注的分子点缀。偏转与鉴别光学部件40和检测器28可以是例如由MA州Bilerica市的BrukerOptics公司提供的、具有电荷耦合器件检测器(CCD)的Sentinal拉曼光谱仪。检测器28还可以是任何其他低噪声、高量子效率的多通道检测器或CCD阵列。偏转与鉴别光学模块还可包括滤光片、声光可调谐滤光片(AOTF)、光栅、衍射光学部件和全息光学部件的任何适当组合。在一优选实施例中，偏转与鉴别光学模块是适当的全息衍射光栅，它将波长选择与将收集的拉曼散射光在检测器28上聚焦相结合。源通过滤光片62是只将源波长带通过滤的涂层，从而消除了在液流通路之前收集拉曼散射光，可使用任何适当的公知的多层或全息带通滤光片。源吸收滤光片64和66是抑制源波长的涂层，从而消除了在液流通路之后的拉曼散射，可使用任何适当的公知的多层或全息带通滤光片。一旦核心液流53和环绕的鞘液51通过了拉曼室61，它们就会被排入废料容器54。尽管已经以专用于结构特征和/或方法动作的语言描述了本发明，但是将会理解，在所附的权利要求书中界定的发明不必限于所述的特定特征或动作。相反，这些特定特征和动作以实现所要求保护的发明的示范性方式公开。权利要求1.一种用于识别分子的装置，包括能够产生含有分子的流体动力聚束的液流的流体控制模块；能够照射所述分子的光源；以及能够检测自所述分子非弹性散射的光的检测器。2.如权利要求1所述的装置，其中，所述分子与金属胶体相締合。3.如权利要求1所述的装置，还包括能分析所述检测光以识别所述分子的分析模块。4.如权利要求1所述的装置，还包括能将所述金属胶体结合进所述分子的超声破碎器。5.如权利要求l所述的装置，还包括仪器外壳，其中所述流体控制冲莫块还包括可以从所述仪器外壳拆卸的筒，且其中所述流体动力聚束液流出现在所述可拆卸筒上。6.如权利要求l所述的装置，其中，所述光源是固态激光器。7.如权利要求6所述的装置，其中，所述固态激光器是在所述分子上聚焦的红光垂直腔表面发射激光器(VCSEL)，从而提供所述非弹性散射光线。8.如权利要求l所述的装置，其中，所述检测器还包括声光可调谐滤光器(AOTF)。9.如权利要求1所述的装置，其中，所述分析才莫块还包含数据库，所述数据库包含典型分子的表面增强拉曼光谱(SERS)。10.—种识别分子的方法，包括下列步骤将所述分子置于流体动力聚束液流中；用预定波长的光照射所述分子；以及检测来自所述分子的非弹性散射光。11.如权利要求IO所述的方法，还包括使金属与所述分子相締合的締合步骤。12.如权利要求IO所述的方法，其中，还包括分析所述检测的非弹性散射光来识别所述分子的步骤。13.如权利要求IO所述的方法，其中，所述照射步骤发生在所述分子处于所述流体动力聚束流中时。14.如权利要求11所述的方法，其中，所述締合步骤还包括通过液相摄取和声裂法的其中一项或多项将所述金属以胶质形式结合进所述分子。15.如权利要求14所述的方法，其中，所述金属胶体选自铜、金、4艮、鉑、4巴和铱。16.如权利要求11所述的方法，其中，所述締合步骤还包括将所述分子附着到下列的一个或多个上金属胶态聚集体、金属胶体涂敷的珠、金属胶体填充的脂质体以及金属胶体灌注的珠。17.如权利要求IO所述的方法，其中，还包括下列步骤设置仪器外壳；以及设置可从所述仪器外壳拆卸的筒，且其中所述流体动力聚束液流出现在所述可拆卸筒上。18.如权利要求IO所述的方法，其中，所述照射步骤利用激光器。19.如权利要求10所述的方法，其中，所述激光器是红光垂直腔表面发射激光器(VCSEL)。20.如权利要求10所述的方法，其中，所述检测步骤利用从棱镜、衍射光栅、薄膜滤光片、吸收滤光片和声光可调谐滤光器(AOTF)或其组合选择的波长鉴别装置。21.22.如权利要求12所述的方法，其中，所述分析步骤包括使用数据库，所述数据库包含典型分子的表面增强拉曼光谱(SERS)。全文摘要一种用于在微粒、细胞或分子流过流动血细胞计数器中的感测点时，通过获得微粒、细胞或分子的拉曼光谱来进行各微粒、细胞或分子的化学识别的方法和系统。可为细胞或分子的微粒与适当的贵金属胶体或胶态聚集体相缔合。通过超声波声裂法，细胞微粒可与金或银胶粒相缔合，同时在样本制备容器中包含金或银胶态悬浮液。接着通过流体控制模块将胶态缔合的微粒流体动力聚束成单列。通过在微粒流过感测点时用激光器照射微粒并收集被微粒非弹性散射(拉曼散射)的光，获得各个微粒的表面增强拉曼光谱。然后，分析表面增强拉曼光谱以识别微粒。文档编号G01N21/65GK101103263SQ200580046623公开日2008年1月9日申请日期2005年11月16日优先权日2004年11月17日发明者A·帕马纳布汉,B·S·弗里茨,C·卡布斯申请人:霍尼韦尔国际公司