专利名称：镁诊断/测定试剂盒及镁的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种镁诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁浓 度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
镁测定方法很多，概括起来有比色法、荧光法、离子层析法，离子
选择性电极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀 释质谱法(ID-MS)等。
镁测定的决定性方法是同位素稀释质谱法，参考方法是原子吸收分 光光度法法。这些方法虽然结果准确，但设备复杂，费用昂贵，不适 合常规实验室和自动分析。
比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达 旦黄法、邻甲酚酞络合酮法(0CPC)、钙镁试剂(Calmagite)法、以 及新近报道的2-(8'-羟基喹啉-5'-磺酸-7'-偶氮)-变色酸(8Q5SAC) 法。比色法操作简便，费用低，适合常规实验室应用。但存在试剂空 白吸光度高，胆红素和其它阳离子的干扰，试剂稳定性差及试剂中含 有腐蚀性或毒性成分等缺点。
离子选择性电极法可测定生理溶液中镁离子活度。采用中性载体 (ETH7025)液膜离子选择电极测定准确度较高。但还存在钙干扰(生 理范围内)Ca2+最大干扰10%等不足。 离子色谱法测定血清总镁在测定之前需对样本进行预处理，包括
酸化稀释和过滤。Thie叩ont等使用该法对五种国际标准和技术学会 用火焰原子吸收分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅 为0. 35%，认为离子色谱法可作为总镁测定有价值的参考方法。
Mg2+的酶法测定技术在近几年研究非常活跃，取得较大进展。已应 用于Mg2+测定的酶学方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联 法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激 酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖 变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦丙酮 酸激酶和乳酸脱氢酶偶联法。酶法检测镁结果准确，干扰影响小，适 合于自动化分析。由于酶试剂不断更新，使测定快速、灵敏，操作简 便，因而具有较好的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续
监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化， 得以测定镁浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的镁 诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全 自动生化分析仪上进行镁浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因 而可以得到切实的推广应用。
本发明镁浓度测定方法原理如下
腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸甘油激酶/Mg^甘油+ 腺苷三磷酸
甘油+辅酶甘油脱氢酶甘油酸+还原型辅酶
这种方法应用需要镁离子激活的甘油激酶(Glycerokinase ; EC 2.7丄30)酶(偶)联甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase ; EC 1丄1.6; EC1丄1.72; EC1丄1.156; EC 1丄99.22)酶促反应连续监测法。甘油 激酶酶解甘油-3-磷酸产生甘油，再通过(偶)联合甘油脱氢酶的作用， 最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm 处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速 度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算镁的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明镁诊断/测定
试剂盒较为理想
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
甘油激酶 12000 U/L
甘油脱氢酶 20000 U/L
腺苷二磷酸 6 mmol/L
甘油-3-磷酸 10mmol/L
本发明的镁诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、甘油激酶、甘油脱氢酶。 辅酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、甘油脱氢酶在试剂1 或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水 溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂l
缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸。 试剂3
缓冲液、稳定剂、甘油激酶、甘油脱氢酶。 辅酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、甘油脱氢酶在试剂1、 试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定镁浓度的方法，其辅酶可 以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的镁诊断/测定试剂为单试剂，包括:
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
甘油激酶 12000 U/L
甘油脱氢酶 20000 U/L
腺苷二磷酸 6 mmol/L
甘油-3-磷酸 10mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁样品 与试剂的体积比例为1/25,反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间 大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出镁的浓 度大小。 实施例二
本实施例的镁诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
辅酶
腺苷二磷酸 甘油-3-磷酸
歸mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L 12 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
甘油激酶
甘油脱氢酶
50 mmol/L
16000U/L
30000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始
吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测镁样品
与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，
延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化
分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出镁的浓
度大
小,
实施例三
本实施例的镁诊断/测定试剂为三试剂，包括: 试剂1(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
腺苷二磷酸
甘油-3-磷酸
画mmol/L 50 mmol/L 16 mmol/L 30 mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
甘油激酶
甘油脱氢酶
100mmol/L
50 mmol/L
24000 U/L 36000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定镁浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时 间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测镁样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟 左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出镁的浓
度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应 用。
权利要求
1.一种酶比色法的镁浓度测定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸 甘油激酶/Mg2+ 甘油+ 腺苷三磷酸甘油+辅酶 甘油脱氢酶 甘油酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出镁的浓度大小测定结果。
2. —种镁诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1~~~ 50mmol/L辅酶 1- 6 mmol/L甘油激酶 1000——80000 U/L甘油脱氢酶 1000——80000 U/L腺苷二磷酸 1——50 mmol/L甘油-3-磷酸 1——50mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述镁诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脱氢酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述镁诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脱氢酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺 苷二磷酸、甘油-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甘油激 酶、甘油脱氢酶组成。辅酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述镁诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、 甘油脱氢酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成; 试剂2，由缓冲液、稳定剂、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸组成；试剂 3，由缓冲液、稳定剂、甘油激酶、甘油脱氢酶组成。辅酶、腺苷 二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、甘油脱氢酶在试剂l、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述镁诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸 铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的镁诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定镁浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、腺苷二磷酸、甘油-3-磷酸、甘油激酶、甘油脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出镁的浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/84GK101173934SQ20061009731
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司