一种检测土壤反硝化酶活性的分析方法

专利名称：：一种检测土壤反硝化酶活性的分析方法
技术领域：
：本发明涉及土壤中反硝化酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中反硝化酶活性的分析方法。技术背景土壤中的反硝化酶能将在土壤氮代谢过程中形成的硝态氮还原生成亚硝态氮或者氮气或一氧化氮，土壤中的还原态化合物可作为氢的供体。反硝化酶反硝化酶N03—-N-N02—-N-N2+N0+2H+2H因此，土壤中反硝化酶活性的强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素的气态损失，间接影响氮肥的利用效率。土壤中反硝化酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中反硝化酶活性的检验有很重要的意义。而到目前为止，有关反硝化酶活性的测定基本都是参照JordanTEetW(1998)和WhiteJRetaHl999)的方法。该种方法步骤比较繁瑣，需用专用分析设备，试剂瓶和抽滤装置进行抽真空培养，且培养批次的不同具有差异性和不确定性，使其难以适应土壤中反硝化酶活性的定性比较和定量研究；同时，该种方法样品的前期处理比较麻烦，降低了实验的效率，增加了实验结果的不准确性。
发明内容本发明的目的在于提供一种检验土壤中反硝化酶活性的分析方法。该方法是在借鉴前人测定方法的原理基础上，对反硝化酶活性的测定步骤和显色方法进行了部分改进(对其样品的处理方法和测定方法进行改进)，从而减少样品处理和试验步骤的复杂性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种检测土壤中反硝化酶活性的分析方法，1)称取0.5-lg过1-1.5隱筛的土壤风干样品n份分别装入n支试管中，n>2,向其中n-l支试管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物KN03溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；然后向试管中分别加入l-2mL重量浓度0.5%-P/。的葡萄糖溶液作为氢的供体，用蒸馏水补充至15-20mL,摇匀，塞上不透气的橡胶塞后37C恒温培养48h;同时作试剂空白对照(不加土壤，其余同样品处理)；2)培养结東后，3900-4100r/min离心20-25min;3)用紫外分光光度法分别测定吸光度A22。，A275;4)求出校正吸光度A-A22。-A275;5)制作工作标准曲线，以硝酸根溶液的系列浓度和测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b;6)根据吸光值A和斜率b，计算所测定溶液中硝酸根的浓度S，S=A*b;7)计算样品中硝酸根浓度；8)计算反硝化酶活性计算公式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中Si为试剂空白中的N03—-N的含量(mg),S2为样品中的N03—-N的含量(rag/L),S3为样品对照中的N03—-N的含量(mg/L),V为浸提液总体积(mL)，W为称土样重(g),1000为单位转换系数，T土样培养时间(h)。对于酸性土样品，分析前应调解其PH为7-8.5,可釆用加入碳酸锦的方法调解，每支试管中分别加入15-25mgCaC03,混匀向其中n-l支试管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物KN03溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照。(对于石灰性土壤而言，碳酸钙无需加入，因为土壤本身的pH值既可以满足微生物的最适pH)制作工作标准曲线过程为吸取硝酸根标准溶液OmL,0.5mL,lmL,2mL,3mL,4mL，5mL分别放于lOOmL容量瓶中(如有沉淀过滤)用蒸馏水定容，用紫外分光光度计测其吸光度A'，以硝酸根溶液的系列浓度0mg/L,0.5mg/L,1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L,5mg/L和测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b。本发明方法改进的依据土壤反硝化酶是硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、土壤羟胺还原酶等一切与硝态氮还原有关的酶的总称，它们都是参与土壤中氮素代谢的还原酶类。它们在测定过程中均需要厌氧培养条件。硝酸还原酶活性测定是以硝酸钾(KN03)为底物，通过加入2,4-二硝基酚抑制亚硝酸还原酶的活性，来检测单位时间内N02—-N的生成量；亚硝酸还原酶活性的测定方法则是以亚硝酸钠(NaN02)为底物，经过24小时厌氧培养，通过单位时间内NO—21的减少量来表征；羟胺还原酶活性的测定则是以羟胺(NH20H)为底物，经过5小时厌氧培养，通过单位时间内羟胺的减少量来衡量羟胺还原酶的活性。与此相同，本方法中土壤反硝化酶活性的测定是以硝酸钾(KN03)为底物，经过48h的厌养培养，通过计算单位时间内单位土壤的N03—-N的减少量来表征反硝化酶的活性。本试验中土壤样品淹没在液面以下，目的就是为培养试验创造良好的厌养环境。本发明所使用的测定原理为土壤反硝化酶反应需要在厌养环境中进行，加入试管中的硝态氮的去向只能是作物利用、淋失、土壤吸附和反硝化4个方面之一。本试验中，1g土壤被溶液完全淹没，处于厌氧条件下，其硝态氮也不可能淋失，加之其又是一种阴离子，土壤对其吸附的量很小。所以培养结東后硝态氮的损失只能是反硝化作用的结果。因此，本试验拟通过反应后N03--N的损失量来表征土壤反硝化酶活性。硝酸根在紫外线(22Onm)有吸收峰，样品可以不经处理用紫外分光光度计测其吸光度，转化并计算硝酸根的含量，进而计算减少的N03--N量。与过去的分析方法相比较，本发明的优点主要有1)所需设备简单、降低了试验成本。本发明中的培养试验是在直径10-15mm、长为100-150mm的普通玻璃试管中进行，不需用原来方法中提及的用来实现抽真空的带磨口塞的专用真空瓶及真空泵。2)所使用的方法不需要显色，减少操作过程的复杂性。利用硝酸根在紫外线有吸收峰，免去了样品的复杂处理，由于硝酸根在紫外线(220nm)有吸收峰，样品可不经处理在紫外分光光度计上于波长220nm和275nm直接测定A，和A275，用校正吸光度A=A22。一A^查得硝酸根浓度。3)操作简单，分析结果稳定可靠，重现性好。原来方法需要设置灭菌土壤作为对照，本方法只需要一个不加底物的溶液作为对照，与传统方法比较，所需设备简单，成本低；同时，由于本发明所涉及到的培养方法减少了厌氧培养过程的复杂性和不确定性，故分析结果重现性非常良好。离心处理使吸附在土壤颗粒上的硝态氮充分与水混合并溶解在溶液里，提高了实验结果的准确度。具体实施方式试剂配制1.硝酸根标准溶液[P(冊3—XOOmg.L-1]:称取硝酸钾(KN03，分析纯)0.1631g溶于水稀释至1L。2.底物KN(U容液aOg/L):称取10gKNOs溶于蒸馏水中,用蒸馏水定溶至1L。3.CaC03，分析纯试剂。4.ly。的葡萄糖溶液称取lg葡萄糖，用蒸馏水定容至100mL。5.制作工作标准曲线吸取硝酸根标准溶液OmL，0.5mL,lmL,2mL,3mL，4mL，5mL分别放于100mL容量瓶中(如有沉淀过滤)用蒸馏水定容，用紫外分光光度计测其吸光度A',以硝酸根溶液的系列浓度(0mg/L,0.5mg/L，1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L，5mg/L)和测定的吸光值A'制作工作标准曲线，得到斜率b。操作步骤1)称取lg过lmm筛的土壤风干样品4份于4支试管中，分别加入20mgCaCO3,仔细混合后，向其中3支试管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物KN(V溶液，另l支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；然后向试管中分别加入l-2mL0.5%-1%的葡萄糖溶液作为氢的供体，用蒸馏水补充至15-20mL,摇匀，塞上不透气的橡胶塞后37L恒温培养48h;同时作试剂空白对照；2)培养结束后，4000r/min离心20min;3)用紫外分光光度法测定吸光度A22Q,A275;4)求出校正吸光度A=A22。-A275;5)根据吸光值A和斜率b,计算所测定溶液中硝酸根的浓度S,S=A*b;6)计算样品中硝酸根含量；7)计算反硝化酶活性；计算公式为[S「(S2-S3)*V/1000]/W.T=mgNO广N/g土48h式中为试剂空白中的N(V-N的含量(mg),S2为样品中的N03—-N的含量(mg/L)，S3为样品对照中的N0,-N的含量(mg/L),V为浸提液总体积(mL)，W为称土样重(g)，1000为单位转换系数，T土样培养时间(h)。实施例1本实施例所使用的黑土采自于中国科学院海伦生态试验站，设三个不同的处理l号位对照，既不经过任何处理和添加任何土壤添加剂在25。C培养24h以上的普通土壤；2号为添加硝化抑制剂DCD且在25。C培养24h以上的土壤；3号为添加硝化抑制剂DMPP且在25。C培养24h以上的土壤。土壤含水量均为20%(风干土重)。2号和3号添加硝化抑制剂的土壤，其中两种抑制剂的添加量都是50ppm，用上述方法检测三种处理的反硝化酶活性。每种土壤得具体分析步骤如下1)称取lg过lmm筛的土壤风干样品4份于4支试管中，分别加入20mgCaCO3,仔细混合后向其中3支试管中加入10mL10g/L的底物KNOr溶液，另l只试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；然后向试管中分别加入lmLW的葡萄糖溶液作为氢的供体，用蒸馏水补充至15-20mL，摇匀，塞上不透气的橡胶塞后37。C恒温培养48h;同时作试剂空白对照；2)培养结束后，4000r/min离心20min;3)用紫外分光光度法测定吸光度A，，A275;4)求出校正吸光度A=A22Q-A275;5)根据吸光值A和斜率b,计算所测定溶液中硝酸根的浓度S,S=A*b;6)计算样品中硝酸根含量；7)计算反硝化酶活性。试验结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表中数据可以看出，各处理之间结果差异达到显著水平，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。实施例2本实施例所使用的三种不同种植作物的棕壤均釆于中国科学院沈阳生态实验站其中4号土壤前茬作物为水稻，5号土壤前茬作物为玉米，6号土壤前茬作物为大豆。三种不同耕作制度的土壤均在含水量为2W(风干土重)，温度在25'C条件下培养24h以上，测定其反硝化酶活性，具体步骤如下底物硝酸钾浓度为20g/L,加入5mL,葡萄糖浓度为1%，加入lmL,其余步骤同实例1。试验结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。权利要求1.一种检测土壤中反硝化酶活性的分析方法，其特征在于1)称取0.5-1g过1-1.5mm筛的土壤风干样品n份分别装入n支试管中，n≥2，向其中n-1支试管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物KNO3溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；然后向试管中分别加入1-2mL重量浓度0.5％-1％的葡萄糖溶液作为氢的供体，用蒸馏水补充至15-20mL，摇匀，塞上不透气的橡胶塞后37℃恒温培养48h；同时作试剂空白对照；2)培养结束后，3900-4100r/min离心20-25min；3)用紫外分光光度法分别测定吸光度A220，A275；4)求出校正吸光度A＝A220-A275；5)制作工作标准曲线，以硝酸根溶液的系列浓度和测定的吸光值A’制作工作标准曲线，得到斜率b；6)根据吸光值A和斜率b，计算所测定溶液中硝酸根的浓度S，S＝A*b；7)计算样品中硝酸根浓度；8)计算反硝化酶活性计算公式为[S1-(S2-S3)*V/1000]/W.T＝mgNO3--N/g土·48h式中S1为试剂空白中的NO3--N的含量(mg)，S2为样品中的NO3--N的含量(mg/L)，S3为样品对照中的NO3--N的含量(mg/L)，V为浸提液总体积(mL)，W为称土样重(g)，1000为单位转换系数，T土样培养时间(h)。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于对于酸性土样品，分析前应调解其PH为7-8.5,可釆用加入碳酸钙的方法调解，每支试管中分别加入15-25mgCaC03,混匀向其中n-1支试管中加入5-15mL5g/L-15g/L的底物體03溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照。3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于制作工作标准曲线过程，吸取硝酸根标准溶液OmL,0.5mL,lmL,2raL,3mL,4mL，5mL分别放于100mL容量瓶中用蒸馏水定容，用紫外分光光度计测其吸光度A',以硝酸根溶液的系列浓度Omg/L，0.5mg/L,1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L，5mg/L和测定的吸光值A，制作工作标准曲线，得到斜率b。全文摘要本发明涉及一种检测土壤中反硝化酶活性的分析方法1)称取过筛的土壤风干样品n份于试管中，向其中n-1支试管中加入底物硝酸钾溶液，另1支试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；然后向试管中分别加入葡萄糖溶液，用蒸馏水补充至15-20mL，摇匀，加塞后恒温培养；2)4000r/min离心20min；3)用紫外分光光度法测定吸光度A₂₂₀，A₂₇₅；4)用校正吸光度A＝A₂₂₀-A₂₇₅计算查得硝酸根含量。本发明优点为1)简化了操作步骤，减少了厌养培养过程的复杂性和不确定性；2)减少对设备要求的依赖性；3)方法准确度高，易操作；4)结果稳定可靠，重现性好；5)省略了样品的显色过程。文档编号G01N21/31GK101270385SQ20071001068公开日2008年9月24日申请日期2007年3月21日优先权日2007年3月21日发明者史云峰,武志杰,陈利军,隽英华申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所