专利名称：工程化微生态系统运行状态的诊断方法
技术领域：
本发明涉及的是一种诊断工程化微生态系统运行状态的技术方法，可以用于工程化微生态系统中故障的诊断和排除，属于微生物技术领域。
背景技术：
工程化微生态系统在许多国民经济生产部门中都具有重要地位，微生物群落在食品发酵、菌肥生产、饲料生产、生物冶金以及环境工程等多个工业部门之中都具有重要的用途。这些工业部门或者利用微生物群落来获得有价值的产品，比如食品、菌肥、饲料和金属，或者用于环境的治理，比如废水的生物处理。这些工业部门所采用的工艺往往都是非常复杂的，需要包括若干个工艺阶段或者若干个工艺组成部分。比如说陈醋的发酵工艺中就经常分为产品的发酵阶段和产品的后熟阶段。而在废水处理中，因为有机物的去除，脱氮和除磷很难在一个反应器中同时完成，所以整个处理工艺需要多个不同的反应器的协同参加。系统中一个反应器中微生物群落的活动会改变环境中的物理、化学参数以及营养的组成，从而影响同一反应器中下一阶段或者同一工艺中下一个反应器的群落结构组成，因此微生物群落的时空演替广泛地存在于工程化的微生态系统之中。在一个设计合理的工程化微生态系统中，微生物群落结构的时空演替往往是必须的，群落的演替是实现群落之间功能互补进而高效地协同完成工艺设定目标的前提条件。因为工艺设计的不同和用途的不一致，不同的工程化微生态系统中具有不同的时空演替模式，所以微生物群落的时空演替模式是工程化生态系统的重要特征。而在工程化微生态系统遇到故障时，其固有的时空演替模式也会遭到破坏，因此对于工程化微生态系统群落时空演替的分析能够使我们在系统的水平上对整个工艺进行优化和调控，并在系统出现故障时发现故障产生的位置并对故障发生的原因进行分析。
经对现有技术的文献检索发现，仅有部分研究涉及对于工程化生态系统中群落时间演替的研究，但是并未将其用于工程化生态系统中故障的诊断和排除。如Guieysse等人2001年在《Applied Microbiology and Biotechnology》(应用微生物与生物技术)56卷，780-787页上报道，在一个批次流加硝酸和苯酚的厌氧反应器中，使用主成份分析(principal component analysis，PCA)结合RAPD和T-RFLP两种指纹图谱技术对驯化阶段反应器微生物群落的时间演替进行了描述。首先，该文献研究仅涉及群落的时间演替，而没有涉及群落的空间演替。其次，该文献仅针对一个实验装置在驯化阶段的群落演替，不涉及群落时空演替在实际工程系统中的应用。最后，该文献提出的方法并不完善，不能根据对群落演替模式的分析寻找到排除故障的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出了一种工程化微生态系统运行状态的诊断方法。使其通过正常系统和故障系统之间微生物群落时空演替的差别来对工程化生态系统中出现的故障进行诊断和排除，解决了现有技术中的难题。
本发明是通过以下技术方案实现的。包括以下步骤(1)提取样品的基因组DNA；所述的样品的基因组DNA，具体为正常系统和故障系统中不同反应器的样品或者同一反应器中不同时间点的样品。
所述的从样品的基因组DNA进行16S rDNA V3区PCR，并通过TGGE/DGGE指纹图谱分析所有样品的微生物群落结构；进而通过对系统轨迹进行PCA分析，比较正常系统和故障系统之间群落演替模式的差别，并通过PCA载量分析找到在群落演替中起着重要作用的DGGE条带并对DGGE条带所代表的微生物种群进行鉴定。
(2)16S rDNA V3区PCR-TGGE/DGGE指纹图谱分析；所述的16S rDNA V3区PCR-TGGE/DGGE指纹图谱，用其分析同一工业装置不同反应器或者同一反应器中不同时间点之间微生物群落结构的变化，25μl的16S rDNA V3区PCR体系包括引物P2和P3各6.25pmol，其序列分别为5’-ATTACCgCggCTgCTgg-3’，5’-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggCC TACgggA ggCAgCAg-3’，dNTP各5mmol，模板DNA 10ng，Taq DNA聚合酶1U以及配套1×buffer及50mmol MgCl2。
所述的16S rDNA V3区PCR，其扩增程序如下94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，每两个循环退火温度降低1℃直到55℃，然后55℃退火保持到循环结束，72℃延伸1分钟，共进行25个循环，最后72℃延伸10分钟；采用UVI band/map软件对条带的迁移位置和亮度进行分析。
(3)对系统轨迹进行PCA分析，比较正常系统和故障系统之间群落演替模式的差别；对系统轨迹进行PCA分析，比较正常系统和故障系统之间群落演替模式的差别，具体为每一个反应器或者每一时间点上的DGGE指纹图谱可以转换为一组多维向量，不同的迁移位置代表不同的维度，而条带的亮度作为每一维度的数值。
所述的DGGE指纹图谱，每一个样品的DGGE指纹图谱就对应了多维空间的一个点，把每个反应器或者每一个时间点所对应的点在多维空间中连接起来就组成了一条系统轨迹。
所述的系统轨迹代表系统的空间或者时间的群落演替，再使用PCA分析对多维空间里的系统轨迹进行降维，然后可以直观地在一个二维平面或者三维空间里比较正常系统和故障系统之间群落演替模式的差别。
(4)通过PCA载量分析找到在群落演替中起着重要作用的DGGE条带；所述的通过PCA载量分析找到在群落演替中起着重要作用的DGGE条带，具体为对一正常系统中的微生物群落时空演替轨迹进行PCA载量分析，在主成份上载量大的条带即代表了对于群落时空演替贡献较大的种群。
(5)对DGGE条带所代表的微生物种群进行鉴定。
本发明通过比较故障系统和正常系统的群落演替模式，找到故障出现的位置。并进一步通过对正常系统群落演替模式的分析，为解决系统的故障提供指导和帮助。
图1A1-A2-O固定生物膜工艺流程示意图。
图中1为A1反应器，2为A2反应器，3-6为01、02、03、04反应器，7为进水泵，8为回流泵，9为曝气装置，10为挡板。
图2各个反应器的微生物群落PCR-DGGE指纹图谱示意中所标记的是在系统空间演替中起重要作用的条带图3LNR，LR和I三个系统的微生物群落空间演替轨迹的PCA分析示意4LR系统A2池到O4池的微生物群落空间演替轨迹的PCA分析图。
图5工业系统恢复前(I)和工业系统恢复后(IRe)中各个反应器的微生物群落PCR-DGGE指纹图谱示意6对工业系统恢复前后微生物群落空间演替轨迹的PCA分析图。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步描述本发明。
实施例1焦化废水处理装置中微生物群落结构空间演替模式的比较焦化废水含有高浓度的氨氮和以酚类化合物、多环芳烃和杂环化合物为主的有机物污染，直接排放将对环境产生极大的危害。A1(厌氧)-A2(缺氧)-O(好氧)固定膜法被广泛应用于焦化废水的生物处理中(如图1所示)，其构建编号如下A1反应器1，A2反应器2，01、02、03、04反应器的编号依次为3，4，5，6，进水泵7，回流泵8，曝气装置9，挡板10。
在本实施例中，一个按照此工艺设计的工业装置(I系统)从其投入运行之始就出现COD和NH3-N去除效率低的故障，该故障持续了三年都未能找到出现故障的原因。
为了得到该工艺条件下正常的微生物群落空间演替模式，本实施例按照相同的工艺构建了一套实验室模拟装置作为参照系统(LR系统)。同时，还切断实验装置的回流装置，形成一个带有人为故障的实验室装置(LNR系统)。我们首先使用16S rDNA V3区PCR-DGGE指纹图谱分析分析了I，LR和LNR三个系统中A1，A2，01，02，03和04六个反应器中微生物群落的组成(如图2所示)。在三个系统的所有反应器中总共有402条条带分布在62个不同的迁移位置上。因此，每一个反应器的DGGE指纹图谱可以转换为一个62维向量，其中62个不同的迁移位置分别代表不同的维度，而条带的亮度作为每一维度的数值(如果没有条带则相应维度上的值为0)。这样每一个反应器的DGGE指纹图谱就对应了这个62维空间里的一个点，把系统中每个反应器所对应的点沿着群落演替的顺序分别连接起来就组成了一条系统轨迹。这样的一条轨迹就代表了系统的空间群落演替模式。因此I，LR和LNR三个系统的微生物群落空间演替的模式可以分别用三条62维空间中的系统轨迹来代表。可以进一步使用PCA分析对这些复杂的多维系统轨迹进行降维，这样就可以在一个二维平面或者三维的空间里对这三个系统的微生物群落空间演替模式进行直观地比较(图3)。
参照系统(LR)的系统轨迹首先是沿着右上方从A1延伸到A2，然后沿着右下方从A2延伸到O4。与参照系统相比，工业装置(I)的系统轨迹在A2以后就停止了延伸，这说明从工业装置中A2池到O4池的空间演替没有被建立起来。与参照系统相比，带有故障的实验室装置(LNR)的空间演替模式与参照系统总体相似，但是A2紧挨着A1而与到O的距离变远。这意味着在LNR系统中，从A1到A2的空间群落演替受到明显的迟滞。通过以上分析可以看到，出现故障的系统，其微生物群落的空间演替模式就会受到延迟或者破坏(如图3所示)。
对空间演替的比较分析，可以帮助找到故障出现的位置和原因。对于带有故障的实验室装置(LNR)来说，其故障在于没有回流液进入到A2池，而其空间演替模式中最明显的的迟滞发生在A2池，这正好反映出LNR系统的出现故障的位置。而对于出现故障的工业装置中来说，A2到O4的空间群落演替遭到了破坏正好说明故障应该发生在A2池到O4池。A2池与O池最大的差别在于氧的供应。O池中应该充分曝气而A2池中仅仅因为回流而带来极少量的氧气。工业装置中的群落演替轨迹在A2池到O4池就几乎停止了延伸了，这是因为这四个反应器几乎有着几乎完全一样的群落结构。好氧池中曝气装置的故障是引起A2到O4群落演替停滞最有可能的原因。
对代表正常空间演替模式的系统轨迹进行PCA分析可以帮助我们找到群落演替过程中重要的种群。对参照系统中A2池到O4池的空间演替模式进行了单独分析(如图4所示)。PC1和PC2分别能够解释80.3％和14.2％的数据差异。条带8，33，34，35，38，52和53具有相对较大的PC1载量。条带13具有最大的PC2载量(如图2、表1所示，)。这些条带代表了从A2到O4池群落演替中最重要的
种群。条带53和38的亮度都逐渐增加，条带8，33，34，35，38和52都逐渐降低，而条带13首先升高(A2到O1)然后再降低(O1到O4)。这些不同种群的动态变化是这些种群在群落演替的过程中相互协作和竞争的结果。通过构建克隆文库或者直接割胶对这些条带进行鉴定(如表1所示，)。Band53代表了Nitrospira属的种群，它具有最大的PC1正载量，而band34和35则代表了Thauera属的种群，它们分别具有第一和第二大的PC1负载量。所以这些Thauera属和Nitrospira属的种群都是A2池到O4池群落空间演替中最重要的种群。
在工业装置的故障被排除以后，使用16S rDNA V3 PCR-DGGE分析了工业装置在修复前(I系统)和修复后(IRe系统)每个反应器的群落结构(如图5所示)，并用PCA对工业装置在修复前和修复后的空间群落演替的系统轨迹进行了分析，结果发现从A2池到O4池的空间群落演替在修复后的工业装置中得到了恢复(如图6所示)。
权利要求
1.一种工程化微生态系统运行状态的诊断方法，其特征在于，包括以下步骤(1)提取样品的基因组DNA；(2)16S rDNA V3区PCR-TGGE/DGGE指纹图谱分析；(3)对系统轨迹进行PCA分析，比较正常系统和故障系统之间群落演替模式的差别；(4)通过PCA载量分析找到在群落演替中起着重要作用的DGGE条带；(5)对DGGE条带所代表的微生物种群进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的工程化微生态系统运行状态的诊断方法，其特征是，所述的样品的基因组DNA，具体为正常系统和故障系统中不同反应器的样品或者同一反应器中不同时间点的样品。
3.根据权利要求1或者2所述的工程化微生态系统运行状态的诊断方法，其特征是，从所述的样品的基因组DNA进行16S rDNA V3区PCR，并通过TGGE/DGGE指纹图谱分析所有样品的微生物群落结构；进而通过对系统轨迹进行PCA分析，比较正常系统和故障系统之间群落演替模式的差别，并通过PCA载量分析找到在群落演替中起着重要作用的DGGE条带，对DGGE条带所代表的微生物种群进行鉴定。
4.根据权利要求1所述的工程化微生态系统运行状态的诊断方法，其特征是，所述的16S rDNA V3区PCR-TGGE/DGGE指纹图谱，用其分析同一工业装置不同反应器或者同一反应器中不同时间点之间微生物群落结构的变化，25μl的16S rDNA V3区PCR体系包括引物P2和P3各6.25pmol，其序列分别为5’-ATTACCgCggCTgCTgg-3’，5’-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggCC TACgggA ggCAgCAg-3’，dNTP各5mmol，模板DNA 10ng，Taq DNA聚合酶1U以及配套1×buffer及50mmol MgCl2。
5.根据权利要求1所述的工程化微生态系统运行状态的诊断方法，其特征是，所述的16S rDNA V3区PCR，其扩增程序如下94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，每两个循环退火温度降低1℃直到55℃，然后55℃退火保持到循环结束，72℃延伸1分钟，共进行25个循环，最后72℃延伸10分钟；采用UVI band/map软件对条带的迁移位置和亮度进行分析。
6.根据权利要求1所述的工程化微生态系统运行状态的诊断方法，其特征是，对系统轨迹进行PCA分析，比较正常系统和故障系统之间群落演替模式的差别，具体为每一个反应器或者每一时间点上的DGGE指纹图谱可以转换为一组多维向量，不同的迁移位置代表不同的维度，而条带的亮度作为每一维度的数值。
7.根据权利要求1所述的工程化微生态系统运行状态的诊断方法，其特征是，所述的DGGE指纹图谱，每一个样品的DGGE指纹图谱对应了多维空间的一个点，把每个反应器或者每一个时间点所对应的点在多维空间中连接起来就组成了一条系统轨迹。
8.根据权利要求1所述的工程化微生态系统运行状态的诊断方法，其特征是，所述的系统轨迹代表系统的空间或者时间群落演替，再使用PCA分析对多维空间里的系统轨迹进行降维，然后能直观地在一个二维平面或者三维空间里比较正常系统和故障系统之间群落演替模式的差别。
9.根据权利要求1所述的工程化微生态系统运行状态的诊断方法，其特征是，所述的通过PCA载量分析找到在群落演替中起着重要作用的DGGE条带，具体为对一正常系统中微生物群落的时空演替轨迹进行PCA载量分析，在主成份上载量大的条带即代表了对于群落时空演替贡献较大的种群。
全文摘要
本发明涉及一种微生物技术领域的工程化微生态系统运行状态的诊断方法。包括以下步骤(1)提取样品的基因组DNA；(2)16S rDNA V3区PCR－TGGE/DGGE指纹图谱分析；(3)对系统轨迹进行PCA分析，比较正常系统和故障系统之间群落演替模式的差别；(4)通过PCA载量分析找到在群落演替中起着重要作用的DGGE条带；(5)对DGGE条带所代表的微生物种群进行鉴定。本发明可以应用于工程化微生态系统的时空演替分析。通过分析微生物群落时空演替出现的问题，诊断故障出现的位置和产生的原因，同时为解决工业装置出现的故障提供线索，为调控和优化工程化微生态系统的功能提供指导。并且该方法还可以用来鉴定微生物群落时空演替过程中重要的微生物种群。
文档编号G01N33/48GK1932504SQ20061011662
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月28日 优先权日2006年9月28日
发明者赵立平, 严兴, 冯晓西, 毛跃建, 刘彬彬, 朱晨光 申请人:上海交通大学