专利名称：同型半胱氨酸浓度的测定方法及同型半胱氨酸诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域内对同型半胱氨酸浓度的检测，尤其涉及利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法测定同型半胱氨酸浓度的方法，以及由此制得的同型半胱氨酸诊断试剂盒，属于同型半胱氨酸浓度分析检测技术领域。
背景技术：
测定血浆中同型半胱氨酸浓度的方法有很多种，包括高效液相色谱法(HPLC)、氨基酸分析仪测定法、离子色谱法、酶联免疫分析法(EIA)、毛细管气相色谱-质谱，荧光偏振免疫分析(FPIA)、电化学法及酶法等。
高效液相色谱法(HPLC)是经典的参考方法，但其操作比较复杂，试验耗时比较长，试验数据变异比较大，在临床应用方面逐渐被酶联免疫分析法、荧光偏振分析法和酶法所取代。高效液相色谱法先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式，然后与荧光剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光物质复合物，将衍生后的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同，因此流动相将其洗脱下来的次序也不同，根据这一原理将样品中的不同物质分开，以荧光检测器检测洗脱下同型半胱氨酸-荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品/内标的比值进行比较和计算，就可以测定血总同型半胱氨酸的水平。
酶联免疫分析法(EIA)是临床上测定同型半胱氨酸水平的常用方法，操作比较方便、快捷，重复性好，方法稳定可靠。其缺点是大部分操作还是手工操作，比较耗时。酶联免疫分析法基本分析原理先使用酶将血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶标的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的单克隆或多克隆抗体，采用竞争结合的原理，将不同水平的标准品与酶标抗体竞争结合，然后以显色试剂和终止试剂分别进行显色和终止，制作出同型半胱氨酸浓度与发色强度的标准曲线。样品也按相同步骤处理，在标准曲线上就可以查出其同型半胱氨酸的浓度。
离子色谱法主要用于实验研究，临床上较少使用。其基本分析原理是色谱分析的一种，主要是其固定相采用离子交换物质，根据其对不同离子的吸附力不同可将同型半胱氨酸与其它物质分开进行测定。
毛细电泳法主要用于实验研究，有在临床使用的报道。其特点与高效液相色谱方法相似，其操作比较复杂、试验耗时较长和试验数据变异比较大的缺点。基本分析原理先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式，然后与荧光试剂进行衍生生成同型半胱氨酸-荧光物质复合物，将衍生后的样品进行毛细电泳分析。将样品放置于10千伏左右的高压电场中，因为各种物质所带电荷不同，其等电点也不相同，因此其在电场中的迁移速度也就不同，根据这一原理可将同型半胱氨酸与样品中的其它物质分开，再以荧光检测器检测同型半胱氨酸-荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品/内标的比值进行比较和计算，就可以测定总同型半胱氨酸的水平。
荧光偏振法是临床上测定同型半胱氨酸水平的比较好的方法，该方法完全自动化仪器分析，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理样品中游离同型半胱氨酸和抗单克隆抗体相结合的同型半胱氨酸的荧光偏振强度不同，将样品、标准品与标抗体竞争结合，采用竞争结合的原理制作出同型半胱氨酸浓度与荧光偏振强度的标准曲线，在标准曲线上就可以查出其同型半胱氨酸的浓度。
酶法因应市场需求而新开发出来的测试方法，目前国内有多项专利申请，CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶来测量样品中同型半胱氨酸含量；CN200410016789.6利用同型半胱氨酸转甲基酶(E.C.2.1.1.10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E.C.3.3.1.1)的循环扩增作用，再加上腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶等，或腺苷脱氨酶、谷氨酸脱氢酶等显色反应测定同型半胱氨酸含量；CN200510053210.8利用L-蛋氨酸γ-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之产生硫化氢后再与莹光化合物DMPD2HCl作用产生荧光，该方法使用全自动荧光分析仪测试，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理用基因重组酶将同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氢产物再与荧光显色剂发生化学反应形成可测量的荧光化合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定同型半胱氨酸浓度的方法，以及应用该方法配制而成的同型半胱氨酸诊断试剂盒。
本发明的原理是利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)来测定同型半胱氨酸的浓度，其主要技术路线是采用同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶(EC 4.4.1.2)将同型半胱氨酸裂解产生硫化氢、氨及α-氧代丁酸(2-oxobutanoate)；胱硫醚γ合酶(EC 2.5.1.48)利用硫化氢再次合成同型半胱氨酸，这样就使同型半胱氨酸能不断地被重复循环利用，因此得以不断地扩增其他两个产物——氨及琥珀酸；再利用谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)或琥珀酸半醛脱氢酶(EC 1.2.4.16或EC 1.2.4.24)分别作用于氨或琥珀酸，使还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算同型半胱氨酸浓度的大小。谷氨酸脱氢酶及琥珀酸半醛脱氢酶可以单独使用(消耗一个还原型辅酶)，也可以一齐使用(消耗二个还原型辅酶)，一齐合用可以增加测试的灵敏度一倍。
为实现本发明的目的，一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法测定同型半胱氨酸浓度的方法，采用以下步骤进行首先，将待测样品与含有胱硫醚γ合酶、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酸基-高丝氨酸和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应
然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，测算出同型半胱氨酸浓度大小。
上述酶循环扩增法测定同型半胱氨酸浓度的方法中，所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
实现本发明同型半胱氨酸诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液40～500mmol/L，稳定剂/试剂总体积 1～50％，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶200～50000U/L，胱硫醚γ合酶 200～50000U/L，谷氨酸脱氢酶 2000～500000U/L，琥珀酸半醛脱氢酶 2000～500000U/L，琥珀酸基-高丝氨酸 2～60mmol/L，α-酮戊二酸 2～20mmol/L。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，比如 双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、琥珀酸半醛脱氢酶，可以放在试剂II；试剂II中的琥珀酸基-高丝氨酸、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、胱硫醚γ合酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将试剂配成如下三试剂
与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的α-酮戊二酸可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的谷氨酸脱氢酶、琥珀酸半醛脱氢酶可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的琥珀酸基-高丝氨酸、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、胱硫醚γ合酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，浓度在1％～50％(V/W)范围之内。
用作稳定剂的物质可以是硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)中的至少一种。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液100mmol/L，稳定剂/试剂总体积 50％，还原型辅酶0.25mmol/L，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶2000U/L，胱硫醚γ合酶 2000U/L，谷氨酸脱氢酶 50000U/L，琥珀酸半醛脱氢酶 10000U/L，琥珀酸基-高丝氨酸 50mmol/L，α-酮戊二酸 16mmol/L。
利用酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定同型半胱氨酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的同型半胱氨酸诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行同型半胱氨酸浓度的测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法测定同型半胱氨酸浓度，测试结果准确；(2)参与反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中同型半胱氨酸浓度的大小；(6)本发明提供的液态同型半胱氨酸浓度诊断试剂盒，稳定性好，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
本发明一种同型半胱氨酸浓度的测定方法及同型半胱氨酸诊断试剂盒，采用同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶与同型半胱氨酸裂解产生硫化氢、氨及α-氧代丁酸，由胱硫醚γ合酶与硫化氢再次合成同型半胱氨酸，使同型半胱氨酸能不断地被重复循环利用，不断地扩增氨及琥珀酸，再利用谷氨酸脱氢酶或琥珀酸半醛脱氢酶分别作用于氨或琥珀酸，使还原型辅酶氧化成为氧化型辅酶，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，进而可以测算同型半胱氨酸浓度的大小。
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制同型半胱氨酸诊断试剂盒三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，硫酸铵 50％(占试剂总体积)，NADH 0.25mmol/L，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶 2000U/L，胱硫醚γ合酶 2000U/L，谷氨酸脱氢酶 50000U/L，
琥珀酸半醛脱氢酶10000U/L，琥珀酸基-高丝氨酸 50mmol/L，α-酮戊二酸 16mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出同型半胱氨酸浓度的大小。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制同型半胱氨酸诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 50％(占试剂I总体积)，NADPH0.25mmol/L，谷氨酸脱氢酶 40000U/L，琥珀酸半醛脱氢酶 15000U/L，α-酮戊二酸 12mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，甘油 50％(占试剂II总体积)，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶 2000U/L，胱硫醚γ合酶 2000U/L，
琥珀酸基-高丝氨酸 40mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂I、试剂II的体积比例为2∶20∶5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出同型半胱氨酸的浓度大小。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制同型半胱氨酸诊断试剂盒试剂I——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％(占试剂I总体积)，thio-NADH0.25mmol/L，α-酮戊二酸 10mmol/L；试剂II——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％(占试剂II总体积)，谷氨酸脱氢酶 60000U/L，琥珀酸半醛脱氢酶 20000U/L；试剂III——三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L，丙二醇 50％(占试剂III总体积)，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶 4000U/L，
胱硫醚γ合酶4000U/L，琥珀酸基-高丝氨酸 20mmol/L。
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定同型半胱氨酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测同型半胱氨酸样品与试剂I、试剂II、试剂III的体积比例为4∶40∶5∶5，反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出同型半胱氨酸浓度的大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.同型半胱氨酸浓度的测定方法，包括以下步骤①将待测样品与含有胱硫醚γ合酶、同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶、α-酮戊二酸、谷氨酸脱氢酶、琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酸基-高丝氨酸和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，测算出同型半胱氨酸浓度大小。
2.同型半胱氨酸诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液40～500mmol/L，稳定剂/试剂总体积 1～50％，还原型辅酶0.1～0.35mmol/L，同型半胱氨酸-α，γ-裂解酶200～50000U/L，胱硫醚γ合酶 200～50000U/L，谷氨酸脱氢酶 2000～500000U/L，琥珀酸半醛脱氢酶 2000～500000U/L，琥珀酸基-高丝氨酸 2～60mmol/L，α-酮戊二酸 2～20mmol/L。
3.根据权利要求2所述的同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为硫酸铵、甘油、丙二醇、乙二醇中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH中的一种。
5.权利要求2～4中任意一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
6.权利要求2～4中任意一种同型半胱氨酸诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明涉及同型半胱氨酸浓度的测定方法及同型半胱氨酸诊断试剂盒，采用同型半胱氨酸－α，γ－裂解酶与同型半胱氨酸裂解产生硫化氢、氨及α－氧代丁酸，由胱硫醚γ合酶与硫化氢再次合成同型半胱氨酸，使同型半胱氨酸被重复循环利用，并不断地扩增氨及琥珀酸，再利用谷氨酸脱氢酶或琥珀酸半醛脱氢酶分别作用于氨或琥珀酸，使还原型辅酶氧化成为氧化型辅酶，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，进而可以测算同型半胱氨酸浓度的大小。本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪得出所需的测定结果，精确度好，不受内外源物质的污染，其诊断试剂盒可以制成双剂或三剂，以减少各成分的交叉影响、保持试剂的稳定性。
文档编号G01N31/00GK1912582SQ200610041359
公开日2007年2月14日 申请日期2006年8月17日 优先权日2006年8月17日
发明者王尔中 申请人:王尔中