专利名称：快速富集痕量多肽或蛋白质并实现鉴定的方法
技术领域：
本发明属生化分析技术领域，具体涉及一种多肽和蛋白质痕量样品快速富集和鉴定的方法。
背景技术：
在后基因组时代，蛋白质组研究越来越受到国内外科学工作者的密切关注，而基质辅助激光解析离子源(MALDI)的发明和成功应用，已使生物质谱成为蛋白质组学研究中重要的技术平台。低丰度蛋白的分析与鉴定是蛋白质组学研究的重点和难点内容之一。在生物体中承担重要生命活动的蛋白往往都是低丰度蛋白，然而其极低的含量给后续的分析和检测带来困难，限制了人们对它们的研究和认识。因此低丰度蛋白的有效浓缩是实现其准确分析和鉴定的重要条件之一。实际上在蛋白质组学研究过程中许多方面都涉及到样品的有效富集，以胶内酶解样品的分析为例酶解肽段提取液的体积太大，在质谱分析前必须浓缩。目前最常用的样品浓缩方法有溶剂蒸发法和色谱浓缩法。溶剂蒸发法多费时费力，在干燥过程中容器表面的吸附会造成大量的肽段损失，同时无机盐等杂质也会被浓缩，影响质谱鉴定的灵敏度；色谱浓缩法是利用样品与吸附剂之间的色谱相互作用对样品进行浓缩，疏水性强的样品难以被洗脱，而亲水性的肽段由于与反相填料的作用力弱而回收率差，存在样品岐视效应，如反相色谱。
最近我们实验室将纳米沸石粒子成功的用于痕量蛋白/多肽浓缩-MALDI-MS直接分析。纳米沸石具有丰富可调的表面性质、外表面独特的离子交换性、非常大的活性外表而、均匀分布的纳米孔口吸附等特性，可以与多肽和蛋白溶液形成均匀稳定的溶液，有利于样品富集的进行。但是上述方法富集时间较长，达90分钟；而且固体颗粒带入质谱，一方面会影响信号稳定性与重现性，另一方面由于纳米颗粒的溅射容易污染质谱离子光学通道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高、速度快、重现性好的能对痕量蛋白或多肽进行富集并直接进行鉴定的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下利用记号为CaCO3-PMMA的以纳米碳酸钙粒子表面原位乳液聚合接枝包覆的聚甲基丙烯酸甲酯材料作为纳米吸附剂对多肽和蛋白样品吸附，对痕量多肽或蛋白进行富集后，通过去核保证多肽或蛋白质的全提取并直接完成无固态颗粒化——基质辅助激光解析离子化质谱的分析检测，具体步骤是(1)以CaCO3-PMMA作为纳米吸附剂，对多肽或蛋白质样品的溶液进行富集，样品溶液浓度是1×10-15mol/μL至1×10-10mol/μL，富集时间在10-12分钟之间，富集温度在25-37摄氏度之间，CaCO3-PMMA的溶液浓度在10-15mg/ml之间；(2)对富集了样品的CaCO3-PMMA溶液进行离心、去核处理，将富集的多肽或蛋白质及PMMA链混合物直接与有机基质在靶板上均匀混合，形成均匀细致的结晶，进行基质辅助激光解析离子化质谱分析；(3)根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。
上述方法中，所述去核处理，是将含有乙酸的乙腈溶液与经离心处理后去除上清液而收集的下层固体相混合均匀，进行全提取。所述有机基质可以是2-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA)，用量为4-10mg/ml。
本发明使用的CaCO3-PMMA材料，其核心纳米CaCO3颗粒粒径在60-100nm范围内较为合适，其表面原位乳液聚合接枝包覆的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)以间同(rr)立构结构为主，其含量约10-30wt％。该组合纳米材料不仅拥有较大的比表面积，而且通过疏水性相互作用等作用力对多肽或蛋白质具有高效吸附作用，更重要的是该纳米材料在固态时，PMMA链是包覆在CaCO3颗粒表面，而当其被投入溶液中时，PMMA链会逐渐展开，并延伸至溶液的各个角落，就像海洋里章鱼的触脚一样，可快速吸附多肽或蛋白质；随后的离心过程将吸附了样品的CaCO3-PMMA材料离心至溶液底部，待弃除上清液，加入含有乙酸的乙腈溶液(4-5μL)混匀后，纳米材料的核心CaCO3与酸反应生成醋酸钙沉淀，此时纳米吸附剂的物理结构被完全破坏，所以能够基本实现多肽或蛋白样品的全提取，离心后的上清含有富集的样品和PMMA链，而PMMA链这种聚合物的存在会促使样品与基质形成更均匀细致的结晶。
本发明使用含有乙酸的乙腈溶液对富集有样品的纳米材料进行去核处理，同时完成被富集样品的全提取，靶板上形成的均匀细致的结晶可以提高样品的离子化效率，并保证了样品分析的重现性和稳定性。
本发明使用的CaCO3-PMMA材料对多肽或蛋白都有吸附作用，可以与基质形成均匀细致的结晶，保持基质辅助激光解吸离子化质谱分析信号的稳定性。本方法操作简单、快速、效率高、质谱重现性好。
本发明利用纳米碳酸钙球表面原位聚合聚甲基丙烯酸甲酯材料，对多肽和蛋白样品进行快速、高效富集，通过去核操作，对所富集的样品进行无固态颗粒化——基质辅助激光解析离子化质谱的分析和鉴定，避免了样品损失，增强了系统的耐盐性。
本发明对多肽的富集效率可高达240倍以上。含有100×10-3mol/L碳酸氢氨的5×10-15mol/μL的蛋白质酶解样品也可以通过本发明阐述的方法获得鉴定。
图1为本富集方法流程示意图。
图2为1fmol/μL三个标准多肽混合物样品的MALDI-TOF-MS谱图。(a)是富集前，(b)是1mL样品溶液富集后得到的。(b)得到的样品信号的信噪比是富集前(a)的240-260倍。
图3为500fmol/μL细胞色素c蛋白的MALDI-TOF-MS谱图。(a)是1mL样品溶液富集后得到的，(b)是富集前得到的。(a)相当于未富集的90pmol/μL蛋白样品得到的谱图。
图4为600fmol/μL马心肌红蛋白的MALDI-TOF-MS谱图。(a)富集前得到的，(b)是10分钟富集、离心后上清液得到的，(c)是1mL样品溶液富集后得到的。(a)相当于未富集的100pmol/μL蛋白样品得到的谱图。(b)显示出经过10分钟富集后，绝大部分蛋白都被富集、离心至固态相中，上清液中残余很少。
图5为5fmol/μL马心肌红蛋白酶解肽段样品的MALDI-TOF-MS谱图。(a)是富集前得到的信号，(b)是人为加入100mM的碳酸氢氨作为干扰污染物后得到的信号。(c)是盐存在的情况下富集后得到的信号。可以看到在这么大浓度盐的干扰下，传统方法根本测不到这么痕量的肽段，而CaCO3-PMMA材料却可以得到非常好的信号。富集前不加盐的溶液只测到4条肽，覆盖率只有10％，而被污染溶液富集后却能测到10条肽，覆盖率达到70％。
图6为10μL10mg/mL的纳米材料悬浊液置于1mL10fmol/μL的标准多肽1溶液中分别孵育不同的时间，离心不同时间后取上清液点靶用质谱检测肽段的分子信号。每个点的强度信号是单独7次质谱信号平均的结果。在10fmol/μL没有放置纳米材料的原始溶液中，肽的平均信号强度达到432.9，但是8-9分钟的时候质谱的信号以相当微弱，9-10分钟以后质谱已无法在上清液中检测到肽段信号。从中我们可以发现纳米材料具有快速的富集特性，能在8-10分钟内就将肽段分子基本富集完全。
图7为传统基质点样与纳米材料富集样品后点样两组质谱数据的对照。我们选取了质谱信号强度相当的两组溶液点样A曲线是使用传统方法采用基质CHCA直接点覆0.5μL200fmol/μL的多肽1溶液，B曲线是使用纳米材料富集1mL 1fmol/μL多肽1溶液后取上清液0.5μL和等体积CHCA基质混合点样的方法而得到的，每种方法各做20个样点，每个样点的质谱数据是800个Laser Shots取得的。从中我们可以明显的看出采用纳米CaCO3-PMMA材料富集样品后的方法相比传统基质方法具有更好的样点-样点间重现性。
图中标号1为PMMA，2为CaCO3，3是将CaCO3-PMMA材料放入溶液中，4为样品溶液，5为37摄氏度孵育富集过程，6为离心后弃除上清液，7为二次离心，8为点靶送至MALDI-MS质谱分析，9是第一次离心，10是加入含有乙酸的乙腈溶液并混匀。
具体实施例方式
下面的实例是对本发明提出的利用纳米材料快速富集痕量多肽或蛋白质并实现无固态颗粒化质谱分析的方法的进一步说明。
实施例1CaCO3-PMMA材料对多肽的吸附行为的研究配制1fmol/μL级别的多肽混合液(标准多肽1、2、3溶于50％ACN50％H2O中)，取0.5μL溶液与等体积的α-CHCA基质溶液(0.1％TFA的50％乙腈水溶液)在MALDI靶板上混合，干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析，见图2a。将纳米CaCO3-PMMA材料在上述溶液中孵育10分钟后离心10分钟，弃除上清液，然后取5μL含乙酸(0.2μL)的乙腈溶液重新混匀固定相，离心5分钟，取上清液(最终的含有肽/PMMA链的ACN上清溶液)0.5μL与等体积的α-CHCA基质溶液(0.1％TFA的50％乙腈水溶液)在MALDI靶板上混合干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析，结果见图2b。
实施例2CaCO3-PMMA材料对细胞色素c蛋白的吸附研究调整样品溶液为500fmol/μL的细胞色素c蛋白溶液(50％ACN50％H2O)，其它条件不变，重复上述富集实验。得到的结果参见附图3所示。
实施例3CaCO3-PMMA材料对马心肌红蛋白的吸附研究调整样品溶液为600fmol/μL的马心肌红蛋白溶液(50％ACN50％H2O)，其它条件不变，重复上述富集实验。得到的结果参见附图4a和c所示。图4b是是纳米CaCO3-PMMA材料在上述溶液中孵育10分钟后离心10分钟，然后取上清液0.5μL与等体积的α-CHCA基质溶液(0.1％TFA的50％乙腈水溶液)在MALDI靶板上混合干燥结晶后进行MALDI-TOF/MS分析的结果。
实施例4对蛋白质酶解物及耐盐性的研究调整样品溶液为加了100mM浓度碳酸氢氨的5fmol/μL马心肌红蛋白酶解肽段溶液(溶剂为50％乙腈、50％水)，其它条件不变，重复上述富集实验。得到的结果参见附图5所示。可以看到在这么大浓度盐的干扰下，传统方法根本测不到这么痕量的肽段(图5b)，而CaCO3-PMMA材料却可以得到非常好的信号(图5c)。富集前不加盐的溶液只测到4条肽，覆盖率只有10％，而被污染溶液富集后却能测到10条肽，覆盖率达到70％。
实施例5快速富集的验证将10μL10mg/mL的纳米材料悬浊液置于1mL10fmol/μL的多肽1溶液中分别孵育不同的时间，离心不同时间后取上清液点靶用质谱检测肽段分子信号，详情见图6，图6中每个点的强度信号是单独7次质谱信号平均的结果。在10fmol/μL没有放置纳米材料的原始溶液中，肽的平均信号强度达到432.9，但是8-9分钟的时候质谱的信号以相当微弱，9-10分钟以后质谱已无法在上清液中检测到肽段信号。从图6中我们可以发现纳米材料具有快速的富集特性，能在8-10分钟内就将肽段分子基本富集完全。
实施例6质谱数据重复性方面的实验为了说明纳米CaCO3-PMMA材料富集样品对于质谱数据重复性方面的贡献，我们做了传统基质点样与纳米材料富集样品后点样两组数据的对照，实验结果呈现于图7。我们选取了最终质谱信号强度相当的两组溶液点样A曲线是使用传统方法采用基质CHCA直接点覆0.5μL200fmol/μL的多肽1溶液，B曲线是使用纳米材料富集1mL 1fmol/μL多肽1溶液后取上清液0.5μL和等体积CHCA基质混合点样的方法而得到的，每种方法各做20个样点，每个样点的质谱数据是800个Laser Shots取得的。从图7中我们可以明显的看出采用纳米PMMA-CaCO3材料富集样品后的方法相比传统基质方法具有更好的样点-样点间重现性。A方法得到的样品肽段分子强度从2000到11000变化，是由于金属靶板上的微区多样性、溶剂挥发时间不同等因素干扰导致不同部位样品分子/基质分子比的重大差异从而导致重现性较差。而B方法得到的样品质谱信号强度则基本稳定在5000-7000之间，保持了较好的质谱信号。这是由于采用纳米材料富集肽段溶液后，点样的溶液是富集有肽段的PMMA线性链，这种线性链在溶液中的存在形态有利于在各区域形成稳定的样品分子/基质分子比，从而得到较好的样点-样点间重现性。
下表是实施例中使用的三种标准多肽和两种标准蛋白质的性质
权利要求
1.一种快速富集痕量多肽或蛋白质并实现无固态颗粒化质谱分析的方法，其特征是利用记号为CaCO3-PMMA的以纳米碳酸钙粒子表面原位乳液聚合接枝包覆的聚甲基丙烯酸甲酯材料作为纳米吸附剂对多肽和蛋白样品吸附，对痕量多肽或蛋白进行富集后，通过去核保证多肽或蛋白质的全提取并直接完成无固态颗粒化——基质辅助激光解析离子化质谱的分析检测，具体步骤是(1)以CaCO3-PMMA作为纳米吸附剂，对多肽或蛋白质样品的溶液进行富集，样品溶液浓度是1×10-15mol/μL至1×10-10mol/μL，富集时间在10-12分钟之间，富集温度在25-37摄氏度之间，CaCO3-PMMA的溶液浓度在10-15mg/ml之间；(2)对富集了样品的CaCO3-PMMA溶液进行离心、去核处理，将富集的多肽或蛋白质及PMMA链混合物可直接与有机基质在靶板上均匀混合，形成均匀细致的结晶，进行基质辅助激光解析离子化质谱分析；(3)根据质谱结果，鉴定多肽或蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述CaCO3-PMMA中CaCO3平均粒径为60-100nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述去核处理是利用含有乙酸的乙腈溶液与经离心处理后去除上清液而收集的下层固体相混合均匀，进行样品全提取。
全文摘要
本发明是一种以纳米碳酸钙粒子表面原位聚合聚甲基丙烯酸甲酯材料(简称CaCO
文档编号G01N30/72GK1811406SQ200610023670
公开日2006年8月2日 申请日期2006年1月26日 优先权日2006年1月26日
发明者贾韦韬, 陆豪杰, 陈雪花, 杨芃原 申请人:复旦大学