专利名称：维生素d化合物的释放试剂的制作方法
维生素D化合物的释放试剂背景信息本发明涉及用于释放与维生素D -结合蛋白相结合的维生素D化合 物的试剂组合物，用于检测25-羟基维生素D化合物的方法，其中通过 使用这种试剂，25-羟基维生素D化合物从维生素D-结合蛋白中释放， 并且分析如此所获得的混合物。本发明还涉及用于释放维生素D化合物 的试剂的用途以及检测25-羟基维生素D的试剂盒，其包含用于释放除 常见免疫试剂之外的维生素D化合物的试剂。维生素D的充分供给是必需的，如术语"维生素(vitamin)，，早已暗示 的那样。维生素D的缺乏导致严重的疾病如询偻病或者骨质疏松。虽然 在上个世纪的早期，维生素D仍然被看作一种单一物质，但是在过去的 三十年内，维生素D系统已经变为一种维生素D代谢产物的复杂且多 样的网络。如今，40种以上的不同的维生素D代谢产物是已知的 (Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281)。人类只能通过来自阳光的紫外线作用于皮肤上而产生D3维生素或 者维生素D2(calciferols)。在皮肤中产生的维生素D3结合到所谓的维生 素D-结合蛋白，其将它输送到肝脏中，在此通过25-羟基化作用将它转 化为25-羟基维生素D3。除皮肤和肝脏之外，许多其它组织目前已知涉 及维生素D新陈代谢，而上述两个器官早已在下述文献中提及，(参考 Schmidt-Gayk, H. et al. (eds.), "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic AMP", Springer Verlag, Heidelberg (1990) pp. 24-47)。 25-羟基维生素D，更具体地说，25-羟基维生素D2和25-羟基维 生素D3，就其数量而言，是人有机体中的重要存储形式。当需要时，这 些前体可以在肾中转化而形成生物活性的la,25-二羟基维生素D，所谓 的D激素。生物活性的维生素D尤其调节从肠的钙吸收、骨矿化，并 且影响许多其它代谢途径如胰岛素体系。测量维生素D水平本身是没有多少益处的，当测定患者的维生素D 状况时，因为取决于食物吸收，维生素D(维生素D2和维生素D》的浓度 变化很大。另外，在循环(24小时)中维生素D具有较短的生物半衰期，因此出于这种原因也不是合适的测定患者的维生素D状况的参数。同样也适用于生理活性形式的维生素D(l,25-二羟基维生素D)。这些生物活 性形式同样以较小的且较大变化的浓度存在，相比于25-羟基维生素D 而言。由于全部这些原因，特别地，25-羟基维生素D的量化是一种合 适的全面分析患者的总的维生素D状况的手段。25羟基维生素D或者其它维生素D化合物对维生素D-结合蛋白的 结合使得维生素D化合物的测定极大地复杂化。全部已知的方法要求待 分析的维生素D化合物从其与结合蛋白形成的复合物中释放或者分离。 在下文中，为了简化的目的，这被称为从维生素D-结合蛋白中释放维生 素D化合物，虽然当然其只能从维生素D化合物和维生素D-结合蛋白 的复合物中，而不是单独地从维生素D-结合蛋白中被释放。因为维生素D-结合蛋白具有恰当再摺起的高倾向，通常需要首先释 放维生素D化合物，然后使待被分析的维生素D化合物与维生素D-结 合蛋白分离。由于25-羟基维生素D的高的临床价值，许多方法从文献中是已知 的，这使得25-羟基维生素D可以或多或少:故可靠地测定。Haddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 992-995, and Eisman, J.A. et al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305例如描述了使用高 压液相色谱(HPLC)测定血液样品中25-羟基维生素D的浓度。其它测定25-羟基维生素D的方法尤其是基于使用维生素D结合蛋 白，如牛奶中存在的那些。因此，Holick, M.F.和Ray, R. (US 5,981,779) 以及DeLuca等(EP 0 583 945)描述了用于羟基维生素D和二羟基维生 素D的维生素D分析，其基于这些物质结合到维生素D-结合蛋白，其 中这些物质的浓度是通过竟争性测试程序测定的。然而，这种方法的先 决条件是待测定的维生素D代谢产物首先必需从原始的血液或者血清 样品中分离并且必需通过例如色谙进行纯化。Armbruster, F.P.等(W099/6721 l)教导了为通过乙醇沉淀法进行维 生素D测定，应当制备血清或者血浆样品。在这种方法中，通过离心作 用除去蛋白质沉淀物，并且乙醇(ethanolic)上清液包含可溶维生素D代 谢产物。这些可以在竟争性结合分析中进行测量。或者，EP 0753743教导了蛋白质可以和血液或者血清样品分离，使 用高碘酸盐。在这种情况下，在获自用高碘酸盐处理的样品的无蛋白质的上清液中测定维生素D化合物。在一些商业测试中，乙腈被推荐用于萃取血清或者血浆样品(例如，在DiaSorin的放射免疫分析中或者在 "Immundiagnostik"公司的维生素D测试中)。最近几年中，许多不同的释放试剂被提出，其原则上应当适于从样 品中存在的结合蛋白中释放维生素D化合物。然而，这种释放或者脱附 (detachment)应当在较温和条件下进行，使得能够在结合测试中直接使用 用释放试剂处理的样品(参见例如WO 02/57797和US 2004/0132104)。最 近几年中虽然进行了很多努力，但是用于测定维生素D的所有可得的方 法具有缺点，如费力的样品制备，差的标准化，测试程序间的差的协调 性或者加料(spiked)维生素D的差的回收(就此特别参见Zerwekh, J.E., 见上文)。特别难以使维生素D化合物的测试自动化。自动化要求解决非常困 难的问题，即钢丝行走生存(surviving a tightrope walk): —方面，必需在 合适的释放试剂的帮助下从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物， 另 一 方面，条件必需被选择使得所述样品可以直接进行进一 步的分析。 这种直接进一步的分析的先决条件是， 一方面，维生素D-结合蛋白在这 种分析期间没有结合或者不再显著地结合维生素D化合物并由此不妨 碍这种分析，而另一方面，所用的释放试剂没有妨碍检测试剂如抗体结 合到待检验的维生素D-结合蛋白。另外，众所周知，维生素D-结合蛋 白的不同的等位基因存在于人群中，其生物化学行为不同。维生素D化 合物的释放和测量应当对于各种等位基因/表型是可比较的。因此,本发明的目的是开发一种用于维生素D化合物的释放试剂， 特别是用于羟基维生素D化合物的释放试剂，其可以至少部分地解决现 有技术的问题。在下文中描述了并且由所附权利要求涵盖了用于释放维 生素D化合物的合适的试剂组合物，用于测定25-羟基维生素D化合物 的方法，试剂组合物的用途和使用该试剂组合物的用于测定25-羟基维 生素D化合物的试剂盒。发明内容本发明涉及一种从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物的试 剂组合物，其具有3.8-4.8的pH值并且包含5-30vol。/。的一种或多种选自 二甲亚砜(DMSO)和液体有机酰胺的两性试剂以及任选地0.7-8volQ/。的短 链(C1-C3)醇。此外，本发明涉及一种免疫检测25-羟基维生素D化合物的方法， 包括以下步骤a)混合待检验的样品与用于从维生素D-结合蛋白中释 放维生素D化合物的试剂，这形成了混合物，该混合物具有3.8-4.8的 pH值并且包含5-20volQ/。的一种或多种选自二曱亚砜(DMSO)和液体有 机酰胺的两性试剂以及任选地0.5-5vol。/o的短链(Cl-C3)醇，和b)免疫分 析获自a)的混合物。另外，描述了本发明的试剂组合物如何可用于从维生素D-结合蛋白 中释放维生素D化合物。另外，公开了一种用于检测25-羟基维生素D的试剂盒，其包含测 试程序所需的试剂和用于从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物 的根据本发明的试剂组合物。在第一优选的实施方案中，本发明涉及用于从维生素D-结合蛋白中 释放维生素D化合物的试剂组合物，其具有3.8-4.8的pH值并且包含 5-30volQ/o的一种或多种选自二甲亚砜(DMSO)和液体有机酰胺的试剂以 及任选地0.7-8vol。/。的短链(Cl-C3)醇。液体有机酰胺全部是在20。C温度下是液体的那些有机酰胺。优选 的有机酰胺是二曱基曱酰胺(DMF)、曱基乙基-甲酰胺、N-曱基吡咯烷酮 (N-MP)、 N,N-二甲基乙酰胺、四甲基脲(TMU)、 1,3-二甲基-3,4,5,6-四氬 -2(1H)-嘧啶酮(DMPU)和六曱基磷酸三酰胺(HMPT)。根据本发明可以用于维生素D释放试剂的化学试剂的基团具有常 见的特征，即它们是两性化合物。用于释放维生素D的试剂组合物更优 选地包含7-20%的所述两性试剂。释放试剂优选地包含DMSO、 DMF、 N-MP和/或DMPU。原则上，上述两性试剂中的一些的混合物，例如由一些液体酰胺组 成的，可以存在于根据本发明的试剂组合物中。优选地，使用上述的两 性试剂中的仅仅三个、更优选地，仅仅两个，还优选地仅仅一个。还优选的是根据本发明的试剂组合物的pH值是pH3.8-pH4.6,更优 选地pH3.9-pH4.5,还优选地pH4.0-pH4.5。如上所述，释放试剂可以另外包含0.7-7vol。/。的短链(Cl-C3)醇。已 经证明了当这种短链醇也存在于释放试剂中时，是有利的。短链醇的比 例优选的是0.8-5voP/0。在本发明的意义内，短链醇是甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。乙醇已 被特别证明是适合作为短链醇的，因此它是更优选的。用于从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物优选的试剂组合 物具有3.8-4.8的pH值，包含5-30volQ/o的一种或多种选自二曱亚砜 (DMSO)和液体有机酰胺的试剂以及0.7-8volQ/c)的短链(Cl-C3)醇。除维生素D本身之外，获自维生素D新陈代谢的其它已知的化合 物结合到维生素D-结合蛋白。在人群中维生素D-结合蛋白的基因编码 以不同的等位基因的形式出现。众所周知通过这些等位基因编码的多肽 在生物化学上是不同的，即它们导致不同的表型。这些生物化学的差异 还影响了维生素D化合物的结合和释放。根据本发明的试剂组合物适于 独立于维生素D-结合蛋白的表型而释放维生素D化合物。因此，本发 明的优选的实施方案是根据本发明的试剂组合物用于从维生素D -结合 蛋白中释放维生素D化合物，或者如上所述用于从维生素D-结合蛋白 和维生素D化合物的配合物中释放维生素D化合物的用途。根据本发明的试剂组合物另外优选地用于在那些包含或者可能包 含不同表型的维生素D-结合蛋白的样品中释放维生素D化合物。为了从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化合物，根据本发明的 试剂组合物与样品(优选地血清或者血浆)混合。释放试剂和样品的混合 比优选的是10:1-1:10。另夕卜，优选的是混合约1/3-3体积份更优选地1/2-2体积份释放试剂 与1体积份样品。緩冲液组成和浓度由本领域技术人员选择，使得在用维生素D的免 疫物质培养期间调节两性试剂的规定的pH范围和期望的浓度。根据本 发明的试剂组合物优选地包含20mM-400mM緩冲液部分。所述緩沖液 部分特别优选地为30mM-350mM或者50mM-300mM。另外，本发明涉及一种免疫检测25-羟基维生素D化合物的方法， 包括以下步骤a)混合待检验的样品与用于从维生素D-结合蛋白中释 放维生素D化合物的试剂，这形成了混合物，该混合物具有3.8-4.8的 pH值并且包含5-20vol。/。的一种或多种选自二曱亚砜(DMSO)和液体有 机酰胺的两性试剂以及任选地0.5-5vol。/。的短链(Cl-C3)醇，和b)免疫分 析获自a)的混合物。对免疫检测根据本发明的25-羟基维生素D化合物必不可少的是获自样品的25-羟基维生素D化合物(-分析物)在上述用于混合物的条件下 用免疫物质进行培养。在这种培养期间，pH特别优选的是pH4.0-pH4.5。 根据本发明选择的两性试剂的浓度优选的是7-15vol%，更优选地 8-12vol%,在用免疫试剂培养分析物期间。在用免疫试剂的所述培养期 间，短链醇的浓度优选的是0.7-1.5vol%,更优选地，0.8-1.2vol%。如果没有另外叙述，术语"维生素D化合物"将被理解为包括包含根 据以下结构式I和II的维生素D2的主链或维生素D3的主链的所有化合 物。式I<formula>formula see original document page 8</formula>在结构式I和II中，根据类固醇命名法，描述了维生素D的位置。25-幾基维生素D表示维生素D代谢产物，其在结构式I和II,即25-羟 基维生素D2以及25-羟基维生素D3的位置25处羟基化。另外的25-羟 基-维生素D化合物是1,25和24,25-二羟基维生素D形式。1,25-二羟基维生素D是指在结构式I和II的位置1以及位置25处 具有鞋基化作用的维生素D的活性形式(所谓的D激素)。其它已知的维生素D代谢产物是24-， 25-二羟基维生素D2和24,25-二羟基维生素D3。优选地，进行维生素D化合物的免疫检测，使得检测到至少一个选 自25-羟基维生素D2、 25-羟基维生素03、 1,25 二羟基维生素D2和1,25-二羟基维生素D3的25-羟基维生素D化合物。如上文已经提到的，25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，特别 地，是用于诊断学的维生素D的相关形式。在根据本发明的方法中，检 测25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3是优选的。原则上，全部蛋白质结合配对(partem)如抗体或者其它结合一种或 多种25-羟基维生素D化合物的特异结合多肽可被用作免疫材料。在用 于检测25-羟基维生素D化合物的上述方法中的先决条件仅仅是对待检 验的25-羟基维生素D化合物的结合是在所选择的培养条件下发生的。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、这些抗体的抗原结合片段 如Fab片段、F(ab)2'片段或者单链抗体。特别地，特异结合多肽是结合 配对(partem),如可通过噬菌体展示(McCafferty, J.等，Nature 348 (1990) 552-554)、重组DNA技术(US4,816,567)或重组(recombinatorial)抗体库 (Lamck, J.W.和Fry, K.E. Hum. Antibod. Hybridomas, 2 (1991) 172-189) 获得的那些。优选的是使用以常规方式产生的多克隆或者单克隆抗体或 者其抗原结合片段。全部已知的维生素D代谢产物本身不是免疫原的。来自维生素D 新陈代谢的组分的化学活化以及其耦合到载体分子或者报道基团不是 微不足道的。因此，对于成功的免疫来说，有必要制备共轭体，其例如 包含25-羟基维生素D作为半抗原。术语半抗原是本领域技术人员所理 解的，为一种物质，其本身不是免疫原的，但是通过耦合到较大的载体 分子，以能够防止抗体产生的方式存在。用于生产半抗原共轭体的合适 的载体材料为本领域技术人员所知。牛血清白蛋白、P-半乳糖苷酶或者所谓的钥孔虫戚血兰素(keyhole limpet hemocyanin) (KLH)通常用作载 体材料。如其示于通式I和II中的结构的各种位置原则上适用于活化和耦合 到载体。经由25-羟基维生素D2或者25-羟基维生素D3的位置3的耦合， 例如，已被证明有益于产生抗体，其以合适的方式结合25-羟基-维生素 D。在实施例中，详细地描述了用于产生结合25-幾基维生素D2以及25-羟基维生素D3的抗体的方法。根据本发明的试剂组合物已被证明适用于25-羟基维生素D化合物 的自动化测试。本发明优选地涉及根据本发明的试剂组合物用于从维生 素D-结合蛋白中释放维生素D化合物的用途，特别是在用于测定25-羟 基维生素D化合物的免疫测试中。25-羟基维生素D的测试优选地完全自动化。在这种情况下，完全 自动化是指实验员只需将样品放置在自动化分析仪上，而全部进一步的 步骤自动地由分析器进行。完全自动化测试特别优选地在获自Roche Diagnostics的Elecsys⑧分一斤4义上进^亍。根据本发明的试剂组合物优选地用于检测25-羟基维生素D2和/或 25-羟基维生素D3的方法中。测试优选地以竟争性免疫分析的形式进行，其中根据本发明的试剂 组合物被用作所谓的样品緩沖液，即样品与根据本发明的试剂组合物的 混合。在这种竟争性测试中，以规定数量添加到测试中的维生素D化合 物与来自样品的相应的维生素D化合物竟争检测抗体的结合部位。样品 中存在的维生素D化合物越多，检测信号越小。用于25-羟基维生素D化合物的免疫检测的方法，可以——基于对 本发明的认识——以多种方式进行。例如并且以优选的方式，样品首先与根据本发明的试剂组合物混合 并且培养，然后添加进一步的测试组分。另外并且以优选的方式，样品、根据本发明的试剂组合物和免疫物 质直接混合在一起，随后进行培养。还可能并且优选地，根据本发明的试剂组合物已经包含免疫物质。 这意味着，在这种实施方案中，根据本发明的试剂组合物另外优选地包 含25-羟基维生素D的多克隆或者单克隆抗体。许多商用测试体系基于使用涂布有抗生物素蛋白或者抗生蛋白链菌素(SA)的固相，例如SA-涂布的微滴定板或者SA-涂布的胶乳。在测试程序之前或期间，生物素化的分析物衍生物，例如，结合到 这种SA固相。当检测25-羟基维生素D时，这可以例如是生物素化的 25-羟基维生素D2和/或生物素化的25-羟基-维生素D3。当使用SA-涂布 的固相时，有可能并且优选地，样品、根据本发明的试剂组合物、生物 素化的25-羟基维生素D衍生物和免疫物质被混合并在一起培养。根据本发明的教导，本领域技术人员能够组装一种测试试剂盒，其 包含检测维生素D化合物所必需的全部組分。特别地，用于检测维生素 D化合物的优选的测试试剂盒的特征在于除维生素D化合物的抗体之 外，所述试剂盒包括具有3.8-4.8的pH值的试剂组合物并且包含 5-30vol。/。的一种或多种选自二曱亚砜(DMSO)和液体有机酰胺的两性试 剂以及任选地0.7-8vol。/o的短链(Cl-C3)醇。通过以下实施例和附图进一步解释本发明。实际保护范围源于本发 明所附的权利要求。
图1:方法比较免疫分析(-DMSO)和LC-MS-MS 借助于联合液相色谱和质谱(LC-MS-MS)以及借助于免疫分析(IA) 来测定25-羟基维生素D，其中未添加DMSO的緩冲液(；DMSO)用于培 养。对总共53个样品的结果(单位ng/ml)进行绘图，X轴为LC-MS-MS， Y轴为IA。图2:方法比较免疫分析(+DMSO)和LC+MS+MS 借助于LC-MS-MS以及借助于IA来测定25-羟基维生素D,其中在 IA中，包含DMSO的緩沖液^+DMSO)用于培养。对总共48个样品的 结果(单位ng/ml)进行绘图，X轴为LC-MS-MS, Y轴为IA。 图3:方法比较免疫分析(-DMSO)和LC-MS-MS 借助于LC-MS、MS以及借助于IA来测定25-羟基维生素D,其中在 IA中，无DMSO的緩沖液用于培养。使用来自具有非洲血统的人的31 个样品作为样品。对总共78个样品的结果(单位ng/ml)进行绘图，X轴 为LC掘掘,Y轴为IA。图4:方法比较免疫分析(+DMSO)和LC+MS+MS借助于LC-MS-MS以及借助于IA来测定25-羟基维生素D，其中在IA中，包含DMSO的緩沖液用于培养。其中，使用来自具有非洲血统 的人的31个样品作为样品。对总共79个样品的结果(单位ng/ml)进行绘 图，X轴为LC-MS-MS， Y轴为IA。图5:方法比较免疫分析(+DMSO)和LC+MS+MS 借助于LC-MS-MS以及借助于IA来测定25-羟基维生素D,其中在 IA中，包含DMSO的緩沖液用于培养。其中，使用来自具有非洲血统 的人的81个样品作为样品。对总共136个样品的结果(单位ng/ml)进行 绘图，X轴为LC-MS-MS， Y轴为IA。图6:方法比较免疫分析(+DMF)和LC+MS+MS 借助于LC-MS-MS以及借助于IA来测定25-羟基维生素D,其中在 IA中，包含二曱基曱酰胺的緩沖液^+DMF)用于培养。其中，使用来自 具有非洲血统的人的81个样品作为样品。对总共136个样品的结果(单 位ng/ml)进行绘图，X轴为LC-MS-MS, Y轴为IA。 图7:方法比较免疫分析(+N-MP)和LC+MS+MS 借助于LC-MS-MS以及借助于IA来测定25-羟基维生素D，其中在 IA中，包含N-MP的緩沖液(^+N-MP)用于培养。其中，使用来自具有 非洲血统的人的81个样品作为样品。对总共135个样品的结果(单位 ng/ml)进行绘图，X轴为LC-MS-MS, Y轴为IA。 实施例1合成25-羟基维生素D3-3-半琥珀酸酯KLH对于这种合成来说，在位置3(参照通式II)对25-羟基维生素D3进行 化学活化，并且将其耦合到作为免疫原载体的KLH上。这种合成是经 由中间体步骤25-羟基维生素Dr3-半琥珀酸酯和25-羟基维生素03-3-半 琥珀酸酯-N-轻基琥珀酰亚胺酯进行的。1.1制备25-羟基维生素D3-3-半琥珀酸酯将10mg(25(imol)25-羟基维生素D2(Sigma-Aldrich, No. H-4014)溶解 在l ml无水吡，定中并且在黑暗中与125mg(1.25mmol)琥珀酸酐一起在室 温下搅拌4天。在10 ml乙酸乙酯中吸收反应混合物并且在所有情况下 用2X10ml水、O.IM盐酸和随后再用水洗涤。使用约lg无水硫酸钠干 燥有机相，过滤并且在真空中除去溶剂。在高真空中干燥残余固体。获 得了 10.5mg(收率84%)的无色固体。1.2 25-羟基维生素Dr3-半琥珀酸酉旨-N-羟基-琥珀酰亚胺酯的制备将10.0mg(20pmo1) 25-羟基维生素Dr3-半琥珀酸酯溶解在7 ml无 水二氯甲烷中并且与2.76mg(24)imol)N-羟基-琥珀酰亚胺和 3.72mg(24iLimol)N(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基-碳二亚胺(EDC)混合。在 氩气下搅拌过夜，然后用10ml水洗涤有机相两次，用约lg无水硫酸钠 干燥并且过滤。在真空中除去溶剂，在高真空中干燥残余反应产物3h。 获得了 11.3mg(收率94。/。)N-羟基琥珀酰亚胺酯，其用于共轭体而无需 进一步純化。1.3合成25-幾基维生素Dr3-半琥珀酸酯-KLH将150mg钥孔虫戚血兰素(KLH; Sigma-Aldrich No. H 8283)溶解在 25ml0.1M磷酸钾緩冲液中，添加在2mlDMSO中的pH=8.0和11.3mg 的N-羟基-琥珀酰亚胺酯。在室温下搅拌过夜，随后通过凝胶柱(AcA 202,柱体积0.5L; 0.1M磷酸钾緩冲液，pHK7.0)纯化产物。借助于UV 吸收(A^256nm)来检测包含结合蛋白质的级分并且集中起来(po01)。添加 10%甘油并且将灰乳白色的溶液用于免疫。实施例2生成和分离25-羟基维生素D3的抗体 2.1免疫抗体在绵羊(sheep)中产生。获自实施例1的25-羟基维生素D3-3-半 琥珀酸酯KLH共轭体用于免疫。免疫剂量是0.1mg/动物。第一次免疫 在完全Freud's佐剂中进行。进一步的免疫在4周时间间隔在不完全 Freud's佐剂中进行，达10个月的时间。在各次免疫时间间隔的中间收 集血清。2.2纯化多克隆绵羊抗体在Aerosil⑧(1.5。/。)的帮助下，从用25-羟基维生素Dr3-半琥珀酸酉旨 -LKH共轭体免疫的绵羊的血清中除去含脂质的组分。随后，使用硫酸 铵(1.7M)，沉淀免疫球蛋白。相对于15mM磷酸钾緩冲液(包含50mM NaCl, pH=7.0),对沉淀物进行渗析，并且随后通过DEAE琼脂糖 (sepharose)进行色谱纯化。从这种色镨柱的流通(flow-through)中获得IgG 级分^PAB〈25-羟基-维生素D3> S-IgG (DE)。2.3亲和色语法以纯化25-羟基维生素D-特异性抗体 制备用于多克隆抗体的免疫色谱纯化的含共轭25-羟基维生素D2的 用作测定特异性的免疫吸附剂(immunadsorber)。通过以下步骤获得免疫吸附剂(immunadsorber):a) 合成羟基维生素D2-3-2'-氰乙基醚在氩气气氛下在10 ml无水乙腈中将20.6mg(50jiimol)25-羟基维生素 D2(FlukaNo. 17937)溶解在具有内部温度计的25 ml三颈圆底烧瓶中。将 1.5 ml叔丁醇/乙腈(9:l)添加到溶液中并且在水浴中冷却到6°C。随后添 加820^1的丙烯腈溶液(86inl丙烯腈/1.0 ml乙腈)并且在6。C搅拌15分钟。 然后添加205^1的氢化钾溶液(25mg KH/0.5 ml叔丁醇/乙腈9:1)。短暂絮 凝出现，其后获得了透明溶液。在6。C搅拌反应溶液达进一步的45分 钟，随后在4。C搅拌60分钟。随后，用10ml甲基-叔丁基醚稀释反应溶液，并且洗涤2次，每次 用10mlH2O。用约lg无水石危酸钠干燥有才几相，在G3玻璃料上过滤并 且在旋转蒸发器上蒸发。在高真空中将其千燥而形成粘稠透明的残余 物，质量约55mg。b) 合成羟基维生素Dr^3-氨丙基醚将以上获得的全部腈溶解在15ml二乙醚中，与7.5mg氢化锂在7.5 ml二乙醚中的悬浮液混合，同时搅拌。在室温下搅拌反应混合物1小时。 然后，添加38.4氢化铝锂在6.6ml二乙醚中的悬浮液。这导致混合物的 强烈的混浊。在室温下再搅拌反应混合物1小时，然后在水浴中将反应 混合物冷却到0-5。C并且小心地添加35 ml水。通过添加6.6 ml 10M氢 氧化钾溶液使得pH为强碱性的。将其萃取3次，每次使用65ml曱基-叔丁基醚。使用约5g无水硫 酸钠干燥合并的有机相，过滤并且在室温下在旋转蒸发器上蒸发。使用 油泵，干燥剩余物至质量恒定。将粗产物溶解在5mlDMSO和3.0ml 乙腈中，借助于制备HPLC纯化。洗提液AH敖孔-H2O+0.1%三氟乙酸；洗提液B二95。/。乙腈+5o/o微孔-H2O+0.1。/oTFA;梯度50%B-100%B，在100 min内流速30ml/min温度室温柱尺寸0 = 5.0 cm; L = 25 cm; 柱材料Vydac C18/300A/15-20 pim 测定波长226nm根据分析HPLC(Vydac C18/300A/5pm; 4.6x250mm),产物含量大于 85%的级分被集中在圆底烧瓶中并且被冻干。获得13.7mg(收率58%)， 为无色冷冻干燥物(lyophilisate)。c) 羟基维生素D2-3-3'-N-(半环庚)氨丙基-醚-N-羟基琥珀酰亚胺酯 的合成将n,7mg(25jumol)的氨基衍生物溶解在5 ml新蒸馏的DMF中并且 添加92mg(250)Limol)辛二酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。添加3.5)li1三乙胺并 且在氩气下搅拌该溶液过夜。由制备HPLC纯化粗产物(条件如上)。冻 干后获得了 10.1mg(收率56。/。)N-羟基琥珀酰亚胺酯。d) 合成羟基维生素D2免疫吸附剂(immunoadsorber)在G3玻璃料上用200 ml 0.5M氯化钠溶液洗涤20 ml EAH琼脂糖 (Amersham Biosciences, No. 17-0569-03),并且用200 ml 0.03 M磷酸钟 緩沖液(pHN7.1)来平衡。在过量的液体已通过玻璃料排出后，在200ml 的相同的緩沖液中吸取悬浮液，并且添加1.7mg(2.3iLimol)N-轻基琥珀酰 亚胺酯/10mlDMSO。在振荡器上在室温下搅动反应混合物过夜。其还 被转移到玻璃料，使其排出，并且用500ml 0.05M磷酸钾緩沖液/0.15M 氯化钠(pH-7.0)洗涤。在完全排出后，将其再悬浮在25ml的相同的緩冲 液中，并且添加0.15ml的25%叠氮化钠溶液以便保存。e) 纯化抗体将来自d)的10ml的亲合性基质装入柱中，并且用由50mM磷酸钾、 150m画aCl组成的、pH=7.5的緩沖液(PBS)平衡。将3.6g的PAB<25-羟基维生素D3〉S-IgG(DE)装载到柱上。用PBS、0.5MNaCl溶液(含0.05% Tween⑧20和30mM氯化钠)阶式洗涤所述的柱。用3mMHCl溶液从亲 合性基质上分离特异性结合的免疫球蛋白。HC1洗脱物相对于lmM乙 酸乙酯进行渗析并且随后冻干。将冷冻干燥物(lyophilisate)溶解在PBS 中，在Superdex200⑧上通过色谱除去聚集体，将如此获得的免疫吸附 的多克隆抗体用于进一步的步骤。使用1M丙酸再生免疫亲合性基质并 且将其保存在含0.9%叠氮化钠的PBS溶液中。实施例3用于检测25-羟基维生素D的分析根据制造商的指导来使用商业分析。如文献中所迷，借助于 HPLC(用于25(OH)维生素D3的测试，获自"Immundiagnostik" Company,Bensheim,顺序号KC 3400)或借助于LC-MS-MS(Vogeser, M等，Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417)进行25-羟基维生素D测定。用于新的免疫学测试的成分的制备和一般测试程序在下文中描述3.1合成羟基维生素D2-3-3'-N-(半环庚)氨丙基-醚-生物素 -(卩-Ala)-Glu-Glu-Lys(s)共轭体t Ag-Bi)将13.7mg(25nmol)轻基维生素Dr3-3'-氨丙基醚溶解在3.5 ml DMSO中，添加28.7mg(30)iimol)生物素-(卩-Ala)-Glu-Glu-Lys(s)-半-辛二 酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Applied Science, No. U866656)和12.5|tU 三乙胺，在室温下将其搅拌过夜。用4.5 mlDMSO稀释反应溶液,滤过 0.45pm微过滤器，随后借助于制备HPLC(条件参见实施例2.3 b))进行纯 化。将根据分析HPLC的包含大于85%产物的级分集中起来并且将其冻 干。获得了9.8(收率30%)纯化的生物素共轭体。3.2相对于通过亲和色谱法纯化的25-羟基维生素D^PAB-Ru)的多 克隆抗体的钌化(ruthenylation)将根据实施例2.3 e)的亲合性-纯化抗体转移到100mM磷酸钾緩冲 液(pl^8.5),将蛋白质浓度调节到1 mg/mL。将钌化(ruthenylation)试剂(钌 (II)三(联吡啶基)-N-羟基琥珀酰亚胺酉旨)溶解在DMSO中，并且将其添加 到抗体溶液中，摩尔比为7.5-1。在60min的反应时间后，通过添加L-赖氨酸终止该反应，在Sephadex G25上通过凝胶渗透色镨法分离过量的 才示i己i式剂。3.3免疫分析中的测试程序使用获自Roche Diagnostics公司的Elecsys 系统，测量样品。25pl 样品与30pl释放试剂(A)混合，并且同时或顺序地与15pl钌化 (ruthenylated)检测抗体(B)混合并且培养9分钟。在下一步骤中，添加生 物素化的壁抗原(C)(50pl),通过进一步添加释放试剂(A)(50pl),将pH 值保持在期望的范围内。在进一步的9分钟培养后，添加涂布有抗生蛋 白链菌素(SA)(3CHd)的可磁化的聚苯乙烯颗粒(D),并且在进一步的9分 钟培养后，象通常一样，测定结合钌化(ruthenylated)抗体的量。释放试剂(A)包含220mM乙酸酯緩沖液，pH=4.00.1 %醋氧甲苯酸(oxypyrion)0.1% MIT1% EtOH0.1%聚乙二醇单十二醚(polydocanol) 0.2%兔IgG和两性试剂，当规定时。具有钌化(ruthenylated;K25-OH-维生素D^元体共轭体的溶液(B),其 包含20mM 磷酸盐緩沖液，pH=6.5 0.1 %醋氧甲苯酸(oxypynon) 0.1。/。MIT(N-甲基异多唑酮HC1) 1% EtOH(乙醇)0.1%聚乙二醇单十二醚(polydocanol) 1% 兔IgG(DET) 2.0昭/mlPAB-Ru(获自实施例3.2) 以及两性试剂，当^见定时。 具有生物素化的壁抗原的溶液(C)包含 20mM 磷酸盐緩沖液，pH=6.5 0.1%醋氧曱苯酸(oxypyrion) 1% E認0.1 %聚乙二醇单十二醚(polydocanol) 0.2%兔IgG0.18|iig/ml Ag-Bi(获自实施例3.1)以及两性试剂，当规定时。具有SA-涂布的胶乳颗粒(D)的悬浮液包含0.72mg/ml具有470ng/ml的结合容量的SA-涂布的可磁化的聚苯乙烯颗粒。 实施例4添加/不添加两性试剂的样品培养緩冲液在先前试验中，在用于检测25-羟基维生素D的若干测试程序中， 观察到获自具有高加索血统的人的血清和获自具有非洲血统的人的血 清的表现不同。具有不同种族血统的供体的正常血清因此已经被特定地检验。4.1培养条件的比较，有和没有DMSO(高加索人)以下两种緩冲液组合物;故用作释放试剂(a) 释放试剂(A)、溶液(B)和溶液(C)(参见实施例3.3),没有 DMSO卜DMSO)和(b) 释放试剂(A)、溶液(B)和溶液(C)，其还包含10% DMSO(=+DMSO)。检验总共约50份获自具有高加索血统的人的正常血清，并且每次 与标准方法LC-MS-MS比较。如在图1中可见的，免疫学测试的值与 LC-MS-MS相关(借助于线性回归确定r值为0.86)。然而，图1还清楚 地显示回归线的斜率是极低的(计算为0.44)。这表示了样品的非常错构 (falsified)的回收。使用DMSO的LC-MS-MS和免疫学测试之间的方法比较示于图2 中。在比较没有DMSO的试剂组合物中，计算出较高的相关性(尸0.89) 和较高的斜率(0.60)。4.2培养条件的比较，有/没有DMSO(高加索人和非洲人)对总共80份正常血清，其中约50份来自具有高加索血统的人，31 份来自具有非洲血统的人，进行免疫分析，并且每次与标准方法 LC-MS-MS比较。使用与实施例4.1中相同的緩沖液(a)和(b)。如在图3 中可见的，免疫学测试的值与LC-MS-MS的相关性不是很好。通过线性 回归确定r值为0.69。然而，图3还清楚地显示回归线的斜率是才及小的(计 算为0.30)。这表示了样品的非常错构(falsified)的回收。使用DMSO的LC-MS-MS和免疫学测试之间的方法比较示于图4 中。相比于没有DMSO的试剂组合物，发现明显较高的相关性(产0.93) 以及大大改进的斜率(0.70)。实施例5各种两性试剂的比较 使用以下緩沖液组合物(b)释放试剂(A)、溶液(B)和溶液(C)，其还包含10% DMSO(=+DMSO),(b)释放试剂(A)、溶液(B)和溶液(C),其还包含10%DMF(=+DMF),和(d)释放试剂(A)、溶液(B)和溶液(C),其另外包含10%N-MP( = + N-MP)。使用不同的试剂组合物以从维生素D-结合蛋白中释放维生素D化 合物，检验约135份获自具有各种血统的人的正常血清，并且每次与标 准方法LC-MS-MS相比较。如从图5、 6和7中可看出的，除DMSO之 外，DMF和N-MP也适合作为用于维生素D化合物的释放试剂的添加 剂。对于全部三种添加剂，获自免疫学测试的值与LC-MS-MS相关性极 好。使用线性回归，确定r值分别为0.91(緩沖液(b))、 0.92(緩沖液(c)) 和0.92(緩冲液(d))。因而，根据本发明的组合物试剂使得可以独立于维 生素D-结合蛋白的表型来测定25羟基维生素D。基于初步参照物的值，在本实施例以及早先的实施例中，确定了免 疫学测试的绝对值，并且因此所述绝对值没有有益的值。仍然必须进行 借助于LC-MS-MS的用于测定可靠的绝对值的参照物标准化。相对值显 示出使用根据本发明的组合物试剂所实现的显著的测试改进。
权利要求
1.用于释放维生素D的试剂组合物，其具有3.8-4.8的pH值并且包含5-30vol％的一种或多种选自二甲亚砜(DMSO)和液体有机酰胺的两性试剂以及任选地0.7-8vol％的短链(C1-C3)醇。
2. 根据权利要求1的试剂组合物，其特征为二甲基甲酰胺(DMF)、 N,N-二曱基乙酰胺、四曱基脲(TMU)、 N-曱基吡咯烷酮(N-MP)、 1,3-二 曱基-3,4，5,6-四氢-2(lH)-嘧啶酮(DMPU)和六甲基磷酸三酰胺(HMPT)用 作两性试剂。
3. 根据权利要求1或者2的试剂组合物，其特征为存在7-20vo10/0 的两性试剂。
4. 根据权利要求1-3中的任一项的试剂组合物，其特征为乙醇作 为短链醇存在。
5. 用于免疫检测25-羟基维生素D化合物的方法，包括如下步骤a) 将待研究的样品与从维生素D-结合蛋白释放维生素D化合物的 试剂混合而形成混合物，其具有3.8-4.8的pH值并且包含5-20vol。/o的一 种或多种选自二曱亚砜(DMSO)和液体有机酰胺的两性试剂以及任选地 0.5-5volQ/o的短链(Cl-C3)醇；b) 免疫分析获自a)的混合物。
6. 根据权利要求5的方法，其中25-羟基维生素D化合物选自25-羟基维生素D2、 25-羟基维生素D3、 1.25-二羟基维生素D2和1.25-二羟 基维生素D3。
7. 根据权利要求5的方法，其中测定25-羟基维生素D化合物、 25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。
8. 根据权利要求1-4中任一项的试剂组合物用于从维生素D-结合 蛋白中释放维生素D化合物的用途。
9. 根据权利要求1-4中任一项的试剂组合物用于从维生素D-结合 蛋白中释放维生素D化合物的用途，其中所述释放独立于维生素D-结 合蛋白的表型。
10. 检测25-羟基维生素D的试剂盒，其包含免疫检测至少25-羟基 维生素D化合物的组分，其特征为，所述试剂盒还包含根据权利要求 1-4中任一项的试剂组合物。
全文摘要
本发明涉及用于释放与维生素D-结合蛋白相结合的维生素D化合物的试剂组合物，用于检测25-羟基维生素D化合物的方法，其中使用这种试剂从维生素D-结合蛋白释放25-羟基维生素D化合物并且分析如此获得的混合物，用于释放维生素D化合物的试剂的用途以及用于检测25-羟基维生素D的试剂盒，除通常的免疫试剂之外，其包含用于释放维生素D化合物的试剂。
文档编号G01N33/82GK101273272SQ200680035942
公开日2008年9月24日 申请日期2006年9月27日 优先权日2005年9月29日
发明者A·基里亚特索利斯, A·普尔曼, E·休伯, L·冯普罗夫, N·霍恩, S·费尔德曼, U·科博尔德 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司