专利名称：用作肾毒性标记物的甲状腺素运载蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为肾毒性生物标记物的甲状腺素运载蛋白在肾皮质中的积累。
甲状腺素运载蛋白是一种不在肾脏中表达的血浆蛋白质，并且在血浆中检测到甲状腺素运载蛋白与例如某些肿瘤、营养不良或胰腺炎的存在相关。
本发明涉及甲状腺素运载蛋白积累的原位检测，其中在发生退化改变的肾皮质区域内鉴定甲状腺素运载蛋白的积累。因此，根据本发明，对肾皮质中甲状腺素运载蛋白积累的检测可用于评价肾毒性。
本申请证实，当施用庆大霉素时受调节的生物标记物之一被鉴定为甲状腺素运载蛋白(前白蛋白)，它是一个13kDa的血液转运蛋白。然后，通过Western印迹证实了该结果，这表明该蛋白质在来自庆大霉素处理大鼠的肾脏中比来自对照大鼠的肾脏中明显更多。
在药物研制过程中所测试的候选药物副作用之一是肾毒性。
肾毒性的特征在于近端小管的明显退化/再生(4级)，其在用100mg/kg/天的庆大霉素处理7天的大鼠内明显可见，因此证实庆大霉素处理诱导了肾毒性。因此，庆大霉素处理被用作鉴定肾毒性的新标记物。通过MAIDL IMS分析大鼠肾薄切片。分析所得到的谱图并将峰分等级。将质量m/z 12959的峰归为皮质中的第一位的等级，其在庆大霉素处理的大鼠肾脏中的平均信噪比为5，并且在对照中完全缺乏。
从皮质区域微抽提皮质蛋白质，并通过反相色谱分级分离。含有质量m/z 12959处峰的级分经串联MS鉴定为甲状腺素运载蛋白。
在原位以及在HPLC级分中证明了甲状腺素运载蛋白的存在。同样，也证明了通过串联质谱鉴定为甲状腺素运载蛋白S28-Q146(甲状腺素运载蛋白的一种加工形式)的m/z种类12959仅仅存在于庆大霉素处理样品的原位质谱中和HPLC级分D10质谱中。
因此，本发明提供一种评价肾毒性的方法，其包括以下步骤a)提供来自怀疑患有肾毒性的受试者的肾样品；b)确定与健康受试者相比甲状腺素运载蛋白在怀疑患有肾毒性的受试者肾皮质中的积累；其中，与健康受试者相比，甲状腺素运载蛋白在怀疑患有肾毒性的受试者肾皮质中的积累增加指示存在肾毒性。
所述受试者可以是哺乳动物。所述哺乳动物可以是非人哺乳动物。所述非人哺乳动物可以是大鼠。
甲状腺素运载蛋白在肾皮质中的积累可以通过任何适宜方法确定。此类方法之一是免疫组织化学，其使用甲状腺素运载蛋白特异的且适合免疫组织化学的抗体。开展免疫组织化学的方法是本领域技术人员众所周知的。另一种方法是对肾皮质提取物进行电泳以及随后通过例如使用甲状腺素运载蛋白特异抗体的Western印迹或质谱对甲状腺素运载蛋白的检测。检测肾皮质中甲状腺素运载蛋白积累的优选方法是肾切片的MALDI成像质谱(IMS)。这使得可以在损伤肾皮质中检测和定位标记物的加工形式。
附图简述
图1肾薄切片上的基质点样方案。
图2对照对庆大霉素处理大鼠肾脏皮质中7个最明显区别特征的聚类分析。
图3对照和庆大霉素处理大鼠肾脏皮质中m/z 12959的平均信号。
图4鉴定方案。
图5m/z 12959的串联质谱分析A)完整质谱图。B)简洁(Deconvulated)质谱图。C)解析的串联质谱图。
图6数据库检索结果。
图7A)来自肾皮质和HPLC级分D10的胞质部分的Western印迹分析。B)大鼠肾皮质和HPLC级分的MALDI MS分析，D10G/C庆大霉素/对照的HPLC级分D10；G/C庆大霉素/对照的肾胞质部分。
图8来自对照和庆大霉素处理大鼠肾的免疫组织化学检查。来自处理大鼠(A)和对照大鼠(B)的整个肾脏切片的扫描数字图像显示在处理的肾皮质内有高水平的甲状腺素运载蛋白免疫反应性。来自皮质(C、E)对髓质(D、F)的高放大倍数显微照片显示了TTR免疫反应性在处理肾脏皮质小管中的具体位置。通过二氨基联苯胺-Ni灰色沉淀和甲酚紫复染显示TTR免疫反应性。
实施例实施例1肾毒性的模型系统实施例1a)动物处理从当地管理机构获得动物研究许可，并且所有研究方案都遵守动物福利指南。大约12周龄的雄性HanBrlWistar大鼠(300g±20％)获自BRL，Füllinsdorf，瑞士。这些动物单独圈养在20℃及50％相对湿度的垫有木刨花的Macrolone笼中，12小时光照/黑暗循环，自由饮水和摄食Kliba 3433啮齿动物饲料(Provimi Kliba AG，Kaiseraugst，瑞士)。
用100mg/kg/天量的庆大霉素(溶于盐水)或媒介物皮下注射(sc)动物，连续处理7天，最后一次施用后24小时通过吸入CO2处死。在处死前立即在异氟烷麻醉下从眼后窦收集终末血样用于临床化学研究。
实施例1b)组织学典型肾脏样品在10％中性缓冲福尔马林中固定。所有样品均使用常规方法处理并用Paraplast包埋。切成约2-3微米的组织切片，并用苏木精-伊红(HE)或高碘酸-希夫反应(PAS)染色。
实施例2庆大霉素处理大鼠肾皮质的MALDI-IMS研究肾脏区域内(皮质、髓质、乳头)的差异蛋白质表达以便研究在组织病理学上所观察到的庆大霉素的毒性是否与通过IMS得到的结果相关联。当施用庆大霉素时，皮质区内的几个蛋白质峰受到明显的调节。
在用100mg/kg/天的庆大霉素处理7天的大鼠内清楚地观察到近端小管的明显退化/再生(4级)。该发现与通过MALDI IMS对大鼠肾脏薄切片的分析相关。如下所述，将9个对照和9个庆大霉素处理大鼠肾脏薄切片(来自3个动物，每个动物3片；如图1所示将基质点样于该薄切片上)进行质谱分析。
实施例2a)MALDI IMS样品制备切下大鼠肾脏，在干冰上迅速冷冻，并在进一步处理之前保存在-80℃。用冰冻切片机(LEICA CM 3000，Leica Microsystems)于-18℃切成12μm切片，贴于ITO-包被的传导载玻片上(氧化铟锡，50×75×0.9mm，Delta Technologies)。根据已公开的方法(Schwartz，S.A.，Reyzer，M.L.和Caprioli，R.M.(2003)Journal of Mass Spectrometry 38，699-708)进行样品制备。然后将组织切片浸没于乙醇浴中固定，并在真空下干燥30分钟。在所有过程中，这些切片尽可能储存在真空中。用移液器将MALDI基质手工点样。200nL新鲜制备的芥子酸溶液(以20mg/ml浓度溶于1∶1的水/乙腈、0.1％三氟乙酸中的3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸，Fluka)点在组织上。结晶后，在斑点上覆盖另外200nL的芥子酸溶液，并且将基质室温干燥。如果不立即通过质谱分析，则将样品置于真空下。
实施例2b)质谱使用带有标准337nm N2激光(在50Hz下工作且激光光斑大小为50μm)的UltraFlex MALDI ToF/ToF设备(Bruker Daltonics)获得MALDIMS谱图。在正线性模式(2kDa-30kDa)中以恒定激光功率操作设备。对于每个手工点样的基质滴平均进行总共8次的100次激光脉冲。使用蛋白质校准标准溶液(胰岛素、泛蛋白I、细胞色素C、肌球蛋白；BrukerDaltonics)对谱图进行外部校准。在获得后使用来自谱图的过量的已知峰(血红蛋白α-链、胸腺素β-4、细胞色素c氧化酶多肽VIIa L、泛蛋白、细胞色素c氧化酶多肽VIb)进行内部校准。
实施例2c)数据分析联合使用商业可得的工具和Vanderbilt大学内部开发的工具对图谱进行处理。使用ProTS-Date软件(Efeckta Technologies公司)进行基线扣除、归一化、峰检测和光谱调整。对所有谱图进行基线校准以去除化学噪声对信号的影响。该步骤可通过局部估计基线并从原始数据中扣除基线谱图来实现。对于本数据集，将软件进行设置，认为不同m/z区域分辨率的差异是因为窗口宽度是峰宽的10倍。通过按比例换算成一般总离子流，将基线校准的谱图在强度上进行归一化。使用ProTS-Date进行峰检测，并且选出一列13个共有峰作为使用二次校准功能的内部调整点。选择共有峰的标准是该峰必须在大于80％的待调整谱图中出现，必须没有干扰峰或重叠峰，并且这些峰具有小于7个质量单位的所观察矩心值标准偏差。为了避免出现在调整步骤中由外推所造成的误差，要在跨过从2500至15000质量单位的整个目的质量范围内选择调整峰。包含矩心值和归一化强度的峰表输出为单独文件。
使用Vanderbilt大学内部开发的程序，根据峰的m/z值，将峰表归类(bin)。使用遗传算法并行检索策略(Yanagisawa，K.，Shyr，Y.，Xu，B.J.，Massion，P.P.，Larsen，P.H.，White，B.C.，Roberts，J.R.，Edgerton，M.，Gonzales，A.，Nadaf，S.，Moore，J.H.，Caprioli，R.M.，和Carbone，D.P.(2003)The Lancet 362，433-439)，将输出的MALDI-TOF MS峰对样品进行调整。简言之，将峰归类在一起，这样使来自不同样品的峰数目最大化，同时来自同一样品的峰数目最小化。产生一系列质量窗口或峰类，使得相似峰从众多谱图中分开。为了使用加权灵活混合共变量方法(WeightedFlexible Compound Covariate Method)(WFCCM)确定用于庆大霉素诱导肾毒性的相关生物标记物，根据观察到的差异程度把谱图特征分等级。由Shyr，Y.等人(Shyr，Y.和KyungMann，K.(2003)A Practical Approach toMicroarray Data Analysis，D.Berrar编)描述的该策略使用了6个不同统计学检验的组合，以便计算基于在处理和对照之间所观察到差异的等级。
可以使用单一数据聚类分析成功区分对照和处理情况。如所期望，在皮质中发现了大多数的能区分对照和处理的峰。表1显示了经统计学鉴定为在对照皮质对处理样品皮质中上调或下调的蛋白质。图2显示了使用最高的7个等级的峰基于WMA、最大平均S/N和p值得到的簇。
表1在皮质中的谱形按照1)WMA、2)最大平均S/N、3)p值归类的用于庆大霉素诱导肾毒性的生物标记物等级
在该数据表中，在质量m/z 12959处的峰定为皮质中的第一位的等级，其在庆大霉素处理大鼠肾脏中的平均信噪比为5，并且在对照中完全缺乏(图3)。在m/z 6480上的双电荷种类显示具有相似行为。
实施例3微洗脱在皮质区域进行液体微抽提。
通过在肾脏皮质区域直接上下吹吸1μl溶剂(1∶1的水/乙腈、0.1％三氟乙酸)几秒钟进行蛋白质微抽提。在几个样品上重复该过程几次，得到约20μl体积的混合样品。然后，该样品在真空离心干燥仪中干燥，并重溶于95∶5的水/乙腈、0.1％三氟乙酸。
所得到的蛋白质混合物通过反相液相色谱分级分离。
使用配备1mm内径聚合柱(219TP5110，Vydac)的标准Agilent 1100系列HPLC(Agilent Technologies)以50μl/分钟流速进行蛋白质分级分离。溶剂A为溶于水的0.1％三氟乙酸，溶剂B为溶于乙腈的0.1％三氟乙酸。使用下列程序洗脱蛋白质5％的B溶液5分钟之后，在7分钟内梯度上升至35％的B溶液，然后在34分钟内梯度上升至60％的B溶液，接着在0.5分钟内增加至90％的B溶液并维持10分钟。从刚开始运行至48分钟每30秒收集一次级分，级分直接收集于96孔微量滴定板内(Greinerbio-one)。如果需要，样品可经几轮HPLC分级分离，然后合并相应的级分用以分析。
将1μl级分与1μl的溶于90∶10的水/乙腈、0.1％TFA中的1g/L芥子酸点在384MALDI锚定靶(Bruker Daltonics)上，通过MALDI-TOF MS测定所得到的LC级分。
通过比较IMS产生谱图和LC分级分离谱图，确定目的峰的存在。
实施例3a)蛋白质的鉴定然后，包含目的蛋白质种类的级分通过纳-ESI质谱进一步分析，并且目的蛋白质通过串联质谱鉴定。
为了鉴定蛋白质，含有目的质量的HPLC级分在真空离心干燥仪中干燥，并重溶于含1％甲酸的水/乙腈(1∶1)中，使用Applied Biosystems Q-StarPulsar在纳-电喷雾模式中的标准操作条件下进行蛋白质鉴定。选择目的质量中的多电荷种类之一进行串联质谱分析，记录其串联质谱图并人工解析。使用Mascot MS/MS离子检索程序(Matrix Science，http//www.matrixscience.com)利用SwissProt数据库(版本46.6)及0.1Da的片段和前体质量容限进行蛋白质鉴定。
鉴定该峰所采取的策略图解于图4。蛋白质从皮质区域微抽提，并通过反相色谱分级分离。m/z 12959的蛋白质存在于级分D10中，并可以成功地与在从组织样品直接记录的谱图中检测到的种类进行对比。将该级分干燥，并在50％乙腈、1％甲酸中重构用于串联质谱分析(图5)。产生的质谱可以与甲状腺素运载蛋白(swTTHY_RAT)的第28位Ser至第146位Gln成功匹配(图6)。
实施例4组织提取物和HPLC级分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析当施用庆大霉素时受调节的生物标记物之一被鉴定为甲状腺素运载蛋白(前白蛋白)，它是一个13kDa的血液转运蛋白。通过使用对该蛋白质高度特异的抗体进行Western印迹证实了该结果，这表明该蛋白质在来自庆大霉素处理大鼠的肾脏中比来自对照大鼠的肾脏中明显更多(图7)。
在含有250mM蔗糖和蛋白酶抑制剂(Roche Complete)的10mMTris-HCl pH7.6中将一片皮质匀浆，从而得到对照和处理大鼠肾脏的组织提取物。该组织提取物于4℃下连续离心三次(680g，10分钟；10000g，10分钟；100000g，1小时)，同时弃去沉淀，保留最后离心步骤的上清作为肾胞质组分。
将1μl肾胞质组分和相应HPLC级分在4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上电泳，并且随后将蛋白质转移到PVDF膜上。印迹膜在5％的奶粉(溶于含0.1％Tween 20的PBS)中封闭1小时，并用绵羊抗前白蛋白抗体(Abcam)(溶于含5％奶粉和0.1％Tween 20的PBS)室温孵育过夜。用含有0.1％Tween 20的PBS洗涤后，印迹膜与辣根过氧化物酶缀合的抗绵羊IgG抗体(Silenus Laboratories)孵育1小时。使用ECL western印迹试剂(Amersham)检测抗体结合。
同样，通过串联质谱鉴定为甲状腺素运载蛋白S28-Q146的m/z种类12959仅仅存在于庆大霉素处理样品的原位质谱中和HPLC级分D10的质谱中。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)<120>用作肾毒性标记物的甲状腺素运载蛋白<130>case 23145<160>2<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>147<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>甲状腺素运载蛋白<222>(1)..(147)<223>swissprot基因座TTHY_RAT，登录号P02767<400>1Met Ala Ser Leu Arg Leu Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Ile Phe1 5 10 15Ala Ser Glu Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu20 25 30Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Val Asp Val35 40 45Ala Val Lys Val Phe Lys Lys Thr Ala Asp Gly Ser Trp Glu Pro Phe50 55 60Ala Ser Gly Lys Thr Ala Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr65 70 75 80Asp Glu Lys Phe Thr Glu Gly Val Tyr Arg Val Glu Leu Asp Thr Lys85 90 95Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu Tyr Ala Glu100 105 110Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly His Arg His Tyr Thr Ile Ala115 120 125Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Asn
130 135 140Pro Gln Asn145<210>2<211>120<212>PRT<213>褐家鼠<220>
<221>Ser 28至Gln 146的加工形式<222>(1)..(120)<400>2Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser1 5 10 15Pro Ala Val Asp Val Ala Val Lys Val Phe Lys Lys Thr Ala Asp Gly20 25 30Ser Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys Thr Ala Glu Ser Gly Glu Leu35 40 45His Gly Leu Thr Thr Asp Glu Lys Phe Thr Glu Gly Val Tyr Arg Val50 55 60Glu Leu Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe65 70 75 80His Glu Tyr Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly His Arg85 90 95His Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr100 105 110Ala Val Val Ser Asn Pro Gln Asn115 120
权利要求
1.一种评价肾毒性的方法，其包括以下步骤a)提供来自怀疑患有肾毒性的受试者的肾样品；b)确定与健康受试者相比甲状腺素运载蛋白在怀疑患有肾毒性的受试者肾皮质中的积累，其中，与健康受试者相比，甲状腺素运载蛋白在怀疑患有肾毒性的受试者肾皮质中的积累增加指示存在肾毒性。
2.权利要求1所述的方法，其中所述受试者是非人哺乳动物。
3.权利要求2所述的方法，其中所述非人哺乳动物是大鼠。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述确定包括通过MALDI-IMS测定甲状腺素运载蛋白在肾皮质中的积累。
全文摘要
甲状腺素运载蛋白被鉴定为一种评价肾毒性的新标记。在肾毒性中，甲状腺素运载蛋白在肾皮质中积累，其中毒性作用的特征在于在暴露于毒性化合物的生物体中观察到近端小管的明显退化/再生。
文档编号G01N33/68GK1873415SQ20061008853
公开日2006年12月6日 申请日期2006年6月1日 优先权日2005年6月3日
发明者R·卡普廖利, A·迪克雷, H·迈斯特曼, S·吕佩 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司