专利名称：用于鉴别繁殖型松材线虫的化学染色法的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴别繁殖型松材线虫的化学染色方法，具体地说涉及用于对繁殖型松材线虫病进行监测和识别的化学染色方法。
背景技术：
松材线虫病，俗称松树的“癌症”，松树一旦感染此病，长则半年，短则二个月就会死亡。此病自1982年在我国南京中山陵附近被首次发现以来，已经蔓延到包括江苏、安徽、广东、广西、浙江、福建、上海、重庆、湖北、山东等10余省市，86县市，受害面积达到126万亩，对南方5亿亩松林构成了严重威胁。而且发生范围还在逐年扩大。每年致死松树600多万株，造成直接经济损失25亿元，间接损失达250亿元(国家林业局统计资料)。目前，主要依靠清除所有病树来进行治理，从致病机理出发寻找适宜的防治方法成为当务之急。松材线虫病的病原——松材线虫为我国最重要的外来入侵种之一，其侵染循环可分为繁殖型和扩散型两部分。繁殖型线虫在健康松树内大量增殖而使松树发病。随着环境恶化，扩散型三龄幼虫(LIII)开始形成，从而进入扩散循环。LIII向松墨天牛的幼虫蛀道和蛹室周围聚集，随着天牛的羽化而脱皮变为四龄持久型幼虫(LIV)。LIV随着天牛取食而被携带到新的健康松树，开始新一轮的侵染循环。LIV通过取食或产卵时在树皮上所造成的伤口进入树脂道，然后脱皮变成成虫，这些雌、雄成虫交尾后产卵，卵孵化后变为繁殖型幼虫并大量繁殖而使松树很快枯萎变黄再次成为松墨天牛产卵的对象，产卵孵化的松墨天牛幼虫又进入松材线虫病树内取食蛀道。两者协调配合，为对方完成生活史提供所需条件，并利用对方创造的条件完成自身发育。繁殖型线虫的大量繁殖是松材线虫和松墨天牛联合造成松树快速死亡的前提，如果能尽早检测到繁殖型线虫的存在，则在症状尚未发生的潜伏期就能发现病害并采取措施，预防在林区的扩展。
目前在松材线虫的口岸检疫和林间发生地进行调查及培养观察时，繁殖型和扩散型线虫的识别都是使用显微镜虫体特征观察法。需要调查人员具有线虫虫体结构的基本知识，而且繁殖型和扩散型线虫不易区分，特别是统计繁殖型和扩散型线虫的比率时更显困难。另外，松材线虫初步判定目前尚无可靠指标，一些可靠的生化鉴定法操作复杂而且需要相关的设备和条件，在基层和野外不易进行。
本发明源自于利用松树寄主的萜烯类物质可特异性地刺激繁殖型线虫从化感器分泌特异性蛋白质，并可用库马西亮蓝进行染色，从而可方便简单地区分繁殖型线虫和扩散型线虫。此方法可利用在口岸检疫新鲜松树的松材线虫的鉴定上，也可用在野外调查及松材线虫培养观察时，繁殖型线虫的调查统计上。由于操作简单，易于判断，此方法也可用作松材线虫初步判定一项指标。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于鉴别繁殖型松材线虫的化学染色法，解决在口岸检疫的取样和松材线虫疫情发生地的调查取样及松材线虫培中的区分判断繁殖型线虫的非指标性和复杂性，及发生地的调查时初步判定松材线虫线虫的可靠性。
本发明的技术方案如下本发明提供的用于鉴别繁殖型松材线虫的化学染色法，通过选定特定的化学成分及其配比配制一种刺激剂，该刺激剂可以刺激繁殖型线虫从化感器分泌特异性蛋白质，并将所分泌的特异性蛋白质用库马西亮蓝进行染色，从而鉴别繁殖型线虫。
本发明提供的用于鉴别繁殖型松材线虫的化学染色法，其步骤如下1、将含有组份A、B及组份C的刺激剂溶于有机溶剂中；所述刺激剂与有机溶剂的重量份配比为2-50∶100；所述刺激剂中的组份A、B及组份C的重量份配比为54-90∶9-43∶1-5；所述组份A为α-蒎烯，组份B为β-蒎烯，组份C为长叶烯；2、将溶于有机溶剂中的刺激剂滴入含有松材线虫的水溶液中，并加入10μL的库马西亮蓝(brillant-blue P-250)，在室温下至少放置24小时，在显微镜下进行观察其分泌的特异性蛋白质被染色的为繁殖型松材线虫。
所述组份A、组份B及组份C的配比为90∶9∶1，效果最佳。
本发明用于鉴别繁殖型的化学染色法的操作方法为将按上述重量份配比的组份A、组份B和组份C组成的1.5μg刺激剂溶解在20μL二甲基亚砜(DMSO)后，加入至100μL含有松材线虫的水溶液中，并加入10μL的0.2％brillant-blue P-250(库马西亮蓝)在室温下放置24小时就可在显微镜下看到线虫头部分泌的被染色的特异性蛋白质。组份A、组份B和组份C的重量份配比为90∶9∶1时，效果最佳。
目前尚无鉴别繁殖型的化学染色法，本发明用于鉴别繁殖型的化学染色法的优异之处在于1)本发明提供的刺激繁殖型线虫从化感器分泌特异性蛋白质的刺激剂源自松树挥发物，属于天然有机物质；其结构稳定，常温常压下化学性质稳定，无毒，不污染环境；2)本发明提供的刺激剂含可刺激繁殖型线虫从化感器分泌特异性蛋白质的化合物萜类化合物，在市场上很容易购买，配制简单；3)本发明操作简便可靠，适用于基层的调查工作。
4)本发明在口岸及林间调查及实验室中，达到了很好的鉴别繁殖型和松材线虫初步判定的效果。
具体实施例方式
实施例1-3按表1所列的重量份配比组成的刺激1.5μg溶于20μL的二甲基亚砜(DMSO)，然后加入100μL含有松材线虫的水溶液中并加入10μL的0.2％ brillant-blue P-250(库马西亮蓝)在室温下放置24小时(每一处理作10重复)；并将观察到的染色效果列于表1。
表1 不同重量份配比组成的刺激对繁殖型松材线虫的染色效果
由表可知，使用本发明提供的用于鉴别繁殖型松材线虫的化学染色法，具有很好的鉴定效果，为我国松材线虫的检疫和调查研究提供了一种新的方法。
实施例4-6按表2所列的重量份配比组成的刺激0.5μg溶于20μL的三乙二醇二醋酸酯，然后加入100μL含有松材线虫的水溶液中并加入10μL的0.2％ brillant-blue P-250(库马西亮蓝)在室温下放置24小时(每一处理作10重复)；并将观察到的染色效果列于表1。
表2 不同重量份配比组成的刺激对繁殖型松材线虫的染色效果
实施例7-9按表3所列的重量份配比组成的刺激10.5μg溶于20μL的二氯甲烷，然后加入100μL含有松材线虫的水溶液中并加入10μL的0.2％brillant-blue P-250(库马西亮蓝)在室温下放置24小时(每一处理作10重复)；并将观察到的染色效果列于表3。
表3 不同重量份配比组成的刺激对繁殖型松材线虫的染色效果
权利要求
1.一种用于鉴别繁殖型松材线虫的化学染色法，其步骤如下1)将含有组份A、B及组份C的刺激剂溶于有机溶剂中；所述刺激剂与有机溶剂的重量份配比为2-50∶100；所述刺激剂中的组份A、B及组份C的重量份配比为54-90∶9-43∶1-5；所述组份A为α-蒎烯，组份B为β-蒎烯，组份C为长叶烯；2)将溶于有机溶剂中的刺激剂滴入含有松材线虫的水溶液中，并加入10μL的库马西亮蓝，在室温下至少放置24小时，在显微镜下进行观察其分泌的特异性蛋白质被染色的为繁殖型松材线虫。
2.按权利要求1所述的用于鉴别扩散型松材线虫的化学染色方法，所述组份A、组份B及组份C的配比为90∶9∶1。
全文摘要
本发明的用于鉴别繁殖型松材线虫的化学染色法，步骤是1)将刺激剂溶于二甲基亚砜溶剂中；刺激剂与二甲基亚砜的重量份配比为2－50∶100；刺激剂中的组份A、B及组份C重量份配比为54－90∶9－43∶1－5；组份A为α－蒎烯，组份B为β－蒎烯，组份C为长叶烯；2)将溶于二甲基亚砜中的刺激剂滴入含有松材线虫的水溶液中，并加入10μL的重量百分浓度为0.2％的库马西亮蓝，室温下放置24小时，显微镜下观察其分泌的特异性蛋白质被染色的为繁殖型松材线虫。本发明使用的刺激剂源自松树挥发物，属天然有机物质，结构稳定，无毒，无污染；且操作简便可靠，适于口岸及林间基层繁殖型松材线虫调查及检疫。
文档编号G01N31/22GK101042335SQ20061005844
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月24日 优先权日2006年3月24日
发明者孙江华, 韦卫, 赵莉蔺, 刘杏忠 申请人:中国科学院动物研究所