专利名称：犬抗狂犬病毒抗体胶体金免疫层析检测试剂板及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂板及其制备方法，具体地是一种用胶体金免疫层析法快速检测犬抗狂犬病毒IgG抗体的试剂板及其制备方法。
背景技术：
犬不仅用于狩猎、侦破、看门、食肉和作为宠物饲养，犬还是进行生命科学、医学、药学、化工、农业、军事、环保、航天及生物工程领域应用广泛的重要实验动物之一。随着我国在生命科学、医学、药学等研究领域发展速度加快，实验犬的使用量不断增大，质量要求不断提高，实验犬的生产基地在不断涌现，但实验犬的检测体系尚未建立，使得狂犬病的危害更加突出，保证犬尤其是实验犬的质量和工作人员的身体健康与生命安全成为十分突出的课题。特别是我国进入WTO后，我国生命科学的研究成果、医药、生物制品以及实验犬等将跨出国门走向世界，这些均需要实验犬的质量检测工作标准化作为支撑，以突破发达国家设立的技术壁垒，进入国际市场。
随着经济的发展和人民生活水平的提高，宠物犬的数量在不但增加，犬的活动区域也在不断扩大。从宠物医疗市场得到的信息，人们是迫切希望了解宠物接种狂犬疫苗后对犬是否具有保护力，而目前狂犬病毒抗体的检测工作因受检测条件和费用的限制，并没有得到广泛的应用。狂犬病毒(Rabies Virus)是狂犬病的病原体，而我国又是狂犬病的高发国家，居世界第二位，仅次于印度，由于狂犬病是人畜共患性疾病，多数的狂犬病是与人类密切接触的犬传播的，其危害已经引起政府和人民的高度关注。
目前，国内外用ELISA方法检测人血清中抗狂犬病毒抗体，辅助临床上狂犬病的诊断和用于狂犬疫苗效果的评价方法已经成熟。用于实验动物包括犬、猴、鼠等狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒，也有一定的研究和报道。但是现有检测狂犬病毒抗体的方法包括ELISA方法、荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法等都存在相应的弱点。ELISA方法虽然灵敏度高，但容易出现假阳性结果。荧光免疫法、放射免疫法及化学发光法需要一定的实验仪器，且放射免疫法还不可回避放射性同位素污染的问题。而胶体金免疫层析法刚好可以避免以上几种检测方法的缺点。该方法是一种很成熟的实验检测方法，以其特异性强、成本低，操作简便，结果可靠、可单份或成批测定、不需任何仪器等优点已被广泛接受，且已用于多种病原的检测，包括禽流感病毒、乙肝病毒、结核杆菌、霍乱弧菌、弓形虫、疟原虫感染的检测等，也有用胶体金免疫层析法检测狂犬病毒抗原的报道。因此建立科学、快速、先进的实验动物和宠物犬狂犬病毒抗体检测方法，按规范程序生产相应的标准化试剂盒是当务之急。
发明内容
本发明的目的是提供一种用胶体金免疫层析法快速检测犬抗狂犬病毒IgG抗体的试剂板及其制备方法。本发明的试剂板检测快速，检测准确率高、特异性强，携带方便，操作简便，检测试剂板在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达1年，且检测重复性好。
犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板，试剂板水平面自下而上依次为样品吸收区1、金标抗体区2、固相化抗体区3和吸水区4，样品吸收区1铺设的为在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜5上铺设玻璃纤维膜，玻璃纤维膜上依次铺设金标探针聚酯膜7和硝酸纤维素膜6，硝酸纤维素膜6上包被检测线31和对照线32，检测线31侧贴有金标探针聚酯膜7，对照线32侧贴有吸水滤纸8，其中检测线31包被的是狂犬病毒糖蛋白，对照线32包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，狂犬病毒糖蛋白合适包被量为2-3μg蛋白，金标探针合适抗体标记量为10μg/ml，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为4-5μg蛋白。
其中样品吸收区1对应的是聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜5及铺设玻璃纤维纸，金标抗体区2对应的是金标探针聚酯膜7，固相化抗体区3对应的是硝酸纤维素膜6及包被的被检测线31和对照线32，吸水区4对应的是吸水滤纸8。
犬狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板的制备方法，按以下步骤进行1、狂犬病毒糖蛋白制备从感染了狂犬病毒3aG株的鼠脑组织中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增出编码糖蛋白的基因片段，重组入pUC19克隆载体，再将pUC19rabG中的糖蛋白基因片段亚克隆入pMAL-C2X质粒原核表达载体，在氨苄平板上挑取经鉴定含有pMAL-C2XN质粒的单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，加入异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导振荡培养2小时，然后收集细菌培养物，重悬于5-10ml 20mmol/L Tris-HCl亲和柱平衡缓冲液，在冰浴条件下超声破碎菌体15秒，离心收集上清液，并用5-10ml 20mmol/LTris-HCl亲和柱平衡缓冲液稀释后，装上预先平衡好的葡聚糖凝胶G75(SephadexG-75)柱进行纯化而获得所需狂犬病毒糖蛋白；2、用胶体金标记兔抗犬IgG多克隆抗体制成金标探针结合垫，在硝酸纤维素膜上包被狂犬病毒糖蛋白检测线，以及用羊抗兔IgG纯化抗体包被对照线，制成免疫层析试剂板；3、将金标探针结合垫和免疫层析试剂板铺设在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜5上，再铺上吸水滤纸8和样品吸收区1的玻璃纤维膜就得到犬狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板。
本发明的试剂板具有以下优点检测时，抽取被测者少量血液，滴在该试剂板上，对比检测线和对照线的颜色，即可判定犬体内是否产生了可中和狂犬病毒的有效抗体。
1、检测快速检测时间只需5-10分钟，能够满足现场检测的需要。
2、检测准确率高、特异性强本反应与其他犬易感病原体没有交叉反应，检测灵敏度与ELISA基本相同。
3、携带方便，操作简便本发明不需要借助其它仪器设备，适合各级人兽医院及个人使用。
4、检测试剂板在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达1年，且检测重复性好。
图1为犬抗狂犬病毒IgG抗体检测试剂板平面结构区域图。
图2为犬抗狂犬病毒IgG抗体检测试剂板纵切面结构图。
具体实施例方式
犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板，试剂板水平面自下而上依次为样品吸收区1、金标抗体区2、固相化抗体区3和吸水区4，样品吸收区1铺设的为在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜5上铺设玻璃纤维膜，玻璃纤维膜上依次铺设金标探针聚酯膜7和硝酸纤维素膜6，硝酸纤维素膜6上包被检测线31和对照线32，检测线31侧贴有金标探针聚酯膜7，对照线32侧贴有吸水滤纸8，其中检测线31包被的是狂犬病毒糖蛋白，对照线32包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，狂犬病毒糖蛋白合适包被量为2-3μg蛋白，金标探针合适抗体标记量为10μg/ml，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为4-5μg蛋白。
本发明试剂板的制备方法1、本发明中狂犬病毒糖蛋白制备方法是从感染了狂犬病毒3aG株的鼠脑组织中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增出编码糖蛋白的基因片段，重组入pUC19克隆载体，再将pUC19rabG中的糖蛋白基因片段亚克隆入pMAL-C2X质粒原核表达载体，在氨苄平板上挑取经鉴定含有pMAL-C2XN质粒的单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，加入IPTG37℃诱导振荡培养2小时，然后收集细菌培养物，重悬于8ml 20mmol/LTris-HCl亲和柱平衡缓冲液，在冰浴条件下超声破碎菌体15秒，离心收集上清液，并用8ml 20mmol/L Tris-HCl亲和柱平衡缓冲液，稀释后，装上预先平衡好的葡聚糖凝胶G75(SephadexG-75)柱进行纯化而获得所需狂犬病毒糖蛋白。
2、胶体金标记兔抗犬IgG多克隆抗体的方法分别取半径为20nm的胶体金20ml及兔抗犬IgG多克隆抗体200μg，在pH8.5的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白(BSA)作为稳定剂，且使得BSA最终浓度为1％，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-抗体复合物。
3、将胶体金-抗体复合物喷涂于聚酯膜上用20ml聚乙二醇洗涤胶体金-抗体复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用20ml浓度为2mmol/L，pH9.0的硼酸缓冲液溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上，烘干。
4、免疫层析膜的包被检测线包被的是狂犬病毒糖蛋白，对照线包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，每条线宽4mm，狂犬病毒糖蛋白合适包被量为2μg蛋白，最大量包被量为3μg蛋白，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为4μg蛋白，最大量包被量为，5μg蛋白。
5、试剂板装备塑料聚乙烯板作为支撑载体，上面粘有一层聚氯乙烯片材作为衬膜，由下至上是一层玻璃纤维组成的样品吸收区，其次是吸附了胶体金-抗体复合物的聚酯膜。然后是硝酸纤维膜，最上一层是吸水层，由一层滤纸组成，外面用胶带包封。
犬抗狂犬病毒IgG抗体快速检测试剂板的使用方法血清含中和抗体达0.5IU/ml值时，检测线出现红色的阳性反应，如检测线无此反应，即为阴性，表明血清中没有狂犬病抗体或抗体量不足，对照线不管血清中有没有狂犬病抗体均出现红色的阳性反应，表明试剂板有效，如对照线无反应，说明试剂板失效。根据WHO规定标准，中和抗体达到0.5IU时，犬才能有免疫力，否则应及时加强免疫，或改进免疫方法，或更换免疫疫苗。
权利要求
1.犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板，试剂板水平面自下而上依次为样品吸收区(1)、金标抗体区(2)、固相化抗体区(3)和吸水区(4)，其特征在于样品吸收区(1)铺设的为在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜(5)上铺设玻璃纤维膜，玻璃纤维膜上依次铺设金标探针聚酯膜(7)和硝酸纤维素膜(6)，硝酸纤维素膜(6)上包被检测线(31)和对照线(32)，检测线(31)侧贴有金标探针聚酯膜(7)，对照线(32)侧贴有吸水滤纸(8)，其中检测线(31)包被的是狂犬病毒糖蛋白，对照线(32)包被的是羊抗兔IgG纯化抗体，狂犬病毒糖蛋白合适包被量为2-3μg蛋白，金标探针合适抗体标记量为10μg/ml，羊抗兔IgG纯化抗体合适包被量为4-5μg蛋白。
2.犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板的制备方法，其特征在于按以下步骤进行(1)狂犬病毒糖蛋白制备从感染了狂犬病毒3aG株的鼠脑组织中提取总RNA进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，扩增出编码糖蛋白的基因片段，重组入pUC19克隆载体，再将pUC19rabG中的糖蛋白基因片段亚克隆入pMAL-C2X质粒原核表达载体，在氨苄平板上挑取经鉴定含有pMAL-C2XN质粒的单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，加入异丙基β-D硫代半乳糖苷37℃诱导振荡培养2小时，然后收集细菌培养物，重悬于5-10ml的20mmol/L Tris-HCl亲和柱平衡缓冲液，在冰浴条件下超声破碎菌体15秒，离心收集上清液，并用5-10ml的20mmol/L Tris-HCl亲和柱平衡缓冲液稀释后，装上预先平衡好的葡聚糖凝胶G75柱进行纯化而获得所需狂犬病毒糖蛋白；(2)胶体金标记兔抗犬IgG多克隆抗体的制备分别取半径为20nm的胶体金20ml及兔抗犬IgG多克隆抗体200μg，在pH8.5的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白BSA作为稳定剂，且使得BSA最终浓度为1％，采用高速离心法除去未结合的多克隆抗体和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀即为胶体金-抗体复合物；(3)用胶体金标记兔抗犬IgG多克隆抗体制成金标探针结合垫，在硝酸纤维素膜上包被狂犬病毒糖蛋白检测线，以及用羊抗兔IgG纯化抗体包被对照线，制成免疫层析试剂板；(4)将金标探针结合垫和免疫层析试剂板铺设在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜5上，再铺上吸水滤纸8和样品吸收区1的玻璃纤维膜就得到犬狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板。
全文摘要
本发明涉及一种犬抗狂犬病毒IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂板及其制备方法，在聚乙烯板及聚氯乙烯衬膜(5)上铺设玻璃纤维纸以及硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上包被检测线和对照线，检测线侧贴有金标探针聚酯膜，对照线侧贴有吸水垫，其中检测线是包被狂犬病毒糖蛋白，对照线是包被羊抗兔IgG纯化抗体。其制备方法主要是用基因工程重组的狂犬病毒糖蛋白包被于免疫层析膜上，用胶体金标记兔抗犬IgG多克隆抗体，制成金标探针结合垫。本发明的试剂板检测快速，检测准确率高、特异性强，携带方便，操作简便，检测试剂板在常温下即可保存，无需特殊的设备和仪器。保存期可达1年，且检测重复性好。
文档编号G01N33/558GK101042401SQ20071005194
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者钱金宏, 廖园园 申请人:艾博(武汉)生物技术有限公司