专利名称：：一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明属于水产学科生物
技术领域：
，具体是涉及一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
：螺原体类(spiroplasma)微生物能在淡水甲壳动物及其他经济水生动物(克氏原螯虫下和南美白对虾等)中传播，对水产养殖构成了极大的威胁。目前水生动物螺原体病原的检测可以利用光镜，电镜技术，微生物学，和分子生物学方法，这些技术已运用于我们实验室虾蟹类螺原体病原的常规检测，但这些检测实验操作复杂，需要特定的专业技能和仪器设备，很难在生产实际中推广运用。以血清学反应原理为基础的酶联免疫吸附(Enzyme-Linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测方法在不需要特殊仪器的情况下，可直接通过肉眼观察颜色反应变化来鉴别检测结果，具有简洁方便，特异性强，灵敏度高等优点，所以快速有效的检测方法和试剂盒急待开发。特别是其多抗制备条件需要进行不断摸索，以便获得高效价的抗体，为试剂盒研制奠定基础。
发明内容本发明的目的是提供一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒，包括包被液、洗涤液、小牛血清、一抗血清、酶结合物工作液(二抗)、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照和酶标板条；所说的显色液分为四甲基联苯胺(TMB)、拧檬酸-磷酸盐缓冲液和双氧水；所说的阳性对照是含水生动物螺原体的样本，阴性对照是不含螺原体的样本，一抗血清为水生动物螺原体的多克隆抗体，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG多克隆抗体。本试剂盒中所用的包被液、洗涤液、显色液、终止液、小牛血清以及酶结合物工作液是酶联免疫中常规试剂。具体地，所说的包被液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸缓冲液；洗涤液为含0.05%吐温-20、pH7.4的磷酸缓冲液；显色液成份有柠檬酸-磷酸盐缓冲液，四甲基联苯胺(TMB)固体，30%过氧化氢液体；终止液为2mol/L硫酸溶液。所说的酶标板条优选12孔。上述所说的阳性对照中的水生动物螺原体，优选蟹螺原体Spiroplasma.CRAB，龙虾螺原体Spiroplasma.CRAYFISH和南美白对虾螺原体Spiroplasma.SHRIMP。其中，水生动物螺原体的多克隆抗体可通过常规的动物免疫方法(免疫抗原采用破碎或全菌的，灭活或不灭活，免疫方式采用腹部皮下注射，耳静脉注射，注射加佐剂或不加佐剂注射，3次和4次免疫)获得，但本发明推荐用以下方法制备采用经甲醛灭活后的螺原体全菌作为免疫抗原，在健康新西兰大耳兔腹部多点与耳静脉相结合进行4次人工免疫，前两次注射抗原加等体积佐剂，经效价检测后，通过心脏抽血，分离获得高效价螺原体多克隆抗体。本发明的检测原理为在检测中，将对照样本和待检样本分别包被微孔板(聚苯乙烯微量滴定板)，孵育后，经洗涤加入制备好的水生动物螺原体多克隆抗体(一抗)，该抗体与结合在微孔板上的抗原发生特异性结合；洗涤后除去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG多抗(二抗)；孵育后再经洗涤除去未结合的酶结合物，显色后终止。阳性对照显示出黄色，阴性对照则无显色，根据待测样本的显色反应与对照进行比对，即可得到检测结果。本发明的检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒，主要采用间接ELISA方法，检测水生动物血液和肌肉样品中的螺原体，该试剂盒使用方便，快速，经济，敏感性高，特异性强，重复性好，便于推广应用，能有效的检出样本中的螺原体。具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。实施例中所说的螺原体是依照现有技术从患颤抖病的中华绒螯蟹，患系统性疾病的龙虾和南美白对虾体内分别分离培养出蟹螺原体Spiroplasma.CRAB,龙虾螺原体Spiroplasma.CRAYFISH和南美白对虾螺原体Spiroplasma.SHRIMP;申请人保存的上述菌抹20年内可以向公众提供。实施例1:检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒(1)抗原的制备从患颤抖病的中华绒螯蟹，患系统性疾病的龙虾和南美白对虾体内分别分离培养出蟹螺原体Spiroplasma.CRAB，龙虾螺原体Spiroplasma.CRAYFISH和南美白对虾螺原体Spiroplasma.SHRIMP,在R2培养基中传代2—3代后的菌株进行冷冻干燥或一70度保存。抗原制备将分离、培养获得的虾蟹螺原体(蟹螺原体Spiroplasma.CRAB，龙虾螺原体Spiroplasma.CRAYFISH或南美白对虾螺原体Spiroplasma.SHRIMP病原，采用0.4%甲醛12-15小时灭活。灭活病原以12000r/min离心50min，洗涤，离心，重复3次，制备成抗原，并用电镜鉴定抗原纯度，紫外分光光度计测定浓度。然后置4"C冰箱保存备用。病菌培养物上置电镜铜网吸附2min，滤纸吸干后滴一滴4%戊二醛液，20s后吸干，滴一滴2%磷钩酸钠，放置5s，置于日立H-600型透射电子显微镜下观察。在电镜下观察，可见其含大量的螺原体，未见杂菌。通过光镜计数法测得浓度为1()S个/ml。紫外分光光度计测定抗原蛋白浓度，根据公式蛋白浓度(g/L)=(样品吸光值/标准样品吸光值)*标准蛋白浓度计算得出。(2)—抗血清(多克隆抗血清)的制备选用2公斤以上健康雄性健康新西兰大耳兔作为免疫动物，将分离培养的螺原体作为免疫抗原，216吗/ml，4'C保存；然后进行免疫注射程序，将0.9ral免疫抗原加0.9ml弗氏完全佐剂，充分混合，在家兔腹部皮下多点注射，每点0.3ml(第一次免疫)；第一次免疫一周后，用lml免疫抗原加lml弗氏完全佐剂，充分混合，在家兔腹部皮下多点注射，每点0.4ml(第二次免疫)；第二次免疫一周后，用0.4ml免疫抗原耳静脉注射(第三次免疫)；第三次免疫一周后耳静脉微量取血，间接ELISA测3免抗体效价，若达不到要求次曰继续耳静脉注射0.5ml进行4免；一周后，心脏采血，分离血清，加入O.l%NaN3，在-70。C下保存，得中华绒螯蟹颤抖病病原菌纯培养物TDA的多克隆抗体。(3)酶结合物工作液(二抗)购自北京博奥森生物技术有限公司。(4)阳性、阴性对照的制备阳性对照取自具有典型颤抖病症状的蟹和患螺原体病的虾，病蟹血上置电镜铜网吸附2min，滤纸吸干后滴一滴4%戊二醛液，20s后吸干，滴一滴2%磷钨酸钠，放置5s，置于日立H-600型透射电子显微镜下观察。在电镜下观察，可见其含大量的螺原体。阴性对照来自健康蟹和虾血液则观察到背景干净，没有螺原体。(5)小牛血清购自中美合资兰州民海生物工程有限公司。(6)其他试剂的配制包被液pH9.6的碳酸缓冲液；洗涤液pH7.4，含0.05%吐温-20的磷酸缓冲液；显色液分为柠檬酸-磷酸盐缓冲液，四甲基联苯胺(TMB)固体，30%过氧化氢液体；终止液2mol/ml硫酸溶液。(7)酶标条FEP11096,96孔可拆板，购自南京布克生物技术有限公司。(8)检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒1#碳酸缓冲液(包被液)1,2ml(1.5ml离心管)2#洗板用洗涤液50ml(1个50ml冷冻管)3#小牛血清280^1(5ml冷冻管)4#一抗3|al(1.5ml离心管)5#二抗0.4^1U.5ml离心管)6#TMB0.15mg(PCR管)7#柠檬酸-磷酸盐缓冲液1.5ml(1.5ml离心管)8#双氧水7》1(PCR管)9#终止液1.3ml(1.5ml离心管)10#阳性对照5^1(1.5ml离心管)11#阴性对照5nl(1.5ml离心管)酶标条1条12孔实施例2:最佳反应条件的建立间接ELISA工作浓度的确定固定抗原的浓度150吗/ml，系列稀释抗血清的浓度l:50，1:250，1:1250，1:6250，1:31250，1:156250用间接ELISA技术测定抗体效价及最佳工作浓度；采用交叉连续稀释法确定免疫血清的最佳工作浓度，抗原浓度恒定183pg/ml，调节免疫血清的稀释度l:100，1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800，1:25600，1:51200，1:102400。经间接ELISA反应后，获得在人=450处的吸收值；如表1所示，制备的免疫血清用间接ELISA测定的效价为1:31250;如表2所示，最佳工作浓度选取阳性/阴性〉2.1，阳性结果od值为l.O左右，对应的一抗血清稀释度为1:400;相应包被抗原浓度为l:20，过高和过低的稀释度都会增加非特异吸附。表l兔免疫血清效价OD值测定一抗比例1/501/2501/12501/62501/312501/156250阴性对照0.0610.0240.010.0040.0030.0033免血清1.9191.3890.9770.5850.2350.064免血清2.2721.6511.2190.8350.4990.188空白0.009注3免4免都是31250表2最佳工作浓度OD值测定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3:间接ELISA方法的敏感性、特异性、重复性，保存期验证(1)敏感性根据实施例2确定的一抗最佳工作浓度和二抗推荐的工作浓度，系列稀释抗原浓度，以确定最小检测的抗原浓度；免疫血清抗体的浓度恒定为1:400;酶标二抗的工作浓度恒定l:3000，而抗原的浓度改变范围为0.573pg/ml-34.2pg/ml，测定免疫血清对抗原的敏感度；结果如表3可见，用此方法可测的0.573|ig/ml的抗原蛋白量。表3不同抗原稀释度的ELISA检测<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>①从显色反应观察，本法最低检测是在第7个滴度1/320，即34.2*5*1/32(^0.537ng/ml,检测范围为0.537吗/ml—34.2pg/ml.②从OD值可以看出，最低检测值也是第7个滴度约0.06左右。(2)特异性选择嗜水气单胞菌Jeraw朋as7/>^rap/7a，霍乱菌属WZ)n'oC/zo/erae(江苏省水生动物疫病预防控制中心馈赠)，大肠杆菌Eycfew/c/z/aCo仏铜绿假单孢菌PwwtfomoraaJen/g/wwa，XcZ，链雾菌属5^"e/7to附yc^s/，SDD，枯草杆菌5acZ〃tw5"w&z7/s，BS，不动杆菌属A7'恥to^c^^,W22，油菜花螺原体CR-1，蜜蜂的螺原体，CH-1(均为南京农业大学环境微生物农业部国家重点实验室馈赠)与多克隆抗血清交叉反应来判断抗血清的特异性，实验细菌的浓度为10S个/ml;由螺原体免疫实验兔所得的抗血清除了与水产螺原体有正常显色反应外，与水产常见细菌均无交叉反应，与来自油菜花和蜜蜂的螺原体有非常弱的反应，从显色上能完全与阳性反应区别，因此本实验室制备的多克隆血清为专一性较高的抗螺原体血清；(3)重复性通过人工回感实验，将发病蟹分为强阳性，中阳性，弱阳性三类，每一类选取3只，每只重复检测5次。实验结果表明，无论是批间还是批内变异系数均小于10%，本方法重复性良好。(4)保存2-8'C避光保存6个月，室温27-29'C可存放至少8天，37°C以上存放不要超过24小时。实施例4:样品的检测间接ELISA病原检测(环境25-27度，检测3个样品为准，3次重复/样)，用实施例1所说的酶联免疫试剂盒进行检测，其操作为取样血液检测用lml注射器从虾蟹附肢抽取血液以1:1与磷酸缓冲液(PBS)混合，混合液为待检测样；肌肉检测用剪刀取1立方厘米大小的肌肉组织放入500nlPBS中将组织捣碎，取上清液待检测。加样和温育-每孔滴加5(al检测样品和lOOpl碳酸缓冲液(1号)的混合液，保鲜膜包裹，室温30min温育；lO号ll号内分别注入lOOpl碳酸缓冲液(l号)，将每管混合液分别滴入孔内；洗涤温育结束甩干，每孔注入洗涤液(2号，八成满)静置3分钟后甩干，此操作重复3次，最后一次甩干后在吸水纸轻拍击以促使水分吸干；配制稀释液从第2号管取2.5ml液体加入第3号管，配成稀释液；加一抗从第3号管取1.2mL稀释液滴入4号混匀，100^1/孔，保鲜膜包裹，室温30min温育；洗涤温育结束甩干，每孔注入洗涤液(八成满)静置3分钟后甩干，此操作重复3次，最后一次甩干后在吸水纸轻拍击以促使水分吸干；加二抗从第3号管1.2mL稀释液滴入5号混匀，10(Vl/孔，保鲜膜包裹，室温30min温育；洗涤温育结束甩干，每孔注入洗涤液(八成满)静置3分钟后甩干，此操作重复4次(28-31度时此操作重复5次)，最后一次甩干后在吸水纸轻拍击以促使水分吸干；显色将6号8号混入7#配成显色液，lOO^il/孔，10min显色；终止显色9号取终止液100pl/孔终止显色，肉眼观察结果。权利要求1、一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒，包括包被液、洗涤液、小牛血清、一抗血清、酶结合物工作液、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照和酶标板条；所说的显色液分为四甲基联苯胺、柠檬酸-磷酸盐缓冲液和双氧水；所说的阳性对照是含水生动物螺原体的样本，阴性对照是不含螺原体的样本，一抗血清为水生动物螺原体的多克隆抗体，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG多克隆抗体。2、根据权利要求1所说的酶联免疫试剂盒，其特征在于，其中所说的包被液为pH9.6、0.05mol/L的碳酸缓冲液；洗涤液为含0.05%吐温-20、pH7.4的磷酸缓冲液；显色液成份有柠檬酸-磷酸盐缓冲液，四甲基联苯胺固体，30%过氧化氢液体；终止液为2mol/L硫酸溶液。3、根据权利要求2所说的酶联免疫试剂盒，其特征在于，其中所说的水生动物螺原体的多克隆抗体通过以下方法制备得到采用经甲醛灭活后的螺原体全菌作为免疫抗原，在健康新西兰大耳兔腹部多点与耳静脉相结合进行4次人工免疫，甜两次注射抗原加等体积佐剂，经效价检测后，通过心脏抽血，分离获得高效价螺原体多克隆抗体。全文摘要本发明涉及一种检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒。所说的试剂盒包括包被液、洗涤液、小牛血清、一抗血清、酶结合物工作液、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照和酶标板条；所说的显色液分为四甲基联苯胺、柠檬酸-磷酸盐缓冲液和双氧水；所说的阳性对照是含螺原体的样本，阴性对照是不含螺原体的样本，一抗血清为水生动物螺原体的多克隆抗体，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG多克隆抗体。主要采用间接ELISA方法，检测水生动物血液和肌肉组织样品中的螺原体，该试剂盒使用方便，快速，经济，敏感性高，特异性强，重复性好，便于推广应用，能有效的检出血液和肌肉组织样本中的螺原体。文档编号G01N33/543GK101105494SQ20071002533公开日2008年1月16日申请日期2007年7月24日优先权日2007年7月24日发明者霆吴,文王,王俊海,伟顾,桦黄申请人:南京师范大学