先兆子痫的诊断的制作方法

专利名称：先兆子痫的诊断的制作方法
先兆子痫的诊断相关申请参考本申请要求2004年12月21日提交并且名称为"鉴定、诊断和跟 踪患先兆子痫女性的方法和试验"的美国临时申请No. 60/637,948的权 益。所参考申请的全部教导在此引入作为参考。
背景技术：
先兆子痫是高达6~8%妊娠并发的高血压病症并且一直是母亲和围 产期发病和死亡的首要因素(1,2)。但是，尽管进行了广泛的研究，这 种多系统病症的病因学仍然未被完全了解。血管内皮活化随后血管痉挛 似乎是先兆子痫发病机理的中心特征。其原因的理论包括胎盘的异常植 入和发育、氧化应激、受损的内皮前列腺素类和一氧化氮稳态平衡、遗 传多态性、异常的循环型自身抗体以及异常的母亲全身性炎症反应(3，4，5, 6， 7)。最近，更多关注于血管发生调节剂表达水平变化的影响，其能引 起先兆子痫的症状，包括高血压、蛋白尿、内皮细胞活化和血小板聚集增 加(8， 9,10， 11， 12 )。具体而言，近来的研究已报导了临床先兆子痫患者的血管内皮生长因 子(VEGF )、胎盘生长因子(P1GF)和可溶性fms-样酪氨酸激酶-l (sFlt-l) 的母体血清浓度变化(13， 14， 15 )。 VEGF和P1GF是涉及胎盘发育的生长 因子，并且都有助于促有丝分裂活性和血管发生，这对发育中胎儿至关重 要。sFlt-l是Flt-l受体的剪接变体。它缺少F1M的细胞质和跨膜结构域， Flt-l是结合VEGF和P1GF并激活它们信号通路的受体。血清sFlt-l增加 在临床可识别的先兆子痫发生之前约5周出现，并且早在首三个月，游离 P1GF降低是显著的(13,15,16)。相比较，VEGF血清浓度在患有临床先 兆子痫女性的整个妊娠期间较低(15)。这些血管发生因子还似乎在调节人肾小球血管生理中重要。向妊娠 啮齿动物施用的外源性sFlt-l导致高血压、蛋白尿和肾小球内皮增生(endotheliosis ) (17 )。相似地，中和VEGF (肾小球血管内皮的关键丝 裂原存活因子)导致凋亡增加、肾小球毛细血管修复受损以及重度蛋白尿(18)。在重度先兆子痫中，肾小球内皮增生是该病症的常见特征，其进一 步支持高血压病症患者中血管发生因子变化和一般性肾功能之间的联系(19, 20， 21, 22， 23 )。目前，没有专门试验来预测或诊断先兆子痫或来预知该病症在特定 患者中将发生的严重性。早期症状包括持久性头痛、视力或对光敏感性 受损以及腹痛。然而，直到典型地在妊娠第20周之后进行的常规内科 检验中显示出血压升高和尿中蛋白质(蛋白尿)，通常不进行先兆子痫 诊断(l)。先兆子痫的严重影响(包括发作、脑出血、弥散性血管内凝 血和肾衰竭)可能在这种诊断后非常短时间内出现。这些方法是不精确 的并且很少提供对发生最严重症状的可能性的深入了解。而且，当前的 诊断需要医师仔细检查和侵入性方法，这进一步拖延了早期和立即评估 并使之复杂化。需要早期、准确地检测和诊断先兆子痫和相关蛋白尿高 血压病症的方法。发明内容本发明涉及确定或辅助确定妊娠女性处于发生先兆子痫或其它高 血压病症的风险中的方法。在某些实施方案中，本发明涉及确定或辅助 确定妊娠女性具有先兆子痫的方法。在进一步实施方案中，本发明涉及 筛选或预筛选妊娠女性以识别具有低风险发生高血压病症的那些妊娠 女性的方法，这降低在妊娠期间对额外检查的需要。申请人假定先兆子痫相关的母亲肾的功能和形态学紊乱指示尿中 sFlt-l、 VEGF和P1GF水平的改变可以聚类高血压病症并J^Ut常血压的 M对照中区分患重度先兆子痫的妊娠女性。虽然几篇近期公开文章报道 循环中sFlt-l水平增加以及血清P1GF和VEGF水平降低可预测先兆子痫 的发作，但是之前还没有'^研究这些血管发生因子的尿排泄，也没有在 疾病严重程度的情形中分析这样的排泄水平的具体作用。本发明提供监测 和使用來洋中sFlt-l、 VEGF和P1GF水平作为高血压病症包括先兆子痫的 诊断指标。而且，本发明提供非侵入式方法区分重度先兆子痫与其它高血 压病症。所开发的方法和试验筒单、廉价并且可在早至妊娠首三个月使用， 因此增加了早期检测和治疗的可能性。而且，虽然本发明参考M女性描 述，本文所述方法还可用于评价非妊娠女性在妊娠期间发生高血压病症的 风险。在一个实施方案中，通过测量从试验对象所得尿样中的sFlt-l浓度 并将该浓度与适当的标准比较，本发明提供诊断或辅助诊断妊娠女性具 有或倾向于发生高血压病症的方法。例如，该标准可以是从妊娠正常的 妊娠女性或从具有证实的高血压病症包括先兆子痫的妊娠女性所得尿中的sF1M浓度。这样的对象被称为参照对象。从参照对象获得参照样品， 获得参照样品时参照对象所处妊娠周对应于获取试验样品时试验对象所 处M周。可以在从试验对象获取尿样的同时获取并分析参照样品。作为 替代，可以使用已建立的标准(预先建立的标准或评价试验对象中所得尿 样后形成的标准)。与正常M女性尿中的sFlt-l浓度相比，所评^fH^女 性(试i^对象)尿中sFlt-l浓度增加指示该女性出现先兆子痫或其它高血 压病症的风险增加。sFlt-l浓度增加到超过9.5 pg每亳克尿肌酸酐指示该 妊娠女性发生轻度先兆子痫的风险增加，而sFlt-l浓度增加到超过40 pg 每毫克尿肌酸酐指示该妊娠女性发生重度先兆子痫的风险增加。在另一个实施方案中，本发明提供了通过测量从妊娠女性中所得尿 样中的P1GF和sFlt-l浓度并将所得值进一步分析而评价或辅助评价妊娠 女性将发生高血压病症的可能性的方法。在一个实施方案中，使用公式 分析该值并计算所称谓的女性uFP,其等于log [sFlt-l/PlGFx100。该 分析的结果指示所评价的妊娠女性是否处于发生高血压病症的风险。例 如，uFP超过1.4是风险增加的先兆指标，妊娠女性将需要治疗以防止 发生或恶化高血压病症相关症状。作为进一步实例，uFP超过2.1在区 分患重度先兆子痫的妊娠女性和正常血压对照中具有88.2%灵敏度和 100%特异性。与目前可用的方法(通过试条试验和测量总蛋白质浓度 评价蛋白尿)相比，本方法提供显著更准确的对妊娠女性重度先兆子痫 的诊断。在本发明的另一个方面，所述uFP值被用作发生先兆子痫的特 异性并发症风险的诊断指标，包括经剖腹产分娩、血清尿酸增加、收缩 压和舒张压增加、试条蛋白尿、孕次(gravidity )、分娩时胎儿体重、 胎盘早剥、宫内发育迟緩(IUGR)溶血、血小板减少、肝脏酶升高和 HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、低血小板计数)。上述方法中，可在禁食或非禁食状态下得到尿样。可以采用免疫学 分析如ELISA检测血管发生因子。本文7>开方法的一些方面中，妊娠 女性可诊断为具有以下任何的高血压病症或者发生任何这些病症的风 险增加先兆子痫、子痫、轻度先兆子痫、慢性高血压、EPH妊娠中 毒、妊娠高血压、并发先兆子痫(包括在慢性高血压、慢性肾病或狼疮 基础上发生的先兆子痫)、HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板
计数低)或肾病。虽然本发明参考妊娠女性(人)进行描述，但是其还 可以用于诊断和/或评价在非人类雌性中发生高血压病症的风险。在另一个实施方案中，本发明是用于确定妊娠女性是否具有发生高 血压病症比如先兆子痫风险的诊断试剂盒。所述试剂盒可包括接受尿样 的接受器，可检测样品中血管发生因子的工具(例如试剂)，以及基于 所得值评价发生高血压病症风险的指导。在一个具体实施方案中，所述试剂盒包括试剂比如抗体，其用于检测血管发生因子比如P1GF和 sFlt-l，用于确定妊娠女性是否有发生先兆子痫的风险以及用于评价女性 发生先兆子痫风险的指导，其可以包括参照或标准。在一个具体实施方 案中，所述试剂盒包括至少一种检测P1GF的抗体和至少一种检测sFlt-l 的抗体。除非另外指出，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域 一般技术人员普遍理解的意义相同。虽然与本文描述方法和材料相似或 相等的那些可用于实施或检验本发明，但是适当的方法和材料描述于 下。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过参考并入 本文。材料、方法和实施例仅仅是示例性的，而不具有限制含义。从以下详细说明和权利要求，本发明的其它特征将是显而易见的。


本专利的文件包含至少一个彩色附图。经要求并付必要费用后，将 由专利商标局提供带有彩图的本专利副本。图1显示加入本研究的患高血压病症的妊娠女性和对照的母亲特 征、胎儿特征和临床表现。通过单因素ANOVA (卞)、Kruskal-Wallis ANOVA ($)、卡方(，)分析数据。图2显示患不同高血压病症的妊娠女性的临床实验室特征。通过 Maim-Whitney检验(§ )、 Student t國检验(￥)分析数据。图3显示随机小便中测量的血管发生因子浓度。通过Kruskal-Wallis ANOVA ($)分析数据并且值用每毫克肌酸酐表示(mgc)。图4A-4D显示不采用本文描述的稳定化处理，sFlt-l和VEGF随时 间的多肽降解。
图5A-5B显示(A ) sFlt-l和(B) P1GF的代表性ELISA试验结果。图5C-5D显示(C )用于从ELISA数据中计算uFP的代表性展开 表和(D)与对照(CRL)相比患重度先兆子痫(sPE)的患者的平均 (+SD) uFP。图6显示每个试验组和对照组中可溶性fms-样酪氨酸激酶-l ( sFlt-l) 与游离胎盘生长因子(P1GF)之比率的散点图。NP-CTR:非妊娠对照； P-CTR:妊娠对照；p-HTN:不满足重度先兆子痫标准的高血压/蛋白 尿女性；sPE:重度先兆子痫。图7显示接受者工作曲线(receiver operating curve, ROC )分斗斤， 证明uFP (log [aFlt-l/PlGFx100)区分正常血压对照与患重度先兆子 痫女性的能力。图8显示尿酸对比uFP数据的散点图；r:回归线；PI:预测区间 (群体置信区间)。73%尿酸数据可用于分析。sFlt-l:可溶性fms-样酪 氨酸激酶-l; P1GF:胎盘生长因子。图9显示尿血管发生因子、白蛋白、肌酸酐的血清和尿浓度，以及 在随机小便中测量的总蛋白质比肌酸酐比率。对正态分布数据(卞)，结 果报告为平均值土SEM，或者对偏斜数据($)报告为中值和范围。图10A-10B显示(A)研究组的血清VEGF浓度以及它们的显著性 水平，和(B)研究组的尿VEGF浓度以及它们的显著性水平。NP-CTR: 非妊娠对照；P-CTR:妊娠对照；mPE:轻度先兆子痫；sPE:重度先 兆子痫。数据表示为平均值和SEM。图11A-11B显示(A)研究组的血清sFlt-l浓度以及它们的显著性 水平，和(B)研究组的尿sFlt-l浓度以及它们的显著性水平。NP-CTR: 非妊娠对照；P-CTR:妊娠对照；mPE:轻度先兆子痫；sPE:重度先 兆子痫。数据表示为平均值和SEM。图12A-12B显示(A)研究组的血清P1GF浓度以及它们的显著性 水平，和(B)研究组的尿P1GF浓度以及它们的显著性水平。NP-CTR: 非妊娠对照；P-CTR:妊娠对照；mPE:轻度先兆子痫；sPE:重度先 兆子痫。数据表示为平均值和SEM。 图13显示源于患高血压病症的妊娠女性和对照对象的血管发生标 志物以对数形式的排泄分数。
具体实施方式
先兆子痫发生在妊娠后半期并且与重要的母亲和胎儿发病和死亡 有关。目前，没有有效的筛选试验来诊断或评价发生这种疾病和相关高 血压病症的风险。结果是妊娠女性直到发生该病症相关并发症(包括血压升高和蛋白尿)后很久才接受有效的监测或治疗。此外，由于在妊娠 早期阶段护理人员没有可排除妊娠女性具有风险的有效手段，因此很少 或没有发生这些病症之风险的妊娠女性必须在她们整个妊娠期间经受 不必要的症状检验。如本文所述，申请人假设由于先兆子痫持续伴随母体肾脏的功能和 形态学紊乱，因此患先兆子痫的妊娠女性的尿中血管发生因子水平被改 变，并将提供更有效和更少侵入性的筛选方法以鉴定或辅助鉴定患高血 压病症包括先兆子痫的妊娠女性。本文所用的"先兆子痫"根据公认的标准定义为在每个体间隔4到 6小时有两次，血压至少140/卯mmHg并且在24小时尿蛋白质排泄中 尿中排泄至少0.3 g蛋白质(或试条试验中至少+l或更大)。本文所用 的"重度先兆子痫"也根据公认标准定义为间隔6小时至少两次血压至 少160/110 mmHg并且在24小时尿蛋白排泄中大于5克蛋白质或在试 条试验上持续+3蛋白尿。重度先兆子痫可包括HELLP综合征(溶血、 肝脏酶升高、血小板计数低)。重度先兆子痫的其它要素可包括根据美 国人口统计小于10%百分比中的宫内发育迟緩(IUGR)，持续性神经 症状(头痛、视觉障碍)、上腹痛、少尿(少于500mL/24h)、血清肌酸 酐大于1.0mg/dL、肝脏酶升高(大于正常两倍)、血小板减少(<100,000 个细胞尔L )。本文描述的是与以下相关的方法和组合物，检测和/或监测妊娠女性尿样中血管发生因子尤其是VEGF、 P1GF和sFlt-l的水平，以及这种 水平与在妊娠女性妊娠过程中特定点处妊娠女性将发生高血压病症比如先兆子痫的可能性之间的关系。"妊娠过程"指很多妊娠阶段或时期， 包括贯穿每个三月期以及从一个三月期向下一个三月期过渡期间的妊 娠。"妊娠过程"包括正常妊娠和发生高血压病症的妊娠的妊娠期。"正 常妊娠"指没有并发症并且该女性不发生高血压病症的妊娠。在公开的方法中，妊娠女性可诊断为具有任何以下高血压病症或者发生任何这些病症的风险增加先兆子痫、子痫、轻度先兆子痫、慢性 高血压、EPH妊娠中毒、妊娠高血压、并发先兆子痫(包括慢性高血 压、慢性肾病或狼疮基础上发生的先兆子痫)、HELLP综合征(溶血、 肝脏酶升高、血小板计数低)或肾病。虽然本发明参考妊娠女性进行描 述，但是本文描述的方法还可以用于评价非妊娠女性在妊娠期间发生高 血压病症的风险。本文描述的方法和组合物能通过检测和/或监测妊娠女性尿样中血 管发生标志物水平来实现评价和/或监测妊娠女性发生高血压病症的风 险。如本文所述，这可通过在妊娠期间不同阶段获取尿样并分析其血管 发生因子水平来实施。所得值还可与已知标准相比较。本文所用的"适 当标准，，指从参照对象中所得尿中血管发生标志物的水平。可从正常妊 娠的妊娠女性尿样或从证实患有高血压病症比如先兆子痫的妊娠女性 尿样中确定适当的标准浓度(参照对象)。形成适当标准基础的样品来 自参照对象，当获取样品时，所述参照对象的妊娠周与获取试验样品时 试验对象所处妊娠周相对应。可以在从试验对象获取尿样的同时获取并 分析参照样品。作为替代，采用统计学研究和常规试验可前瞻性或回顾 性确定标准表达水平以评价试验对象尿样。本领域一般技术人员采用公 知方法可确定标准表达水平。可经本发明方法评价的尿样包含足够水平的感兴趣血管发生因子 用于经本文所述评价技术来检测。具体而言，尿样必须具有可检测水平 的任一种VEGF、 PlGF和sFlt-l，所用评价技术适用于此。如果当分析 时样品中含有可检测水平的感兴趣血管发生标志物，可在收集后立即或 晚些时间分析尿样。例如可在-70'C冷冻尿样和/或在用稳定或保存感兴趣 血管发生标志物的试剂预处理的容器中混合、合并或保存。在一个优选实 施方案中，从早晨第一次小便中收集尿样。本文所用的术语"血管发生标志物"指一种或多种分子比如VEGF、 P1GF和sFlt-l,其可单独或组合使用于检测或辅助检测发生高血压病症 的风险；监测高血压病症相关的妊娠并发症进程；和/或监测治疗高血 压病症相关的妊娠并发症的有效性。
本文所用的术语"多肽"指不限定具体长度的氨基酸聚合物。因此， 肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义内。可通过检测已转录分子表达或其相应蛋白质的多种公知方法的任 何一种评价可用于本发明方法的血管发生标志物水平。这种方法的非限 定性实例包括检测分泌蛋白的免疫学法、蛋白质纯化法、蛋白质功能或 活性分析、核酸杂交方法、核酸逆转录法和核酸扩增法。在一个实施方案中，采用ELISA分析评价血管发生标志物水平。在某些实施方案中，本发明包括在测量血管发生标志物水平之前采 用 一种或多种稳定剂处理妊娠女性的尿样和/或采用 一种或多种稳定剂 预处理用于收集这种尿样的容器。术语"稳定剂"指一种或多种能用于 防止血管发生标志物降解的分子比如多肽或核酸。在一个实施方案中， 稳定剂是蛋白酶抑制剂，包括任何以下物质4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(AEBSF)和PefablocSC、抗蛋白酶(Antipain)和抗蛋白酶二盐酸盐、 抑酶肽(Aprotinin )、苯甲脒(Benzamidine)和盐酸苯曱脒、苯丁抑制素(Bestatin)、抑糜酶素(Chymostatin )、 E-64(L-反式-环氧琥珀酰-亮氨 酰胺-(4-胍基)-丁烷或N-N-(L-反式-羧基环氧乙烷-2-n)-L-亮氨酰-精胺(N—[N-(L—trans—carboxyoxiran國2國carbonul)-L-leucyl-agmatine )、 。二^ 四乙酸及其钠盐(EDTA-Na2)、亮抑酶肽(Leupeptin )、乙基马来跣亚胺、 胃酶抑素(P印statin)和胃酶抑素A、膦酰二肽(phosphoramidon )、叠 氮化钠、胰蛋白酶抑制剂或s-氨基己酸。申请人已证明患有高血压病症的妊娠女性尿中sFlt-l显著增加并且 尿P1GF显著降低。本发明特征在于测量尿样中P1GF和sFlt-l浓度 并运用这些对立生长因子的比率来从具有其它形式高血压病症包括伴 随或不伴随慢性高血压的轻度先兆子痫的妊娠女性以及正常血压对照 中区分出具有重度先兆子痫的妊娠女性。本发明的方法还可用于评价妊 娠女性发生特定高血压病症并发症包括先兆子痫的风险。这样的并发症 可包括剖腹产分娩、血清尿酸增加、收缩压和舒张压增加、试条蛋白尿、 孕次(gravidity )、分娩时胎儿体重、胎盘剥离、IUGR、溶血、血小板 减少、肝脏酶升高和HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板计数 低)。在某些实施方案中，可使用公式分析血管发生标志物的浓度或水平 的测定结果。所得值提供有关妊娠女性将发生高血压病症比如先兆子痫 可能性的信息。本文所用的术语"公式"指任何数学表达式、运算法则 或其它量度，其可用于评价感兴趣的血管发生标志物水平是否指示妊娠 女性具有高血压病症和/或高血压病症的特定并发症或者有发生这些疾 病的风险。在一个实施方案中，使用公式计算妊娠女性的uFP。对于本发明的 目的，术语"uFP"指log [sFlt-l/PlFG x100。在本发明的一个方面， uFP超过1.4是风险增加的先兆指标，妊娠女性将需要治疗以防止发生 或恶化高血压病症相关症状。在本发明的另一个方面，uFP超过2.1指 示妊娠女性具有重度先兆子痫或处于发生重度先兆子痫的风险。在本发 明的又一方面，uFP超过2.1指示妊娠女性有剖腹产分娩的风险。在一些实施方案中，本发明提供涉及本发明方法和/或组合物的试剂 盒。试剂可以是标记化合物或能检测对应尿样中本发明血管发生标志物 的多肽以及用于检测多肽量的工具(例如结合该多肽的抗体)。用于和可用于本发明方法中血管发生标志物相对应多肽相结合的适当试剂包 括抗体、抗体衍生物、抗体片段等。对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可包括，例如(1)第一抗体(例如，附着于固体支持物)，其结合对应 本发明血管发生标志物的多肽；和，任选地，(2)第二种不同抗体，其 或与所述多肽相结合或与第一抗体相结合并且与可检测标记相偶联。釆用适当的样品来比较待测样品中所得结果。所述试剂盒还可以包含其它的成分比如緩冲剂、防腐剂或蛋白质稳 定剂。试剂盒还可以进一步包含检测可检测标记必需的成分(例如酶或 底物)。试剂盒的每个成分可被包封于单独容器内并且所有各种容器可包 含在单个包装中，还附带说明书来解释采用试剂盒进行分析的结果。可 采用稳定剂预处理所述容器和/或稳定剂可以是试剂盒的成分。本发明还涉及评价患重度先兆子痫的女性中是否发生肾小球损伤 可以解释尿样中血管发生标志物的释放增加。最近报道的研究支持这样 的观点胎盘形成缺陷导致胎盘缺血随后全身性释放损伤母亲血管内皮 的细胞毒性产物。申请人假定血管发生中的这种紊乱还间接作用于母亲 的全身脉管系统，包括肾脏中(19,20, 21, 22,23)。由于肾小球内皮增
生是先兆子痫的常见形态学损害，申请人关注尿样中血管发生标志物的 水平增加是否因为由于肾小球损伤而导致这些标志物在尿中的分泌增 加，或者尿排泄增加是否反映了胎盘或全身性血管合成的增加。申请人 发现血清中血管发生因子水平不是一贯地与尿中该因子水平相关联。他们还发现患有重度先兆子痫的女性在临床明显的疾病时VEGF和sFlt-l 的排泄分数增加，无论由蛋白尿程度所反映的肾小球完整性是否丧失。本文所用的不定冠词和定冠词指至少一个该冠词的语法对象。本文所用的术语"包括"意思是指短语"包括但不限于"，并且可 与"包括但不限于"互换使用。本文所用的术语"比如"意思是指短语"比如但不限于"，并且可 与"比如但不限于"互换使用。虽然所提供的详细描述参考VEGF、 PlGF和sFlt-l，本领域净支术人 员将清楚知道本描述还可应用于每种生长因子的家族成员、类似物、天 然存在的等位基因变体、异构体、前体和/或变体。除非另外指出，本发明的实施将运用在本领域技术范围内的细胞生 物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学常规技 术。这些技术被描述于文献中。实施例在此一般性描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发 明，包括这些实施例仅仅是为了举例说明本发明某些方面的目的，而不 是意图限制本发明。实施例1患高血压病症的妊娠女性中sFlt-l水平增加和P1GF水平降低 #与者釆用2004年2月到8月之间Yale New Haven医院接纳的68名女性 的尿洋。在耶鲁大学人类调查委员会(Human Investigation Committee of Yale University)批准的规则下收集样品。从所有参与者那里得到书面知 情同意书。基于月经日期和/或，20周之前的超声检查确认胎龄。所有
请求加入研究的女性同意参加。申请人要求从允许进入产房以及分娩前高低风险病房(the antepartum High and Low Risk Units )的妊娠女性中招 收并预期招收到患者。所招收患者都没有被排除在最后分析之外。测试以下组的女性重度先兆子痫(sPE, n=17)、不满足重度先兆 子痫标准与妊娠相关的高血压/蛋白尿病症(pHTN， n=21)、健康妊娠 对照(P-CTR， n=16)、和健康非妊娠育龄期女性(NP-CTR, n=14 )。 本文所用的"先兆子痫"根据公认标准定义为在每个体间隔4到6小时 有两次，舒张血压至少140/卯mmHg并且在24小时尿蛋白质排泄中尿 中排泄至少0.3 g蛋白质(或试条试验中蛋白尿至少+1 )。本文所用的"重 度先兆子痫(sPE)"被定义为HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血 小板计数低)，在6小时间隔中至少2次血压>160/110 mmHg、在24小 时尿蛋白排泄中蛋白质>5克、或在试条试验上持续+3蛋白尿。该定义 的其它要素包括根据美国人口统计小于10%百分比中的宫内发育迟緩 (IUGR)，持续性神经症状(头痛、视觉障碍)、上腹痛、少尿(少于 500 mL/24h)、血清肌酸酐>1.0 mg/dL、肝脏酶升高(大于正常两倍)、 血小板减少(〈100，000个细胞/nL)。"慢性高血压(crHTN)"指妊娠前 或妊娠20周之前血压持续升高>140/90 mmHg。"蛋白尿"被定义为24 小时尿收集物中蛋白质^OOmg。为了评价胎盘高血压病症的组织学变 化，申请人咨询了不了解本研究结果的临床病理学家产生的病理学报 告。38名高血压患者的病理学报告中有29名可以使用，并且对以下内 容进行摘要真皮炎的存在性、体积>3"的梗塞、与先兆子痫一致的病 理学变化的征兆(蜕膜血管没有滋养层浸润或生理性转化的征兆)、和/ 或剥离的征兆(含铁血黄素沉积和/或绒毛间血栓)。68名参加研究的患者中，17名满足sPE标准。在加入时，申请人 仅仅了解女性是否高血压或该女性是否达到sPE标准。由于不能预见高 血压状态的性质，pHTN(n-21)组是不一致的，由具有crHTN(n=10)、 轻度先兆子痫(n=9)或高血压蛋白尿肾病(n=2,狼疮和肾病综合征) 在先病史的女性组成。与sPE女性相比较，pHTN组年龄显著较大(Student-Newman-Keuls， p=0.021)(图1 )。取样时各组之间的胎龄(GA)没有 差异。相似地，在我们的研究对象中，孕次、已产子女数或母亲体重没 有差异。与P-CTR相比，sPE和pHTN组的高血压女性的血压显著更
高(平均动脉压sPE:122, pHTN:115， P-CTR : 77 mmHg, p<0.001 )。 更高比例的sPE女性表现出神经症状(图1 )。发生在高血压组的临床实验室和胎盘组织学变化支持临床诊断(图2)。当用快速尿试条试验筛选时，sPE女性患有更严重程度的蛋白尿。 然而，当分析实验室24小时尿蛋白质排泄时，不能证实sPE和pHTN 组之间有差异。与pHTN女性相比，sPE患者的乳酸脱氢酶-LDH (血 管内溶血的标志)、尿酸水平更高，并且血小板计数更低。妊娠期间由 sPE并发剥离(含铁血黄素沉积和/或绒毛间血栓)的组织学征兆更常见 (p=0.003， Fisher's精确检验)。标准采用无菌容器收集随机尿样(5-10mL/样品)。加入研究时，所 有sPE女性安置导尿管(Foley catheter)以允许准确监测尿输出量。没 有导尿管时，采用其它无菌技术("直导管straight cath"或"清洁收集 clean catch")收集尿样。"直导管，，技术是用直导管以无菌方式收集尿 样的"入和出"方法。"清洁收集"技术是收集尿样同时尽可能避免细 菌污染生殖器菌群。60%的sPE女性在开始硫酸镁发作预防之后加入研 究。硫酸镁发作预防是临床先兆子痫患者的标准护理，由于用硫酸镁处 理已显示能预防这些患者的发病。9名女性在开始发作预防性治疗之前 以及之后2-12小时收集尿样。平行进行尿样的生化分析。收集之后样 品在3000xg和4t:下离心20分钟，等分试样并立即保存在-80r直到采 用特异性免疫分析检测sFlt-l、 VEGF和P1GF水平。^建为、奸才法根据制造商说明书(R&D Systems, Minneapolis, MN )进行人游离 VEGF、 sFlt-l和P1GF的ELISA分析。在预先用抗游离VEGF、 sFlt-l 或P1GF的捕获抗体包被的96孔板中分析样品， 一式两份。孵育操作后 洗涤并才艮据操作说明在450nm读数。分析中VEGF、 sFlt-l和P1GF的 最小可检测剂量分别是5、 5和7pg/mL。分析间和分析内变异系数在 3%-10%变化。由于蛋白尿可能经历日内变异，因此基于采用源于已知.刮
将数据标准化。由肌酸酐和/或总蛋白质浓度将血管发生因子的水平标准化。统计学分析釆用Kolmogorov-Smirnov法将所有数据组进行正态性检验并且才艮 告为平均值和95%置信区间(95%CI)(对于正态分布数据)或者中值 加范围(偏斜数据)。VEGF、 sFlt-l和PIGF浓度以算术平均数表示并 且在数据对数变换之前(Kruskall-Wallis ANOVA )或之后(单因素 ANOVA)完成统计学分析。采用Student's t-检验或Mann-Whitney秩 和检验进行两组间比较。用Fisher's精确检验或卡方检验比较比例关系。 我们应用单变量分析和多变量分析以及线性回归模型来识别作为自变量 的母体或实验室特征与作为因变量的sFlt-l/PlGF比率之间的显著相关 性。采用Pearson或Spearman积差相关法测量所选自变量之间的共线性 以及因变量和自变量之间的其它相关性。采用MedCalc (Broekstraat， Belgium)统计学软件进行接受者工作曲线(ROC)分析。统计学显著性 判断设置在p<0.05。^ * sF"-7水"f在取样时尿中VEGF、 sFlt-l、 PIGF和GA水平之间没有相关性 (VEGF: r=0.09， sFlt-l: r=0.02, PIGF: r=-0.03, p>0.05 )。下图3表示尿 中血管发生因子水平(以非对数形式)。与NP-CTR相比，患sPE女性的尿中VEGF水平较高(Student-Newman-Keuls, p=0.023 )。妊娠组之间尿中VEGF没有显著变化(单因 素ANOVA， p=0.536 )。与NP-CTR组相比，健康妊娠女性尿中PIGF浓 度显著增加(Student-Newman-Keuls， p<0.001 )。与NP誦CTR相比，正 常妊娠与尿中显著更高的PIGF水平有关(p<0.001)。与健康妊娠对照 相比，pHTN和sPE女性尿中PIGF输出量显著降低(p<0.001 )。最后， 与pHTN ( p=0.016 )和P-CTR ( p<0.001)相比，已经确定sPE女性尿 中sFlt-l水平显著更高。与P-CTR组相比，pHTN女性尿中sFlt-l输 出量更高(p=0.001 )。 P-CTR和NP-CTR健康对照之间尿中sFlt-l水 平没有显著性差异(p=0.594)。实施例2
尿样中sFlt-l和VEGF的降解进行试验以检验尿中血管发生因子的稳定性。测试来自先兆子痫患 者的8个尿样(i)如本文所述作为尿样或(ii)在室温下24小时后。 下图4显示采用Bland-Altman —致性方法分析这两种样品的ELISA数据 之间的一致性。该分析对所述两次测量(偏差)之间差异值对其平均值进 行作图分析，以评估如果这两种技术之间的差异^艮重要，这两种方法是否 可以互换^^用以及差异之间的变异性是否随测量值范围的增加而增加。结 果证明sFlt-l的免疫反应性损失最大(图4A:平均57.5 pg/mL )，随 后是VEGF (图4B:平均41.1 pg/mL )。对于P1GF (图4C ),负偏差 (-8.8 pg/mL )提示室温24小时后测量值稍微增加，提示其它因素比如 样品蒸发还可能影响结果。图4D举例说明免疫反应性从之前作为100% 水平而发生的相对变化。结果提示sFlt-l的免疫反应性统计学降低(对 于sFlt-l，带符号秩检验p=0.023 )， VEGF不变(p>0.05 )，以及P1GF 显著增加(带符号秩检验p=0.023 )。实施例3尿中sFlt國l/PlGF比如本文发现，正常妊娠特征表现为尿中P1GF排泄增加，而高血压 状态特征表现为sFlt-l增加，但尿中P1GF降低。下图5A-5B显示代表 性ELISA试验，证实这样的高血压状态对以下的影响(A)妊娠女性 sFlt-l水平和(B )妊娠女性P1GF水平。考虑到这点，申请人推断尿中 sFlt-l/PlGF (uFP)比率将是个体尿中血管发生标志物稳态平衡的更好 指标。采用以下/>式计算该比率指标uFP = logsFlt/PlGFx1001。下图 5C-5D显示(C )用于从本文提供的ELISA数据计算uFP的展开表和 (D )比较sPE患者与P-CTR的平均(+SD ) uFP。这些计算的结果证 实，与pHTN ( Student誦Newman-Keuls, p=0.008 )、 P曙CTR (p〈0.001)或 NP-CTR (p〈0.001)比较，sPE女性中uFP显著升高(图6)。与P-CTR (p〈0.001)和NP-CTR (p〈0.001)比较，pHTN组uFP值也显著升高。对uFP进行ROC分析。通过这个分析，已经确定在区分sPE女性 和正常血压对照中，截断值>2.1具有88.2%灵敏度和100%特异性(曲 线下面积，[95% CI0.974
x [Sc/ [Sax [Uc，其中[Ua和[Sa分别代表尿和血 清中血管发生因子的浓度，以及[Uc和[Sc代i尿和血清中肌酸酐浓度。 对白蛋白和总蛋白质进行相似的计算。申请人以p<0.05判断统计学显著 性。i营发'^厉f、蛋^#、 ##經*^蛋^虞/厲^幹化举、 凝軒在j&淨-^^^;^"f图9显示免疫分析结果。组间血清和尿中VEGF、 sFlt-l和P1GF 浓度具有显著性差异。与mPE女性相比，sPE女性血清蛋白质浓度显 著更低(Kruskal-Wallis ANOVA， p<0.05 )但尿中并非如此(p=0.495 )。 尿中随机总蛋白质/肌酸酐比率长期被提倡为24-小时尿中总蛋白质排泄 的强预测因子(25)。与其它研究组相比，sPE女性而非mPE女性尿中 随机总蛋白质比肌酸酐比率显著增加(Kruskal-Wallis ANOVA， p-0.007 )。血清白蛋白分析结果证实组间没有显著性差异(图9)。然而，根据 随机尿样分析，组间白蛋白尿具有显著性差异(p<0.001)。 mPE组 (r=0.477, p=0.080)或sPE组(r=0.143, p=0.472 )蛋白尿和白蛋白尿 之间没有显著相关性。与具有mPE的女性(单因素ANOVA，p=0.04) 和P-CTR女性(p=0.005 )相比，具有sPE的女性血清肌酸酐浓度显著 更高。i清-^ # KEGF ^乎妊娠的特征表现为血清VEGF水平降低(NP-CTR对P-CTR， p<0.001)(图9)。与P-CTR相比，sPE女性具有显著更低的血清游离 VEGF浓度(ANOVA Kruskal-Wallis, p<0.05 )，而与mPE女性相比并 非如此(p>0.05 )(图10A )。 NP-CTR、 P-CTR和mPE女性中尿中VEGF 浓度没有差异(单因素ANOVA, p=0.371)。相比而言，sPE女性尿中 VEGF浓度超过mPE组的两倍(p=0.01)(图10B )。对于sPE组，白 蛋白尿和尿中VEGF水平之间没有显著相关性(r=0.083, p=0.860 )。mPE 中蛋白尿和尿中VEGF浓度之间具有显著相关性(r=0.713， p=0.003 )， 而sPE组并非如此(r= -0.021, p=0.918 )，这表明sPE深深改变血清和
尿中这种血管发生因子的浓度，而与蛋白尿无关。血清-尿中sFlt-1shuiping 妊娠与血清sFlt-l水平增加相关(ANOVAKruskal-Wallis， NP-CTR 对P-CTR， p<0.001)(图IIA)。与健康妊娠对照相比，临床诊断时mPE 和sPE组中平均血清sFlt-1水平都显著提高(p<0.05)。由于sPE女性 血清中sFlt-1浓度比mPE高47%,可区分sPE和mPE ( sPE对mPE， p<0.05)。妊娠本身不影响尿中sFlt-1浓度(NP-CTR对P-CTR，p>0.05) (图IIB)。然而，与P-CTR组相比，mPE对象尿中sFlt-1水平显著更 高(ANOVAKruskal-Wallis, p=0.007 )。尿中sFlt-1浓度随疾病严重程 度而变化(sPE对mPE， p<0.05 )。 sPE组内白蛋白尿和尿中sFlt-1水平 之间没有显著相关性(r=0.324, p=0.873 )。 mPE组(r=0.137， p=0.628 ) 或sPE组(r-0.336,p-0.087)蛋白尿和尿中sFlt-1浓度之间没有显著相 关性。总之，先兆子痫女性血清和尿中sFlt-1浓度显著提高。这种紊乱 随高血压病症的严重程度而变化。在正常妊娠期间血清和尿中PIGF浓度显著提高(ANOVA Kruskal國Wallis， P誦CTR对NP-CTR， p<0.05 )(图12A和12B )。此外， 与P-CTR相比，sPE女性和mPE血^ PIGF水平低五衞sPE对P-CTR， p<0.05 ) ( mPE对P-CTR, p<0.05 )。与mPE相比,sPE女性血清PIGF 水平显著更低(sPE对mPE， p<0.05 )(图12A )。相似地，对于尿中PIGF 浓度保持该比率(sPE对P-CTR， p=0.004)。先兆子痫女性尿中PIGF 浓度没有显著性差异(sPE对mPE， p=0.733 )。对于sPE组，白蛋白尿 和尿中PIGF水平之间没有显著相关性(r=-0.091, p=0.653 )。 sPE中蛋 白尿和尿中PIGF浓度之间是相反的并且具有显著相关性(Pearson r=-0.6, p=0.002 )。总之，与mPE和P-CTR女性相比，sPE女性具有显 著更低的血清PIGF水平。在先兆子痫女性中尿中PIGF水平也更低， 但不随高血压疾病严重程度而变化。血管发生因子，白蛋白和蛋白质的排泄分数为了评价重度先兆子痫女性中是否发生肾小球损伤可以解释尿样 中血管发生标志物的释放增加，申请人分析了每种已鉴定血管发生标志
物的排泄分数与以高概率反映肾小球滤过能力受损的白蛋白尿、非特异 性蛋白尿之间的关系。还对每个研究组进行了血管发生标志物的排泄分 数与尿中随机总蛋白质比肌酸酐比率之间的相关性分析。物质的排泄分 数代表排泄于尿中的该物质与肾小球滤过部分相比的比例。 一般相对于 肌酸酐清除率来报告，因为肌酸酐既不被吸收又不被显著分泌，因此抵消了尿浓度/稀释的任何作用。与NP-CTR相比，健康妊娠女性排泄显 著更多的VEGF ( ANOVAp〈0.001)(图9 )。与P-CTR相比，pHTN不 影响VEGF排泄分数(p=0.346 )。然而，与pHTN ( p=0.007 )或P-CTR (p<0.001)女性相比，sPE显著增加VEGF朝一泄分数。妊娠的特征表现为sFlt-1排泄分数显著降低(P-CTR对NP-CTR， p<0.001 )。 pHTN不影响sFlt-1排泄分数(P國CTR对pHTN, p=0.43 ); 而与P誦CTR (p<0.001)和pHTN (p<0.001)相比，sPE逆转妊娠谦导 的变化而引起sFlt-l排泄分数增加(图4)。P1GF排泄分数遵从与sFlt-1排泄分数相似的模型。与NP-CTR相比， P-CTR女性的P1GF排泄分数降低(P-CTR对NP-CTR, p<0.001 )。相似 地，pHTN不进一步影响PlGF排泄分数(P-CTR对pHTN，p-0.125);而 sPE女性患者中这种作用被部分地逆转(sPE对pHTN， p<0.001 )。妊娠的特征不表现为健康对照中白蛋白排泄分数增加(NP-CTR对 P-CTR， p=0.385 )。而且，与pHTN和P-CTR组相比，sPE中白蛋白排泄 分数显4增加(单因素ANOVA，p<0.001)。与健康:fe^( NP画CTR对P-CTR, p>0.05 )或pHTN( P-CTR对pHTN p>0.05)相关的总蛋白质排泄分数没有显著变化。相反，本分析证实与 pHTN女性相比，sPE中总蛋白质排泄分数在疾病临M现期时极显著地 增加(sPE对pHTN p<0.001 )。白蛋白排泄分数与任何血管发生因子排泄分数之间没有显著相关性， 除了患pHTN疾病的女性以外并且仅^mt于sFlt-1 (r=0.639， p=0.01)和 P1GF (r=0.687, p=0.004 )。在NP-CTR女性中蛋白尿与任何被调查的血管发生因子排泄分数之间 无相关性(Pearson, VEGF [r=0.33， p=0.382，sFlt-1 [r=0.40, p=0.296]， P1GF [r=0.59， p=0.09)。鉴定了在P-CTR女性中蛋白尿与sFlt-1排泄分数之间
具有显著相关性(sFlt-l [r=0.59， p=0.03)。在健康P-CTR女性中PIGF和 sFlt-l的排泄分数与蛋白尿不相关(p>0.05)。然而，在pHTN女性中蛋白 尿与任何所述血管发生因子的排泄分数之间无相关性VEGF (r=0.42, p=0.118)、 sFlt-l ( r=0.23， p=0.414 )、或PIGF (i=0.34, p=0.214 )。在sPE 中，蛋白尿与VEGF (r=0.30, p=0.127)或sFlt-l (r=0.35， p=0.07)排泄分 数之间无相关性。相反，蛋白尿与PIGF排泄分数之间具有显著相关性 (r=0.50， p-0.01 )。此外，在sPE女性患者中尿中随机总蛋白质/肌酸酐比 率与PIGF (r=0.60， p=0.002 )或sFlt-l (sFlt醫l: r-0.50， p=0.007 )排泄分数 之间具有显著相关性。申请人观察到与健康妊娠对照相比，sPE中血清VEGF和PIGF水 平显著更低而sFlt-l显著更高。与sFlt-l和PIGF不同，所有研究组中尿 中VEGF浓度保持显著高于其血清水平。然而，甚至当考虑蛋白尿程度作 为受损肾小球完整性的反映时，申请人发现sPE与VEGF和sFlt-l排泄分 数的增加相关。相比之下，之前推测为先兆子痫标志物的PIGF(分子量 4^f艮多的蛋白质)与蛋白尿和尿中随机总蛋白尿/肌酸酐比率相关。基于本 发明发现血清和尿中所有血管发生因子水平随高血压疾病严重程度而变 化，sPE区分自身为不同的高血压临床实体。然而，血清和尿中浓度变化 不平行发生。申请人进一步确定sPE女性中血清游离VEGF水平降低，但是其尿 输出量却例外的增加。可通过其与血浆蛋白质比如sFlt-l的实质性结合 来解释血清水平降低。因此，可能不能通过只检测其游离形式的高座_特异 性ELISA检测VEGF。随后，尿中水平和排泄分数显著增加更可能是内 在肾脏生产(intrinsic kidney production)的结果，而较少可能由于肾小 球渗漏所引起(26)。本文所述发现即尿中VEGF水平显著增加不依赖于 蛋白尿和血清VEGF水平进一步支持该理论。此外，目前还不清楚肾脏增 强VEGF生产的机制，这需要进一步研究。总之，sPE的特征在于VEGF和sFlt-l排泄分数显著增加。这种增加 的幅度与由总蛋白质排泄分数、白蛋白尿或尿中随机总蛋白质比肌酸酐比 率反映的蛋白尿程度不相关。it^明血清水平变化和肾小球损伤不是造成 先兆子痫中^jk管发生因子输出增加的唯一机制。
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权利要求
1.诊断妊娠女性为具有或易于发生高血压病症的方法，其包括将妊娠女性尿样中可溶性fms-样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)水平与适当的标准相比较，其中所述标准是从正常怀孕的妊娠女性所得尿样中特征性的sFlt-1水平。
2. 权利要求l的方法，其中所迷标准获取自正常怀孕的妊娠女性 而且这种女性所处孕周对应于妊娠女性对象获取试验尿样时所处孕周。
3. 权利要求1的方法，其中与所述标准相比sFlt-l表达显著增加确 定该女性处于发生高血压病症的风险。
4. 权利要求1的方法，其中sFlt-l水平大于9.5pg每毫克尿肌酸酐 是先兆子痫的诊断指标。
5. 权利要求1的方法，其中sFlt-l水平大于40pg每毫克尿肌酸酐 是重度先兆子痫的诊断指标。
6. 权利要求l的方法，其中所述高血压病症是妊娠引起的高血压、 妊娠高血压、先兆子痫、EPH妊娠中毒、子痫、并发先兆子痫、HELLP 综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板计数低)和慢性肾病。
7. 权利要求l的方法，其中在测量相关血管发生因子水平之前采 用稳定剂处理所述尿样。
8. 权利要求l的方法，其中采用免疫学分析进行测量。
9. 权利要求8的方法，其中所述免疫学分析是ELISA。
10. 诊断妊娠女性为具有或易于发生高血压病症的方法，其包括将 妊娠女性尿样中可溶性fms-样酪氨酸激酶-l (sFlM)水平与适当的标准 相比较，其中所述标准是从具有高血压病症的M女性中所得尿样中特征 性的sFlt-l水平。
11. 权利要求10的方法，其中所述标准获取自具有高血压病症的妊 娠女性而且这种女性所处孕周对应于妊娠女性对象获取试验尿样时所处孕周。
12. 权利要求10的方法，其中与所述标准相比相似的sFlt-l表达确 定fcft^女性具有高血压病症或有发生高血压病症的风险。
13. 权利要求10的方法，其中sFlt-l水平大于9.5pg每毫克尿肌酸 酐是先兆子痫的诊断指标。
14. 权利要求10的方法，其中sFlt-l水平大于40pg每毫克尿肌酸 酐是重度先兆子痫的诊断指标。
15. 权利要求10的方法，其中所述高血压病症是妊娠引起的高血压、妊娠高血压、先兆子痫、EPH妊娠中毒、子痫、并发先兆子痫、 HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板计数低)和慢性肾病。
16. 权利要求10的方法，其中在测量相关血管发生因子水平之前采 用稳定剂处理所述尿样。
17. 权利要求10的方法，其中采用免疫学分析进行测量。
18. 权利要求17的方法，其中所述免疫学分析是ELISA。
19. 诊断或辅助诊断妊娠女性为具有或易于发生高血压病症和/或 某些与此相关因素的方法，其包括测量所述女性尿样中sFlt-l和胎盘生 长因子(P1GF)的水平并计算sFlt-l和PlGF表达之间的关系，其中从这 种计算中获得的关系指示该女性是否有发生高血压病症和/或某些与此相 关因素的风险。
20. 权利要求19的方法，其中所得关系可用于评价妊娠女性发生高 血压病症相关病况的风险，其中所述病况选自血清尿酸增加、剖腹产 分娩、收缩压和舒张压增加、试条蛋白尿、孕次、分娩时胎儿体重低、 胎盘破坏、宫内发育迟緩(IUGR)、溶血、血小板减少、肝脏酶升高和 HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板计数低)。
21. 权利要求19的方法，其中所述计算是以下比率指标(uFP): log [sFlt-l/PlGFx100。
22. 权利要求21的方法，其中uFP大于1.4是妊娠女性需要治疗 以预防发生或恶化高血压病症相关症状之风险增加的先兆指标。
23. 权利要求21的方法，其中uFP大于2.1是重度先兆子痫的诊 断指标。
24. 权利要求21的方法，其中uFP大于2.1是妊娠女性需要剖腹 产分娩之风险增加的诊断指标。
25. 权利要求19的方法，其中所述高血压病症是妊娠引起的高血 压、妊娠高血压、先兆子痫、EPH妊娠中毒、子痫、并发先兆子痫、 HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板计数低)和慢性肾病。
26. 权利要求19的方法，其中在测量相关血管发生因子水平之前采 用稳定剂处理所述尿样。
27. 权利要求19的方法，其中釆用免疫学分析进行测量。
28. 权利要求27的方法，其中所述免疫学分析是ELISA。
29. 确定妊娠女性是否处于发生高血压病症的风险的试剂盒，其包含(a)接受尿样的接受器；(b) 检测sFlt-l的工具；(c) 参照样品；和(d) 用于诊断所述女性中高血压病症的说明。
30. 权利要求29的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含检测P1GF的 试剂。
31. 权利要求29的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含稳定剂。
32. 权利要求29的试剂盒，其中所述参照样品包含从正常怀孕女性 所得尿样中特征性的sFlt-l水平。
33. 权利要求29的试剂盒，其中所述试剂盒可用于诊断妊娠引起的 高血压、妊娠高血压、先兆子痫、EPH妊娠中毒、子痫、并发先兆子 痫、HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板计数低)和慢性肾病。
34. 权利要求7的方法，其中所述稳定剂是蛋白酶抑制剂。
35. 权利要求16的方法，其中所述稳定剂是蛋白酶抑制剂。
36. 权利要求26的方法，其中所述稳定剂是蛋白酶抑制剂。
37. 权利要求31的试剂盒，其中所述稳定剂是蛋白酶抑制剂。
38. 权利要求34的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是以下的任何一种 或其任意组合AEBSF、 PefablocSC、 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟、抗蛋 白酶、抗蛋白酶二盐酸盐、抑酶肽、苯甲脒、盐酸苯甲脒、苯丁抑制素、 抑糜酶素、E-64、 L-反式-环氧琥珀酰-亮氨酰胺-(4-胍基)-丁烷、N-[N-(L-反式-氛基环氧乙烷-2-n)-L-亮氨酰]-精胺、乙二胺四乙酸及其钠盐、亮 抑酶肽、N-乙基马来酰亚胺、胃酶抑素、胃酶抑素A、膦酰二肽、叠氮化 钠、胰蛋白酶抑制剂和e-氨基己酸。
39. 权利要求35的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是以下的任何一种 或其任意组合AEBSF、 PefablocSC、 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟、抗蛋 白酶、抗蛋白酶二盐酸盐、抑酶肽、苯甲脒、盐酸苯甲脒、苯丁抑制素、 抑糜酶素、E-64、 L-反式-环氧琥珀酰-亮氨酰胺-(4-胍基)-丁烷、N-[N-(L-反式-羧基环氧乙垸-2-n)-L-亮氨酰-精胺、乙二胺四乙酸及其钠盐、亮 抑酶肽、N-乙基马来酰亚胺、胃酶抑素、胃酶抑素A、膦酰二肽、叠氮化 钠、胰蛋白酶抑制剂和s-^J^己酸。
40. 权利要求36的方法，其中所述蛋白酶抑制剂是以下的任何一种 或其任意组合AEBSF、 PefablocSC、 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟、抗蛋 白酶、抗蛋白酶二盐酸盐、抑酶肽、苯甲脒、盐酸苯甲脒、苯丁抑制素、 抑糜酶素、E-64、 L-反式-环氧琥珀酰-亮氨酰胺-(4-胍基)-丁烷、N-[N-(L-反式-氯基环氧乙烷-2-g)-L-亮氨酰]-精胺、乙二胺四乙酸及其钠盐、亮抑酶肽、N-乙基马来酰亚胺、胃酶抑素、胃酶抑素A、膦酰二肽、叠氮化 钠、胰蛋白酶抑制剂和s-lL&己酸。
41.权利要求37的试剂盒，其中所述蛋白酶抑制剂是以下的任何一 种或其任意组合AEBSF、 PefablocSC、 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟、抗 蛋白酶、抗蛋白酶二盐酸盐、抑酶肽、苯甲脒、盐酸苯曱脒、苯丁抑制素、 抑糜酶素、E-64、 L-反式-环氧琥珀酰-亮氨酰胺-(4-胍基)-丁烷、N-[N-(L-反式-羧基环氧乙烷-2-g)-L-亮氨酰-精胺、乙二胺四乙酸及其钠盐、亮 抑酶肽、N-乙基马来酰亚胺、胃酶抑素、胃酶抑素A、膦酰二肽、叠氮化 钠、胰蛋白酶抑制剂和s-氨基己酸。
全文摘要
本发明提供涉及检测和/或监测妊娠女性尿样中血管发生因子、尤其是VEGF、PlGF和sFlt-1水平的方法和组合物，以及这样的水平对妊娠首三个月、中三个月和/或末三个月中发生妊娠并发症、包括高血压病症比如先兆子痫之风险的影响。本发明还提供用于鉴定和筛选处于发生妊娠并发症比如先兆子痫之风险的患者的试剂盒。
文档编号G01N33/53GK101163970SQ200580047028
公开日2008年4月16日 申请日期2005年12月21日 优先权日2004年12月21日
发明者伊琳娜·布希姆斯基, 克特林·S·布希姆斯基, 埃罗尔·诺尔维茨 申请人:耶鲁大学