专利名称：一种丹参丹酚酸a检测分析方法
技术领域：
本发明涉及药物质量分析领域，具体涉及一种丹参丹酚酸A检测分析方法。
背景技术：
丹参为唇形科鼠尾属植物Salvai miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，是中医药最常用药之一。现有质量分析技术中多以丹参素和原儿茶醛对丹参及其制剂(包括复方制剂)进行质量控制和含量测定的常用物质，文献显示丹参素是丹酚酸类分解后的次产物，而且分子结构简单而容易合成；原儿茶醛不是丹参中特有或独有的成份，这样就可以在药品制备中加入一定量的上述物质，以达到在质量检测中符合标准的目的，给药品质量分析工作带来巨大的困难；很多文献采用丹酚酸B进行质量测定，丹酚酸B是丹参丹酚酸中活性成分之一的物质，但不能完全代表丹参及其制剂的质量好与坏；采用上述质量分析方法不能很好的确定丹参及含有丹参的制剂的质量，因此，丹参原药材、含有丹参的制剂的质量测定一直存在着一些缺陷，这是医药科研工作人员急需解决的难题之一。
丹酚酸A是存在于唇形科植物丹参中的一种水溶性酚酸类化合物。近年来丹酚酸A被发现具有强烈的抗氧化作用和清除氧自由基作用，对多种心、脑血管疾病及肝、肾功能损伤和肺纤维化等组织器官的病变均有明显的保护作用，因此，提供一种准确的质量分析方法来测定丹参及其制剂中丹参丹酚酸A含量是极其必要的；但是，作为一种强抗氧剂的丹酚酸A其本身不太稳定，在加温、光照、潮湿和暴露在空气的条件下，丹酚酸A会发生降解，因此怎么保证在检测中使丹酚酸A稳定、不降解是关键的技术难点；而且，丹参及丹参制剂中还会含有丹酚酸A性质相近的化合物，普通的检测分析方法不能精确测量丹酚酸A含量。
文献“RP-HPLC法测定香丹注射液中丹酚酸A的含量”(《药物分析杂质》2002、22(4)311)和专利“一种含有原料药材丹参的注射剂及其质量控制方法”(申请号为200410081525.9)使用甲醇∶水∶甲酸的流动相进行检测分析，虽然在一定程度上可以保持丹酚酸A的稳定性，但是其使用的甲酸的量比较大(与水和甲醇比例为0.8％)，对检测分析柱的损伤比较大，而且这种流动相对丹酚酸A进行分析得到峰纯度不好，这样的检测结果是不精确的，会造成丹参丹酚酸A含量不准确，从而导致产品质量的不稳定性。
发明内容
基于上述原因，根据丹参丹酚酸A的性质，在高效液相检测过程中我们发现，为了提高丹酚酸A峰纯度、保持丹酚酸A的稳定性，应该在流动相中加入一定量的酸，采用特定的梯度洗脱，这样就可以很好的将丹酚酸A含量确定，同时可以保持丹酚酸A的稳定性，使丹酚酸A的含量得到精确的测定，但在流动相中加入太多量的酸会对填充柱损伤较大，而加入酸的量不在一定范围内就不能产生很好的峰纯度，我们通过长期实验研究确定流动相为乙腈、水和甲酸，或乙腈、水和乙酸，或乙腈、水和磷酸，在0-72分钟内梯度洗脱，梯度洗脱中保持流动相中甲酸、乙酸或磷酸体积百分比在0.02％-0.38％范围内变化，乙腈在5％-80％范围内变化，通过以不同比例的乙腈与甲酸或乙酸或磷酸溶液作为流动相，用此流动相在梯度时间内梯度洗脱，可以很好的将丹参丹酚酸A与其性质相近的杂质分离开，保证了丹酚酸A含量的精确性，并可以很好的保持色谱柱的使用率；优选实验中确定流动相中甲酸、乙酸或磷酸体积百分比在0.04％-0.19％范围内变化，乙腈在5％-80％内变化。
本发明通过以下技术方案实现的。
丹参药材、丹参丹酚酸A样品、含有丹参的药物制剂(包括复方制剂)、含有丹参丹酚酸A的药物制剂色谱柱C18反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS预柱色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；0-15分钟时，乙腈的比例由5％升至20％，0.1-0.4％乙酸水溶液或0.1-0.4％磷酸水溶液或0.1-0.4％甲酸水溶液的比例由95％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.1-0.4％乙酸水溶液或0.1-0.4％磷酸水溶液或0.1-0.4％甲酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.1-0.4％乙酸水溶液或0.1-0.4％磷酸水溶液或0.1-0.4％甲酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.1-0.4％乙酸水溶液或0.1-0.4％磷酸水溶液或0.1-0.4％甲酸水溶液的比例由50％降至20％；对照品溶液的配制精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加50％乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；供试品溶液的配制精密称取或量取样品，经过处理后，放到容量瓶中，加50％乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积或峰高计算含量即得。
上述方法中，保持乙酸在体积百分比在0.02％-0.38％范围内变化；优选流动相中乙酸体积百分比在0.04％-0.19％范围内变化；其中乙酸可以用磷酸或甲酸代替；高效液相色谱法检测波长为286nm。
取丹参丹酚酸A样品、丹参药材、丹参注射液、丹参丹酚酸A注射剂按照上述方法进行检测分析，检测结果见表1
表1检测结果
结论通过实验表明，采用本申请分析方法可以很好对丹参及其制剂进行质量分析，充分说明本申请检测分析方法具有科学意义。
1.图1流动相为甲醇∶水∶甲酸＝41∶59∶0.8的高效液相色谱图，样品为丹参丹酚酸A，批号为20060324；(横坐标是时间，纵坐标是电压)2.图2流动相为甲醇∶水∶甲酸＝41∶59∶0.8的峰纯度图，样品为丹参丹酚酸A，批号为20060324；(横坐标是时间，纵坐标是电压)3.图3流动相为乙腈、水、磷酸的高效液相色谱图，样品为丹参丹酚酸A，批号20060324，在72分钟时间梯度内，流动相乙腈在5％-80％范围内变化，磷酸在0.02-0.095内变化；(横坐标是时间，纵坐标是电压)4.图4流动相为乙腈、水、磷酸的峰纯度图，样品为丹参丹酚酸A，批号20060324，在72分钟时间梯度内，流动相乙腈在5％-80％范围内变化，磷酸在0.02-0.095内变化；(横坐标是时间，纵坐标是电压)5.图5流动相为乙腈、水、磷酸的高效液相色谱图，样品为丹参丹酚酸A，批号20060324，在72分钟时间梯度内，流动相乙腈在5％-80％范围内变化，磷酸在0.04-0.18内变化；(横坐标是时间，纵坐标是电压)6.图6流动相为乙腈、水、磷酸的峰纯度图，样品为丹参丹酚酸A，批号20060324，在72分钟时间梯度内，流动相乙腈在5％-80％范围内变化，磷酸在0.04-0.18内变化；(横坐标是时间，纵坐标是电压)7.图7流动相为乙腈、水、磷酸的高效液相色谱图，样品为丹参丹酚酸A，批号20060324，在72分钟时间梯度内，流动相乙腈在5％-80％范围内变化，磷酸在0.06-0.285内变化；(横坐标是时间，纵坐标是电压)8.图8流动相为乙腈、水、磷酸的峰纯度图，样品为丹参丹酚酸A，批号20060324，在72分钟时间梯度内，流动相乙腈在5％-80％范围内变化，磷酸在0.06-0.285内变化；(横坐标是时间，纵坐标是电压)9.图9流动相为乙腈、水、磷酸的高效液相色谱图，样品为丹参丹酚酸A，批号20060324，在72分钟时间梯度内，流动相乙腈在5％-80％范围内变化，磷酸在0.08-0.38内变化；(横坐标是时间，纵坐标是电压)10.图10流动相为乙腈、水、磷酸的峰纯度图，样品为丹参丹酚酸A，批号20060324，在72分钟时间梯度内，流动相乙腈在5％-80％范围内变化，磷酸在0.08-0.38内变化；(横坐标是时间，纵坐标是电压)表2不同液相条件分离结果比较
实验结论图1的峰纯度较差，表明丹参丹酚酸A的色谱峰中含有其他成分，使得丹参丹酚酸A含量测定结果不准确；图2-5峰纯度良好，保证了丹参丹酚酸A含量的准确性；通过上述实验表明，本申请质量分析方法具有一定的科学意义。
注将上述检测样品更换成丹参药材、含丹参制剂或含丹参丹酚酸A的制剂，图谱的效果相近；将上述磷酸更换成甲酸或乙酸，图谱的分离结果相近。
制备实施例实施例1丹参药材药材检测色谱柱C18反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS预柱色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；0-15分钟时，乙腈的比例由5％升至20％，0.2％磷酸水溶液的比例由95％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％磷酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％磷酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％磷酸水溶液的比例由50％降至20％；对照品溶液的配制精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加50％乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；预处理精密称取丹参药材细粉，甲醇超声提取，滤过，浓缩干燥，加50％乙醇定容；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积或峰高计算含量即得。
上述方法中，保持磷酸体积百分比在0.04％-0.19％范围内变化； 高效液相色谱法检测波长为286nm。
实施例2丹参丹酚酸A样品检测分析色谱柱C18反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS预柱色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；0-15分钟时，乙腈的比例由5％升至20％，0.3％甲酸水溶液的比例由95％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.3％甲酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.3％甲酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.3％甲酸水溶液的比例由50％降至20％；对照品溶液的配制精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加50％乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；供试品溶液的配制精密称取丹参丹酚酸A样品，甲醇超声提取，滤过，浓缩干燥，加50％乙醇定容；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积或峰高计算含量即得。
上述方法中，保持甲酸体积百分比在0.06％-0.285％范围内变化；高效液相色谱法检测波长为286nm。
实施例3复方丹参片的检测分析色谱柱C18反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS预柱色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；0-15分钟时，乙腈的比例由5％升至20％，0.1％乙酸水溶液的比例由95％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.1％乙酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.1％乙酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.1％乙酸水溶液的比例由50％降至20％；对照品溶液的配制精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加50％乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；预处理精密称取复方丹参片细粉，甲醇超声提取，滤过，浓缩干燥，加50％乙醇定容；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积或峰高计算含量即得。
上述方法中，保持乙酸体积百分比在0.02％-0.095％范围内变化；高效液相色谱法检测波长为286nm。
实施例4香丹注射液的检测分析色谱柱C18反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS预柱色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；0-15分钟时，乙腈的比例由5％升至20％，0.2％乙酸水溶液的比例由95％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.2％乙酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.2％乙酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.2％乙酸水溶液的比例由50％降至20％；对照品溶液的配制精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加50％乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；供试品溶液的配制精密量取香丹注射液，加50％乙醇，滤过，定容；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积或峰高计算含量即得。
上述方法中，保持乙酸体积百分比在0.04％-0.19％范围内变化；高效液相色谱法检测波长为286nm。
实施例5丹参丹酚酸A注射液色谱柱C18反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS预柱色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；0-15分钟时，乙腈的比例由5％升至20％，0.4％乙酸水溶液的比例由95％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.4％乙酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.4％乙酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.4％乙酸水溶液的比例由50％降至20％；对照品溶液的配制精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加50％乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；供试品溶液的配制精密量取丹参丹酚酸A注射液，加50％乙醇，滤过，定容；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积或峰高计算含量即得。
上述方法中，保持乙酸在体积体积百分比在0.08％-0.38％范围内变化；高效液相色谱法检测波长为286nm。
注上述检测分析原料可以互相替换；上述检测分析方法中流动相中甲酸、乙酸、磷酸可以互相替换；
注本发明所要求保护的具体技术方案，不限于上述实施例所表达的技术方案的具体组合。
权利要求
1.一种丹参丹酚酸A的检测分析方法，包括丹参药材、丹参丹酚酸A样品、含有丹参的药物制剂、含有丹参丹酚酸A的药物制剂的高效液相色谱法检测分析，其特征在于流动相为乙腈、水和乙酸，在0-72分钟内梯度洗脱，梯度洗脱中保持流动相中乙酸体积百分比在0.02％-0.38％范围内变化，乙腈的体积百分比在5％-80％范围内变化。
2.根据权利要求1所述的一种丹参丹酚酸A的检测分析方法，其中流动相中乙酸体积百分比在0.04％-0.19％范围内变化，乙腈的体积百分比在5％-80％变化。
3.根据权利要求1所述的一种丹参丹酚酸A的检测分析方法，其特征在于色谱柱C18反相色谱柱，NUCLEODUR，250*4.6mm，ODS预柱色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速1.0ml/min；柱温35℃；0-15分钟时，乙腈的比例由5％升至20％，0.1-0.4％乙酸水溶液的比例由95％降至80％；15-55分钟时，乙腈的比例由20％升至30％，0.1-0.4％乙酸水溶液的比例由80％降至70％；55-65分钟时，乙腈的比例由30％升至50％，0.1-0.4％乙酸水溶液的比例由70％降至50％；65-72分钟时，乙腈的比例由50％升至80％，0.1-0.4％乙酸水溶液的比例由50％降至20％；对照品溶液的配制精密称取丹酚酸A对照品到容量瓶中，加50％乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；供试品溶液的配制精密称取或量取样品，经过处理后，放到容量瓶中，加50％乙醇溶解摇匀，并稀释至刻度；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积或峰高计算含量即得。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种丹参丹酚酸A的检测分析方法，其中高效液相色谱法检测波长为286nm。
5.根据权利要求1、2或3所述的一种丹参丹酚酸A的检测分析方法，其中乙酸用甲酸或磷酸代替。
全文摘要
本发明公开了一种丹参丹酚酸A检测分析方法，包括丹参药材、含有丹参的药物制剂、丹参丹酚酸A样品、含有丹参丹酚酸A的药物制剂的高效液相色谱法检测分析，其特征在于根据丹参丹酚酸A在溶液中不稳定的性质，以及在丹参、丹参丹酚酸A样品、含有丹参的药物制剂、含有丹参丹酚酸A的药物制剂中含有大量的极性与丹酚酸A相近的水溶性物质，我们采用控制流动相中酸类物质保持在一定范围内，进行梯度洗脱的方法检测分析，在保持丹参丹酚酸A稳定的情况下，保证丹酚酸A峰的纯度，保证了丹参丹酚酸A含量测定的准确性。
文档编号G01N33/15GK1987452SQ20071000054
公开日2007年6月27日 申请日期2007年1月12日 优先权日2007年1月12日
发明者米长江, 顾群, 阮爱华, 李志刚 申请人:北京本草天源药物研究院