专利名称：独一味药材、中间体及其注射液的指纹图谱质量检测方法
技术领域：
本发明涉及中药材、中间体及其注射液的质量检测方法，特别涉及独一味药材、中间体及其注射液的指纹图谱质量检测方法。
背景技术：
独一味中主要的化学成分主要有黄酮类成分和环烯醚萜类成分和一些脂肪酸类成分等。黄酮类成分主要有木犀草素、木犀草素-7-o-葡萄糖苷，槲皮素、槲皮素-3-o-阿拉伯糖苷，芹菜素等成分。目前中药的质量标准很不规范和完善，质量分析和评价的手段还很落后，无法准确的反映现有中药材以及成品的质量状况。中药指纹图谱是借鉴法医学中指纹鉴定的概念，经适当处理，用一定的分析手段得到能够反映中药特征的共有色谱峰，通过共有色谱峰来鉴定中药的真伪，确保中药的质量。同时结合中药中的有效成分的含量作定量测定，不仅可以对原料药材进行真假鉴别，同时也让中药内在的指标成分量化、标准化。
通过比较筛选，因槲皮素在指纹图谱中出峰时间相对稳定，且在该时间段供试品没有色谱峰出现，可作为“标尺”来标定各特征峰，所以本发明应用高效液相色谱法以槲皮素作为内标物质，进行中药材、中间体、成品的指纹图谱研究并建立相应的对照指纹图谱，并以此作为控制原药材及成品质量的重要指标。
在200410083678.7号专利申请中虽然也涉及到了独一味指纹图谱的相关技术内容，但是该专利申请在药材、中间体和注射剂供试品的制备过程中引入了大孔吸附树脂进行前处理，因而可能对最终的结果造成至少两个方面的影响其一是大孔吸附树脂在吸附和洗脱的过程中不可避免的会引入新的物质；其二是大孔吸附树脂在处理的过程中，将供试品中的有关物质吸附。不能反映真实的指纹特征。
发明内容
本发明目的在于提供独一味药材或独一味注射液中间体及其注射液的指纹图谱质量检测方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现本发明独一味药材的指纹图谱质量检测方法，该方法包括如下步骤色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃；分析时间1小时；进行梯度洗脱前10分钟，按流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90的比例关系进行洗脱，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90变为乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85；10-40分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85变为乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70；40-50分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70变为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；50-60分钟，流动相保持为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；参照物溶液的制备取槲皮素对照品，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；供试品溶液的制备取粉碎后过内径为5mm筛的独一味药材粉末1-10重量份，优选5重量份，置烧瓶中，加水50-200体积份，优选100体积份，回流提取1-3小时，优选2小时，滤过，水液蒸干，残渣加甲醇适量溶解，1000r/min离心，上清液移置20体积份容量瓶中，加入参照物溶液0.4-4体积份，优选2体积份，甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定；供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度大于0.90；独一味药材共有指纹峰的相对保留时间分别为1号峰0.145±0.002，2号峰0.154±0.002，3号峰0.199±0.001，4号峰0.220±0.001，5号峰0.231±0.001，6号峰0.242±0.001，7号峰0.260±0.002，8号峰0.298±0.003，9号峰0.313±0.002，10号峰0.336±0.003，11号峰0.369±0.003，12号峰0.386±0.004，13号峰0.402±0.001，14号峰0.414±0.002，15号峰0.476±0.006，16号峰0.484±0.004，17号峰0.533±0.003，18号峰0.550±0.001，19号峰0.585±0.002，20号峰0.642±0.005，21号峰0.661±0.003，22号峰0.760±0.001，23号峰0.796±0.007，24号峰即S峰1，25号峰1.077±0.012；相对峰面积比值分别为1号峰0.136±0.100，2号峰1.648±0.564，3号峰1.745±0.653，4号峰0.062±0.031，5号峰0.728±0.247，6号峰0.370±0.141，7号峰0.230±0.112，8号峰0.116±0.048，9号峰0.815±0.262，10号峰0.090±0.025，11号峰0.132±0.107，12号峰0.228±0.140，13号峰0.154±0.193，14号峰0.142±0.183，15号峰1.752±0.455，16号峰2.508±1.357，17号峰0.541±0.379，18号峰0.179±0.152，19号峰2.508±2.437，20号峰0.202±0.109，21号峰0.330±0.262，22号峰0.349±0.137，23号峰0.206±0.046，24号峰即S峰1，25号峰0.205±0.077。
上述体积份与重量份的关系为毫升与克的关系。
本发明独一味注射液中间体的指纹图谱质量检测方法，该方法包括如下步骤色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃；分析时间1小时；进行梯度洗脱前10分钟，按流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90的比例关系进行洗脱，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90变为乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85；10-40分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85变为乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70；40-50分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70变为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；50-60分钟，流动相保持为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；参照物溶液的制备取槲皮素对照品，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；供试品溶液的制备取独一味注射液中间体0.5-2体积份，优选1体积份，置10体积份的容量瓶中，加入参照物溶液0.5-2体积份，优选1体积份，甲醇稀释至10体积份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定；供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度大于0.90；独一味注射液中间体共有指纹峰的相对保留时间分别为1号峰0.143±0.001，2号峰0.153±0.001，3号峰0.165±0.001，4号峰0.198±0.001，5号峰0.217±0.001，6号峰0.230±0.001，7号峰0.242±0.002，8号峰0.260±0.001，9号峰0.312±0.001，10号峰0.391±0.008，11号峰0.475±0.002，12号峰0.484±0.002，13号峰0.532±0.001，14号峰0.554±0.004，15号峰0.586±0.001，16号峰0.640±0.003，17号峰0.660±0.002，18号峰0.717±0.001，19号峰即S峰1，20号峰1.070±0.007；共有指纹峰的相对峰面积比值分别为1号峰0.029±0.019，2号峰0.384±0.138，3号峰0.028±0.013，4号峰0.260±0.013，5号峰0.094±0.005，6号峰0.121±0.004，7号峰0.058±0.007，8号峰0.086±0.010，9号峰0.127±0.003，10号峰0.037±0.001，11号峰0.352±0.014，12号峰0.619±0.026，13号峰0.119±0.012，14号峰0.032±0.006，15号峰1.402±0.054，16号峰0.051±0.006，17号峰0.183±0.010，18号峰0.066±0.042，19号峰即S峰1，20号峰0.036±0.005。
上述独一味注射液中间体的制备方法如下，但不限于本方法取独一味药材，加水煎煮三次，第一次加15～25倍的水浸泡0.5～1小时，煎煮0.5～1.5小时，第二次、第三次各加10～20倍量水，分别煎煮0.5～1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至药液浓度为1∶1～2的浓缩液；加乙醇使含醇量达60％～80％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液再加乙醇使含醇量达80％～90％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液用30％～50％的氢氧化钠调PH至8～9，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液加10％～30％硫酸调PH至5～6，放置1～3小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入注射用水稀释至适量，5～8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液加活性炭0.05％～0.25％，煮沸15～30分钟，过滤，滤液加入注射用水至与药材重量比为20体积重量份，得独一味注射剂中间体。
本发明独一味注射液的指纹图谱质量检测方法，该方法包括如下步骤色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃；分析时间1小时；进行梯度洗脱前10分钟，按流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90的比例关系进行洗脱，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90变为乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85；10-40分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85变为乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70；40-50分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70变为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；50-60分钟，流动相保持为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；参照物溶液的制备取槲皮素对照品，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；供试品溶液的制备取独一味注射液0.5-2体积份，优选1体积份，置10体积份的容量瓶中，加入参照物溶液0.5-2体积份，优选1体积份，甲醇稀释至10体积份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定；供试品指纹图谱与对照指纹图谱；相似度大于0.90；独一味注射液共有指纹峰的相对保留时间分别为1号峰0.141±0.005，2号峰0.153±0.001，3号峰0.199±0.001，4号峰0.218±0.002，5号峰0.233±0.002，6号峰0.242±0.001，7号峰0.260±0.001，8号峰0.312±0.001，9号峰0.475±0.001，10号峰0.484±0.001，11号峰0.530±0.001，12号峰0.550±0.001，13号峰0.0.585±0.001，14号峰0.659±0.001，S峰1；共有指纹峰的相对峰面积比值分别为1号峰0.023±0.028，2号峰0.168±0.140，3号峰0.163±0.078，4号峰0.054±0.021，5号峰0.067±0.029，6号峰0.031±0.022，7号峰0.047±0.048，8号峰0.057±0.049，9号峰0.164±0.110，10号峰0.325±0.174，11号峰0.066±0.066，12号峰0.048±0.050，13号峰0.591±0.423，14号峰0.091±0.071，S峰1。
上述独一味注射液制备方法可以是如下方法，但不限于本方法取独一味药材，加水煎煮三次，第一次加15～25倍的水浸泡0.5～1小时，煎煮0.5～1.5小时，第二次、第三次各加10～20倍量水，分别煎煮0.5～1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至药液浓度为1∶1～2的浓缩液；加乙醇使含醇量达60％～80％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液再加乙醇使含醇量达80％～90％，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液用30％～50％的氢氧化钠调PH至8～9，于5～8℃冷藏12～24小时，滤过；滤液加10％～30％硫酸调PH至5～6，放置1～3小时，滤过，回收乙醇至无醇味，加入注射用水稀释至适量，5～8℃冷藏12～24小时，滤过，滤液加活性炭0.05％～0.25％，煮沸15～30分钟，过滤，滤液加入注射用水至与药材重量比为10体积重量份，搅匀，然后加入氯化钠，加入0.05％～0.25％活性炭，加热至80℃，煮沸15～30分钟，滤过，滤液加注射用水稀释至适量，用稀硫酸调pH值5.5～6.0，补加注射用水至与药材重量比为20体积重量份，用0.22μm微孔滤膜滤过，灌装于5ml安瓿中，灭菌，即得。上述体积重量份的比例为ml/g。
在本发明中独一味药材，独一味注射液中间体以及独一味注射液三种供试品的特征峰数量递减也准确的反映了独一味药材在制备成独一味注射液过程中，不必要物质随制备过程不断去除的现象，更加准确的反映和表现了独一味在制备过程中不断精制，去除与治疗无关的相关成分，利于在生产过程中精确的对产品质量进行控制和监测。
本申请在药材、中间体和注射剂供试品的制备过程中未引入大孔吸附树脂进行前处理，确保了有效成分最大限度的在指纹图谱中体现，能反映真实的指纹特征。
实验研究表明本发明独一味药材、中间体及其注射液指纹图谱质量检测方法的供试品溶液在24小时内稳定；各峰的分离度较好，基线较平稳，药材指纹图谱与制剂指纹图谱的有较好相关性；的精密度良好；方法的重现性良好。由结果表明，本发明药材指纹图谱，具有一定的专属性，可明显区分不同产地的药材差异，为药材的鉴别提供依据，区别药材的伪劣，为生产合格的制剂提供前体和保障，工艺已相对的稳定，可用于制剂的工业化生产；本发明制定的中间体指纹图谱具有一定的专属性，可用于工艺的监控，保证成品的质量；本发明的独一味注射液指纹图谱具有一定的专属性，可用于成品质量的控制，保证成品的质量。
图1为独一味药材标准指纹图谱；图2为独一味中间体标准指纹图谱；图3为独一味注射液标准指纹图谱。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1 独一味药材指纹图谱实验(1)药材的来源药材来源主要为甘肃省武都县，产地比较固定，药材生长的自然环境相同，因此收集该地区不同地方的药材或不同采收季节的药材和市售的药材作为供试品；同时收集不同产地的药材作为供试品与之相比较，使药材具有足够的代表性。见表1。
表1独一味药材来源
独一味中主要的化学成分主要有黄酮类成分和环烯醚萜类成分和一些脂肪酸类成分等。黄酮类成分主要有木犀草素、木犀草素-7-o-葡萄糖苷，槲皮素、槲皮素-3-o-阿拉伯糖苷，芹菜素等成分。实验应用高效液相色谱法以独一味中黄酮类成分作为检测指标进行实验，建立药材的指纹图谱。
(2)仪器与试药Agilent1100高效液相色谱仪，Chemistation色谱工作站，Thermo ODS-2HYPERSIL(C18，250mm×4.6mm，5μm)色谱柱。
Sartorius型分析天平(感量0.1mg、0.01mg)，德国赛多利斯公司生产。乙腈，色谱纯，进口，MERCK公司。水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
(3)色谱条件的选择①流动相的选择选择以甲醇-0.2％磷酸水溶液和乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相进行实验，结果表明，乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相时，色谱峰的峰形好，各峰分离较完全，故选用乙腈-0.2％磷酸水溶液作为流动相。
由于样品中成分复杂，在恒流条件下，样品中的各个成分分离度差，较难体现指纹图谱的整体特性；流动相以如下梯度运行，样品中各组分均有较好的分离，基线平稳，故选用作为流动相。
表2梯度运行表
流速以1ml/min较为适合，在此条件下，各峰分离较好。
②检测波长的选择应用DAD检测器对供试品进行了全波长测定比较，结果在254nm所测指纹图谱中主要色谱峰的响应值较大，各色谱峰特征突出，故确定最大吸收波长为254nm。
③色谱柱的选择由于样品中主要成份为黄酮类成份，因此采用通用的十八烷基键合硅胶为填充剂色谱柱进行分离。Thermo ODS-2 HYPERSIL(C18，250mm×4.6mm，5μm)色谱柱。
在上述色谱条件下进样考察，结果样品在此填料色谱柱分离度很好，确定选用5u C18(2)100A，4.6mm×250mm，色谱柱。
(4)梯度滞后时间测定用一零体积连接器代替色谱柱，以甲醇为溶剂A，含0.1％丙酮的甲醇为溶剂B，检测波长为260nm，梯度运行见下表表3梯度运行
结果梯度滞后时间为0min。
(5)供试品溶液的制备供试品溶液主要是提取和富积药材中的黄酮类成分，为了便于对比药材和制剂的相关性，参照制剂的制备工艺，实验设计如下提取方法①取粉碎后过内径为5mm筛的药材粉末5g，置烧瓶中，加水100ml，回流提取2小时，滤过，浓缩至20ml，加乙醇至醇浓度为75％，冰箱放置12小时，滤过，回收乙醇，残渣加95％乙醇溶解，定容于20ml的容量瓶中摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；②取粉碎后过内径为5mm筛的药材粉末5g，置烧瓶中，加95％乙醇100ml，回流提取2小时，滤过，蒸干，残渣加95％乙醇溶解定容于20ml的容量瓶中摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；③取粉碎后过内径为5mm筛的药材粉末5g，置烧瓶中，加水100ml，回流提取2小时，滤过，蒸干，残渣加适量甲醇溶解，离心(1000r/min)，上清液定容于20ml的容量瓶中摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
分别吸取10ul进样测定。结果表明方法①制备的供试品溶液色谱图中各峰分离度较好，有较强的特征性，但方法复杂，时间较长，因此不能采用；方法②虽然各峰的分离度较好，基线较平稳，但由于与制剂工艺相差较大，测得药材指纹图谱与制剂指纹图谱的相关性较差，因此也没有采用；方法③各峰的分离度较好，基线较平稳，测得药材指纹图谱与制剂指纹图谱的有较好相关性，因此确定采用该方法制备药材供试品溶液。
(6)分析时间在上述色谱条件的下进样考察2小时，结果表明，在60分钟内，样品中所有峰均可被完全洗脱出，故分析时间确定为1小时。
(7)方法学考察①稳定性实验取同一供试品溶液，分别在不同时间进样检测，考察指纹图谱相似度变化情况，结果见表4。
表4.稳定性实验相似度评价结果
实验结果表明在24小时内，相似度没有明显的变化，RSD％小于0.3％，说明供试品溶液在24小时内是稳定的。
②精密度实验取同一供试品溶液连续进样5次，考察指纹图谱相似度变化情况，结果见表5。
表5精密度实验相似度评价结果 实验结果表明5次进样的相似度相没有明显的变化，RSD％小于0.3％，表明仪器的精密度良好。
③重现性实验取同一批号药材5份，照供试品溶液的制备方法同法制备供试品溶液，在上述条件下检测，以考察供试品制备方法的重现性，结果见表6。
表6重现性实验相似度评价结果 结果显示，5份样品进样后测定的相似度没有明显的变化，RSD％小于0.3％，说明该方法的重现性良好。
(8)相似度评价表7十批独一味药材相似度评价
实验例2 独一味中间体及注射剂指纹图谱色谱条件选择采用梯度洗脱，流动相随时间的变化情况见表8。
表8梯度运行表
流速lml/min；检测波长254nm。
柱温30℃； 分析时间1小时。
结果表明，在此色谱条件下测定，样品中个色谱峰特征突出，分离度好，基线平稳。
实验例3 独一味中间体指纹图谱稳定性实验取独一味中间体1ml，置10ml的溶量瓶中，加入取槲皮素对照品适量，加甲醇制成0.4mg/ml的溶液1ml，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，得供试品溶液，分别在不同时间进样10μl检测，记录色谱图，考察指纹图谱相似度变化情况，结果见表9。
表9稳定性实验相似度评价结果 实验结果表明在24小时内，相似度均大于0.98，RSD为0.05％，说明供试品溶液在24小时内基本稳定。
实验例4 独一味中间体指纹图谱重现性实验表10重现性实验相似度评价结果 结果显示，5份样品进样后测定的指纹图谱相似度均大于0.98，RSD为0.09％，相似度变化不显著，说明该方法的重现性良好。
实验例5 独一味中间体指纹图谱相似度评价表11十批独一味中间体指纹图谱相似度评价 结果显示各批相似度没有显著的变化，RSD％为0.26％，小于3.0％，表明本方法制定的中间体指纹图谱具有一定的专属性，可用于工艺的监控，保证成品的质量。
实验例6 独一味中间体及注射液指纹图谱供试品溶液制备方法选择实验①取独一味中间体或注射液原液作为供试品溶液。
②取独一味中间体或注射液1ml，置10ml的溶量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为供试品溶液。
分别取上述供试品溶液10μl进样测定，记录色谱图。结果表明样品原液进样，各个色谱峰的分离度较差，基线不平稳；样品甲醇稀释进样后，各个色谱峰的分离度较好，基线平稳。色谱图和原液进样色谱图各个色谱峰比例没有显著的差别，能客观全面的反应制剂的整体特征，因此确定采用②方法作为供试品溶液的制备方法。
实验例7 独一味注射液指纹图谱稳定性实验取同一供试品溶液，分别在不同时间10μl进样检测，记录色谱图，考察指纹图谱相似度变化情况，结果见表12。
表12稳定性实验相似度评价结果 实验结果表明在24小时内，相似度变化不明显，RSD％小于3.0％，说明供试品在24小时内是稳定的。
实验例8 独一味注射液指纹图谱供试品制备方法的重现性实验取同一批号样品5份，照供试品溶液的制备方法同法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，计算相似度。结果见表13表13重现性实验相似度评价结果 结果显示，5份样品进样后测定的指纹图谱相似度均大于0.98，RSD为0.79％，RSD％小于3.0％，说明该方法的重现性良好。
实验例9 独一味注射液指纹图谱相似度评价表14十批独一味注射液指纹图谱相似度评价
结果显示各批样品相似度没有显著的变化，RSD％为2.65％，小于3.0％，表明工艺已相对的稳定，可用于制剂的工业化生产。本方法制定的独一味注射液指纹图谱具有一定的专属性，可用于成品质量的控制，保证成品的质量。
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
具体实施例方式
实施例1独一味药材的指纹图谱质量检测方法色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃；分析时间1小时；进行梯度洗脱梯度洗脱
参照物溶液的制备取槲皮素对照品适量，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；
供试品溶液的制备取粉碎后过内径为5mm筛的药材粉末5g，置烧瓶中，加水100ml，回流提取2小时，滤过，水液蒸干，残渣加甲醇适量溶解，1000r/min离心，上清液移置20ml容量瓶中，精密加入参照物溶液2ml，甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定；供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度大于0.90；独一味药材共有指纹峰的优选相对保留时间分别为0.145±0.002(1)，0.154±0.002(2)，0.199±0.001(3)，0.220±0.001(4)，0.231±0.001(5)，0.242±0.001(6)，0.260±0.002(7)，0.298±0.003(8)，0.313±0.002(9)，0.336±0.003(10)，0.369±0.003(11)，0.386±0.004(12)，0.402±0.001(13)，0.414±0.002(14)，0.476±0.006(15)，0.484±0.004(16)，0.533±0.003(17)，0.550±0.001(18)，0.585±0.002(19)，0.642±0.005(20)，0.661±0.003(21)，0.760±0.001(22)，0.796±0.007(23)，1(S)(24)，1.077±0.012(25)；优选相对峰面积比值分别为0.136±0.100(1)，1.648±0.564(2)，1.745±0.653(3)，0.062±0.031(4)，0.728±0.247(5)，0.370±0.141(6)，0.230±0.112(7)，0.116±0.048(8)，0.815±0.262(9)，0.090±0.025(10)，0.132±0.107(11)，0.228±0.140(12)，0.154±0.193(13)，0.142±0.183(14)，1.752±0.455(15)，2.508±1.357(16)，0.541±0.379(17)，0.179±0.152(18)，2.508±2.437(19)，0.202±0.109(20)，0.330±0.262(21)，0.349±0.137(22)，0.206±0.046(23)，1(S)(24)，0.205±0.077(25)。
实施例2独一味中间体的指纹图谱质量检测方法色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃；分析时间1小时；进行梯度洗脱梯度洗脱
参照物溶液的制备取槲皮素对照品适量，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；供试品溶液的制备取独一味注射液中间体1ml，置10ml的溶量瓶中，精密加入参照物溶液1ml，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定；供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度大于0.90；独一味中间体共有指纹峰的优选相对保留时间分别为0.143±0.001(1)，0.153±0.001(2)，0.165±0.001(3)，0.198±0.001(4)，0.217±0.001(5)，0.230±0.001(6)，0.242±0.002(7)，0.260±0.001(8)，0.312±0.001(9)，0.391±0.008(10)，0.475±0.002(11)，0.484±0.002(12)，0.532±0.001(13)，0.554±0.004(14)，0.586±0.001(15)，0.640±0.003(16)，0.660±0.002(17)，0.717±0.001(18)，1(19)(S)，1.070±0.007(20)；共有指纹峰的优选相对峰面积比值分别为0.029±0.019(1)，0.384±0.138(2)，0.028±0.013(3)，0.260±0.013(4)，0.094±0.005(5)，0.121±0.004(6)，0.058±0.007(7)，0.086±0.010(8)，0.127±0.003(9)，0.037±0.001(10)，0.352±0.014(11)，0.619±0.026(12)，0.119±0.012(13)，0.032±0.006(14)，1.402±0.054(15)，0.051±0.006(16)，0.183±0.010(17)，0.066±0.042(18)，1(19)(S)，0.036±0.005。
实施例3独一味注射液的指纹图谱质量检测方法色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃；分析时间1小时；进行梯度洗脱梯度洗脱
参照物溶液的制备取槲皮素对照品适量，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；供试品溶液的制备取独一味注射液1ml，置10ml的容量瓶中，加入参照物溶液1ml，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定；供试品指纹图谱与对照指纹图谱；相似度大于0.90；独一味注射液共有指纹峰的优选相对保留时间分别为0.141±0.005(1)，0.153±0.001(2)，0.199±0.001(3)，0.218±0.002(4)，0.233±0.002(5)，0.242±0.001(6)，0.260±0.001(7)，0.312±0.001(8)，0.475±0.001(9)，0.484±0.001(10)，0.530±0.001(11)，0.550±0.001(12)，0.0.585±0.001(13)，0.659±0.001(14)，1(S)(15)；共有指纹峰的优选相对峰面积比值分别为0.023±0.028(1)，0.168±0.140(2)，0.163±0.078(3)，0.054±0.021(4)，0.067±0.029(5)，0.031±0.022(6)，0.047±0.048(7)，0.057±0.049(8)，0.164±0.110(9)，0.325±0.174(10)，0.066±0.066(11)，0.048±0.050(12)，0.591±0.423(13)，0.091±0.071(14)，1(S)(15)。
权利要求
1.一种独一味药材的质量控制方法，其特征在于该方法中指纹图谱的检测步骤为色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃；分析时间1小时；进行梯度洗脱前10分钟，按流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90的比例关系进行洗脱，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90变为乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85；10-40分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85变为乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70；40-50分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70变为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；50-60分钟，流动相保持为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；参照物溶液的制备取槲皮素对照品，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；供试品溶液的制备取粉碎后过内径为5mm筛的独一味药材粉末1-10重量份，置烧瓶中，加水50-200体积份，回流提取1-3小时，滤过，水液蒸干，残渣加甲醇适量溶解，1000r/min离心，上清液移置20体积份容量瓶中，加入参照物溶液0.4-4体积份，甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定；共有指纹峰的相对保留时间分别为1号峰0.145±0.002，2号峰0.154±0.002，3号峰0.199±0.001，4号峰0.220±0.001，5号峰0.231±0.001，6号峰0.242±0.001，7号峰0.260±0.002，8号峰0.298±0.003，9号峰0.313±0.002，10号峰0.336±0.003，11号峰0.369±0.003，12号峰0.386±0.004，13号峰0.402±0.001，14号峰0.414±0.002，15号峰0.476±0.006，16号峰0.484±0.004，17号峰0.533±0.003，18号峰0.550±0.001，19号峰0.585±0.002，20号峰0.642±0.005，21号峰0.661±0.003，22号峰0.760±0.001，23号峰0.796±0.007，24号峰即S峰1，25号峰1.077±0.012；共有指纹峰的相对峰面积比值分别为1号峰0.136±0.100，2号峰1.648±0.564，3号峰1.745±0.653，4号峰0.062±0.031，5号峰0.728±0.247，6号峰0.370±0.141，7号峰0.230±0.112，8号峰0.116±0.048，9号峰0.815±0.262，10号峰0.090±0.025，11号峰0.132±0.107，12号峰0.228±0.140，13号峰0.154±0.193，14号峰0.142±0.183，15号峰1.752±0.455，16号峰2.508±1.357，17号峰0.541±0.379，18号峰0.179±0.152，19号峰2.508±2.437，20号峰0.202±0.109，21号峰0.330±0.262，22号峰0.349±0.137，23号峰0.206±0.046，24号峰即S峰1，25号峰0.205±0.077。
2.如权利要求1所述独一味药材的质量控制方法，其特征在于该方法中供试品溶液的制备步骤为取粉碎后过内径为5mm筛的独一味药材粉末5重量份，置烧瓶中，加水100体积份，回流提取2小时，滤过，水液蒸干，残渣加甲醇适量溶解，1000r/min离心，上清液移置20体积份容量瓶中，加入参照物溶液2体积份，甲醇定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
3.一种独一味注射剂中间体的质量控制方法，其特征在于该方法中指纹图谱的检测步骤为色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃；分析时间1小时；进行梯度洗脱前10分钟，按流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90的比例关系进行洗脱，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90变为乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85；10-40分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85变为乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70；40-50分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70变为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；50-60分钟，流动相保持为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；参照物溶液的制备取槲皮素对照品，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；供试品溶液的制备取独一味注射液中间体0.5-2体积份，置10体积份的容量瓶中，加入参照物溶液0.5-2体积份，甲醇稀释至10体积份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定；共有指纹峰的相对保留时间分别为1号峰0.143±0.001，2号峰0.153±0.001，3号峰0.165±0.001，4号峰0.198±0.001，5号峰0.217±0.001，6号峰0.230±0.001，7号峰0.242±0.002，8号峰0.260±0.001，9号峰0.312±0.001，10号峰0.391±0.008，11号峰0.475±0.002，12号峰0.484±0.002，13号峰0.532±0.001，14号峰0.554±0.004，15号峰0.586±0.001，16号峰0.640±0.003，17号峰0.660±0.002，18号峰0.717±0.001，19号峰即S峰1，20号峰1.070±0.007；共有指纹峰的相对峰面积比值分别为1号峰0.029±0.019，2号峰0.384±0.138，3号峰0.028±0.013，4号峰0.260±0.013，5号峰0.094±0.005，6号峰0.121±0.004，7号峰0.058±0.007，8号峰0.086±0.010，9号峰0.127±0.003，10号峰0.037±0.001，11号峰0.352±0.014，12号峰0.619±0.026，13号峰0.119±0.012，14号峰0.032±0.006，15号峰1.402±0.054，16号峰0.051±0.006，17号峰0.183±0.010，18号峰0.066±0.042，19号峰即S峰1，20号峰0.036±0.005。
4.如权利要求3所述的独一味注射剂中间体的质量控制方法，其特征在于该方法中供试品溶液的制备步骤为取独一味注射液中间体1体积份，置10体积份的容量瓶中，加入参照物溶液1体积份，甲醇稀释至10体积份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
5.一种独一味注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中指纹图谱的检测步骤为色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃；分析时间1小时；进行梯度洗脱前10分钟，按流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90的比例关系进行洗脱，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液10∶90变为乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85；10-40分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液15∶85变为乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70；40-50分钟，流动相由乙腈-0.2％磷酸水溶液30∶70变为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；50-60分钟，流动相保持为乙腈-0.2％磷酸水溶液40∶60；参照物溶液的制备取槲皮素对照品，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；供试品溶液的制备取独一味注射液0.5-2体积份，置10体积份的容量瓶中，加入参照物溶液0.5-2体积份，甲醇稀释至10体积份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，测定；共有指纹峰的相对保留时间分别为1号峰0.141±0.005，2号峰0.153±0.001，3号峰0.199±0.001，4号峰0.218±0.002，5号峰0.233±0.002，6号峰0.242±0.001，7号峰0.260±0.001，8号峰0.312±0.001，9号峰0.475±0.001，10号峰0.484±0.001，11号峰0.530±0.001，12号峰0.550±0.001，13号峰0.0.585±0.001，14号峰0.659±0.001，S峰1；共有指纹峰相对峰面积比值分别为1号峰0.023±0.028，2号峰0.168±0.140，3号峰0.163±0.078，4号峰0.054±0.021，5号峰0.067±0.029，6号峰0.031±0.022，7号峰0.047±0.048，8号峰0.057±0.049，9号峰0.164±0.110，10号峰0.325±0.174，11号峰0.066±0.066，12号峰0.048±0.050，13号峰0.591±0.423，14号峰0.091±0.071，S峰1。
6.如权利要求5所述的独一味注射液的质量控制方法，其特征在于该方法中供试品溶液的制备步骤为取独一味注射液1体积份，置10体积份的容量瓶中，加入参照物溶液1体积份，甲醇稀释至10体积份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，即得。
全文摘要
本发明公开独一味药材、中间体及其注射液的指纹图谱质量检测方法。该方法色谱条件及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，进行梯度洗脱；取槲皮素对照品，加甲醇制成40μg/ml的溶液，作为参照物溶液；独一味药材供试品溶液的制备取药材粉末，回流提取，滤过，水液蒸干，残渣加甲醇适量溶解，离心；上清液，加参照物溶液，甲醇定容，摇匀，滤过，取滤液，即得；中间体及其注射液供试品溶液的制备取独一味注射液中间体或注射液，加参照物溶液，甲醇稀释，摇匀，滤过，取滤液，即得；测定法吸取参照物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪中，测定；供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度大于0.90。
文档编号G01N30/00GK1947740SQ200610138560
公开日2007年4月18日 申请日期2006年11月9日 优先权日2006年11月9日
发明者阙文彬, 李育飞 申请人:成都优他制药有限责任公司