修饰肽的方法和鉴定肽的方法

专利名称：修饰肽的方法和鉴定肽的方法
技术领域：
本发明涉及修饰肽的方法和使用该方法鉴定肽的方法。
背景技术：
对于研究天然肽和蛋白(在下文，也恰当地称为"肽")的生物学特征 和功能，氨基酸序列的信息是不可缺少的。目前，基于相应的基因信息，
即编码这些氨基酸序列的基因组基因和由mRNA制备的cDNA的碱基序 列，将氨基酸序列如肽和蛋白的氨基酸序列确定为推导的氨基酸序列。此 外，通过直接分析肽的序列的任何方法确定蛋白质的这些氨基酸序列。在 这些情形中，仍旧需要肽的氨基酸序列的信息来详细说明编码肽的基因组 基因和制备自mRNA的cDNA。
获得氨基酸序列的信息的方法包括肽质量指纹(PMF)法。所述方法是 基于信息如分子量鉴定起始肽的方法，其中将例如在SDS-PAGE中经电泳 分离的条带切下，使用蛋白水解酶如切割位点特异性的蛋白酶将所述条带 消化为多个肽片段，并且根据质量分析测量每个肽片段的信息如分子量。 为了使用该方法以足够的精确度鉴定所述肽，通过消化肽产生至少4-5个 肽片段是必要的。
然而，在待测量的具有低分子量的肽情形中，通常是经过蛋白水解酶 的处理获得的肽片段的数目是有限的这样的情形。此外，甚至在待测量的 具有高分子量的肽的情形中，认为不能获得足够数量的肽片段，因为通过 用蛋白水解酶消化所述肽获得的肽片段的数目取决于蛋白水解酶的作用 方式。
使用PMF方法提高鉴定肽的精确度的方法包括比较由一些蛋白水解 酶消化获得的肽片段的质量分析的光谱的方法。但是，在这种方法中，将 获得很多光谱，并且获得待比较的多个峰，由此使鉴定变得复杂。
此外，另一种方法包括比较由所述肽获得的修饰前和修饰后的肽片段
的分子量的方法，例如通过非特异性地修饰组成所述肽的氨基酸残基。然 而，该方法具有这样的问题，即追踪/比较在修饰前片段和修饰后片段之间 的变化的步骤是复杂的，因为所述肽不是被特异性地修饰。
此外，另一种方法可以包括比较使用酶特异性修饰肽的氨基酸残基而 获自所述肽的修饰前和修饰后的肽片段的分子量的方法。然而，使这样的 酶在凝胶中反应是困难的。此外，该方法具有这样的问题，即在修饰反应 后获得分子量信息的步骤中，由进行蛋白水解酶的裂解处理的修饰酶来源 的酶片段影响被靶向的肽片段的峰。因此，该方法不是方便的。
此外，甚至在理论上可以获得足够数目的肽片段的情形中，因为包括 相当大的电离趋势的异质性和抑制作用的多个作用， 一些获得的肽片段可 能在使用质量分析的分子量测量中没有被观察到。甚至在任何情形中，存
在提高使用PMF方法鉴定所述肽的精确度的需要。
应该注意的是，本申请人不能发现在本申请提交前，任何涉及本发明 的已经公布的现有技术文献。因此，现有技术文献的信息没有被公幵。
公开内容概述 本发明待解决的问题
本发明基于上述提及的问题进行，并提供容易地和特异性地修饰组成 肽的特定氨基酸残基的方法。此外，本发明通过提及的所述特异性修饰方 法，提供使用获自许多修饰的氨基酸残基的肽的新信息来提高鉴定肽的精 确度的方法。
解决问题的方法
技术领域：
本发明所述的修饰肽的方法的特征在于
一种修饰肽的方法，其中将由基底支持(s叩ported)的肽和包含醇的
全卤化羧酸水溶液反应，以选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基。
此外，本发明所述的鉴定肽的方法的特征在于 鉴定肽的方法包括下列步骤
使由基底支持的肽和包含醇的全囱化羧酸的水溶液反应，以选择性地 酯化所述肽的谷氨酸残基；
将所述基底浸入蛋白酶溶液中以获得来自所述肽的肽片段； 测量所述肽片段的分子量；和
基于所述分子量确定所述肽。 发明效果
根据本发明，特异性地修饰在基底中的肽的谷氨酸残基是可能的。此 外，根据作为这种修饰方法的结果，组成所述肽的谷氨酸的数目，肽的鉴 定精确度得以提高。
附图简述
图l显示马肌红蛋白的序列，用胰蛋白酶消化的消化片段的推导的序 列和消化片段的观察的序列。
图2是显示根据本发明的方法获得的肌红蛋白的质量分析的光谱的 图，其中其谷氨酸残基被酯化，其中(A)对应于马肌红蛋白的胰蛋白酶消 化，和(B)对应于其谷氨酸残基被酯化的马肌红蛋白的胰蛋白酶消化。
图3是肌红蛋白的134-139残基(片段a)的质量分析的光谱，其中在上 面的光谱没有对应于进行本发明的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行 本发明的反应步骤。
图4是肌红蛋白的32-42残基(片段b)的质量分析的光谱，其中在上面
的光谱没有对应于进行本发明的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行本 发明的反应步骤。
图5是肌红蛋白的64-77残基(片段c)的质量分析的光谱，其中在上面 的光谱没有对应于进行本发明的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行本 发明的反应步骤。
图6是肌红蛋白的119-133残基(片段d)的质量分析的光谱，其中在上 面的光谱没有对应于进行本发明的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行 本发明的反应步骤。
图7是肌红蛋白的17-31残基(片段e)的质量分析的光谱，其中在上面
的光谱没有对应于进行本发明的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行本 发明的反应步骤。
图8是肌红蛋白的17-31残基(片段f)和80-96残基(片段g)的质量分析 的光谱，其中在上面的光谱没有对应于进行本发明的反应步骤，而在下面 的光谱对应于进行本发明的反应步骤。
图9是肌红蛋白的103-118残基(片段h)的质量分析的光谱，其中在上 面的光谱没有对应于进行本发明的反应步骤，而在下面的光谱对应于进行 本发明的反应步骤。
实施本发明的最佳方式
(根据本发明修饰肽的方法) 根据本发明修饰肽的方法的特征在于
一种修饰肽的方法，其中将由基底支持的肽和包含醇的全卤化羧酸水 溶液反应，以选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基。
在本发明中，所述基底不受限制，只要其是能够保持所述肽的凝胶组 合物，并且包括例如聚丙烯酰胺凝胶。所述基底可以是不仅用于常规一维 SDS-PAGE，还用于二维电泳，如凝胶电泳的一员(member)。
在本发明中，所述醇不受限制，只要其是包含能够与氨基酸残基进行 酯化反应的醇式羟基的化合物，并且可以是，例如，具有l-5个碳原子的醇。 醇的实例包括低级醇如甲醇，乙醇，丙醇和丁醇。其中，优选甲醇。此外， 醇的除了轻基之外的原子团可以是具有各种质量的原子团，并且包括，例 如在氢，2H和具有其的基团的情形中。这些原子不受限制，只要其不抑 制如上提及的醇与氨基酸残基的酯化反应。
在本发明中，所述肽可以包含或可以不包含谷氨酸残基。所述肽可以 是这样的肽，其包含分子内键合如S-S键合，与金属配位，根据氧化还原 状况改变侧链的状态，并且可以进行翻译后修饰如磷酸酯和糖链。在S-S 键合空间抑制试剂攻击谷氨酸的情形中，本发明可通过根据常规方法还原 反应物以裂解S-S键合而应用。此外，肽的分子量不受限制，只要其可以 保持在基底中，并且可以是但不限于在7-200 KDa的范围内。
在本发明中，所述全卤化羧酸不受限制，只要其包含低级碳链，并且 还包含任何卤素原子如氟和氯。例如，其包括三氯乙酸，三氟乙酸，五氟 丙酸和七氟丁酸。其中，根据向基底的渗透性，优选三氟乙酸。在本发明所述的修饰肽的方法中，可以适当调节反应条件如温度，时
间，浓度和pH。
反应温度不受限制，只要所述肽没有被从基底洗脱，并且可以将液相
保持在液体状态。所述温度可以优选地在0-4(TC范围内，更优选地在20-4(TC范围内，并且尤其优选地在室温-25'C的范围内。在超过4(TC的情形 中，将发生副反应如肽与全卤化羧酸的裂解反应。此外，在低于O'C的情 形中，因为液相被固化，反应将不会迸行。
反应时间可以根据反应温度改变，并且例如可以在2-24小时范围内。 在少于2小时的情形中，谷氨酸残基与全卤化羧酸的选择性酯化反应将进 行得不充分。在超过24小时的情形中，会发生副反应如肽的天冬氨酸残 基的酯化。此外，在长时间的反应中，会出现一些问题，即从根据本发明 修饰肽的方法获得的肽的质量分析的光谱信号被扭曲，发生副反应如氨基 酸丝氨酸和苏氨酸的水解，和样品肽从基底中被洗脱出来。
用于根据本发明所述的修饰肽的方法的包含醇的全卣化羧酸的水溶 液的每种成分的浓度不受限制，其中醇浓度优选地在5-30 v/v。/。范围内， 全卤化羧酸的浓度优选地在10-40 v/v。/。范围内。在使用甲醇作为醇并且甲 醇浓度少于1 v/v。/。的情形中，提供给谷氨酸的醇通过与酸的反应被消耗， 由此使醇缺乏。在超过60 v/计/。的情形中，所述基底脱水并且收縮，由此 阻止反应的进展。在全卤化羧酸浓度少于1 v/v。/。情形中，酸通过与醇的酯 化反应所消耗，由此使催化剂缺乏。在超过60 v/vO/。的情形中，没有获得 较好结果，因为发生了一不必要的脱水。在每种成分的浓度中，如果使用甲 醇作为醇，三氟乙酸作为全卤化羧酸，关于包含醇的全卤化羧酸的水溶液 的浓度优选地是水、甲醇与三氟乙酸的体积比为100 -600: 150 -350: 300 -700，考虑到可获得较好结果，更优选地500: 250: 500。
根据本发明的修饰肽的方法，仅将由基底支持的肽的谷氨酸残基的羧 酸基团特异性转化为相应的酯化的醇(例如，在甲醇的情形中，甲基羧基)。
(根据本发明鉴定肽的方法)
根据本发明鉴定肽的方法的特征在于
鉴定肽的方法包括下列步骤
使由基底支持的肽与包含醇的全卤化羧酸的水溶液反应，以选择性地
酯化所述肽的谷氨酸残基；
将所述基底浸入蛋白酶溶液中，以获得从所述肽得到的肽片段； 测量所述肽片段的分子量；和
基于所述分子量，确定所述肽。其后，将每个步骤称为反应步骤，消 化步骤，测量步骤和确定步骤。 (反应步骤)
反应步骤基于上述提及的根据本发明修饰肽的方法。由此，将由基底 支持的肽的谷氨酸残基转化为用于所述反应的醇的相应的酯(例如，如果使 用醇，其被甲基化的分子)。材料，条件和反应的其它在上面已经提及。应 该注意，将对应于醇，通过反应步骤的酯化与肽的谷氨酸残基结合的取代 基称为"被取代的残基"。
在使用肽，醇，和全卤化羧酸用上述预定的条件进行反应后，可以在 反应步骤中用任何pH调节剂将基底/液相的pH进行调节。在所述情形中， 优选的pH是如在下列消化步骤中使用的蛋白酶的最佳pH，并且可以优选 地在7-9的范围内。此外，常规pH调节剂可以优选地用作pH调节剂。例 如，优选的pH调节剂包括碳酸氢铵溶液。
此外，去除凝胶中的水的脱水处理可以在反应步骤中进行。用于脱水 处理的材料不受限制，只要凝胶物质没有被溶解，并且所述物质具有对水 的亲合性，并且可以是例如极性非酸碱溶剂，其包括具有4个或更少碳原 子的腈如乙腈(CH3CN)，和具有4个或更少碳原子的酮如丙酮。根据脱水 处理，将维持基底的孔结构的孔大小的水溶剂去除，并且可以将所述肽维 持在保持在所述基底中的状态。
脱水处理可以根据需要的脱水程度而进行。例如，可以将所述基底的 块浸入脱水剂中数次。此外，可以将基底的块浸入20分钟，浸入3次。 在将所述基底的块用任何染料如CBB(考马斯亮蓝)染色时，由于溶剂置换 而将染料去除，并且将基底的块进行脱色。因此，通过颜色的改变可以意 识到溶剂置换的结束。
此外，在本发明中，翻译后修饰的分子内/分子间键合，或分子基团可 以使用适合的试剂进行降解/裂解处理，之后进行反应步骤。例如，在包含 待处理的分子间或分子内S-S键合的肽的情况中，可以将S-S键合裂解以
用还原剂如DTT还原它。此外，可以将如通过S-S键合还原获得的SH基用烷化剂进行迸一步处理以防止S-S键合的再次形成。 (消化步骤)
消化步骤是将所述基底浸入蛋白酶溶液的步骤。所述蛋白酶不受限 制，只要其可以在预定位置裂解所述肽。例如，可以使用胰蛋白酶，本领 域熟知的一种丝氨酸蛋白酶。由此，将由基底支持的肽通过蛋白酶的作用 裂解成如在预定位置裂解的肽片段。
应该注意，将来自如由基底支持的肽的肽片段通过消化步骤从基底洗 脱到液相中，并提供所述液相用于接下来的测量步骤。
(测量步骤)
测量步骤是测量肽和/或肽片段的分子量的步骤。所述测量步骤不受限 制，只要其可以测量肽的分子量，并且可以用各种质谱仪进行。质谱仪的 实例包括离子阱质谱仪，四极质谱仪，扇形磁场型质谱仪，飞行时间质谱 仪和傅里叶变换质谱计。此外，电离方法的实例包括电雾化电离(ESI)法， 基质辅助的激光解吸附/电离(MALDI)方法和快原子轰击(FAB)法。
其中，优选使用MALDI-TOF-MS。由此，MALDI-TOF-MS可以在电 离过程中减少组成肽片段的氨基酸残基的原子团的部分的缺乏。此外，优 选地测量具有相对高分子量的肽片段的分子量是可能的。在将所述蛋白从 样品分离以在凝胶中迸行电泳的情形中，将所述凝胶进行上述处理的情形 中，和回收其以进行测量的情形中，测量相应的阴离子和阳离子都是可能 的。因此，可以用MALDI-TOF-MS进行提高的和可再现的分析。
在将MALDI-TOF-MS用于质量分析的情形中，测量将质子(H+)加入 到肽片段上获得的阳离子类别和测量将质子从肽片段去除获得的阴离子 类别都是可能的。
(确定步骤)
确定步骤是基于信息如来自所述肽的肽片段的分子量确定肽的步骤， 所述肽片段如在上述方法中所获得。
在PMF方法中，基于如通过质量分析获得的来自所述肽的肽片段的 分子量，根据数据库确定肽的方式是公知的。即，因为蛋白酶的切割位点 的特异性，获自特定肽和特定蛋白酶组合的肽片段的质量分析的光谱是明 确的。在根据本发明鉴定肽的方法中，可以用本领域公知的这样的方法来 进行确定步骤。
确定步骤可以基于对应于进行了上述反应步骤的组的肽片段的分子 量和没有进行肽的反应步骤的组的肽片段的分子量而进行。在肽中包含谷 氨酸残基的情形中，用确定步骤将被取代残基结合于谷氮酸残基。结合的 被取代残基将根据分子量的变化反映在质量分析的光谱上。因此，在集中 于特定的肽片段的情形中时，来自进行或未进行确定步骤的被取代的残基 的分子量的变化将反映至少一个谷氨酸残基包含在该特定的肽片段中。
这示例性地显示在图3中。图3是肌红蛋白的134 -139残基(片段a) 的质量分析的光谱，其中在上面的光谱没有对应于进行本发明的反应步 骤，而在下面的光谱对应于进行本发明的反应步骤。根据在上面的光谱和 在下面的光谱之间的比较，约762(m/z)的峰没有在上面的光谱中出现，而 在下面的光谱中出现。这说明在肌红蛋白的134-139残基的肽片段中包含 谷氨酸残基，其与片段a的分子量(747.428)相关，如在上面光谱中所观察 到的。应该注意到，如在序列号3中所显示， 一个谷氨酸残基包含在肌红 蛋白的134-139残基的肽片段的序列中，明显地支持图3的结果。以类似 的方式，如在图9中所显示，肌红蛋白的103-118残基的肽片段的序列包 含谷氨酸残基，并且这显示在约1900的峰，如将图9的在上面的光谱和 在下面的光谱进行比较所观察到的。
此外，可以应用包含一个谷氨酸残基的相同的方式，甚至在所述肽片 段中包含多个谷氨酸残基的情况中也可以引用。这示例在例如图4和7中。 在图4中，在比较在上面的光谱和在下面的光谱时，出现约1285和1299 的新的峰。这反映在肌红蛋白的32-42残基中包含两个谷氨酸残基。这些 在1285和1299 (m/z)出现的新的峰值是在片段b的1270.656的理论分子 量基础上加上14的倍数的数字。数字14是这样的数字，其反映甲基作为 用于所述反应步骤的甲醇的取代残基。即，在反应步骤前后相对于来自特 定肽片段的峰，以来自用于反应步骤的醇的取代残基的分子量的更大质量 出现新峰时，可以确定该特定的肽片段包含谷氨酸残基。此外，当新峰以 取代的残基分子量的质量出现时并且当新峰以取代残基的分子量的倍数 的更大的质量出现时，可以确定该特定的肽片段包含的谷氨酸残基数目为
该倍数。
另一个方面，在反应步骤前后，相对于由特定的肽片段获得的峰没有 观察到新峰的情形中，可以确定在特定的肽片段中包含谷氨酸残基。
应该注意的是，由被取代的残基造成的分子量的改变取决于在根据本 发明修饰肽的方法中与醇相对应的被取代的残基，尽管上述实例显示在使 用甲醇作为醇用于反应步骤的情形中(被取代残基是甲基)。因此，确定步 骤的描述可以应用，从而使其被替代为用于反应步骤的被取代残基的分子
这些信息，即，包含在特定的肽片段中的谷氨酸残基的数目或关于在 特定的肽片段中是否包含谷氨酸残基的信息，以及从质量分析获得的分子 量，对于检验特定肽片段的排布和/或来自该肽片段的肽的排布，是非常有 用的。
—般而言，从PMF方法中的数据库完全地(cyclopaedically)提取在
如在测量中观察到的分子量误差范围内的肽片段。目卩，完全搜索在特定分 子量范围内的肽片段，并且将所有的这些肽片段作为蛋白的候选物进行操 作。因此，从数据库中提取的肽片段，候选蛋白，是基于分子量作为指数之一。
在另一个方面，在根据本发明鉴定肽的方法中，获得不同数目如谷氨 酸残基的存在与否或谷氨酸残基的数目，以及分子量。因此，除了使用肽 片段的分子量作为上述用于搜索的指数之外，使用谷氨酸残基的存在与否 或谷氨酸残基的数目作为指数也是可能的。即，在本领域的PMF方法中， 除了使用分子量作为指数之一广泛确定肽片段之外，基于谷氨酸残基的数 目作为指数进行检验是可能的，由此能够进一步縮窄候选蛋白的范围。
实施方案
将5吗的肌红蛋白(序列号l)用SDS-PAGE进行电泳，随后用CBB 对条带进行染色。切下1 mmxl mm的染色的条带，将其浸入水甲醇 TFA-500:250:500 0iL)比率的水、甲醇和TFA的溶液中，并且在室温放置 4小时。接着，将凝胶用水在室温洗涤4次，15分钟。接着，将凝胶浸入 50 mM的碳酸氢铵溶液(ABC溶液)中直到在凝胶中的pH是约8 (例如，进
行约20分钟)，用100%乙腈溶液进行进一步脱水，并且将其在37。C浸入 12.5 ng/pL的胰蛋白酶溶液达16小时以进行凝胶中的消化。用 MALDI-TOF-MS分析获得的消化的片段。此外，将用胰蛋白酶消化的未 酯化的肌红蛋白的片段类似地用MALDI-TOF-MS分析作为对照。这些结 果正确地显示在

图1中，并且详细结果显示在图2-9中。
图1显示马肌红蛋白的序列，用胰蛋白酶消化的消化片段的推导的序 列和消化片段的观察的序列。在图1中，在上面的部分显示马肌红蛋白的 氨基酸序列(序列号1)，中间部分显示来自所述氨基酸序列的推导的胰蛋 白酶-消化的片段，并且下面部分显示通过MALDI-TOF-MS分析观察的消 化片段。如在下面的部分显示的每个消化的片段分别对应于肌红蛋白的 134-139残基(片段a;序列号2)， 32-42残基(片段b;序列号3), 64-77残基 (片段c;序列号4)， 119-133残基(片段d;序列号5), 17-31残基(片段e;序 列号6), 1-16残基(片段f;序列号7)， 80-96残基(片段g;序列号8)和 103-118残基(片段h;序列号9)。
图2是显示根据本发明的方法获得的肌红蛋白的质量分析的光谱图， 其中肌红蛋白的谷氨酸残基被酯化，其中(A)对应于马肌红蛋白的胰蛋白 酶消化，和(B)对应于其谷氨酸残基被酯化的马肌红蛋白的胰蛋白酶消化。 此外，图3-9是在图2中显示的质量分析的光谱的水平轴被放大的图 并且这些图分别显示a-h的每个片段。图3-9分别对应于
图3:肌红蛋白的134-139残基(片段a;序列号2);
图4:肌红蛋白的32-42残基(片段b;序列号3);
图5:肌红蛋白的64-77残基(片段c;序列号4);
图6:肌红蛋白的119-133残基(片段d;序列号5);
图7:肌红蛋白的17-31残基(片段e;序列号6);
图8:肌红蛋白的l-16残基(片段f;序列号7)和80-96残基(片段g;序 列号8);和
图9:肌红蛋白的103-118残基(片段h;序列号9)。获得的图3-9的 在上面的光谱对应于没有进行本发明的反应步骤，获得的图3-9的在下面 的光谱对应于进行了本发明的反应步骤。此外，在图3-9中，其中在分子 量后指出"Me"或"Ox"的峰，是来自甲基化的肽片段和氧化的肽片段的峰，
如在每个图中所显示。
根据在上面和在下面的光谱之间的比较，在片段中包含谷氨酸残基
(用一个字母"E"表示)的片段a，b,e,f和h的质量分析的光谱中，在上 面的光谱中没有观察到但是在下面的光谱中观察到的峰中，观察到相对于 原始峰分子量改变了 14的峰(在每个图中指示为"Me")。分子量的变化是由 用于本发明反应步骤的甲醇的甲基造成的。尤其是，相对于在片段中包含 多个谷氨酸残基的片段b和e(图4和7)，在与原始峰相比分子量改变了 14的位置新出现了峰，并且还在进一步与所述峰相比分子量改变了 14的 位置出现了新峰(在图4中，关于在1271.6727的原始峰分别对应于在 1285.6866和1299.7527的峰，和在图7中，关于在1607.0612的原始峰分 别对应于在1621.0698和1635.0870的峰)。
应该注意的是，关于对应于肌红蛋白的80-96残基的片段g (序列号8) 的峰，推测其在检测限制以下，由于所述峰即使在对照中也很少被检测到， 因此认为其是难以在光谱中观察到的肽片段。
在另一方面，关于不包含谷氨酸残基的片段c和d(图5和6)，即使与 从进行了或未进行本发明的反应步骤的样品中获得的光谱比较，也没有观 察到上述提及的峰的改变。应该注意，在图6中观察到的片段d的两个大 峰(在上面的光谱中，1502.8437和1518.8537，在下面的光谱中，1502.8139 和1518.8376)来自甲硫氨酸残基的氧化，所述差异不同于甲基的分子量。
此外，对于上述片段，在根据本发明修饰肽的方法中，可以认识到修 饰反应如酯化不发生或即使发生也较少发生在肽中所包含的天冬氨酸残 基上，并且修饰反应是对谷氨酸残基特异性的。此外，即使存在天冬氨酸 残基的酯化作用，基于强度，鉴定谷氨酸残基的甲基酯是可能的。
此外，在根据本发明修饰肽的方法中，由于全卤化羧酸的应用，没有 观察到来自分子如Ser-N, Thr-N和Asp-C的光谱，其中所述分子与强酸如 盐酸具有较弱的键合，也没有观察到谷氨酰胺和天冬酰胺的脱氨作用。因 此，可以认识到根据本发明修饰肽的方法对于蛋白质的结构分析是非常有 用的。
本发明已经关于其实施方案的优选方面进行了特别描述。尽管，本发 明已经描述显示了具体的实施方案，显而易见的是，在不背离本发明受权
利要求限制的广泛精神和范围的条件下，对这些具体实施方案进行了各种 修饰和改变。即，其不应该被解释为本发明受具体实施方案和附图具体解 释的限制。
权利要求
1. 一种修饰肽的方法，其中使由基底支持的肽和包含醇的全卤化羧酸水溶液反应，以选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基。
2. 根据权利要求l所述的修饰肽的方法，其中所述醇的碳的数目在l 到5的范围内。
3. 根据权利要求1或2所述的修饰肽的方法，其中所述全卤化羧酸选自 由三氯乙酸，三氟乙酸，五氟丙酸和七氟丁酸组成的组。
4. 根据权利要求1到3任一项所述的修饰肽的方法，其中所述基底是聚 丙烯酰胺凝胶。
5. 根据权利要求1到4任一项所述的修饰肽的方法，其中所述醇是甲醇。
6. 根据权利要求1到5任一项所述的修饰肽的方法，其中所述全卤化羧 酸是三氟乙酸。
7. —种鉴定肽的方法，所述方法包括下列步骤 使由基底支持的肽和包含醇的全卤化羧酸的水溶液反应，以选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基；将所述基底浸入蛋白酶溶液中，以获得来自所述肽的肽片段-, 测量所述肽片段的分子量；和 基于所述分子量确定所述肽。
8. 根据权利要求7所述的鉴定肽的方法，其中基于所述分子量确定所 述肽的所述步骤是这样的，基于在来自包含所述酯化的谷氨酸残基的肽的 肽片段的分子量和对应于来自所述肽的所述肽片段的分子量之间的差异， 同时确定包含在所述肽中的谷氨酸残基的数目和所述肽的分子量。
全文摘要
本发明意欲提供简单地和特异性地修饰组成肽的特定氨基酸残基的方法，并且提供使用关于通过详细说明由所述特异性修饰方法修饰的氨基酸残基的数目而获得的肽的新信息来提高鉴定肽的精确度的技术。根据本发明修饰肽的方法的特征在于将固定在支持物上的肽和包含醇的全卤化羧酸水溶液反应，由此选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基。根据本发明鉴定肽的方法的特征在于所述方法包括下列步骤使固定在支持物上的肽与包含醇的全卤化羧酸的水溶液反应，以选择性地酯化所述肽的谷氨酸残基；通过将所述支持物浸入蛋白酶溶液中以获得来自所述肽的肽片段；测量所述肽片段的分子量；和基于所述分子量鉴定所述肽。
文档编号G01N33/68GK101379074SQ20078000492
公开日2009年3月4日 申请日期2007年2月8日 优先权日2006年2月8日
发明者上条宪一, 宫崎贤司, 次田晧, 田伏洋, 皆川宏贵, 齐藤惠美子 申请人:日本电气株式会社