专利名称：：抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法，由这种方法制备的抗体，和这种抗体的用途。
背景技术：
：口蹄疫是对畜牧业生产威胁最大的一种动物疫病，不仅会造成重大的经济损失，而且会引起恶劣的政治影响。尤其是2001年英国等无口蹄疫国家暴发口蹄疫后，世界各国都高度重视对该病的检验检疫、预防控制。目前检测、诊断口蹄疫的主要方法是检测发病或带毒动物体内的口蹄疫病毒及其抗体水平，如分离病毒、ELISA等方法。直接分离病毒是对口蹄疫的最可靠的诊断，但较长的周期会延误对该烈性传染病的最佳控制时间；ELISA虽然简单易行、但需要区分是自然感染还是由于疫苗免疫产生的抗体，不能及时做出诊断。为了便于准确及时诊断口蹄疫，直接检测动物体内口蹄疫病毒，避免由于出结果慢、做鉴别诊断等给口蹄疫防制带来的不利因素，生产特异性高的抗口蹄疫病毒单克隆抗体具有很强的实用价值。我国曾于2005年突发大面积的Asial型口蹄疫，疫情波及十几个省市，给我国的畜牧业生产造成重大经济损失。此次暴发不仅持续时间长，而且疫情复杂。由于我国多年来没有暴发过Asial型口蹄疫，因此也没有研制针对Asial型口蹄疫的快速诊断方法。此次暴发警示我们要及早开发研究便捷、快速、敏感、特异的快速诊断试剂以及研制快速诊断试剂盒。综上所述，研制针对Asial型口蹄疫的高特异性单克隆抗体以及用该试剂研制快速诊断试剂盒是十分必要的。
发明内容本发明的主要目的是为了提供一种特异性高的抗Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法。本发明还提供用前述方法得到的这种抗体以及这种抗体的用途。本发明的抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法是用Asial型口蹄疫病毒的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asial型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1，再将VP1插入原核表达载体中得到重组表达质粒，用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株，将菌体超声破碎后除杂蛋白，层析法纯化得到表达的重组蛋白，用重组蛋白给健康小鼠皮下注射进行免疫，取免疫后小鼠的脾脏获得脾细胞，再经分散处理后离心得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养34天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比5~10:1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，沉淀物中按体积比1:2加入浓度为50%的聚乙二醇PEG4000,静置12分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的2535倍的HAT培养液，再将融合细胞按100^1/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加100^1用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗体的杂交瘤细胞，再将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株，再用常规培养液培养上述所得到的杂交瘤细胞株，取培养液用硫酸铵沉淀和凝胶层析法进行纯化得到抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体。本发明的抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体的最佳制备方法是以Asial型口蹄疫病毒(该病毒株保藏于中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室)的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asial型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1。将VPl插入原核表达载体中得到重组表达质粒，再用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株。将前述菌体超声破碎后除杂蛋白，用层析法得到纯化表达的重组蛋白，将重组蛋白与等体积佐剂充分混匀，给健康小鼠皮下注射进行免疫，其中第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂，第二次免疫所用佐剂为不完全弗氏佐剂，第三次免疫不用佐剂，免疫后的3~4天取小鼠的脾脏获得脾细胞进行分散处理，然后按体积比1:30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养34天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比510:1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比l:2加入浓度为50。/o的聚乙二醇PEG4000，再静置12分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液，再将融合细胞按100^1/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加lOO(il用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞，再将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株，再用常规培养液培养上述所得到的杂交瘤细胞株，大量生产单克隆抗体。本发明的另一种抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法与前述方法基本相同，但在后期大量生产单克隆抗体时是采用小鼠体内诱生法，即先用Asial型口蹄疫病毒的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asial型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1，再将VP1插入原核表达载体中得到重组表达质粒，再用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株，将菌体超声破碎后除杂蛋白，用层析法得到纯化表达的重组蛋白，将重组蛋白与等体积佐剂充分混匀，给健康小鼠皮下注射进行免疫，其中第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂，第二次免疫所用佐剂为不完全弗氏佐剂，第三次免疫不用佐剂，免疫后的34天取小鼠的脾脏获得脾细胞进行分散处理，然后按体积比1:30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养34天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，将所得到的杂交瘤细胞注入经降植垸处理的雌性小鼠腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成分，取其上清液用硫酸铵沉淀和凝胶层析法纯化，得到抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体。由前述方法所得抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体可采用硫酸铵沉淀和凝胶层析法进行纯化。由前述的方法可制备抗Asial型口蹄疫病毒的单抗隆抗体。这种单抗隆抗体用于制备检测Asial型口蹄疫病毒的试剂盒，如Asial型口蹄疫病毒的ELISA检测试剂盒，或者Asial型口蹄疫病毒的胶体金检测试剂盒。单抗的效价高，不与O型抗原发生交叉反应，该单克隆抗体特异性地针对Asial型抗原由本发明所得到的杂交瘤细胞株稳定，得到的抗Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体具有高度的血清型特异性，且不与其它血清型发生交叉反应，适合进行快速诊断试剂盒的开发研究。本发明的Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体将为我国口蹄疫的防控提供重要的技术支撑。具体实施例方式以下是本发明的一个具体制备过程介绍(1)用RNeasyMiniKit(Qiagen)试剂盒从Asial型口蹄疫病毒(注该毒株保藏于中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫参考实验室)中提取的总mRNA为模板，用针对Asial型VPl的特异性引物进行反转录和PCR扩增，获得Asial型口蹄疫病毒VP1基因。在本发明中所用的引物为上游引物5'-CCGGAATTCGCTTACCAGTGGATGCTCG-3'下游引物5陽'CCCAAGCTTCGCTAGCTTGAGCAGGTC-3'按照通常连接方法将PCR扩增的目的基因与PGEM-Teasy载体连接，采用通常方法将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，构建含有重组克隆载体的大肠杆菌菌株，用琼脂糖平板(amp+)及蓝白斑筛选阳性克隆，挑取白斑克隆进行扩增。用PCR、酶切以及序列分析鉴定阳性克隆，采用双酶切从鉴定为阳性的克隆上切下目的基因，以分子生物学通常采用的方法回收酶切目的基因片段，将获得的目的基因定向插入表达载体pPRoEXHTb，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态细胞(DH5ot)构建重组表达载体的大肠杆菌菌株，釆用细菌涂板(Kan+抗性)筛选阳性克隆。经PCR、酶切和序列分析等方法鉴定为阳性的重组表达质粒进行原核表达。当重组表达菌生长至对数中期A55。二0.5-1.0时，通常As5。二0.6时，用终浓度为lmmol/LIPTG诱导表达。诱导6小时后收获表达菌，8000rpm离心10min收集沉淀，弃上清。按每克重加5ml20mM/LTris缓冲液(pH8.0)悬浮菌体后，超声破碎菌体，12000rpm离心15分钟后留沉淀弃上清，用包涵体洗涤缓冲液(1MTrispH8.0，0.5MEDTApH8.0，3MNaCl，0.5%TritonX-100)充分洗涤后，12000rpm离心30min以去除杂蛋白，重复4-5次。用8M尿素缓冲液(0.5MNaCl，0.02MTris，8M尿素，pH8.0)悬浮沉淀，用亲和层析法(Ni-NTAHis)纯化表达的重组蛋白，获得的重组蛋白用紫外分光光度计测定含量后-2(TC冻存。(2)制备免疫脾细胞取前述的纯化Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原与等体积佐剂充分混匀，分别注入健康小鼠颈背部两侧、腹股沟部皮下；每只每次注射的病毒剂量为2080吗抗原，间隔24周后，用同样的方法再次重复注入至少1次；第一次免疫用的佐剂为完全弗氏佐剂、第二次免疫所用佐剂改为不完全弗氏佐剂、第三次免疫不用佐剂、佐剂与抗原的比例为l:l(体积比)最后一次免疫后2周，测小鼠血清中的抗口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原的抗体滴度，将显示有足够抗体滴度的小鼠作为免疫脾细胞的来源。测定抗体滴度的方法，可用放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附(ELISA)测定法等，本发明中采用通常的ELISA法。(3)制备骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞通常使用从小鼠中已得到的X-63、NS-1和SP2/0细胞系。在进行细胞融合前，将其在加有10%胎牛血清的DMEM(100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素)的常规培养液中培养34天，以便在融合时可以得到2xl(f或更多的融合细胞。本发明通常选用SP2/0骨髓瘤细胞。(4)细胞融合将2080吗前述所得的纯化Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原向已按步骤(2)的方式免疫接种小鼠，并且在免疫后的34天取小鼠的脾脏获得脾细胞。分散脾细胞，然后按体积比1:30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀。将上述(3)培养的小鼠骨髓细胞瘤SP2/0离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀。用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比(510):1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1:2加入浓度为50。/。的聚乙二醇PEG4000，再静置12分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的25~35倍的HAT培养液，所用的HAT溶液为次黄嘌呤1(T61(T3M，氨基喋呤1(T81(T7M，胸苷1(T6~I(T4M，悬浮融合细胞，最后补加HAT培养液至沉淀物体积的140-160倍。再将融合细胞按lOOpl/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加lOOpl用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。将上述培养孔置于浓度为37%的C02培养箱中，在温度为3538"C条件下培养1014小时，从第3天开始，每隔23天用每孔半量HAT培养液换液体一次。当观察培养孔中出现杂交细胞集落时，先取培养上清液，然后再在每孔加半量HAT培养液。再用ELISA检测抗Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原的抗体及滴度。当检测表明其与对照相比有明显的升高时即视为合格。将上述抗Asial型口蹄疫病毒抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株。可以通过一种经有限稀释该杂交瘤细胞使每一孔中只含有一个单一杂交瘤细胞的方法，或一种从软琼脂培养基中分离集落的软琼脂方法，或一种采用显微操作器，挑取单一杂交瘤细胞的方法，或一种釆用细胞分选仪分离单一的杂交瘤细胞的"分选仪克隆"方法。(5)制备单克隆抗体用常规培养液培养上述(4)中得到的杂交瘤细胞株。大量生产单克隆抗体，可采用大转瓶旋转培养法。或同系小鼠体内诱生法。其中大转瓶旋转培养法可通过培养上述(3)杂交瘤细胞纯化得到抗口蹄疫病毒单克隆抗体。同系鼠(本发明用Balb/c小鼠)体内诱生法可通过将上述(3)得到的产生抗口蹄疫病毒抗体的杂交瘤细胞(5X105106)注入经降植垸处理的雌性小鼠(48周龄)腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体。如果需要进一步纯化，可采用硫酸铵沉淀和凝胶层析法纯化。将抗Asial型口蹄疫病毒VP1基因原核表达抗原的单克隆抗体分别与包被Asial、O、A和C型口蹄疫病毒抗原进行间接ELISA试验，结果显示，我们生产的抗Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体具有高度的血清型特异性，不与其它血清型发生交叉反应。经上培养及纯化处理的抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体即可用以制备检测Asial型口蹄疫病毒的ELISA检测试剂盒，或者用于制备检测Asial型口蹄疫病毒的胶体金检测试剂盒。以下是有关的检测情况表1单克隆抗体腹水与Asial型FMDV抗原反应OD450值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表l中结果显示，阴性对照AsialOD45。值为0.225-0.356;阳性对照OD450值为1.2771.417;而与Asial型抗原的0045。值为0.5521.942之间，与阴性对照相比具有显著的差异，说明该单克隆抗体特异性地针对Asial型抗原。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2屮结果显示，所有筛选的单抗与A型抗原的反应后的OD45Q值与阴性对照和空白对照相比没有显著的差异，不发生反应，而与阳性对照的值相比具有很大的差异，说明该单克隆抗体不与A型抗原发生交叉反应。表3单克隆抗体腹水与C型FMDV抗原反应的OD4so值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3中结果显示，所有筛选的单抗与C型抗原的反应后的OD45o值与阴性对照和空白对照相比没有显著的差异，不发生反应，而与阳性对照的值相比具有很大的差异，说明该单克隆抗体不与C型抗原发生交叉反应。表4单克隆抗体与O型FMDV抗原反应的OD450值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4中结果显示，所有筛选的单抗与O型抗原的反应后的OD45。值与阴性对照和空白对照相比没有显著的差异，不发生反应，而与阳性对照的值相比具有很大的差异，说明该单克隆抗体不与O型抗原发生交叉反应。表5细胞培养液上清、腹水效价测定与亚类鉴定总表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在表5中亚类鉴定为抗Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体为IgG，其中1B8孔的为IgGi、5El孔为IgG^、5E2孔为IgG^，细胞培养液上清效价最高孔5E2为1:2X105，腹水效价能达到1:4X105，说明单抗的效价高，适合进行试剂盒的开发研究。表6对杂交瘤细胞稳定性鉴定(多次传代后的腹水上清的效价)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从表6可见，经过对分泌抗Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株通过Balb/c小鼠腹腔传代，发现14代的抗体效价都稳定在1:4X105，不仅说明抗体效价高，而且所得到的杂交瘤细胞株稳定，适合进行快速诊断试剂盒的开发研究。以上实验数据显示，本发明的这种抗Asial型口蹄疫病毒VP1基因表达抗原的单克隆抗体不仅特异性高，敏感性好，效价高，而且稳定，适合用于快速诊断试剂盒的研制。权利要求1、抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法，其特征在于用Asial型口蹄疫病毒的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asial型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1，再将VP1插入原核表达载体中得到重组表达质粒，用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株，将菌体超声破碎后除杂蛋白，层析法纯化得到表达的重组蛋白，用重组蛋白给健康小鼠皮下注射进行免疫，取免疫后小鼠的脾脏获得脾细胞，再经分散处理后离心得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养3～4天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比5～10∶1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，沉淀物中按体积比1∶2加入浓度为50％的聚乙二醇PEG4000，静置1～2分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的25～35倍的HAT培养液，再将融合细胞按100μl/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加100μl用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗体的杂交瘤细胞，再将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株，再用常规培养液培养上述所得到的杂交瘤细胞株，取培养液用硫酸铵沉淀和凝胶层析法进行纯化得到抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体。2、根据权利要求1所述的抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法，其特征是用重组蛋白给小鼠免疫按以下方法进行第一次用完全弗氏佐剂与等体积重组蛋白进行免疫，第二次用不完全弗氏佐剂与等体积的重组蛋白进行免疫，第三次免疫不用佐剂；免疫后的3~4天取小鼠的脾脏获得脾细胞进行分散处理，然后按体积比1:30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养34天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，用1640培养液悬浮上述脾细胞沉淀和骨髓瘤细胞沉淀，并将脾细胞和骨髓瘤细胞按数量比5~10:1混合两种细胞，然后离心去上清液，充分分散沉淀物，向沉淀物中按体积比1:2加入浓度为50%的聚乙二醇PEG4000，再静置1~2分钟后离心去上清液，在沉淀物中缓慢加入沉淀物体积的2535倍的HAT培养液，再将融合细胞按100^1/孔加入至96孔培养板中，每孔中再加100(il用HAT培养液洗取的小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，得到抗Asial型口蹄疫病毒抗体阳性、滴度高的杂交瘤细胞，再将杂交瘤细胞转移到另一块96孔板中进行克隆，得到杂交瘤细胞株，再用常规培养液培养上述所得到的杂交瘤细胞株，取培养液用硫酸铵沉淀和凝胶层析法进行纯化得到抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体。3、抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法，其特征在于用Asial型口蹄疫病毒的总mRNA为模板，设计引物进行反转录和聚合酶链式反应，获得Asial型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1，再将VPl插入原核表达载体中得到重组表达质粒，再用重组表达质粒转化大肠杆菌得到重组表达载体的大肠杆菌菌株，将菌体超声破碎后除杂蛋白，用层析法得到纯化表达的重组蛋白，用重组蛋白给健康小鼠皮下注射进行免疫，取免疫后小鼠的脾脏获得脾细胞，再经分散处理后离心得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养3~4天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉淀，将所得到的杂交瘤细胞注入经降植烷处理的雌性小鼠腹腔内，2至3周后收集腹水，离心除去固体成分，取其上清液用硫酸铵沉淀和凝胶层析法纯化，得到抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体。4、根据权利要求3所述的抗Asial型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法，其特征是用重组蛋白给小鼠免疫按以下方法进行第一次用完全弗氏佐剂与等体积的重组蛋白进行免疫，第二次用不完全弗氏佐剂与等体积的重组蛋白进行免疫，第三次免疫只用重组蛋白而不用佐剂；免疫后的34天取小鼠的脾脏获得脾细胞进行分散处理，然后按体积比1:30加入1640培养液，轻轻吹打数次，再将脾细胞离心去上清液得到脾细胞沉淀，取从小鼠中已得到的X-63、NS-1或SP2/0细胞系，在常规培养液中培养34天后，离心去上清液得到骨髓瘤细胞沉5、权利要求1至4所述的任一方法制备的单抗隆抗体。6、权利要求5所述的单抗隆抗体用于制备检测Asial型口蹄疫病毒的试剂盒。全文摘要本发明公开一种用于抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法，用这种方法制备的抗体，和这种抗体的用途。本发明的抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体的制备方法是用Asia1型口蹄疫病毒的总mRNA为模板，获得Asia1型口蹄疫病毒衣壳蛋白的基因VP1，用VP1制备重组表达质粒，用重组表达质粒转化大肠杆菌菌株得重组蛋白，再用重组蛋白制备并获得骨髓瘤细胞及杂交瘤细胞，将杂交瘤进行克隆纯化，最终得到抗Asia1型口蹄疫病毒的单克隆抗体。文档编号G01N33/577GK101096657SQ200710126178公开日2008年1月2日申请日期2007年6月14日优先权日2007年6月14日发明者丛国正,周广青,常惠芸,李克生,杜惠芬,彤林,独军政,谢庆阁,邵军军申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所