专利名称：尼帕病毒的荧光定量rt－pcr检测试剂及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以尼帕病毒基因片段H基因为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对尼帕病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法和应用。
背景技术：
尼帕病毒(Nipah virus，NPV)病是一种烈性人畜共患传染病。1998年9月，在马来西亚的人和猪群中暴发流行一种严重的发热性脑炎病，这次暴发流行的传染病最初怀疑是日本乙型脑炎。到1999年2月，类似的疾病再次暴发，这次暴发与马来西亚怡保市的猪向南部地区运输有关。同年3月，新加坡11名屠宰从马来西亚进口猪的工人发生呼吸道症状和脑炎症状的疾病，由于采取了禁止从马来西亚进口猪的措施，新加坡的暴发流行很快得到了控制。同时，马来西亚通过扑杀疫区和疫区周围地区的100多万头猪，到2000年5月疫情得到了控制。至2000年11月，马来西亚共发病人数为265人，死亡105人，新加坡发病人数为11人，死亡1人。Nipah病毒除可引起人、猪感染外，也可感染狗、猫和羊等家畜。人感染后的潜伏期为7-20天。病人一般表现为发热(可持续3-14天)，头痛，少数病例出现呼吸症状，部分患者在24-48小时内出现嗜睡、意识混乱、痉挛、颤抖，几天后发展为昏迷，多数病例在昏迷中死亡。
这种传染病的某些特征与日本乙型脑炎有明显的不同，该病多发于与猪接触的成年男子，儿童很少发生；与蚊子传播无关；也不受乙型脑炎疫苗免疫的影响等。因此，分离新的病原体受到了马来西亚研究者的重视。1999年3月，用3个严重病人的脑脊液接种Vero细胞进行了病毒分离，分离到的病毒经鉴定属于副粘病毒，由于此病毒最先从Kampung Sungai Nipah村的一名死者身上分离到，故将其命名为Nipah病毒。
该病毒属副粘病毒科单股负链RNA病毒，核衣壳螺旋对称，有囊膜，囊膜有穿膜糖蛋白，包括细胞受体结合蛋白和融合蛋自(F蛋白)，前者又包括糖蛋白(G蛋白)、血凝素(H)或血凝素—神经氨酸酶(NH)。Nipah病毒的基因组测序工作已经完成，基因组长度为18246bp。由核衣壳基因(N)、磷蛋自基因(P)/V基因/C基因、基质蛋自基因(M)、融合蛋白基因(F)、糖蛋自基因(G)、聚合酶基因(L)等组成。Nipah病毒可在Vero、BHK-21、PS等细胞系中生长良好。
根据流行病学、临床症状和病理变化很难确诊。与病猪接触的人多发病，以出现脑炎症状为主，病理变化以血管炎和血管内皮细胞形成合胞体为主，可作为诊断的参考依据。实验室检查可见淋巴细胞减少，血小板减少，低血钠，肝组织中天冬氨酸转氨酶升高。目前采用的诊断方法主要有(1)病毒的分离培养与鉴定；(2)用特异性抗体和透射电镜检测Nipah病毒；(3)核磁共振是诊断Nipah脑炎敏感而有效的方法；(4)从病料中提取病毒基因组，进行RT-PCR检测；(5)采用免疫组化的方法进行病毒的组织定位；(6)对病毒基因进行限制性核酸序列分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用尼帕病毒N基因序列设计合成的尼帕病毒荧光定量RT-PCR检测试剂。
本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。
本发明的再一目的是提供这种检测试剂的应用。
本发明系选择尼帕病毒N基因的保守片段为靶目标，应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，得到最适合的引物和探针。
本发明所述的尼帕病毒荧光定量RT-PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp，引物和探针序列为引物NPV-N-F5’-GTTCAGGCTAGAGAGGCAAAATTT-3’NPV-N-R5’-CCCCTTCATCGATATCTTGATCA-3’探针(FAM)5’-CTGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-3’(TAMRA)。
本发明所述的尼帕病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法由以下步骤组成一、选择NPV N基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为
GTTCAGGCTAGAGAGGCAAAATTTGCTGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGGCAGTGATCAAGATATCGATGAAGGGG；二、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；三、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；四、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；五、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；六、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量临床样品的检测应用评估，得到如权利要求1所述的扩增效率和特异性好的引物和探针。
与现有技术相比，本发明研制的Nipah病毒荧光定量RT-PCR检测试剂可快速、安全和准确地直接检测各种样品中的Nipah病毒，克服了RT-PCR检测方法费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等缺点，可对样品中的NPV进行准确的定量检测，具有简单、易操作、结果直观、敏感性高、特异性强、重复性好等优点。在加强进口动物特别是进口猪的检疫，对于预防Nipah病毒传入我国具有实际应用价值。本发明的优点和积极效果为1、本试剂与常规的RT-PCR相比较，该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点。尼帕病毒荧光定量RT-PCR可对样品中低含量的NPV病毒、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，是一种NPV检测的良好方法。
2、本试剂可对细胞培养物、分泌物、血液、组织等多种样品中的NPV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。
3、本荧光定量RT-PCR试剂除了具有特异性高、敏感性强外，可同时进行大量样品检测，具有高通量性，可减少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险。比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规RT-PCR和免疫捕获RT-PCR产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。
4、与常规PCR相比，荧光定量PCR作出一个定量的、客观的估计，判定出阳性、阴性和可疑。CT值为35.00可确定为阳性和阴性的临界值(cut-off)。更重要的是荧光定量RT-PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。
5、本试剂所组成的试剂盒可在收到样品后4小时之内作出定性、定量检测结果。该荧光定量RT-PCR试剂盒是一种检测临床样品中NPV的敏感和可靠的方法。
具体实施例方式
1、NPV N基因重组质粒的构建按照黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，中国科学出版社，2003年1月，第1217页至第1259页，进行尼帕病毒N基因克隆和测序，构建NPV N基因重组质粒，将重组质粒命名为pBAD-N。
2、设计引物和探针本发明选择NPV N基因的保守片段为靶目标，通过对GenBank中报道的NPV各分离病毒株基因的DNA序列和上述1克隆和测序的尼帕病毒NPV基因DNA序列进行同源性分析比较，选定NPVNPV基因的保守片段(76bp)，应用primerExpress软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针，引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，确定扩增效率和特异性最好的一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为76bp。
3、RNA提取尼帕病毒RNA和标准品同时制备。参照世界动物卫生组织(OIE)编著的《动物疫病诊断试验和疫苗标准手册》(2004年)第2.10.10章节，用酚/氯仿核酸抽提法提取RNA，用无RNA酶的超纯水溶解总RNA，分泌物、组织、血液(抗凝血)、血清和细胞组织等材料直接提取RNA。荧光RT-PCR和常规RT-PCR试验用同批次提取的RNA。
4、NPV荧光定量RT-PCRNPV荧光定量RT-PCR采用50μL体积反应液，在7000型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行42℃30min反转录；95℃预变性5min；95℃变性15sec，60℃1min，扩增40个循环。
引物和探针的浓度进行精确筛选，以获得最低的CT值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)。每次检测时，设立用水代替病毒RNA样品的4个阴性对照(或正常组织、细胞阴性对照)；设立相当于1000、100、10、1TCID50/每反应管的NPV标准各4个对照；每个样品检测做3管平行试验。在4个阴性对照为阴性、阳性对照为阳性时，整个试验有效，可进一步判定结果。每个样品须作多个备份，以进行稳定性、重复性试验。
5、常规RT-PCR常规RT-PCR的上游引物和下游引物与荧光定量RT-PCR相同，扩增目标片段长度为76bp，按常规方法进行扩增。检测用2％琼脂糖电泳分析，阳性扩增结果出现一条76bp特异性条带。
6、NPV荧光定量RT-PCR的特异性、敏感性用NDV、BVDV、PPV以及正常Vero、BHK-21细胞、野外采集猪的组织样品和血清进行特异性比较检测。对NPV样品进行10倍系列稀释，用常规RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测，比较它们的敏感性。
7、荧光定量RT-PCR稳定性和重复性试验在评估NPV荧光定量RT-PCR检测NPV方法中的组内和组间试验的重现性、稳定性时，用NPV样品，在同样反应条件下，反复进行荧光定量RT-PCR检测，每次试验的每个样品做6个平行的反应管，重复12次。
8、标准阳性对照样品的制备、标准曲线的建立及核酸拷贝数的计算上述1构建的重组质粒pBAD-N，转化大肠杆菌TOP10，LB培养基(含Amp100μg/mL)增殖，碱裂解法提取，经试剂盒纯化，质粒浓度用分光光度计测OD260定量。模板浓度的计算在作绝对定量时，首先制备标准曲线。对标准品进行10-1、10-2、10-3、10-4～10-7稀释，通过测OD知道质粒原液(标准品)的浓度后，换算出每个PCR管中模板的数量。做荧光定量RT-PCR检测，以拷贝数的对数为X轴，CT值为Y轴作回归曲线，获得标准曲线。
9、引物和探针及其浓度的筛选选择引物、探针、模板的最佳浓度配比，获得荧光定量RT-PCR反应的最低CT值和最高ΔRn，提高扩增效率和敏感性。应用含有目的片段的质粒标准品，经系列稀释，制备DNA不同含量的检测样品。对设计的二对引物和各自的探针，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探针终浓度，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度。
10、对样品的检测用荧光定量RT-PCR对NPV样品、NDV、BVDV、PPV以及正常Vero、BHK-21细胞、野外采集猪的组织等试验样品进行检测。提取的RNA稀释后检测，阳性样品的CT值均小于或等于35.0，阴性对照样品的CT值均大于38.0，试验特异性强。CT值38.0可作为是阳性和阴性的临界值。CT值大于38.0可判为阴性，CT值小于或等于35.0可判为阳性，在35.0-38.0之间为可疑，须重新试验。荧光定量RT-PCR检测NPV的特异性强，敏感性高，重复性很好。
11、NPV荧光定量RT-PCR标准化试剂和检测程序11.1试剂盒组成(50μl反应×50次)根据上述1～10试验结果，按照反应条件优选、对比试验和验证试验确定的反应条件，配制如下试剂盒组份
11.2操作方法11.2.1总RNA提取(1)取1ml-1.5ml组织样品研磨上清液或液体样品置1.5ml eppendorf管中，12000rpm，4℃，离心5min，弃上清液。
(2)加入1ml溶液I，充分振荡混匀，置室温5min，彻底裂解。
(3)加200μl溶液II，小心盖上帽盖，用力快速振荡15sec，室温放置3min。
(4)12000rpm，4℃，离心15min。
(5)小心吸取上层水相，转移至一新的1.5ml eppendorf管中，加入500μl溶液III，混匀，室温放置10min。
(6)13000rpm，4℃，离心10min，弃上清液。
(7)加1000μl溶液IV，充分振荡混匀，12000rpm，4℃，离心5min。小心充上清液。管底部可见有乳白色胶样RNA沉淀。
(8)小心打开管盖，室温自然干燥沉底的RNA。
(9)取11μl溶液IX置入已半干燥的沉底RNA，溶解RNA。可直接用于反转录或-70℃保存备用。
11.2.2反应组份配制(1)取一支200μl光学PCR反应管，反应总体积为50μl，向反应管中加入下列反应物 (2)定量按需要对标准品进行稀释后制作标准曲线，至少7个稀释度。
(3)设立对照阳性对照和阴性对照各设2管。
11.2.3扩增按下列参数设置反应条件
11.2.4结果分析和判定(1)结果分析条件设定直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
(2)质控标准——阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。
——阳性对照的Ct值应小于35.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在Threshold(荧光临界值)附近。否则，此次实验视为无效。
——定量用的标准品扩增曲线出现典型的扩增曲线，指数区较明显，7个点具良好的线性范围，平台区汇于一起，相关系数在0.98以上。
(3)结果描述及判定——阴性Ct值应大于38.0或无扩增曲线，表示样品中无尼帕病毒。
——阳性Ct值小于或等于35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在尼帕病毒。
——有效原则Ct值在35.0～38.0的样本建议重做。重做结果Ct值大于38.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。
——定量根据标准曲线作出定量。
权利要求
1.一种尼帕病毒荧光定量RT-PCR检测试剂，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp，引物和探针序列为引物NPV-N-F5’-GTTCAGGCTAGAGAGGCAAAATTT-3’NPV-N-R5’-CCCCTTCATCGATATCTTGATCA-3’探针(FAM)5’-CTGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGG-3’(TAMRA)。
2.按照权利要求1所述的尼帕病毒荧光定量RT-PCR检测试剂的制备方法，其特征在于由以下步骤组成(一)、选择尼帕病毒特异而各毒株间比较保守的N基因序列的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为GTTCAGGCTAGAGAGGCAAAATTTGCTGCAGGAGGTGTGCTCATTGGAGGCAGTGATCAAGATATCGATGAAGGGG；(二)、应用primer Express软件和primer prere5.0软件，设计引物和探针；(三)、引物和探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成；(四)、探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR；(五)、将设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验后，初步确定候选引物和探针；(六)、经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量临床样品的检测应用评估，得到如权利要求1所述的扩增效率和特异性好的引物和探针。
3.权利要求1所述的尼帕病毒荧光定量RT-PCR检测试剂在制备NPV荧光定量RT-PCR标准化试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种以尼帕病毒基因片段为靶目标设计合成的生物制剂，尤其是能够对尼帕病毒进行检测的试剂以及这种试剂的制备方法。本发明系选择尼帕病毒特异而各毒株间比较保守的N基因片段为靶目标，精心设计、合成引物和探针。将设计的多对引物和探针进行最佳配对筛选实验，并经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，得到最适合的引物和探针。本发明所述的尼帕病毒荧光定量RT－PCR检测试剂包含一对特异性引物和一条特异性荧光探针，扩增目标片段长度为76bp。本试剂可对尼帕病毒进行快速检测。
文档编号G01N21/64GK1840701SQ20061001061
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月6日 优先权日2006年1月6日
发明者花群义, 周晓黎, 董俊, 杨云庆, 徐自忠, 肖荣海, 尹尚莲 申请人:云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心