用于减少细胞脂肪和预测用酪氨酸激酶抑制剂治疗后的心脏毒性的组合物和方法

专利名称：：用于减少细胞脂肪和预测用酪氨酸激酶抑制剂治疗后的心脏毒性的组合物和方法用于减少细胞脂肪和预测用酪氨酸激酶抑制剂治疗后的心脏毒性的组合物和方法背景心脏具有强大的ATP生成能力，使其在生物的一生中行使高效泵的功能。成年人的心肌利用脂肪酸(FA)和/或葡萄糖氧化作为其主要能量来源。正常情况下，成年人的心脏通过线粒体中脂肪酸的氧化获得其绝大多数的能量。心肌细胞具有在碳水化合物糖酵解和Krebs循环(三羧酸循环)之间转换并转换至脂肪养料源的能力，从而在不同的生理学和饮食条件下维持ATP以恒定速率生成。该代谢和养料选择的灵活性对于正常的心功能至关重要。尽管心脏能量转化容量和代谢通量在多个层面上受到调节，一个重要的调节机制发生在基因表达的层面上。参与多重能量转导途径的基因的表达响应于发育、生理学和病理生理学的信号而受到动态调节。参与这些关键能量代谢途径的基因由核受体超家族成员特别是脂肪酸活化的过氧化物酶体增殖因子活化受体(PPAR)和核受体辅激活因子-PPARY辅激活因子-1oc(PGC-1ot)以及雌激素受体相关蛋白ERRa，、ERRfi和ERRy和它们的激活因子PGR-1和PERC在转录水平上进行调节。根据生理学和病理生理学状态心脏PPAR/PGC-1复合物的动态调节将在下面进行更为详尽的说明。PGC-la为PPARY辅激活因子，与在棕色脂肪中适应性生热有关。两个结构相关的蛋白PGC-lfi和PARC已经得到克隆并且表现出参与调节能量代谢途径。PGC-1a的组织特异性且诱导型表达提示其参与细胞能量生成代谢过程(包括线粒体的生物发生和氧化、肝糖原异生以及骨骼肌葡萄糖摄取)的动态调节。PGC-loc在强氧化作用的组织(例如心脏、骨骼肌、棕色脂肪和肝脏)中选择性地表达。心脏中PGC-la的表达在出生时急剧增加。这与从葡萄糖代谢到脂肪氧化的围产期转换相吻合。还已经知道PGC-loc的活性和表达水平受冷暴露、禁食以及锻炼(已知促进氧化代谢的刺激)的诱导。培养的心肌细胞中pgc-1的被迫表达诱导参与多重线粒体能量转换/能量产生途径的核与线粒体基因的表达，增加细胞线粒体数量并且刺激偶联的呼吸作用。与这些刺激相关的信号传导途径(包括p38MAP激酶、IJ-肾上腺素能/cAMP、一氧化氮、AMP激酶和Ca2-钩调蛋白激酶)通过增加PGC-1ot表达或通过其反式激活功能激活PGC-1oc和其下游耙基因。这些代谢和结构的改变可导致扩张性心肌病和心脏的舒张功能障碍。有趣的是，线粒体增殖是可逆的并且心肌病可以通过转基因表达的减少得到补救。这表明除了通过PPAR作用为细胞脂肪酸代谢的激活因子，PGC-loc与线粒体生物发生相关。因此，PGC-loc表现出作用为氧化能量代谢的主要调节因子并响应细胞能量状况的变化。新出现证据表明孤儿核受体的雌激素相关受体(ERR)家族作用为心脏和骨骼肌能量代谢的PGC-1-活化调节因子。ERR家族有三个成员ERRot、ERRB、和ERRy。在主要依赖于线粒体氧化代谢以生成ATP的成年组织(例如心脏和慢收缩骨骼肌)中ERRot和ERRy的表达升高。出生后在心脏中ERRoc的表达急剧增加，伴随参与细胞脂肪酸摄入和线粒体氧化的酶的全面上调。近来已将ERRot和ERRy确定为辅激活因子PGC-1家族的新配偶体。这种在ERR同种型和PGC-1oc之间功能上的关联激发了对ERR在能量代谢中作用的兴趣。ERRot基因的缺失揭示了ERRoc在脂质代谢的组成型调节中的组织特异性作用。在ERRcc丄小鼠中白色脂肪质量的减少与脂肪细胞大小和脂质合成速率的减少一致。相反地，ERRot很可能在心脏中的脂质分解代谢中起作用，与其和PGC-loc的功能相互作用相一致。不表现出明显的心脏表型的error八小鼠显示出心脏pgc-1oc和erry表达的代偿性增加。这些结果表明ERR同种型促成心脏中脂肪酸代谢基因的组成型表达。然而基因表达改变引起的代谢上的影响尚未为人所知。正使用过量表达errot的心肌细胞中的基因表达分析鉴定心脏ERRoc耙基因。ERRa激活了参与能量生成途径包括细胞脂肪酸摄取(LPL、CD36/FAT、H-FABP、FACS-1)、B-氧化(MCAD、VLCAD、LCHAD)以及线粒体电子传递/氧化磷酸化(细胞色素c、c0xiv、COXVIII、NADH泛醌脱氩酶、黄素蛋白-泛醌氧化还原酶、ATP合酶IJ)的基因。ERRoc也增加心肌细胞中棕榈酸的氧化速率。ERRoc对fi-氧化酶基因的活化涉及PPARoc信号传导途径。ERRa直接激活PPARa基因表达，并且在来自于PPARa_/—小鼠的细胞中ERRa介导的对MCAD和M-CPTI的调节被消除。目前还已知道ERRoc参与PGC-lct调节线粒体生物发生。已知其通过调节&/^2基因(编码NRF-2复合物的一个亚基并且直接在转录水平上激活参与线粒体氧化代谢的基因)介导PGC-la活化NRF途径。ERRa和其辅激活因子PGC-la激活MCAD、细胞色素c和ATP合酶B基因启动子。综合起来这些结果将ERRoc确定为通过参与PGC-1调节路径对心脏氧化能量代谢的调节因子。然而，在心脏中ERR的精确生物学作用尚未确定。核受体ERRy(雌激素相关受体y)在心脏、骨骼肌、肾脏和脑以及发育中的神经系统中高表达。哺乳动物细胞中辅激活因子PGC-1a和PGC-1P的表达有力地增强了由ERRy引起的转录激活。孤儿受体的组成型活化功能2(AF-2)对于协同增强至关重要。功能性受体截短分析已经用于鉴定额外的氨基末端活化功能，这对于ERRy2同种型和pgc-1ot是特异性的。体外实验表明erry与这两种辅激活因子均有直接相互作用。这些发现与PGC-la和PGC-ie作为对ERRy的组织特异性辅激活因子的不同调节功能的假设相吻合。不过需要更多的研究进一步定义这些功能。在转基因小鼠中pgc-1的心脏特异性过表达导致心肌细胞中线粒体失控增殖，致使肌节结构丧失和扩张性心肌病。因此，PGC-l是在对能量需求的响应中控制心脏线粒体数量和功能的重要调节分子。即使不是所有的，大多数这些调节途径涉及信号传导途径7中中间体的磷酸化。对磷酸化的抑制，例如通过多种不同的激酶抑制剂的作用，影响这些信号传导途径，导致脂肪酸代谢的改变，其可引起器官毒性，包括心脏毒性。许多新的抗癌药物为激酶抑制剂并且伴有毒性。因此，需要方法以鉴定药物是否伴有毒性作用，以及该毒性作用是否可能在患者体内发生。还需要方法在维持其对抗磷酸化的受体靼的效力同时避免这些抑制剂的毒性作用。概述公开了诊断毒性特别是心脏毒性是否可能在选择用多种药物(例如酪氨酸激酶抑制剂或者erbB抑制剂)进行治疗的患者中发生的方法。此外还公开了评估一种候选药物是否可能具有毒性或者心脏毒性作用的方法。在一种方法中，可分析脂质例如甘油三酯和胆固醇以确定是否存在脂肪酸氧化紊乱。在另一种方法中，可测定负责所观察到的脂肪酸氧化的酶(例如MCAD)。关于脂质水平，认为在正常细胞中AMP活化的蛋白激酶的活化可导致脂质水平的特征性减少，以及糖酵解的和较短碳链中间产物(例如C2至C6碳中间产物)的相应增加。对于本公开内容的目的而言，可将与正常细胞中的特征性脂质减少的任何统计学显著偏差视为脂肪酸氧化紊乱。类似地，对于本公开内容的目的而言，对于参与这些代谢途径的酶，这些酶的活性或水平的量相对于正常细胞的任何统计学显著改变(通过Western、Northern、PCR或者其它技术测量)可视为脂肪酸氧化紊乱。脂肪酸氧化紊乱的诊断可用于预测增加的毒性风险并且可能作为药物使用的禁忌指示。或者，如果一种药物用在患有脂肪酸氧化紊乱的患者身上，可使用所述方法指示密切关注患者心脏功能的必要性。或者可以通过诸如正电子发射体层摄影术的已知方法测量葡萄糖摄取。对于施用酪氨酸激酶抑制剂药物时葡萄糖摄取不减少或不减少至与正常非癌细胞相同程度的情况下，则该药物治疗可能对于非癌细胞有毒。或者，在暴露于酪氨酸激酶抑制剂时，如果ATP水平的减少超过在正常非癌细胞中，则预示该酪氨酸激酶抑制剂有毒。另一种用于预测选择用药物(例如酪氨酸激酶抑制剂，特别是erbB抑制剂)治疗的患者是否具有心脏毒性的方法是评估患者体内TNFct的水平(无论在肿瘤或血液或在二者中)。TNFoc的水平可以用于预测患者是否可能由于药物(特别是赫赛汀)治疗导致具有与心脏毒性相关的不良事件。此外还公开了施用激活AMP活化的蛋白激酶(AMPK)的药物(例如某些酪氨酸激酶抑制剂)以为了美容原因或体重减轻而减少患者的脂质和脂肪的方法。该方法基于惊人的发现-AMP活化的蛋白激酶的激活因子导致细胞代谢转换，从而将脂质氧化为较少碳的中间产物。该代谢转换导致受处理细胞脂质含量的惊人减少。以足以激活AMP活化的蛋白激酶的量施用AMP活化的蛋白激酶的激活因子可用于使细胞去掉一部分其脂质含量。已知有许多向细胞施用此类化合物的方法并可以使用。可使用局部或者全身施用。可通过注射、通过皮肤贴剂或软骨或洗液进行局部施用。此外还公开一种方法用于将AMP活化的蛋白激酶的激活因子施用于患者，或者将其包含在一种介质中与器官温育，使用的量足以^f呆护器官例如心肌和/或脑细胞免于急性窘迫(acutedistress)，所述急性窘迫通常会由创伤诸如缺血、细胞因子释放、葡萄糖剥夺和在诊断出这类情况的细胞和器官中导致代谢压力的类似事件引起。还可以使用双激酶抑制剂，特别是导致AMP活化的蛋白激酶活性增加的酪氨酸激酶抑制剂。优选地如详述中进一步所说明的，这类激酶抑制剂对于其靶将是特异性的。已知并且可使用许多施用方法。例如该药物可包含在溶液中以对器官进行灌注或可进行全身施用。此外还公开一种方法用于保存器官用来移植。该方法涉及制备含有AMPK激活因子的保存溶液并且使器官与该保存溶液接触。该保存溶液可以是任何添加足够量AMPK激活因子以提供对器官的改进保护的已知保存溶液。在此描述了另外的特点和长处，并将由以下详述和附图清楚地说明。附图简述图1为在Au565细胞中受赫赛汀处理调节的基因列表。图2为用NDF或赫赛汀处理并且进行脂质染色的Au-565细胞的照片。图3为用GW-2974处理并且进行脂质染色的Au-565细胞的照片。图4为在不同条件下生长并且进行脂质染色的原代人心肌细胞的照片。图5为显示在不同条件下检测脂质呈阳性人心肌细胞的百分比的条形图。图6为MDA-MB-468细胞用GW-2974处理并通过Fl雨o-4检测胞内Ca的照片。图7A为显示某些酪氨酸激酶抑制剂对于p-eEF2和p-AMPKa表达的影响的Western印迹照片。图7B为显示不同化合物存在下Au565细胞中的p-eEF2表达的染色细胞照片。图8为经过或不经过不同激酶抑制剂处理的心肌细胞中ERRa和MCAD的照片。图9为显示用不同类型erbB抑制剂和TNFa組合处理的HMC的生长抑制的条形图。图10为用TNFa、GW2974或者赫赛汀(或者组合)处理后探观'JNF-kB的HMC的Western印迹。详述—方面，本公开是基于发现药物(例如酪氨酸激酶抑制剂，如赫赛汀和拉帕替尼(lapatinib，Tykerb))影响与脂质代谢途径相关的基因的表达并且强烈影响细胞内脂质的量。用本发明的激酶抑制行处理，通过增加或减少所述细胞氧化脂肪酸的能力而影响脂肪酸代谢。当培养生长的正常脂肪细胞暴露于例如GW2974、GW572016的激酶抑制剂时，所述细胞中储存的脂质迅速消失。该观察结果也在心脏细胞中观察到。可使用油红O脂质染色进行该类研究。因此，用拉帕替尼(tykerb)和其它Herl/Her2酪氨酸激酶抑制剂处理致使该类细胞丢失脂肪，这与降低的脂质合成速率和/或增加的脂质氧化速率相吻合。用其它药物(例如赫赛汀)，NDF脂质含量表现出增加。还已经知道许多激酶抑制剂可用作化疗剂。在一些患者中这些药物产生心脏毒性。本公开基于可以将脂肪酸代谢的缺陷与心脏毒性相联系的惊人发现。因此，在脂肪酸代谢方面具有特定功能障碍或者血液中TNFoc水平高、并且经受激酶抑制剂治疗的患者，用例如erbB酪氨酸激酶抑制剂的激酶抑制剂治疗后，更有可能遭受心脏功能失常例如心肌病。另外，已经发现在肿瘤组织或血清中具有高水平的TNFot或其下游存活因子NF-kB的患者通常对赫赛汀有更好的反应。该发现引出了新方法的开发，用于预测患者在用影响某些细胞蛋白质磷酸化状态的药物(包括激酶抑制剂，单独或与其它活性剂联合使用)治疗时是否将遭受心脏毒性。公开一种方法用于分析患者的脂质包括甘油三酯及胆固醇和/或脂质代谢酶例如尤其是MCAD。这类分析的结果可用于预测何时可能由激酶抑制剂治疗引起心脏毒性并且提供对经受药物(例如激酶抑制剂，包括赫赛汀、GW572016或者其它erbB抑制剂)治疗的患者应该密切监测其心脏功能的早期指示。已经发现5-'AMP-活化的蛋白激酶(已显示它在其它组织中使乙酰辅酶A羧化酶磷酸化并且失活)的活性在缺血末期显著增加，并且在再灌注的过程中保持升高。在缺血过程中5，-AMP的累积导致AMP活化的蛋白激酶的活化，在再灌注过程中AMP活化的蛋白激酶使乙酰辅酶A羧化酶磷酸化并且失活。随后的丙二酰辅酶A水平的降低可导致在缺血心脏的再灌注过程中脂肪酸氧化速率的增加。对于心脏毒性，已知有多种脂肪酸氧化紊乱并且在下面表1中列出。如果在患者中检测出这样一种紊乱，可以提供激酶抑制剂可对心脏有毒的指示。表I酰基辅酶A脱氢酶缺陷酰基辅酶A脱氢酶，短链(SCAD)酰基辅酶A脱氢酶，中链(MCAD)酰基辅酶A脱氬酶，长链(LCAD)酰基辅酶A脱氢酶，极长链(VLCAD)2—烯酰辅酶A水合酶缺陷L-3-羟酰辅酶A脱氢酶缺陷L-3-羟酰辅酶A脱氢酶，短链(SCHAD)三官能蛋白质长链FA(LCHAD)ot亚基(HADHA)P亚基(HADHB)3-酮脂酰辅酶A硫解酶缺陷3-酮脂酰辅酶A硫解酶，中链(MCKAT)三官能蛋白质oc-曱基酰基辅酶A消旋酶(AMACR)缺陷肉碱-酰基肉碱移位酶缺陷3p212，4-二烯酰辅酶A还原酶缺陷8q21电子传递黄素蛋白(ETF)缺陷15q23鱼鳞癣状红皮病(NCIE2):CGI58基因；3p21三官能蛋白质缺陷亚基A和B酪氨酸血症1°肉碱代谢紊乱脂肪酸和肉碱转运途径脂肪酸氧化途径脂质紊乱线粒体生化异常过氧化物酶体紊乱这类紊乱可以通过任何适当的方法进行检测。例如，在某些紊乱中可将脂肪酸饲喂给个体并且追踪其代谢。或者，例如，可以测定酶水平，如通过Western印迹，或者对某些基因产物可以分析mRNA水平。任何可检测到的减少表明存在脂肪酸氧化紊乱，并且用酪氨酸激酶抑制剂治疗可能对正常细胞和器官有毒。在一种方法中，可对作为用激酶抑制剂治疗候选人的患者进行这些疾病的筛选以确定他们是否有可能遭受心肌细胞毒性。例如可对培养生长的心肌细胞中的生物大分子进行测定以确定施用候选药物如何影响这些大分子的水平。在一种方法中，可将人心肌细胞培养生长并且可在候选药物存在的情况下对磷酸化的AMP活化的蛋白激酶的水平进行监测。这可以通过检测磷酸化的AMP活化的蛋白激酶的Western印迹法进行测定。并非对本发明进行限制，相信在应激条件(例如缺氧、缺血、葡萄糖剥夺和饥饿)下，细胞内AMP:ATP比例的增加变构激活AMP活化的蛋白激酶(AMPK)，这是一种意图保持细胞能量平衡的反应。最初发现AMP活化的蛋白激酶抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶，HMGR)的制备物。AMPK的活化被认为起始了一系列下游磷酸化事件，使细胞从活跃的ATP消耗(例如脂肪酸、胆固醇和蛋白质的生物合成)转换为ATP生成(例如脂肪酸和葡萄糖氧化)。应激诱导的AMPK活化被认为是在一个或多个上游AMPK激酶(AMPKK)对其a亚基上172位的苏氨酸的磷酸化之后发生，所述上游AMPK激酶包括钾调蛋白依赖性激酶激酶P(CAMKKP)(—种钙激活的蛋白激酶)和LKB1(由Peutz-Jegher综合征肺瘤抑制基因编码的丝氨酸/苏氨酸激酶)。相信在骨骼肌和心脏中AMPK的活化导致对乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的磷酸化和抑制，认为这13进而又减少了丙二酰辅酶A(其自身为肉碱棕榈酰转移酶l(CPTl)的抑制剂)的水平。认为CPT1的去抑制导致了伴随的脂肪酸p-氧化的增加，这被认为引起了线粒体生成ATP增加。应激诱导的AMPK活化还被认为通过抑制mTOR并且直接调节eEF2(已知与心脏保护相关的翻译延伸因子)来抑制蛋白质合成。重要的是，线粒体功能的改变被认为可引起由伊马替尼(imatinib)所致的心肌细胞死亡。另外，通过AMPK介导的TSC2磷酸化对帽依赖性翻译的抑制被认为在响应ATP耗尽的细胞存活中极其重要。AMPK活化后增加的ATP生物合成而非消耗，可能还保护心肌细胞免于缺血性损伤。已发现可激活AMPK及其下游底物的分子例如GW2974(—种强有效的小分子HER2/EGFR酪氨酸激酶抑制剂，具有类似于拉帕替尼的活性镨)，刺激脂肪酸氧化，这进而又增加在表达HER2的人心肌细胞中ATP的生成，形成对由TNFa(—种在心衰中检测到的已知细胞因子)诱导的细胞凋亡的保护。相反地，不活化AMPK的分子例如曲妥珠单抗(trastuzumab)导致响应TNFa的增加的心肌细胞死亡。对于AMPK和随之的能量生成的特异性HER2-靶向疗法的效果可以预测心肌病相关的风险，并且提供一种新的HER2-引导的治疗策略，以保护心肌在急性缺血损伤之后免于TNFa或其它促细胞凋亡刺激物的杀伤效应。另外，酪氨酸激酶抑制剂可用于减少细胞中的脂肪，特别是其它方面正常或无蛋白质酪氨酸激酶活性介导的疾病的细胞。对于这个目标，哺乳动物或组织的至少一部分可用激酶抑制剂处理，从而减少细胞中脂类的量。可使用任何合适的激酶抑制剂。确定合适的抑制剂的方法是为人所熟知的。例如，脂肪细胞的样品可在存在和缺乏激酶抑制剂的条件下生长，并且以已知方法用油红0染色以确定该激酶抑制剂是否导致储存脂肪的减少。导致可观察到的脂肪储存减少的激酶抑制剂适合于本发明。适合于本发明的例示性激酶抑制剂包括erbB抑制剂，特别包括GW2974、GW572016等。下面的表II显示了用GW2974处理所获得的脂类含量的减少。Au565在本领域已知的正常条件下生长，并用GW2974(25nM)处理两天。收集细胞、清洗并在水中超声波处理(200jiL水中2，000，000个细胞)。将细胞旋转离心下来并且通过对胞内代谢物的MS/MS检测酰基肉碱(线粒体脂肪酸氧化的副产物)。表II酰基肉碱(pmol蛋白)C18:lC16C2对照(细胞沉淀)8.564.09148.54GW2974(细胞沉淀)4.10.83258.88在一种方法中，细胞可用合适的激酶抑制剂处理以减少脂肪储量。该方法可包括以下步骤用足量合适的酪氨酸激酶抑制剂接触细胞以使细胞除去其自身中一定量并且优选大部分或更优选几乎所有其过剩储存脂类。所述细胞可处于体外细胞培养中或位于个体中。当用于无疾病或无蛋白质酪氨酸激酶活性相关疾病的细胞时，本方法特别有效。还公开将激酶抑制剂(例如酪氨酸激酶抑制剂或者双重酪氨酸激酶抑制剂)施用于患者的方法，例如在心脏再灌注期间或心脏病发作期间，以抵消脂肪酸氧化效应并且保护心肌和/或脑细胞。该处理可用于保护心脏细胞、脑细胞和来源于其它组织和器官的细胞，免于由缺血、细胞因子释放、葡萄糖剥夺或其它在代谢上胁迫这类细胞的病症所造成的急性窘迫。优选所述激酶抑制剂是特异性的，在于它们导致代谢活性转换并且不影响无关的靶。各种不同的激酶抑制剂的特异性可通过Fa6/a/等，Asmallmolecule-kinaseinteractionmapforclinicalkinaseinhibitors,NatureBiotechnology23，p.329(通过参考文献引用并入)描述的方法进行测定。相信代谢活性的转换是通过AMP活化的蛋白激酶活性的增加带来的。可将活性剂经口施用、通过注射或通过皮肤贴剂、软骨或洗剂局部施用给个体，或者可不经肠道施用，只要其以足够的量到达目标靶细胞以发挥其减少脂类的效用。例如优选在储存脂质的组织例如脂肪组织局部施用AMP活化的蛋白激酶的激活因子以使脂质含量减少。可将其全身施用给需要治疗代谢性应激、心脏病发作、缺血等的患者o可将AMP活化的蛋白激酶的激活因子以盐类或溶剂化物或者游离化学物质进行施用，然而，优选以药物制剂形式施用该抑制剂。制剂除活性剂外可包含一种或多种药用栽体、稀释剂或赋形剂。药物制剂可以单位剂量形式呈现，包含预先确定量的活性成分/每单位剂量。如此一个单位可根据施用途径和患者的年龄、体重和状态包含例如0.5mg至1g,优选70mg至700mg，更优选5mg至100mg的活性剂。例如在小鼠中，饥饿期间可施用100mg/kg的GW2974以保护心脏。药物制剂可适合以任何适宜途径施用，例如经口(包括口含或舌下)、直肠、鼻、局部(包括口含、舌下或透皮)、阴道或非肠道(包括皮下、肌肉、静脉内或皮内)途径。这样的制剂可通过制药领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成分与载体或赋形剂相结合。适用于口服的药物制剂可以采取的形式为胶囊或片剂；粉剂或颗粒；在水性或非水性液体中的溶液或悬液；可食用的泡沫或搅拌糊(whip);或水包油液体乳剂或者油包水液体乳剂以及在脂质体中。用于透皮施用的药物制剂可呈现为不连续贴剂，旨在与受治者的皮肤保持长时间的紧密接触。可以通过已知方法以离子渗入疗法从贴剂中递送活性成分。用于局部施用的药物制剂可配制为软骨、乳霜、悬液剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油剂。对于外部组织的治疗，制剂可以局部用的软骨或乳霜形式16应用。当配制为软骨时，活性剂可以和石蜡质或者可与水混溶的软骨基质一起使用。或者，活性剂还可以与水包油乳霜基质或油包水基质配制在乳霜中。优选地这类软骨可使活性剂渗透入皮肤并与靶细胞和组织接触，特别在脂肪蓄积的组织和器官中对于脂肪进行改善。适于在口中局部施用的药物制剂包括糖锭、锭剂和漱口水。通过吸入施用的药物制剂包括精细颗粒尘剂或雾剂，可通过多种类型已计量剂量的加压气雾剂、喷雾器或吹入器的方式产生。用于阴道施用的药物制剂可呈现为子宫托、棉塞条、乳骨、凝胶、糊剂、泡沫或者喷雾制剂。非肠道施用的药物制剂可以包括水性和非水性的无菌注射溶液，其可进一步包括例如生育酚的抗氧化剂、緩冲剂、抑菌剂和使制剂与目标受治者血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬液剂，其可包括助悬剂和增稠剂。制剂可呈现于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下保存，只需要在使用前即刻加入无菌的液体载体例如注射用水。临时注射溶液和悬液可从无菌粉剂、颗粒和片剂制备。优选的单位剂量制剂为含有活性成分的每日剂量或亚剂量，或者适当的部分量。应当了解的是除了上述特别提到的成分外，制剂还可包括关系到所讨论制剂类型的本领域常规的其它试剂，例如适合于口服的制剂可包括调味剂。需要用本发明的化合物、盐或溶剂化物进行治疗的动物通常为哺乳动物，例如人类。本发明的活性剂、盐或溶剂化物的治疗有效量将取决于多种因素，包括例如动物的年龄和体重、需要治疗的情况的严重度、制剂的性质和施用途径，并且最终在于主治医生或兽医的判断力。不过本发明化合物对于毒性治疗的有效量通常在受试者(哺乳动物)每天每公斤体重0.1至500mg的范围内，更通常在每天1-200mg/kg体重范围内。因此对于一个70公斤的成年哺乳动物，每天的实际用量通常为70至700fflg，并且该量可以每天单剂量给予或以每天任何数目的亚剂量给予以使总日剂量相同。本发明的盐或溶剂化物的有效量可以作为化合物本身的有效量的比例确定。本发明的化合物及其盐和溶剂化物可单独或与其它治疗剂联合使用。从而根据本发明的联合疗法包括施用至少一种本发明的AMP活化的蛋白激酶的激活因子或其药用盐或溶剂化物，以及至少一种其它药学活性剂，例如癌症治疗剂。组合的活性剂可以一起或者分别施用，并且当分别施用时可同时或以任何顺序序贯施用。本发明的激酶抑制剂和其它药学活性剂的量以及相关的给药时机为达到期望的联合治疗效果目的进行选择。实施例1以下实施例展示了在Au565细胞的体外细胞培养物中受到赫赛汀处理影响的基因的鉴定。Au565细胞在正常条件下生长并且用赫赛汀处理或不做处理。将细胞沉淀，用液氮快速冷冻并且使用标准条件进行微阵列分析。从由细胞沉淀物分离的RNA制备Cy3和Cy5标记的cDNA。表III显示参与脂质代谢的基因。受到上调或下调的参与其它途径的基因也显示于图1中。表III通过微阵列分析不使用或使用赫赛汀处理的Au565细胞代谢基因的改变<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>本实施例证明在用一种小分子酪氨酸激酶抑制剂GW2974处理时脂肪细胞失去脂质。图2显示用一种ErbB刺激性配体NDF或单克隆抗体赫赛汀处理的Au565细胞，二者均导致脂质的生成。这通过相对细胞背景复染(苏木精)用油红进行脂质染色来显示(脂质由红色点表示)。图3显示脂质在未处理的Au565细胞中存在，但在用EGFR和ErbB2的双重抑制剂GW2974处理的细胞中减少。图4显示用GW2974、赫赛汀或NDF处理的心肌细胞。用赫赛汀和NDF处理的细胞中脂质增加(与未处理细胞相比)，但在用GW2974处理的细胞中不减少。图5显示在对照细胞、赫赛汀和GW2974处理的细胞中对脂质的定量测量。用GW2974处理细胞导致了胞内钙的重新分布(图6)。这可以在MDA-MB-468乳癌细胞中看到，其中钓通过Fluoro-4以荧光进行检测。这种钩的重新分布导致AMPK的活化和磷酸化。被活化的AMPK通过对翻译因子eEF-2的磷酸化(其使eEF-2失活并抑制蛋白质合成，为TKI的已知效果)抑制翻译(图7)。图7A显示Au565细胞使用一种刺激性配体(EGF)或GW2974处理并且对p-eEF-2进行探测的western印迹。p-eEF-2在GW2974处理后引人注目地增加。图7B显示p-eEF-2表达(通过IHC)。C225和赫赛汀不使p-eEF-2增加，然而例如易瑞沙、GW2974和雷帕霉素的TKI增加p-eEF-2。ERRot在心脏细胞的脂质代谢中起作用，并且MCAD为分解脂质和脂肪酸的酶。MCAD的突变为常见的遗传病，特别是在北欧家系中。图8显示在赫赛汀处理的细胞中，ERRcx的水平轻微减少。MCAD在经赫赛汀处理的细胞中表达，但在GW2974处理的细胞中完全缺失。实施例3以下实施例展示了用GW2974处理的细胞的mRNA表达镨中的变化。Au565细胞在正常条件下生长并且不用或用GW2974(25pM)进行处理。将细胞沉淀，用液氮快速冷冻并且进行微阵列分析。使用Agilent总RNA分离试剂盒分离得到RNA。使用Agilent低RNA输入荧光线性扩增试剂盒制备Cy3和Cy5标记的cRNA。将经标记的cRNA与G4110A人1A(V2)微阵列(由代表涵盖18K个清楚表征的、全长的人类基因的60聚体寡核苷酸构成)杂交。表IV以表格形式提供了结果。表IV表IVA-离子通道基因名称描迷与对照相比GW2974变化FLJ12476含有IQ钙调蛋白结合结构域的蛋白质5.0xCAMK4钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV，一种参与Ca(2+)-调节的基因表达(包括CREBBP依赖性基因表达)的蛋白激酶4.5xAVIL与绒毛蛋白l(人VIL1)具有高相似性的蛋白质，为一4.2x23<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表IVB-心脏调节<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表IVC-脂肪酸和氨基酸代谢<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>应当了解，对于本领域技术人员，对本文所描述的目前优选的实施方案的多种变化和修改是显而易见的。此类变化和修改可在不偏离本主题内容的精神和范围以及不减少其预期优势下进行。因此旨在将此类变化和修改包含在所附权利要求中。权利要求1.一种预测响应使用酪氨酸激酶抑制剂处理的毒性的方法，包括鉴定待用酪氨酸激酶抑制剂处理的靶细胞群，确定在所述细胞中是否存在脂肪酸氧化紊乱，由此在所述细胞中脂肪酸氧化紊乱的存在预测使用酪氨酸激酶抑制剂处理细胞可能有毒。2.权利要求l的方法，用于预测心脏毒性，其中与在酪氨酸激酶抑制剂存在下无脂肪酸氧化紊乱的细胞的葡萄糖吸收相比，通过对在酪氨酸激酶抑制剂存在下的葡萄糖吸收的正电子发射体层摄影术，确定脂肪酸氧化紊乱。3.权利要求1的方法，其中所述酪氨酸激酶抑制剂为erbB抑制剂。4.权利要求l的方法，其中所述激酶抑制剂为赫赛汀。5.权利要求1的方法，其中脂肪酸氧化紊乱通过测量与经酪氨酸激酶抑制剂处理无脂肪酸氧化紊乱的细胞中脂质含量的减少相比经酪氨酸激酶抑制剂处理的细胞脂质含量的减少而确定。6.权利要求l的方法，其中脂肪酸氧化紊乱通过测量与无脂肪酸氧化紊乱的细胞相比所述细胞中降低量的脂肪酸氧化代谢途径中至少一种酶的活性而确定。7.权利要求l的方法，其中脂肪酸氧化紊乱通过测量与无脂肪酸氧化紊乱的细胞相比所述细胞中减少量的编码脂肪酸氧化代谢途径中至少一种酶的mRNA而确定。8.权利要求l的方法，其中脂肪酸氧化紊乱通过测量经酪氨酸激酶抑制剂处理正常细胞后所述细胞内脂肪酸氧化代谢途径中至少一种酶的量而确定。9.权利要求l的方法，其中脂肪酸氧化紊乱通过测量经酪氨酸激酶抑制剂处理正常细胞后ATP量的减少而确定。10.权利要求1的方法，其中生物大分子为磷酸化的AMP活化的激酶。11.权利要求l的方法，其中生物大分子为细胞因子。12.权利要求1的方法，其中生物大分子为TNFa。13.权利要求1的方法，其中生物大分子为pNFkB。14.权利要求l的方法，其中分析患者体内生物大分子的方法包括从患者組织获得提取物并且在微阵列分析器上分析该提取物。15.减少细胞中的细胞脂肪的方法，包括将细胞与足量的AMPK激活因子接触以导致细胞中脂肪的实质性减少。16.权利要求15的减少脂肪的方法，其中AMPK激活因子为酪氨酸激酶抑制剂。17.权利要求15的减少脂肪的方法，其中AMPK激活因子为ErbB酪氨酸激酶抑制剂。18.权利要求15的减少细胞脂肪的方法，其中将AMPK激活因子非肠道施用。19.权利要求15的减少细胞脂肪的方法局部施用。20.权利要求15的减少细胞脂肪的方法通过注射局部施用。21.权利要求15的减少细胞脂肪的方法通过皮肤贴剂局部施用。22.权利要求15的减少细胞脂肪的方法通过软骨局部施用。23.权利要求15的减少细胞脂肪的方法以洗剂或通过注射局部施用或者以全身治疗施用。24.治疗患有缺血发作的患者的方法，包括大致在缺血期间或再灌注期间对患者施用一定量的AMPK激活因子。25.治疗患者以保护心脏或脑细胞的方法，包括诊断会诱导对性窘迫的一定量的AMPK激活因子。26.权利要求25的方法，其中会诱导代谢性应激的情况选自缺其中将AMPK激活因子其中将AMPK激活因子其中将AMPK激活因子其中将AMPK激活因子其中将AMPK激活因子血、细胞因子释放和葡萄糖剥夺。27.保存用于移植的器官的方法，包括制备包含AMPK激活因子的保存溶液并且将所述器官与该保存溶液接触。全文摘要本发明公开了确定器官毒性特别是心脏毒性是否将在选择用各种激酶抑制剂如酪氨酸激酶抑制剂更特别是erbB抑制剂如赫赛汀治疗的患者中发生的方法。此外，还公开了确定潜在药物是否可能产生心脏毒性效应的方法。所述方法涉及分析脂质水平或者脂肪酸氧化酶、pAMP活化的蛋白激酶的表达、葡萄糖摄取，以确定是否存在脂肪酸氧化紊乱。鉴定脂肪酸氧化紊乱可用作为毒性特别是心脏毒性的预测物，和用作为如果施用诸如酪氨酸激酶抑制剂的药物应小心监测器官功能的指示。还公开了保护器官免于代谢性应激和处理细胞如脂肪细胞以减少其脂质含量的方法。文档编号G01N33/53GK101438155SQ200780013697公开日2009年5月20日申请日期2007年2月27日优先权日2006年2月27日发明者S·S·巴克斯申请人:靶向分子诊断有限责任公司