专利名称：一种检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测领域。具体而言，本发明涉及一种用于检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
喹乙醇(Olaquindox)，又名快育灵、倍育诺(Bayonox)、奥拉金、喹酰胺醇、Fedan。分子式C-(12)H-(13)N-3甲酸甲酯-3-O-4。由2-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物与乙醇胺缩合而成的淡黄色结晶性粉末，微溶于水。
喹乙醇抗菌效力好，促进生长发育，增加瘦肉率，价格便宜。因此曾经被作为抗菌促生长作用的饲料添加剂大量使用。
然而，喹乙醇在被大量使用后，人们也发现了许多问题，如鸡等禽类对喹乙醇敏感。人们对使用喹乙醇添加剂的鸡进行病理解剖时，发现鸡的脏器有药物致损的现象。喹乙醇在动物体内的残留时间长，蓄积毒性大，不仅能使动物中毒或死亡，而且残留在肉中对人体也有较大危害。由于喹乙醇是由2-甲酸甲酯-3-甲基喹噁啉-1、4-二氧化物与乙醇胺缩合而成的，有人认为喹乙醇在动物体内代谢后会生成甲基喹噁啉-1、4-二氧化物，这种物质能抑制脱氧核糖核酸的合成，对染色体畸变有影响，是一种致癌物。
鉴于喹乙醇的毒性和存在的潜在危害，因而人们重新对喹乙醇的安全性进行评价，对喹乙醇的使用也做出了新的规定。美国没有批准使用；欧盟也从1999年开起始全面禁止使用喹乙醇；我国对喹乙醇使用的限制也更加严格。我国农业部颁布的《动物性食品兽药最高残留限量》中也列入了喹乙醇。国家进出口检验检疫局制定了肉中喹乙醇残留量的检验方法《中华人民共和国进出口商品检验行业标准——出口肉中喹乙饲料添加剂质量监督检测实施细则》也把鸡饲料、饮水及鱼饲料中的喹乙醇作为违禁药物进行监督检验。
现有的喹乙醇检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大；再者这些方法需要复杂的仪器，且过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。
因为喹乙醇是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。喹乙醇人工抗原和特异性抗体以及在此基础上建立免疫分析方法尚未见报道。并且本发明首次用固体光气作为连接剂用于制备喹乙醇的人工抗原。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒。
本发明提供了一种快速检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括喹乙醇特异性抗体、喹乙醇-载体蛋白偶联物和酶标二抗。其中喹乙醇特异性抗体为兔抗喹乙醇的多克隆抗体，可用喹乙醇与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔)制得。所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。所述的喹乙醇-载体蛋白偶联物采用化学方法偶联得到。所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶，所述酶标二抗可以用商品化的辣根过氧化物酶酶标二抗，也可以通过过碘酸钠法或戊二醛法将辣根过氧化物酶与二抗偶联制得。在本发明的一个优选实施方案中，所述酶标二抗为羊抗兔IgG抗体。
用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。
为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括喹乙醇抗原或抗喹乙醇特异性抗体的酶标板、喹乙醇标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。
所述的洗涤液为0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1∶1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为四甲基联苯胺或邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的浓缩样品稀释液为含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
另一方面，本发明还提供了一种检测样品中喹乙醇含量的方法，包括步骤(1)样品前处理；(2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有喹乙醇抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗喹乙醇多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值；(3)分析检测结果。
本发明试剂盒的检测原理为将喹乙醇抗原吸附于固相载体上，加入样本或喹乙醇标准品溶液并加入喹乙醇抗体工作液，待测样品中喹乙醇和固相载体上包被的喹乙醇抗原竞争喹乙醇抗体，再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中喹乙醇的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出喹乙醇浓度范围。
有益效果本发明检测喹乙醇的试剂盒主要采用间接竞争酶联免疫测定法定性或定量样品中喹乙醇含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。
本发明该试剂盒采用高特异性的喹乙醇多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检测中发挥重要作用。
图1为喹乙醇酶联免疫检测试剂盒结构图。其中1为试剂盒盒体，2为包被了喹乙醇抗原或抗喹乙醇特异性抗体的酶标板，3为系列标准溶液，4为显色剂A，5为显色剂B，6为抗体溶液，7为酶标二抗溶液，8为酶标二抗稀释液，9为浓缩洗涤液，10为浓缩样品稀释液，11为试剂瓶架。
图2为喹乙醇抑制曲线。
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。
实施例2实施例1 免疫原的合成及免疫血清的制备1.1试剂与仪器喹乙醇(湖北中牧安达药业有限公司生产)，固体光气(BTC)(购自北京耀北生物技术有限公司)，吡啶(Pyridine，AR.WM＝79.10，含量＞99.5％，天津市科密欧化学试剂开发中心)，N，N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF，美国新泽西州ACROSORGANICS公司生产，购自百灵威化学试剂公司)，正三丁胺(Tributylamine，美国新泽西州ACROSORGANICS公司生产，购自百灵威化学试剂公司)，牛血清白蛋白(BSA)，二氯甲烷(北京世纪红星化工有限责任公司生产)
双光束紫外可见分光光度仪(TU-1909，北京普析通用仪器有限公司)，层析装置(3057型便携式记录仪，重庆川仪四厂；SBS系列数控计滴器，恒流泵，自动部分收集器，层析柱，上海沪西分析仪器厂)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机(Minispin最大转速13400rpm最大离心力12100rcf，2ml×12)，1.2喹乙醇人工抗原的合成称取26.3mg喹乙醇溶于3ml的吡啶和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合(1∶1)溶液中，称取固体光气(BTC)9.9mg溶于1ml二氯甲烷中。
将上述喹乙醇和固体光气两溶液混合。具体方法为在冰浴条件下先将少许BTC溶液滴加入喹乙醇溶液中，反应几分钟后将剩余的BTC溶液全部加入，转入室温搅拌反应1小时，得到混合溶液A。
称取50mg载体蛋白BSA或KLH分别溶于0.1mol/L pH8.4的5ml硼酸钠缓冲液中，向其中加入1ml DMF得到载体蛋白溶液B。
将溶液A逐滴加于载体蛋白溶液B中，缓慢滴加，半小时内加完，室温下反应4小时。
然后，将偶联物过SephadexG-25M凝胶层析纯化，用0.01M pH7.4 PBS三倍柱床体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓缩至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物，洗脱液用pH7.4 0.01M PBS。
通过紫外线扫描鉴定偶联物。具体操作为将喹乙醇溶于PBS(0.01M pH7.4)，浓度为15μg/ml；BSA溶于PBS(0.01M pH7.4)，浓度为1.03mg/ml；将纯化后的偶联物同样用PBS(0.01M pH7.4)作适当稀释，使其浓度与BSA浓度接近。将这三种溶液在200nm-400nm之间进行紫外扫描，得出各物质的紫外扫描波谱，如图1-3所示。从图1-3中可以看出喹乙醇与载体蛋白BSA偶联成功。
免疫及特异性抗体的制备将上述喹乙醇-BSA偶联物用生理盐水稀释成1mg/ml溶液备用。
选取6只体重2～2.5Kg健康雄性新西兰大白兔。将偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射器对抽法混合成油包水的乳浊液，按1mg/Kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血1ml，进行抗体效价检测，当抗体效价不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后颈动脉放血，室温凝固2h后4℃过夜，8000r/min离心10分钟，除去血块，血清部分用50％饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33％饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析后用SephadexG-25M层析，即得多克隆抗体。
实施例2 免疫检测方法的建立2.1 ELISA方法确定最佳包被浓度将1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml系列浓度的卵清蛋白(OVA)-喹乙醇偶联物按每孔100μl包被酶标板，4℃包被24h，洗涤5次，拍干，按每孔200μl封闭液4℃下封闭12h，洗涤3次，拍干。加入1∶500稀释的抗血清100μl，室温作用2h，洗涤三次，立即加入100μl酶标羊抗兔抗体，室温作用30min，洗涤三次，加100μl底物液，室温避光作用15min，50μl终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。同时设置空白对照孔(不加抗血清，只加其稀释液)和平行重复孔，取OD值为1.0左右时的包被浓度为最佳浓度。试验数据列于表3。
表1 不同包被浓度的OD值
由表3的数据中可以确定，最佳包被浓度为1μg/ml。
2.2间接ELISA检测抗体效价以1μg/ml浓度包被酶标板，从400倍开始倍比稀释抗血清，按2.1的ELISA步骤操作。以两倍于阴性血清OD值的抗血清OD值对应的抗血清稀释度为抗血清效价。抗血清效价检测结果见表4。
表2 抗血清效价检测结果
从表4的数据可以确定本发明制备的抗血清的效价在6000以上。
2.3间接竞争ELISA检测抗体特异性ELISA操作方法同2.1。不同的是每孔加入50μl不同浓度的游离喹乙醇与卵清蛋白(OVA)-喹乙醇偶联物竞争抗体，随后加入抗血清，得出不同的OD值。根据2.1的结果，所用抗血清最佳浓度为1∶500。喹乙醇系列浓度和试验孔的排列顺序见表3，同时设置平行重复孔和空白对照孔。以0抑制孔的OD值为最大值B0，其它抑制浓度孔OD值为B，B/B0＝50％时对应的喹乙醇浓度为此抗体的IC50值。抗体的特异性检测结果的数据列于表3。然后，用所得数据绘制出喹乙醇抑制曲线(图2)。
表3 抗血清特异性检测结果
由表3中数据可知，喹乙醇抗血清IC50值在5ng/ml左右，表明本发明制备的抗血清是具有良好的特异性的抗喹乙醇多克隆抗体。
实施例3 检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒的组建组建检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分(1)包被喹乙醇抗原的酶标板；(2)蛋白浓度为1mg/L的抗喹乙醇多克隆抗体；(3)用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体；(4)喹乙醇标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(5)底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液为四甲基联苯胺；(6)洗涤液为含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液；(7)浓缩样品稀释液为0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液；(8)终止液为2mol/L的盐酸溶液。
实施例3 检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒的组建组建检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分(1)包被羊抗兔抗抗体的酶标板；(2)蛋白浓度为5mg/L的抗喹乙醇多克隆抗体；(3)用辣根过氧化物酶标记的喹乙醇；(4)喹乙醇标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(5)底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺；
[6)洗涤液为0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液；(7)浓缩样品稀释液为0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液；(8)终止液为2mol/L的盐酸溶液。
实施例4 样品中荚克多巴胺残留的检测1、样品前处理准确称取5g饲料于40ml离心管中。加入20ml样品稀释液(0.01％吐温-20的磷酸盐缓冲液)，加热至60℃，充分振荡10分钟，4000rpm离心10min，取上清5ml。
2、用试剂盒进行检测向喹乙醇-OVA偶联物包被的酶标板微孔中加系列标准品或样品溶液50μl，再加入抗体工作液(1mg/L的抗喹乙醇多克隆抗体)50μl，室温反应1小时。倒出孔中液体，每孔加入250μl经10倍稀释了的洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板3次，用吸水纸拍干。每孔加入酶标记抗抗体100μl，避光室温孵育30min。底物显色液A液(过氧化脲)50μl，再加B液(四甲基联苯胺)50μl，轻轻振荡混匀，室温避光显色15min，每孔加入终止液(2mol/L盐酸)50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。
结果分析计算百分吸光度值并绘制标准曲线，相对应每一个样品中喹乙醇的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程法计算出在样本中喹乙醇的含量。利用专业电脑软件更便于大量的样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色的深浅与系列浓度标准溶液颜色的比较，可以判断出样本中喹乙醇的浓度范围。
实验例1 试剂盒精密度试验本实验例为标准可重复性试验。具体操作为从每批实施例2或3中的方法制备的酶标板中，各抽取10个孔，测定4.5μg/L的标准溶液的吸光度值(OD)，重复3次，计算变异系数CV％。
结果表明变异系数范围在4.8-7.6％之间，符合了变异系数小于20％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了要求。
实验例2 试剂盒的回收率试验取两个浓度的喹乙醇标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。结果表明饲料中的添加回收率为60％-85％。
实验例3 试剂盒保存期试验试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、50％抑制浓度、喹乙醇添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃保存6个月以上。
权利要求
1.一种检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒，其中包括喹乙醇特异性抗体、喹乙醇-载体蛋白偶联物和酶标二抗。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括包被了喹乙醇抗原或抗喹乙醇特异性抗体的酶标板、喹乙醇标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。
3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述喹乙醇特异性抗体为多克隆抗体。
4.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。
5.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗为羊抗兔IgG抗体。
7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的洗涤液为含有0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的显色剂由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
9.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的浓缩样品稀释液为含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
10.一种检测样品中喹乙醇含量的方法，包括步骤(1)样品前处理；(2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有喹乙醇抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗喹乙醇多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值；(3)分析检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的喹乙醇的酶联免疫试剂盒包括喹乙醇特异性抗体、喹乙醇与载体蛋白的偶联物、和酶标二抗。本发明的检测喹乙醇的酶联免疫试剂盒灵敏、快速、准确，主要用于大批样品的筛查；盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测饲料及畜产品中残留的喹乙醇。
文档编号G01N33/544GK1888903SQ200610103899
公开日2007年1月3日 申请日期2006年8月8日 优先权日2006年8月8日
发明者杨曙明, 于洪侠 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所