专利名称：：人类免疫缺陷病毒抗原/抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种人类免疫缺陷病毒抗原/抗体测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：艾滋病，艮卩获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmureDeficiencySyndrome,AIDS),是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的，目前尚不能治愈、病死率高的慢性进行性疾病。根据艾滋病临床表现的不同，可将其分为急性感染期、潜伏期、艾滋病前期、典型艾滋病期四个时期。急性感染期的AIDS通常仅表现为发热、皮疹、淋巴结肿大、乏力、出汗、恶心、呕吐、腹泻、咽炎等轻微症状，绝大多数患者在HIVl/2感染26周后，血清中可出现HIV抗体，可作为早期诊断和疾病筛査的重要指标。急性期症状持续314天后，AIDS出现一个长短不等的(平均210年)的无症状潜伏期，HIV病毒持续繁殖，具有强烈的破坏作用，患者却无任何临床症状。进行广泛的筛查，特别是把好输血关，可大大降低AIDS传播的几率。潜伏期之后,疾病继续发展即进入艾滋病前期和典型艾滋病期，感染者由于免疫功能缺陷导致各种感染，病程发展的后期，感染者出现各种机会性感染和恶性肿瘤，发生严重后果和极高的死亡率。HIV病毒是一种逆转录RNA病毒，常见的为HIV-1型，HIV-2型病毒较为少见。电镜下HIV病毒呈球形，直径100120nm，可见一致密的圆锥状核心，内含病毒RNA分子和酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)，病毒外层囊膜系双层脂质蛋白膜，其中(HIV-1型)嵌有gpl20和gp41，分别组成刺突和跨膜蛋白(HIV-2型相对应的蛋白为gp36)。囊膜内面为P17蛋白构成的衣壳，其内有核心蛋白(P24)包裹RNA。HIV-l+2型主要侵犯人类具有CD4+受体的细胞，特别是CD4+T辅助淋巴细胞，导致人类免疫系统缺陷，最终发生机会性感染和恶性肿瘤。HIV对单核巨噬细胞、CD8+T淋巴细胞与B淋巴细胞也有破坏作用，在疾病发生、发展、预后中也起着一定的作用。目前的AIDS病原学诊断技术主要包括病毒特异性抗体Anti-HIV检测、病毒抗原检测、HIV病毒分离、HIV病毒载量测定和HIV核酸测定等。抗体检测是常规检测方法，包括酶联免疫试验(ELISA)、明胶颗粒凝集试验(PA)、免疫荧光试验(IFA)和斑点印迹(层析或渗滤)及免疫印迹试验(WB)等。免疫印迹试验(WB)用作确证实验，其它方法多用于筛选实验。病毒抗体检测以外的方法一般用在特殊情况，例如，p24抗原检测实验应用于急性HIV感染。检测抗-HIV的ELISA法是国际上应用最早、发展最快、至今在血源筛查中普遍使用的检测技术。ELISA第3代技术采用了"双抗原夹心法"，不仅可检测抗-HIVIgG，而且可检测早期出现的IgM抗体，甚至可检测少见的"0"亚型HIV抗体。1998年，国际上出现第4代ELISA试剂，在检测抗-HIV的同时也可检测p24抗原。化学发光免疫分析(Chemil咖inescenceImmunoassay,CLIA)于1977年问世，1985年第一代化学发光免疫试剂盒研制成功并投放市场。进入九十年代，化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展，从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术，根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位，代表了当今世界发展的方向和潮流，它不仅具有免疫反应的特异性，而且具有化学发光反应的高灵敏度(检测限度可达10—15~10—18mol/L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点，成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)，HRP常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼，luminol)或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼)等，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧的存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。生物素-亲和素免疫放大技术可极大地提高检测方法的灵敏度，且特异性强，稳定性高，适用范围广，实验成本低。生物素-亲和素免疫放大技术有两种基本类型，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待测反应体系和标记生物素，后在此基础上发展了亲和素-生物素化酶复合物技术；另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测，称为标记亲和素-生物素法。根据待测反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为直接法和间接法。在间接法中，亲和素-生物素系统可以与免疫分析检测体系偶联，放大终反应先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗原)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再加入亲和素与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，从而提高了免疫分析的灵敏度。化学发光免疫分析法结合生物素一亲和素免疫放大技术是一种较先进而有效的方法。化学发光检测需要一定的发光增强剂，并配有各自的过氧化物酶系统。主要是生物素与亲合素、过氧化物酶(或碱性磷酸酶)结合，再经过化学发光及增强作用，将光量放大后检测。生物素一亲和素免疫放大技术结合化学发光免疫分析技术应用在HIV免疫分析中可大大提高检测的灵敏度。另外，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，'从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒采用微孔板化学发光免疫分析技术，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更易推广应用。
发明内容本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。本发明的目的是提供一种生物素一亲和素免疫放大技术结合化学发光酶免疫分析技术测定人类免疫缺陷病毒抗原/抗体的试剂盒。本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本发明的人类免疫缺陷病毒抗原/抗体化学发光免疫分析测定试剂盒包括1)人类免疫缺陷病毒抗原和抗体同时包被的固相载体；2)生物素标记的人类免疫缺陷病毒抗体；3)酶标记的人类免疫缺陷病毒抗原和链霉亲和素；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)阴性对照物、人类免疫缺陷病毒抗原和抗体阳性对照物。具体地，本发明的试剂盒可以包括1)人类免疫缺陷病毒HIV1+2型抗原和HIV-1P24抗体同时包被的固相载体；2)生物素标记的HIV-1P24抗体；3)酶标记的HIV1+2型抗原和链霉亲和素；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)阴性对照物、HIV抗体HIV-1P24抗原阳性对照物。根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。根据本发明的试剂盒，其中，所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。优选地，上述试剂盒中，所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚垸)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。本发明同时提供了一种独创的化学发光底物液，它由以下方法制备而成A液在双蒸水中加入Tris和浓HC1配成0.1MpH8.5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入Luminol、Tween20以及苯并荧蒽(结构如下图所示)，混合均匀。B液在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1MpH4.6的柠檬酸缓冲液，在此溶液中加入30%过氧化氢溶液。使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>由此，根据本发明的试剂盒，所述化学发光底物包括A液和B液，其中，基于100mL所述化学发光底物A液，包括1.21gTris、295uL浓盐酸、0.5g鲁米诺、20PLTween20以及0.lg苯并荧蒽；基于100mL所述化学发光底物B液，包括0.73g柠檬酸三钠、0.44g柠檬酸、100uL30o/o的H202溶液，其pH值为4.6。本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤1)以人类免疫缺陷病毒抗原和抗体同时包被固相载体；2)以生物素标记人类免疫缺陷病毒抗体；3)以酶标记人类免疫缺陷病毒抗原和链霉亲和素；4)配制上述酶所作用的化学发光底物；5)配制阴性对照物、人类免疫缺陷病毒抗原和抗体阳性对照物；6)分装上述阴性和阳性对照、生物素标记的人类免疫缺陷病毒抗体、酶标记的人类免疫缺陷病毒抗原和链霉亲和素和该酶所作用的化学发光底物；以及7)组装为成品。根据本发明的方法，优选，所述包被固相载体的步骤包括以下步骤I)包被配制包被液，基于lOOOmL所述包被液包含1.59g的无水碳酸钠和2.94g的碳酸氢钠，所述包被液的pH值为9.6，然后将制备的包被液与适当浓度的人类免疫缺陷病毒抗原和抗体混合，并将所得混合液负载于固相载体上；II)用PBST洗液洗涤上述固相载体；以及III)封闭配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2gNaH2PO4*2H20、2.9gNaH2P0412H20、10gBSA、20g蔗糖、lOOmL新生牛血清和lmL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.07.6，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的固相载体上。在上述方法中，优选，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。在上述方法中，优选，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在上述方法中，优选，所述化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或l，2-二氧乙烷类衍生物。在上述方法中，优选，所述1,2-二氧乙垸类衍生物为(金刚垸)-1,2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金刚垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP隱Star。具体地，本发明的试剂盒包括同时包被有HIV1+2型抗原和HIV-1P24抗体的化学发光包被板48或96孔、标记物2瓶、化学发光底物液2瓶、洗涤液1瓶、阴性对照1瓶、HIV抗体阳性对照1瓶、P24抗原阳性对照1瓶以及其它辅助试剂。其中，具体地，标记物1含有生物素标记的P24抗体；标记物2含有酶标记的HIV抗原和链霉亲和素。其中，具体地，洗涤液为20倍浓縮洗涤液，由4g/LNaH2P04*2H20、58g/LNa2HP04'12H20、180g/LNaCl禾口10ml/LTween20配制成。本发明的试剂盒可以同时检测HIV感染者血清或血浆中的HIV抗体和P24抗原，与目前检测HIV抗体的方法相比，又进一步縮短了检测窗口期；利用生物素亲和素系统，使P24抗原检测的灵敏度大大提高同时，本试剂盒采用化学发光免疫分析技术，比ELISA具有的检测灵敏度，安全可靠，操作简便，与国外的化学发光检测系统相比价格低廉且不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，为临床HIV抗体和HIV抗原的检测和血液安全筛查提供了一种新的检测方法。本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍，可为HIV的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。本发明的试剂盒采用了生物素-亲和素体系，放大了反应信号，从而提高了免疫分析的灵敏度，且特异性强，稳定性高，适用范围广，实验成本低，可更有效地检测HIV。具体实施例方式实施例1制备本发明的人类免疫缺陷病毒抗原/抗体化学发光免疫分析测定试剂盒本发明的人类免疫缺陷病毒抗原/抗体化学发光免疫分析检测试剂盒含有以下成分用HIV抗原和P24单克隆抗体同时包被的预包被发光板；用辣根过氧化物酶标记的酶标HIV抗原标记物和酶标链霉亲和素；生物素化的P24抗体；含有Tween20磷酸盐缓冲液的洗涤液(20倍浓縮洗涤液)；含有鲁米诺、Tween20及其增强剂苯并荧蒽的化学发光底物液A;含有过氧化氢的化学发光底物液B;正常人血清的阴性对照；新生牛血清稀释HIV抗体阳性人血清的HIV抗体阳性对照；以及新生牛血清稀释P24抗原阳性人血清的P24抗原阳性对照。一、用HIV抗原和P24单克隆抗体同时包被预包被化学发光板将包被用HIV重组抗原和P24抗体加至碳酸盐缓冲液中混匀，加至发光板内，每孔100uL，温育过夜，用含有Tween20的磷酸盐缓冲液洗涤发光板3遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液，室温静置2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥发光板，用铝钼袋封口包装，完成HIV抗原/抗体同时包被的预包被发光板的制备。二、生物素化P24抗体的制备将生物素和P24抗体进行标记，制备成生物素化P24抗体。三、辣根过氧化物酶标记HIV抗原和标记链霉亲和素用改良的过碘酸钠法将HIV抗原和辣根过氧化物酶偶联在一起，制备HIV抗原标记物；用改良过碘酸钠法将链霉亲和素和辣根过氧化物酶偶联在一起，制备辣根过氧化物酶标记的亲和素。四、化学发光底物液的制备A液在100ml双蒸水中加入1.21gTris和295yL浓HC1配成0.1MpH8.5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入O.5g的Lumino1、20uL的Tween20以及O.lg苯并荧蒽，混合均匀。B液在100ml双蒸水中加入柠檬酸三钠0.73g和柠檬酸0.44g，配制成0.1MpH4.6的柠檬酸缓冲液，在此溶液中加入100uL30%过氧化氢溶液。使用方法使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用。五、其它组分的制备洗涤液为含有Tween20的磷酸盐缓冲液，阴性对照为混合的正常人血清，HIV抗体阳性对照为新生牛血清稀释的HIV抗体阳性人血清，P24抗原阳性对照为新生牛血清稀释的P24抗原阳性人血清。六、半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成测定试剂盒。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。实施例23制备本发明的人类免疫缺陷病毒抗原/抗体化学发光免疫分析测定试剂盒除分别以塑料珠、磁性颗粒作为载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备本发明的试剂盒。实施例4本发明的试剂盒的使用方法一、在化学发光包被板上加入样品、生物素化抗体和对照物取HIV抗原抗体包被板，平衡至室温后，每次实验设阴性对照3孔，HIV抗体阳性对照2孔，HIV-1P24抗原阳性对照2孔，每孔分别加入100ul，样品孔中每孔加入样品50iU，再加入生物素化P24抗体50y1，混匀，贴上封板膜，置37'C温育30分钟。二、用洗涤液洗板甩去反应液，用稀释后的洗涤液洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。三、加入酶标记物除空白孔外，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的HIV1+2型抗原和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素酶标记物100ul，贴上封板膜，静置37'C30分钟。四、用洗涤液洗板(方法与二相同)五、混合底物使用前将化学发光底物液A和B以1:1混合，置室温避光反应5分钟。六、测量发光强度在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间l秒/孔。七、读取结果根据待测样本的RLU值与临界值的比值S/CO值判断，若S/C0值》1，则为阳性反应，说明样本中含有HIV抗体或P24抗原；若S/C0值〈1，则为阴性反应，说明样本中不含有HIV抗体或P24抗原。实施例5本发明的试剂盒的临床实验比对本发明试剂盒的临床实验比对，实验结果见下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>权利要求1、一种人类免疫缺陷病毒抗原/抗体化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)人类免疫缺陷病毒抗原和抗体同时包被的固相载体；2)生物素标记的人类免疫缺陷病毒抗体；3)酶标记的人类免疫缺陷病毒抗原和链霉亲和素；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)阴性对照物、人类免疫缺陷病毒抗原和抗体阳性对照物。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)人类免疫缺陷病毒HIV1+2型抗原和HIV-lP24抗体同时包被的固相载体；2)生物素标记的HIV-1P24抗体；3)酶标记的HIVl+2型抗原和链霉亲和素；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)阴性对照物、HIV抗体和HIV-1P24抗原阳性对照物。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。5、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或1，2-二氧乙烷类衍生物。6、如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚垸)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。7、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包括A液和B液，其中，基于lOOmL所述化学发光底物A液，包括1.21gTris、295"L浓盐酸、0.5g鲁米诺、20nLTween20以及0.lg苯并荧蒽；基于100mL所述化学发光底物B液，包括0.73g柠檬酸三钠、0.44g柠檬酸、100"L30。/o的H2O2溶液，其pH值为4.6。8、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1)以人类免疫缺陷病毒抗原和抗体同时包被固相载体；2)以生物素标记人类免疫缺陷病毒抗体；3)以酶标记人类免疫缺陷病毒抗原和链霉亲和素；4)配制上述酶所作用的化学发光底物；5)配制阴性对照物、人类免疫缺陷病毒抗原和抗体阳性对照物；6)分装上述阴性和阳性对照物、生物素标记的人类免疫缺陷病毒抗体、酶标记的人类免疫缺陷病毒抗原和链霉亲和素和该酶所作用的化学发光底物；以及7)组装为成品。9、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述包被固相载体的步骤1)采用以下方法I)包被配制包被液，基于1000mL所述包被液包含1.59g的无水碳酸钠和2.94g的碳酸氢钠，所述包被液的pH值为9.6，然后将制备的包被液与适当浓度的人类免疫缺陷病毒抗原和抗体混合，并将所得混合液负载于固相载体上；II)用PBST洗液洗涤上述固相载体；III)封闭配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2gNaH2PO42H20、2.9gNaH2P0412H20、10gBSA、20g蔗糖、lOOmL新生牛血清和lmL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.07.6，然后将所得封闭液负载于上述洗涤^的固相载体上。10、如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。11、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。12、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或1,2-二氧乙烷类衍生物。13、如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚垸)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种人类免疫缺陷病毒抗原/抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括1)HIV抗原和抗体包被的固相载体；2)生物素标记的HIV抗体；3)酶标记的HIV抗原和链霉亲和素；4)上述酶所作用的化学发光底物；以及5)对照物。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤1)HIV抗原和抗体包被固相载体；2)以生物素标记HIV抗体；3)以酶标记HIV抗原和链霉亲和素；4)配制化学发光底物；5)配制对照物；6)分装；以及7)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。文档编号G01N33/543GK101363853SQ20071011998公开日2009年2月11日申请日期2007年8月6日优先权日2007年8月6日发明者应希堂,胡国茂,詹先发申请人:北京科美东雅生物技术有限公司