样品上标签的定位方法

专利名称：样品上标签的定位方法
样品上标签的定位方法
技术领域：
本发明涉及一种分冲斤样品的方法，该方法包括 在样品上预备大体上平坦的表面，
使样品暴露于含有标签的标示试剂，由此将标签引入样品中， 获得一系列样品图像，
获得标签在由此所得的每个图像中的相对位置，以及 由如此所得的相对位置得到标签的相对位置的三维重构。
由电子X线断层摄影术可了解这种方法，例如"电子X线断层摄 影术，采用透射式电子显微镜的三维成像，，，编者J. Frank, ISBN 0-306-43995-6中所述，进一步称为J. Frank。在生物学和组织学中，需 要确定某些分子例如蛋白质、抗体和核苷在例如生物样品中的位置， 以得到关于某些过程在例如生物样品中哪里发生并且如何发生的见 识。类似的需要出现在例如聚合物的分析期间。
在电子X线断层摄影术中，在本质上已知的仪器透射式电子显微 镜(TEM)中用电子束照射薄样品，在TEM中电子束的能量通常为80-300 keV。该样品薄得足以4吏电子束部分穿透它。样品的不同部分显示 出不同的透明度，这是由于无阻碍地通过样品的电子量是与位置有关 的。通过形成一系列图像，其中在各个图像之间该样品是倾斜的(如 此命名的倾斜系列)，并且通过收集来自这一系列图像的数据，可制得 样品的三维重构。
为了成像例如生物组织中的某些结构，可将所谓标签连附到某些 分子上。这些标签的特征在于它们显示出高对比度并且其自身非常特 异性地连附到例如一定类型的抗体，而其自身没有连附到其它类型的 抗体及其它分子。通过检测标签在样品中的位置，于是可确定例如抗
体的存在和定位。
由于通过样品的电子和构成样品的原子之间的相互作用与该原子 的质子数Z非常相关，因此，特别是样品原子组成的局部变化能够这 样成像。由于生物材料包括非常少的高Z原子，因此，尤其贴上含高Z 材料的标签是非常有效的。这种标签可以是含有蛋白质-金络合物的 标签，其中金以金纳米颗粒存在，其典型的直径为1 - 50 nm。这种标签在市场上可购4寻，例》口来自 Nanoprobes Inc. , Yaphank , NY11980-9710, USA的名为NanoGokf的标签。
另一种标记方法采用荧光标签。这些标签响应光照射或例如电子 束照射而发出通常具有非常特定波长的荧光。利用光子探测器可探测 到如此发出的光子，由此指示在该位置存在的标签。这种荧光标签的 例子是例如如此命名的半导体量子点，市售的例如来自Evident Technologies, Troy, NY 12180, USA的名称为EviTag⑧的标签。有机 荧光标签同样也是已知的并且使用广泛，另一种类型的(无机)标签 被描述在例如欧洲申请EP05112781中。
人们注意到预备样品上的平面表面以及使样品与标示试剂相接触 不必按照该顺序进行:很可能首先将标签供给样品，然后预备平坦的 表面，参见"EM中的3-D金原位标记"，P. Gonzalez-Melendi等人， the Plant Journal (2002) Vol. 29(2),第237-243页。
电子X线断层摄影术的缺点是其只能用于非常薄的样品，因为电 子必须通过样品。通常需要小于1pm或甚至小于100 nm的厚度，如 J. Frank中第25页图2所示。为了研究例如细胞中的某些结构，进行 调查研究的特征必须存在于样品中。大于样品厚度的结构可因此没有 对其全部进行研究，伴有的风险是待研究的结构在薄样品中完全不见 了。
电子X线断层摄影术的另一缺点是必须制作许多样品图像，导致 撞击到样品上的电子总量高。这种高总量使样品受到损害，如J. Frank 中第3章所述。为了在进行电子X线断层摄影术时将损害减至最小， 因此经常必须设法使这种损害极小化，例如在低剂量条件下工作-导 致图像中信噪比差-和/或将样品冷却到低温度例如液氮点或甚至液氦 点。
本发明目的是提供一种在较厚样品中定位标签的方法，该样品比 现有技术方法中可能的厚度更厚。
为了那个目的，根据本发明的方法的特征在于 各个图像在大体上相同的方向上显示所述的样品，以及 .从处于该一 系列图像的各连续图像之间的样品中除去表面层， 留下大体上平行于最初形成的平坦表面的新表面层。
通过测定标签在每个图像Ii中的位置，可探测到标签的消失。假定标签存在于图像Ii中，而不存在于接下来的图像Ii+l中，则标签存 在于处于所得图像Ii和Ii+l之间的除去的层中。通过从样品切下许多 层，由此可测定每个标签位于哪一层，并可形成三维重构。
类似地，当标签变得可见时，这暗示标签来到表面达到激发和探 测两者都有可能的程度(在发光的标签的情形中)或者-在含高Z材 料标签的情形中-可探测到由标签发出的反向散射电子。当利用高能 颗粒(例如电子或离子)束探测标签时，这是特别有益的，作为这种 颗粒可达到的距离通常^^皮限制在例如1 pm或更小。
本发明也使在样品中标签的位置能够利用扫描电子显微镜(SEM) 三维被重构。扫描电子显微镜是一种本质上已知的技术。在扫描电子 显微镜中，将具有在例如1 - 50 kV之间的电子束能量的精细聚焦的 电子束扫描在样品的整个表面上，从该电子束在样品上撞击的位置， 次级辐射，例如反向散射电子或光子发出，将被适当的探测器例如反 向散射电子探测器或光子探测器探测到。采用 一 个或多个探测器的信 号来构造样品表面图像，当电子能量低^f艮多时，对样品的损害也极大 地减小。
人们注意到由美国专利US 6,546,788 B2已知一种方法，其中由 样品而得的多个图像被检索并且为了得到样品的三维重构而除去了
一些层。该专利描述了一种方法，其中利用具有调节装置的显微镜测 定样品的拓朴学，在每次除去一层之后测定样品的拓朴学，以及利用 扫描探针显微镜(SPM)测定表面特性，该特性是例如传导性、电子密 度等。作为采用SPM的替代，还公开了光学显微镜的使用。作为测 定拓朴学的显微镜的替代物，公开了相干涉显微镜、激光共焦显微镜 和SPM，s。
US 6,546,788 B2的方法不同于本发明方法，其中US 6,546,788 B2明确地提出不平坦表面的研究，其中采用显微4竟测定拓朴学以及 采用SPM测定关注的特性。其不同于本发明，其中对于各层，其使 用从至少两种不同组分得到的图像，其各自形成一种待分析的图像 一种用于拓朴学，而一种用于待测定的特性。此外没有公开通过使用 标签来增强特定的结构，也没有公开使用颗粒束来测定这种标签的位 置。
在根据本发明方法的一种实施方式中，标签是发光的标签，颗粒束是在样品的整个表面上扫描的精细聚焦的颗粒束，并且其中的信息 包括与所述标签响应暴露于颗粒束而发出的光量成比例的信息。
通过在样品上扫描精细聚焦的颗粒束例如电子束，荧光标签将#皮 激发。然后这些标签发出光子，后者将被光子探测器探测到。这确保
了以高分辨率确定标签的位置。已经证明在低光束能量下分辨率比25 nm还要好。
注意到如此所得分辨率可能小于颗粒束本身的分辨率，因为该标 签也被次级颗粒激发-例如次级电子和反向散射电子-通过利用精细 聚焦的光束照射样品而产生。
在根据本发明方法的另一实施方式中，发光的标签是无机纳米颗 粒，所述纳米颗粒包括掺杂有发光活化剂离子的主晶格，其发挥作为 所述纳米颗粒的发光中心的作用，并且其中获得一种图像，其包括检 测由所述活化剂离子发出的光。
欧洲申请EP05112781中描述了这种类型的发光的标签。使用这种 类型标签的优点是它们非常耐辐射例如耐电子辐射并且出现非常少的 光漂白(即发光性能变差)。
在根据本发明方法的另 一 实施方式中，发光的标签是无机量子点 纳米颗并立。
在根据本发明方法的又 一 实施方式中，发光的标签是有机标签。 有机标签存在于周围已经很有一些时间了 。已知许多靶向的与特
异性分子偶联的不同的发光的标签。
在根据本发明方法的另一实施方式中，标签含有高Z材料。 例如聚合物和生物组织主要是由低Z材料例如碳、氬、氧等组成，并且通常包括^艮少或没有高Z材料。因此，当采用TEM (透射式电
子显微镜)和采用SEM (扫描电子显微镜)时，在两种情形下含有高
Z材料的标签都将显示出极好的对比度。
在根据本发明方法的又一实施方式中，高Z材料包括金纳米颗粒。
包括金纳米颗粒的标签是众所周知的，并且在市场上可购得，例 如命名为NanoGold的标签。
在根据本发明方法的又一实施方式中，用银或金增强金纳米颗粒。当使用电子显微镜时，通过将银或金加入已经存在于样品中的纳 米颗粒中来提高金纳米颗粒的对比度是本领域技术人员已知的方法。
在根据本发明方法的另 一 实施方式中，获得图像包括处理由颗粒 探测器探测到的信号。
颗粒探测器，例如众所周知的Everhart-Thornley探测器或固态反 向散射电子探测器，可用于探测由样品发出的次级颗粒，利用该探测 器的输出，可构成图像。
还可采用气态次级电子探测器，特别适合于在压力约为1-25毫 巴下操作。这种压力是吸引人的，因为它允许在压力等于或高于水的 平衡压力下观测样品。在该高压下操作的这种及其它探测器可用于例 如环境扫描电子显镜(ESEM.)或可变压力扫描电子显微镜 (VP-SEM)。
在根据本发明方法的又一实施方式中，获得图像包括处理由X射 线探测器探测到的信号。
不是探测样品中产生的次级颗粒，而是可探测到样品中产生的X射线。
在根据本发明方法的又一实施方式中，采用颗粒束除去了一个或 多个表面层。
通过用颗粒束例如离子束溅射样品来除去表面层是本质上已知的方法。
在根据本发明方法的又一实施方式中，颗粒束是精细聚蕉的颗粒束。
使用例如离子束，可从样品上碾碎表面材料。这种方法通常在例 如具有产生精细聚焦的离子束的离子柱和产生精细聚焦的电子束的电
子柱两者的仪器中使用。电子束可用于样品观测并且用于测定标签位
置(不管是发荧光的还是高z材料的标签)，离子束可用于从样品上除
去表面材料。已经证明使用在表面上扫描的该精细聚焦的光束导致以 均匀的厚度除去层。
人们注意到为了加大除去表面层的速度，仅局部表面可被除去， 并且不是全部表面层需要除去。
人们还注意到，如本领域技术人员已知，通过在样品附近导入某 些流体可极大地提高碾磨速度。使用什么样的流体非常强烈地取决于所研究样品的组成。
在才艮据本发明方法的又一实施方式中，利用电石兹辐射束除去一个 或多个表面层。
利用光，例如激光器产生的光来除去表面层是一种已知的方法。 在根据本发明方法的又一实施方式中，通过升华作用除去一个或 多个表面层。
如早先提到的，样品可以被冷冻到低温度以使对样品的损害减至 最小，或避免导致赝象的样品变形。本发明人发现通过升华作用除去 非常少的层是可能的。升华作用可以在获得每个图像之间进行，而且 在成像时升华也是可能的。在后者情形中，除去表面层发生在获得图 像之间，但是不限于那段时间。
在根据本发明方法的又一实施方式中，除去一个或多个表面层是 在颗粒光学仪器中原位进行的。
原位进行本发明的方法增加了分析的处理时间，是因为在检查期
间样品驻留的该仪器腔室不必排空以及因为样品不必重新配置这两 方面。
现利用


本发明，其中相同数字表示相同特征。
为此目的
图1是图解描述了在除去表面层之前的SEM图像。
图2是图解描述了在除去表面层之后的SEM图像。
图1示出了生物样品的SEM图像。样品贴有2 nm金标签，其后
来被银增强。所示图像是利用5kV电子束装置，同时将反向散射电子
探测器用作探测器而制作的。
在图1中，所示标签显示为暗点2, 2A,其中指示了几个。由于
低对比度而几乎不能看见的是样品中的结构3。
图2显示在除去薄表面层之后成像时样品的相同部分的图像i。几
个标签消失了，例如图像丄(图1)中用2A指示的标签。因此这些标
签位于在第一图像L和第二图像L之间除去的层中。这样就能够测定
样品中标签位置的三维重构。
如图像]_和1两者中可见，某些点2与其它点比相当大。本发明
人发现这不是由于标签的尺寸差异而致，而是大点表示样品中更深处
的标签，换句话说从表面除去了更多。这或许是由于样品中电子束的相互作用体积，如本领域技术人员已知，其或多或少是梨形的，在 接近表面处表现为直径小而在材料中深处表现为直径大。因此接近于
表面的标签，在那里相互作用体积的直径小，将以比^:从表面进一步 除去的标签更高的分辨率被探测到，在表面那里相互作用体积的直径 较大。
根据本发明方法的惊人优点是这样的，当除去的表面层小于颗粒 束的穿透深度时，可得到增大的分辨率，如每个标签迟早要接近表面 的情形，在那里相互作用体积的直径小。
人们注意到采用TEM或STEM (扫描透射式电子显微镜)可找 回相似的图像。
权利要求
1. 一种分析样品的方法，该方法包括·在样品上预备大体上平坦的表面，·使样品暴露于含有标签的标示试剂，由此将标签引入样品中，·获得一系列样品图像，每个图像包括样品的信息，通过使样品暴露于颗粒束可得到所述信息，·获得标签在由此所得的每个图像中的相对位置，以及·由所得的相对位置得到标签的相对位置的三维重构，其特征在于·各个图像在大体上相同的方向上显示所述的样品，以及·从处于该一系列图像的各连续图像之间的样品中除去表面层，留下大体上平行于最初形成的平坦表面的新表面层。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述标签是发光的标签，所 述颗粒束是在样品的整个表面上扫描的精细聚焦的颗粒束，并且其中 所述的信息包括与响应暴露于对颗粒束而从所述标签发出的光量成比 例的信息。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述发光的标签是无机纳米 颗粒，所述纳米颗粒包括掺杂有发光活化剂离子的主晶格，其起到了 所述纳米颗粒发光中心的作用，并且其中获得一种图像，其包括检测 由所述活化剂离子发出的光。
4. 根据权利要求2所述的方法，其中所述发光的标签是无机量子 点纳米颗粒。
5. 根据权利要求2所述的方法，其中所述发光的标签是有机标签。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述发光的标签包括高Z 材料。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述高Z材料包括金纳米颗粒。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中用银或金增强所述的金纳米 颗粒。
9. 根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中获得图像包括 处理由颗粒探测器探测到的信号。
10. 根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中获得图像包括 处理由X射线探测器探测到的信号。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中采用颗粒束除去 一个或多个表面层。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述颗粒束是精细聚焦的束。
13. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中利用电磁辐射 束除去一个或多个表面层。
14. 根据权利要求1 - 10中任一项所述的方法，其中通过升华作用 除去一个或多个表面层。
15. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述除去一个或 多个表面层是在颗粒光学仪器中原位进行的。
16. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中标签的上边界是 基于在一个图像中不存在标签并且在接下来的图像中存在标签而确定 的，以及标签的下边界是基于一个图像中存在标签并且在接下来的图 ^像中不存在标签而确定的。
全文摘要
本发明涉及一种方法，其中将标签引入样品中，在样品上预备大体上平坦的表面，并且用例如扫描电子显微镜制作样品表面的一系列图像，该标签可以是金标签或例如荧光标签。通过在每个图像的获得之间除去表面层，在一个图像中的表面处标签将被除去并且在接下来的图像中标签将不可见，由此可制得样品中标签位置的三维重构。
文档编号G01N33/58GK101427138SQ200680048500
公开日2009年5月6日 申请日期2006年12月22日 优先权日2005年12月22日
发明者H·N·斯林格兰德 申请人:Fei公司