血细胞分离的制作方法

专利名称：血细胞分离的制作方法
技术领域：
本发明涉及产前诊断领域，特别是涉及从母体外周血中分离胎儿细 胞。具体而言，本发明涉及从母体外周血中分离胎儿细胞的方法以及用 于从母体外周血中分离胎儿血细胞的装置。
背景技术：
现有的疾病产前诊断方法涉及侵入性技术。例如，这类技术包括羊 瞎H会蓉击il太.^6瞎战J.泡；ldH昧空击il 曰箭在主扭巫'击田；S i:f罢入脱
样的物质进行数百万例这类分析来检测染色体异常(例如唐氏综合征) 和其他遗传病症。仅在美国，每年就实施约200000例侵入性产前检测操 作，例如羊膜腔穿刺术和绒膜绒毛取样。这类测试通常是在年龄超过35 岁的妇女以及那些具有其他危险因子的妇女身上进行的，但是大多数具 有染色体或遗传缺陷的孩子仍然是年龄在35岁以下的妇女生的。目前， 这些遗传性障碍仅能利用在侵入性操作中获得的物质来加以检测。在英 格兰和威尔士，过去十年间每年平均有约630000名嬰儿安全出生，但是 母亲平均年龄已经从1995年的28.5岁上升到2005年的29.5岁。胎儿携 带遗传异常的可能性随母亲年龄的增长而急剧增加，并且预计该年龄还 将会继续增加。侵入性产前诊断通常被认为对母亲和胎儿有危险，所有 操作中有1-2%会导致胎儿的自发性流产。
已知需要为现有的疾病产前诊断方法提供非侵入性的替代方法。人 们希望非侵入性产前诊断技术将会消除或者降低上文所述的风险并且将 会使得常规的产前检测得以扩展。使用分离的胎儿细胞的非侵入性产前 诊断还将会比羊膜腔穿刺术和绒膜绒毛取样更加经济实用(即不需要手 术操作)。
已知孕妇的血浆中同时含有胎儿和母体的循环胞外DNA和RNA。 已知可以根据这些胎儿和母体DNA之间的大小差异来分离这两类DNA， 使得胎儿物质得以富集(参见，例如EP-A-1524321 )。然而，由于游离的母体循环核酸DNA水平较高，目前循环胎儿核酸仅,皮用于检测由父亲遗 传的等位基因。胎儿DNA，特别是多态型形式的胎盘编码的种类，已经 被用于产前唐氏综合征诊断。
数十年前就已经知道胎儿细胞存在于所有孕妇的外周血中。因此， 它们代表了 一种用于非侵入性产前诊断的重要的潜在靶标，因为这些胎 儿细胞中的大多数均是有核的。所述已经在母体血液中鉴别出的胎儿细 胞类型包括成红血细胞(有核的红细胞)、'淋巴细胞、间质干细胞和胎盘 来源的营养细胞。如果这些细胞可以被分离至同质程度(即不含污染性 母体细胞)，则可以对所述分离的细胞进行遗传检测。这将会使得常规且 安全的非侵入性遗传检测成为可能，所述遗传检测用于例如非整倍体、 嚢性纤维化病、p地中海贫血和其他遗传性单基因障碍的障碍。
然而，遗憾的是，用于利用诸如荧光原位杂交(FISH)、密度梯度/ 荧光激活细胞分选(FACS)和磁珠激活细胞分选(MACS)细胞分离技 术的方法使用来源自母体外周血的胎儿细胞评估所述非侵入性孕前诊断 的可;f于性的研究(例如,Hahn， S a/" Molecular Human Reproduction (1998) 4 515-521)没有使用独特的胎儿标记，而是使用了存在于某些母 体细胞上的细胞表面标记(例如，转铁蛋白受体CD71或血型糖蛋白A CD235a，参见例如WO96/09409 )。此外，已经试图使用固有的胎儿特异 性珠蛋白s和y来分离胎儿成红血细胞，但是由于所述蛋白也会在成年细 胞(所谓的"F-细胞")中很少量地表达，且其利用会导致对所述胎儿细 胞的破坏，因此它们的利用受到了限制。目前，用于分离胎儿成红血细 胞的技术方法利用例如血型糖蛋白A的标记，所述标记事实上同样会在 母体和胎儿红系细胞上表达(例如Al Mufti C /. (2004) Clin. Lab. Hematol. 26 123-128 )。
在文献中，除了已知的关于所述s和Y珠蛋白和K血型抗原(其中i 为胎儿特异性的)的具体细节外，没有关于胎儿和成人红系细胞之间的 明显生化差异的具体细节。
因此，需要提供真正的胎儿细胞特异性标记。
国际专利申请WO 2004/078999公开了一种使用胎儿细胞特异性标 记从母体外周血中分离胎儿细胞的方法。所述方法包括鉴别一种存在于 胎儿细胞DNA中但不存在于母体DNA中的编码抗原的等位基因，使胎 儿细胞与一种可识别所述抗原的亲和试剂结合并且利用所述亲和试剂对细胞进行筛选。优选的抗原为细胞表面蛋白，特别是人淋巴细胞抗原
(HLA)蛋白。然而，该方法存在许多缺点。例如，该系统需要确定所
述胎儿的父亲的HLA类型(当考虑到可疑的谱系的情况时是众所周知地
不可靠的)，并且该结果可能不是能够清楚地重复的。
还需要用于培养分离自母体外周血的胎儿细胞的有效方法。
已知可使用物理分离技术从母体外周血中分离胎儿细胞，例如参见
WO00/060351,它涉及密度梯度离心。然而，现有的基于密度梯度的方
法可能会改变细胞的生理学特性(Hahn， S " Molecular Human
Reproduction (1998) 4 515-521 )。这可能会包括凋亡的发生，在一项最近
的研究(Babochkina， " Haematologica (2005) 90 740-745 )中在分离 自母体外周血的成红血细胞的很大一部分中均可见到发生凋亡的标志
(通过核浓缩来判断)。或者，如WO 2004/076653中所公开的那样，可 以利用密度梯度分离和抗体介导的筛选的组合来从宫颈管抽吸物中分离 胎儿细胞并且加以富集。
Hohmann等人(Fetal Diagn. Ther. (2001) 16 52-56 )评估了使用各 种抗体来检测胎儿来源的细胞。
US-A-2006/0105353和Bianchi等人(Prenatal Diagnosis (1996) 16 289-298 )7>开了一种4吏用CD45抗体和CD71抗体分离胎儿细胞的方法， W094/25873^^开了一种4吏用CD45抗体的分离方法。

发明内容
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种从母体血液样品(优选 分离的)中分离胎儿细胞的方法，所述方法包括鉴别具有至少一种胎儿 标记(优选l、 2、 3、 4或5种标记)的表达模式不同于所述标记在等价 母体细胞中的表达模式的细胞，并且筛选所鉴别的细胞，其特征在于所 述胎儿标记选自HSP-60(热激蛋白60，GenBank登记号P10809)、单胺 氧化酶、谷氨酰胺合酶(登记号P15104)、 Ara-70 (雄激素受体相关蛋白70， 登记号Q13772)、 Ara-54(雄激素受体相关蛋白54，登记号Q9UBS8)、人 假定蛋白MGC10526 (登记号Q5JSZ7)或MGC10233 (登记号 NP—689928) 、 FLJ20202(HGNC FAM46C) 、 DCN-1蛋白(登记号 NM—020640)、 RAB5A(登记号P20339,也称为HCC-IO、宫颈癌基因10蛋白)、HSP-7C (热激同源71kDa蛋白，登记号P11142)、 EF1A1 (延伸 因子l-al，登记号P68104)、GRP78 (MkDa葡萄糖调节蛋白[前体GRP 78, 登记号P11021)、 MYL4 (肌球蛋白轻链多肽4肌球蛋白轻链1，登记号 P12829)、 DimJ同系物亚家族B成员14(登记号Q8TBM8)、粘着斑蛋白(登 记号P18206)、桥粒斑蛋白(登记号P15924)、 AMMECRl-样蛋白(登记号 Q6DCA0)、胞外基质蛋白2前体蛋白(登记号094769)、非典型蛋白 Cxorf57 ( uncharacterised protein Cxorf57 )(登记号Q6NS14)、过氧化 物还原酶1 (登记号Q06830)、过氧化物还原酶2 (登记号P32119)。优选 地，所述方法还包括将所鉴别的细胞从所述至少一种胎儿标记具有不同 表达模式的其他细胞中分离出来。
本说明书通篇中所使用的术语"不同表达模式，，是指一种标记在胎儿 细胞中的表达不同于该标记在等价母体细胞即在来自母亲的相同细胞类 型(例如，红系细胞如成红血细胞)中的表达。所述标记表达的比较是 在来自母亲和胎儿的对等细胞之间进行的，例如在胎儿成红血细胞中的 表达模式与在母体成红血细胞中的表达模式比较。
所述表达模式的差异可以是，例如所述标记在胎儿细胞而非等价母 体细胞中的特定细胞区室(例如到细胞膜)的定位；胎儿细胞的总蛋白 中某种标记蛋白的量与等价母体细胞的总蛋白中该标记蛋白的量相比增 加或减少；或者某种标记在胎儿细胞中表达而不在等价母体细胞中表达。 它可能还涉及某种特定生化途径的活性的升高或降低，在所述生化途径 中所述蛋白种类发挥重要作用。
在给定细胞中的表达模式可以通过标准分子生物学技术(例如本说 明书中所描述的那些分子生物学技术)来测量，例如通过确定细胞中 mRNA的量，或者通过测定存在于细胞或细胞区室(例如细胞表面膜) 中的给定蛋白的量。
本说明书通篇中所使用的术语"量增加，，是指目的细胞(例如胎儿来 源的红系细胞)中表达的胎儿标记的量高于非目的细胞(即母体来源的 细胞)中表达的所述胎儿标记的量。优选地，其中至少一种胎儿标记的 每一种的表达量均未增加的细胞(即与胎儿来源细胞相比，表达量非常 低的细胞)为母体细胞。
本说明书通篇中所使用的术语"量降低，，是指目的细胞(例如胎儿来 源的红系细胞)中表达的胎儿标记的量低于非目的细胞(即母体来源的细胞)中表达的所述胎儿标记的量。优选地，其中至少一种胎儿标记的 每一种的表达量均未降低的细胞(即与胎儿来源细胞相比，表达量非常 高的细胞)为母体细胞。这类生物标记——被发现与胎儿红系细胞相比， 在成人(母体)红系细胞上上调——允许从胎儿红系细胞和母体红系细 胞的混合物中清除母体细胞。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括鉴别在其细胞表面上 表达至少一种胎儿标记的细胞并且筛选那些细胞。所述胎儿标记可以是
HSP-60、 GRP78、 HSP-7C、 MYL4或EF1A1，并且优选地为HSP-60。 优选地，所述方法还包括将所鉴别的细胞从未在其细胞表面上表达所述 胎儿标记的细胞中分离出来。
所述热激蛋白为高度保守的保护性(伴侣蛋白)蛋白家族，且已知 它们的表达受到下列因素的诱导应激例如热激、与重金属、有毒物质 例如乙醇接触、与紫外线接触、感染、饥饿、脱水和缺氧。具体而言， HSP-60的细胞表面表达是通过将所述蛋白从细胞的线粒体易位至质膜来 对所述细胞与缺氧环境(低氧环境，已知胎儿红系细胞会与该环境接触) 的接触做出应答。当再氧合时HSP-60会减少，并且据报道HSP-60会在 人胎盘中表达。更加值得注意的是，已经证明缺乏HSP-60的小鼠不能进 行胚胎发育，证明了该蛋白至少在这种物种的发育过程中的重要性。自 身HSP-60充当先天性免疫系统的危险信号，并且该蛋白到细胞(例如淋 巴细胞和单核细胞)膜上的易位与疾病或者与应激反应有关(Pfister (2005) J. Cell. Sci. 118 1587-1594; Lang C a/. (2005) J. Am. Soc. N印hrol. 16 383-391; Multhoff (2006) Handbook Exp. Pharmacol, 172 279-304; Romano C /. (2004) Int. Immunopharmacol. 4 1067-1073; Belles C (1999) Infect. Immun. 67 4191-4200 )。因此，该蛋白非常不可能出现在健 康个体(包括孕妇)的成熟成人红细胞的表面上。
发明人已经唯一地且吃惊地发现胎儿红系细胞膜含有HSP-60，而在 成人红细胞膜上完全没有这种蛋白。在正常条件下，HSP-60定位到线粒 体，但是在细胞应激过程中易位到细胞表面。这类应激的一个实例为胎 儿红系细胞在其中生存的缺氧环境。先前已经提出大肠杆菌HSP-60的免 疫接种用于治疗类风湿性关节炎(Bloemendal W "/. (1997) Clin. Exp. Immunol. 110 72-78; WO 2006/032216 )。
在进行所述分离过程之前，可以例如才艮据红系标记(erythroidmarker)的表达，例如通过依次使用密度离心和MACS/FACS以及抗血 型糖蛋白A或抗-Rh相关血型糖蛋白(RhAG)，或者通过使用任何红系 细胞特异性生物标记来从母体细胞中部分地纯化胎儿细胞或其亚群。将 红谱系细胞从母体外周血中预先富集出来会极大地提高胎儿细胞分离和 富集的效率，目的是达到同质。
或者，本发明的方法中使用的标记使得可以从母体成红血细胞中分 离出胎儿成红血细胞和母体非成红血细胞的混合物。随后，可以利用成 红血细胞特异性标记(例如血型糖蛋白A ( GPA))将胎儿成红血细胞从 该混合物中分离出来。或者，根据存在一种已知的红系标记和一种本发 明鉴别的标记来同时分离红系细胞将会分离到纯的胎儿成红血细胞。
所选择的胎儿细胞可以利用常规分离技术如免疫磁学(MACS )或其 他细胞分选方法例如FACS从母体外周血中分离或者富集。或者，所选 择的胎儿细胞可以利用物理粘合剂例如亲和剂(抗体、适体或模拟肽) 来分离或富集。适合的亲和剂包括但不限于抗体、亲和体分子和结构域 抗体。所述亲和剂可结合在与诸如珠子的表面上。优选地，所述亲和剂 为抗体。当所述胎儿特异性标记为HSP-60时，所述抗体优选地为抗 HSP-60抗体或者可与HSP-60反应的适体。
在一个备选的或附加的优选实施方案中，本发明的方法包括鉴别表 达单胺氧化酶的细胞并且筛选这些细胞。出乎意料地，已经确定这些胎 儿标记在胎儿细胞而非母体细胞中唯一地表达。优选地，所述方法还包 括将所鉴别的细胞从不^^单胺氧化酶的细胞中分离出来。
在根据本发明这一方面的方法的另 一个优选的实施方案中，鉴别了 这样的细胞，即所述细胞在其细胞表面上表达HSP-60以及
量增加的至少一种其他胎儿标记，所述至少一种其他胎儿标记选自 单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或 MGC10233、 FLJ20202、 DCN画1蛋白、RAB5A、 HSP國7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、 AMMECRl-样蛋白、非典型蛋白Cxorf57;或
量减少的至少一种其他胎儿标记，所述至少一种其他胎儿标记选自 胞外基质蛋白2前体蛋白、过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。
对于所有标记来说，对各种标记的表达的鉴别或者表达增加或减少 的鉴别可以是同时的。在根据本发明这一方面的方法的一个附加的或备选的优选实施方案
中，鉴别了这样的细胞，即所述细胞表达单胺氧化酶并且
量增加的至少一种其他胎儿标记，所述至少一种其他胎儿标记选自
HSP-60、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或
MGC10233、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、
MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、
AMMECRl-样蛋白、非典型蛋白Cxorf57;或
量减少的至少一种其他胎儿标记，所述至少一种其他胎儿标记选自
胞外基质蛋白2前体蛋白、过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。
对于所有标记来说，对各种标记的表达的鉴别或者表达增加或减少
的鉴别可以是同时的。
或者，在本发明的另一个优选的实施方案中，在所述方法中会使用 两种或多种胎儿标记的任一组合，所述两种或多种标记的每一种均选自 HSP-60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋 MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN國1蛋白、RAB5A、 HSP國7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、 桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、胞外基质蛋白2前体蛋白。优选地， 至少一种所述胎儿标记为HSP-60或单胺氧化酶。所述标记可以同时4吏用 或单独使用。
因此，可以使用第一胎儿标记对所述胎儿细胞进行最初分离，然后 再根据另一种胎儿标记对其进行进一步的分离或富集。所述第一标记可 以是一种标记物，例如一种蛋白，其在胎儿细胞表面上表达而不在母体 细胞表面上表达，例如HSP-60;或者其在胎儿细胞中表达而不在母体细 胞中表达，例如单胺氧化酶。优选地，所述第一标记为位于细胞表面上 的标记，例如HSP-60。所述另一种胎儿标记可以是例如酶(例如单胺氧 化酶)的表达。
因此，本发明的方法中所用的这些标记可以被方便地用于使用对胎 儿非侵入的操作从母体细胞中分离胎儿细胞，先将所述母体血液从母体 中分离出来，再对所述胎儿细胞进行任何处理。然后，所述胎儿细胞可 以被用于检测胎儿体内可能的疾病(例如唐氏综合征和其他非整倍体、 脊柱裂、嚢性纤维化病、p地中海贫血和其他遗传性病症)，所述细胞最 终均来源于所述胎儿。
13当所述标记是可以将所提供的底物转化为可检测产物的酶时，优选 地可以采用荧光标记/探针以使得只在所述胎儿细胞中产生的底物代谢产 物可见。这种技术将使得可以在胎儿和母体血细胞的分离中使用基于
FACS的方法。
优选地，所述胎儿标记或其他胎儿标记为单胺氧化酶，更优选MAOA (登记号NP—000231)或MAOB ( AAB27229 )。这些酶都催化生物活性 胺(例如血清素、肾上腺素和去曱肾上腺素)的氧化脱氨反应，并且因 此可以用于保护所述胎儿防止这些生物活性胺由母体循环系统进入胎盘。
在一个备选的优选实施方案中，所述胎儿标记或其他胎儿标记为谷 氨酰胺合酶(也被称为谷氨酸氨连接酶)。该酶通过结合氨和谷氨酸来催 化产生具有生物活性的氨基酸谷氨酰胺。
在另一个备选的优选实施方案中，所述胎儿标记或其他胎儿标记为 Ara-70 (也被称为核辅激活因子4)。该蛋白属于核辅激活因子转录因子 家族，所述家族基本上会参与调节特定基因的表达。
在一个附加的备选的优选实施方案中，所述胎儿标记或其他胎儿标 记为Ara-54 (也^皮称为RNF14 )。值得注意的是，同ARA-70 —样，这 是另 一种与转录辅激活因子相关的雄激素受体。
在另一个备选的优选实施方案中，所述胎儿标记或其他胎儿标记为 人假定蛋MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN國1蛋白、RAB5A、 HSP-7C (也被称为热激70 kDa蛋白8)、 EF1A1 (也被称为EF-1 a國l、 延伸因子1A-1、 eEFlA-l、延伸因子Tu和EF-Tu)、 GRP78 (也被称为 免疫球蛋白重链结合蛋白、BiP、内质网腔Ca"结合蛋白grp 78 )、 MYL4 (也被称为肌球蛋白轻链碱GT-1同种型)、DnaJ同系物亚家族B成员 14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、胞外基质蛋白2前 体蛋白、非典型蛋白Cxorf57、过氧化物还原酶1或过氧化物还原酶2。
本发明的方法还可以会包括将样品中所选择的胎儿细胞从非等价母 体细胞中分离出来的步骤，该步骤包括鉴别具有至少一种非胎儿标记的 表达模式不同于所述标记在非等价母体细胞中的表达模式的细胞，并且 将所述样品中所鉴别的细胞从其他细胞中分离出来。在所选择的胎儿细 胞为成红血细胞或其他红系细胞的情况下，这种非胎儿标记可以是红系 特异性标记，例如血型糖蛋白A、 B、 C或D、 Rh蛋白、Rh相关蛋白、Kell糖蛋白。优选地，所述标记为血型糖蛋白A。
所述母体血液的分离样品适合于被输回到受试者体内，所述母体血 液的样品获取自该受试者。例如，所述样品可以是管线系统(line system) 的一部分，籍此可以将血液从母亲身上移出然后再输回，例如在血浆分 离置换(aphaeresis)过程中。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种培养胎儿细胞的方法， 所述方法包括富集具有至少一种胎儿标记的表达模式不同于所述标记在 等价母体细胞中的表达模式的细胞，所述至少一种胎儿标记选自
HSP-60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋 MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN画1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、 桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、胞外基质蛋白2前体蛋白、非典型蛋 白Cxorf57、过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。
优选地，所述待培养的胎儿细胞已经使用一种包括根据本发明的第 一方面的方法的方法分离出来。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种含有被分离细胞的细胞 样品，所述被分离细胞利用 一种包括根据本发明的第一方面的方法的方 法可获得或已获得的。优选地，所述细胞样品含有利用一种根据本发明 的第二方面的方法培养的细胞。
优选地，根据本发明的第一或第二方面的方法的细胞和才艮据本发明 的第三方面的样品为红系细胞，例如成红血细胞。优选地，i人为胎儿成 红血细胞存在于母体循环系统中的浓度为一个胎儿细胞/1 x 106-1 x 107个 母体有核细胞。考虑到了其他存在于母体血中的胎儿细胞类型，例如淋 巴细胞、间质干细胞和胎盘来源的营养细胞，但是特别优选成红血细胞， 因为胎儿(Y染色体携带的)淋巴细胞会持续存在数十年，包括在以后 的妊娠中。此外，营养细胞表现出染色体嵌合性，并且由于其较大的体 积而会在母体的肺被快速捕获。成红血细胞会按照红系路径发育，并且 不可能会持续存在于以后的妊娠中。它们以相对高的丰度存在于母体循 环中。因此，它们是适合用于产前诊断的细胞，因为母体血液中存在的 任何胎儿红系细胞均来源自现在的胎儿。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种胎儿细胞分离试剂盒， 包括用于检测一种细胞所具有的至少一种胎儿标记的表达模式是否不同于所述标记在等价母体细胞中的表达模式的工具，以及用于将具有所述 至少一种胎儿标记的不同表达模式的细胞从不具有所述至少一种胎儿标 记的不同表达模式的细胞中分离出来的工具，其特征在于所述胎儿标记
选自HSP-60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定 蛋MGC10526或MGC10233、FLJ20202、DCN-1蛋白、RAB5A、HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、 桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、胞外基质蛋白2前体蛋白、非典型蛋 白Cxorf57、过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种产前疾病诊断方法，所 述方法包括利用 一种包括根据本发明第一方面的方法的方法获得分离的 胎儿细胞的步骤。
优选地，所述方法还包括确定所述分离的胎儿细胞是否含有疾病标 识的步骤。例如，对于唐氏综合征的情况，这可以通过在胎儿细胞中存 在一份额外的21号染色体的拷贝来指示。许多其他疾病的诊断使得对特 定基因的已知突变的遗传分析成为必需。例如，在嚢性纤维化病诊断中， 可以检测CTiF7 基因的已知突变(例如突变AF508)，所述突变为小片段 缺失、大片段缺失或单个核苷酸交换。可以对提取自所述分离的胎儿细 胞的DNA进行这类分析，所述DNA是使用用于从单个或少量细胞中提 取DNA的手动或自动化操作分离的，这些操作是技术人员所公知的。所 提取DNA的扩增可以使用被称为低拷贝数分析的通用扩增方案，例如鉴 证申请中所使用的那些扩增方案，也可以不使用。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种从母体血液中分离胎儿 细胞的方法，所述方法包括鉴别具有至少一种胎儿标记的表达方式不同 于其在等价母体细胞中的表达模式的细胞，并且筛选所鉴别的细胞，其 特征在于所述胎儿标记选自HSP-60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、 Ara画70、 Ara隱54、人假定蛋MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN國1 蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家 族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、胞外基 质蛋白2前体蛋白、非典型蛋白Cxorf57、过氧化物还原酶l、过氧化物 还原酶2。
所述方法还可以包括将样品中所选择的胎儿细胞从非等价母体细胞 中分离出来的步骤，该步骤包括鉴别具有至少一种非胎儿标记的表达模式不同于所述标记在非等价母体细胞中的表达模式的细胞，并且将所述 样品中所鉴别的细胞从其他细胞中分离出来。在所选择的胎儿细胞为成 红血细胞的情况下，这种非胎儿标记可以是红系特异性标记，例如血型
糖蛋白A、 B、 C或D、 Rh蛋白、Rh相关蛋白、Kell糖蛋白。优选地， 所述标记为血型糖蛋白A。
根据本发明的第七方面，本发明提供了用于根据本发明的第一或第 六方面的方法的装置，所述装置包括用于检测一种细胞所具有的至少一 种胎儿标记的表达模式是否不同于其在母体细胞中的表达模式的工具， 以及用于将具有所述至少 一种胎儿标记的不同表达模式的细胞从不具有 所述至少一种胎儿标记的不同表达模式的细胞中分离出来的工具，其特 征在于所述胎儿标记选自HSP-60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或MGC10233、 FLJ20202、 DCN画1蛋白、 RAB5A、 HSP画7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成 员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、胞外基质蛋白2 前体蛋白、非典型蛋白Cxorf57、过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。 当检测到在其细胞表面膜上表达至少一种胎儿标记的细胞并且将该细胞 从未在表面膜上表达该标记的细胞中分离出来时，所述用于检测细胞是 否表达所述标记的工具和/或用于分离表达所述标记的细胞的工具可采取 包括亲和分离材料的栽体的形式。例如，当所述胎儿标记为HSP-60时， 所述亲和分离材料可以是抗HSP-60抗体或适体。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种确定细胞是胎儿细胞的 方法，所述方法包括在所述细胞中(即在所述细胞中或所述细胞的表面 上)检测至少一种胎儿标记，所述胎儿标记具有与其在等价母体细胞中 的表达模式不同的表达模式，其特征在于所述胎儿标记选自HSP-60、 单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或 MGC10233、 FLJ20202、 DCN画1蛋白、RAB5A、 HSP画7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、 AMMECRl-样蛋白、胞外基质蛋白2前体蛋白、非典型蛋白Cxorf57、 过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。因此，所述方法可被用于确i人细 胞是胎儿细胞，例如作为细胞分离^^支术中的阳性对照的一部分。


现在，将仅利用实施例并且参照附图1-13来描述选择和分离胎儿细 胞的方法，其中
图1示出了用于鉴别红系细胞的胎儿标记的二维电泳方法的结果类 型的图示。
图2示出了其他二维电泳实验的代表性结果。图2A示出了使用成人 红细胞膜进行的实验的结果。图2B示出了使用胎儿红系细胞膜(22周) 进行的实验的结果。图2C示出了使用胎儿红系细胞膜(26周)进行的 实验的结果。
图3示出了图2中所述的二维电泳实验的结果，其中在所述胎儿凝 胶中突出标识了热激蛋白60的位置。图3A对应于图2A;图3B对应于 图2B;并且图3C对应于图2C;
图4示出了 DIGE实验的结果。图4A示出了使用成人细胞和胎儿细 胞(妊娠26周)进行的实验的结果，其中圏出了热激蛋白60胎儿特异 性蛋白。图4B示出了使用成人细胞和胎儿细胞(妊娠22周)进行的实 验的结果，其中再次圈出了热激蛋白60胎儿特异性蛋白。
图5示出了上述每张凝胶的DeCyder软件分析的分析屏幕图像。图 5A的屏幕图像代表了成人和胎儿(妊娠22周)样品之间的热激蛋白60 点分析。图5B的屏幕图像代表了成人和胎儿(妊娠26周)样品之间的 热激蛋白60点分析；
图6示出了成人和胎儿红系细胞膜的蛋白质印迹分析的结果。图6A
示出了来自脐穿刺样品(26周)和6名具有不同恒河猴(Rh)表型的成
人的蛋白的印迹；图6B示出了来源自脐穿刺样品(22周)和6名随机的
成人供血者的蛋白的印迹；图6C示出了来源自脐穿刺(26周)、脐带(39
周)、母体(15周)、母体(15周)、随机成人的蛋白的印迹；图6D示出
了来源自脐带(39周，足孕)、随机成人、脐穿刺(22周)、5名随机成
人供体的蛋白的印迹；图6E示出了一种持家基因-G3PDH的印迹，
用于作为阳性对照印迹所有相同的样品以及用于相同蛋白上样浓度的对 昭.
J"、 9
图7示出了分离自成人外周血样品的血型糖蛋白A和热激蛋白60标 记的单核细胞的流式细胞术分析；图8示出了分离自胎儿脐带血样品的血型糖蛋白A和热激蛋白60标 记的单核细胞的流式细胞术分析；
图9示出了获取自成人外周血的经标记的单核细胞的流式细胞术散 点图，示出了成红血细胞(GPA+)和HSP-60+单核细胞的表达镨；
图10示出了获取自胎儿脐带血的经标记的单核细胞的流式细胞仪散 点图，示出了成红血细胞(GPA+)和HSP-60+单核细胞的表达镨；
图11示出了胎盘、胎儿成红血细胞和成人成红血细胞中MAOA和 MAOB的实时PCR分析的结果。图IIA示出了 MAOA相关实验的结果； 图IIB示出了 MAOB相关实验的结果；
图12示出了图2中的三张2D凝胶的PDQuest分析，用圆圏示出了 与母体细胞相比在胎儿细胞中上调并且利用MALDI-TOF分析鉴别的蛋 白的位置；并且
图13示出了分离自胎儿和成人的经培养的成红血细胞的质膜蛋白的 2D电泳比较的结果，突出标识了被鉴别为与成人细胞相比在胎儿细胞中 具有不同表达模式的蛋白。
实施例
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通过比较胎儿红系细胞膜和成人红细胞膜表达的蛋白，将HSP-60鉴 别为胎儿红系细胞表面特异性的。
具体地，使用制备并且贮藏在-80。C下的红细胞血影膜。在优化膜溶 解方案后，发现浓度分别为0.4%和1.2%的去污剂ASB-14和CHAPS的 混合物可产生最佳结果。在每个二维电泳实验中均使用25jig溶解的膜。 通过使用固定的pH梯度来实现聚焦，并且通过将两性电解质(具有各种 pl值的两性物质的混合物)加入到所述样品的上样緩冲液中来加以增强。 将蛋白上样到阳极上，并且在胶条上施加电流。当所述蛋白移向阴极时， 它们被固定在其净电为零的位置处，即它们的等电点。然后将该胶条置 于预制SDS凝胶顶部的预先形成的孔中。然后按照基础SDS-PAGE方案 进行，使得可以根据分子量来分离蛋白，如图1的格式中举例所示。将 凝胶用SyproRuby染色并且用Typhoon成像器扫描，结果在图2中描述。 对图2A、 2B和2C的比较示出了在所述三种细胞样品中每一种的蛋白质组之间的相似性和差异。
使用设计用于比较二维凝胶图像并且确定蛋白表达差异的PDQuest 软件(Bio-Rad)进行凝胶分析。通过准确地记录用于凝胶比对的标记蛋 白，该软件可根据蛋白染色的强度来确定蛋白的上调或下调。对图2中 所示的三张凝胶图像的PDQuest分析突出标识了所有三张凝胶中的上调 和下调蛋白，但是更重要的是，发现了存在两张胎儿凝胶但不存在于所 述成人凝胶中的单种蛋白。在用考马斯亮蓝衬染后，将蛋白点从每张凝 胶上切下来并且进行MALDI分析。通过MALDI-TOF分析将同时存在 于胎儿凝胶和成人凝胶中的单种蛋白鉴别为HSP-60。图3中突出标识了 HSP-60在所述胎儿凝胶图像中的位置。可以看出，在图3A中所示的来 自成人膜的蛋白的凝胶中没有HSP-60。
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为了确认HSP-60作为胎儿红系细胞表面特异性标记的潜力，对上述 样品进行差异凝胶电泳(DIGE)分析。在进行二维电泳前，DIGE利用 荧光染料来标记蛋白样品并且允许最多达三种样品在单独一块凝胶上同 时分离和显影。通常使用染料Cy2、 Cy3和Cy5，每一种均具有不同的激 发波长，从而使得可以对同一张凝胶进行三次不同的扫描，每张图像对 应于每种蛋白样品。然后可以使用图像分析软件例如DeCyder (Amersham)将所述图像合并并且确定它们之间的差异。由于可确认每 种染料均对蛋白浓度中的变化有线性应答，所以该技术是定量的。可以 采用互染(reciprocal dying )来确保所述标记没有偏差。如图4中所示， 将来自R1R1细胞的成人细胞样品与每种胎儿样品一起电泳。如该图中 所突出标识的，再次证明HSP-60为胎儿细胞表面特异性的。
在对所述三张凝胶进行比较的过程中，DeCyder软件突出标识了所 有三种样品中许多上调和下调的蛋白。对每张凝胶单独进行了分析，即 确定成人胎儿凝胶之间的差异，然后将所述两张凝胶彼此进行比较(也 结合了所述两种胎儿样品之间的差异)。再次突出标识了代表HSP-60的 点，因为其存在于两种胎儿样品中但不存在于成人样品中。图5中示出 了对每张凝胶中HSP-60的软件分析屏幕。具体地，通过比较图5A和5B, 可以看出HSP仅存在于胎儿样品的膜中(这些图中的右侧3-D图像)。对^乂斧崖乂乙iz:系勿^處迷存蛋冷^伊遂为、浙4确定^44'不^4 ,做勤60
如上文所述，利用两种技术已经确认了 HSP-60仅存在于胎儿红系细 胞膜中但不存在于成人红系细胞膜中，从BD Biosciences购买抗HSP-60 抗体以对大量样品中的该蛋白进行蛋白质印迹分析。成熟成红血细胞分 离自成人供血者或各个妊娠阶段的胎儿红系细胞。然后对红系细胞进行 低渗裂解以产生纯化的膜(或"血影膜")，然后使用抗HSP-60对其进行 SDS-PAGE和蛋白质印迹分析。红系细胞膜分离自各种来源，包括随机 的成人、26周胎儿、39周胎儿(即脐带血)和母体成人成红血细胞膜(妊 娠15周)。图6图解说明了抗HSP-60与来源自6名成人供血者完全缺乏 反应性，并且确认了该蛋白的胎儿特异性。重要的是，HSP-60似乎在脐 带样品(足孕)中以低得多的水平表达，提供了进一步的证据证明HSP-60 的表面表达为胎儿特异性的。在39周时，红系细胞从胎儿细胞转变为新 生儿细胞并且所述细胞不存在于低氧环境中。
已经使用荧光蛋白标记技术证明，将CD34+干细胞从脐带血中分离 出来之后所产生的胎儿成红血细胞的细胞表面表达HSP-60 (数据未示 出)。来自成人的等价细胞证明了所述蛋白的胞内定位。
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上文所概括的研究明确地证明了膜定位HSP-60是胎儿成红血细胞 特异性的，但不是成人成红血细胞特异性的。然而，已经发现膜定位 HSP-60在成人单核细胞例如白细胞中占非常高的比例(5-26% )(参见图 7和图9的B图)。因此，发明人开发了一种从母体血液样品中富集或纯 化胎儿成红血细胞的方法，所述方法根据成人单核HSP-60+级分不表达 红系特异性标记血型糖蛋白A (CD235a)这一事实将它们消除。在成人 样品中基本上不存在双阳性GPA和HSP-60+细胞(参见图7和9 ),但是 在胎儿脐带样品中存在较小但显著比例的胎儿单核细胞(即成红血细胞) 为HSP-60和GPA双阳性的(图8和10)。这些双标记的细胞为用于非 侵入性产前诊断的特异性靶细胞类型。
成人血沉棕黄层样品和脐带血(39周足孕胎儿)样品均是按照下述方案处理的
1) 将30 ml每种样品加入到Sigma Accuspin histopaque柱中并且在 18-26 CC以1000 g离心15分钟。
2) 去除血浆层并且将单核细胞层转移到50 ml falcon离心管中。
3) 将细胞用25 ml PBS清洗并且通过在18-26 °C以2000 rpm离心10 分钟来加以沉淀。
4) 将细胞沉淀以25 ml红细胞裂解緩沖液(150 mM氯化铵、130 EDTA、 10 mM重碳酸钾)重悬并且置于震荡器上以便于在室温下恒定 混合10分钟。
5) 通过以2000 rpm离心10分钟来沉淀细胞。
6) 将细胞重悬于1 ml PBS中并且使用光学显微镜和血细胞计数器来 进行细胞计数。
7) 将每个样品的1 x 106个细胞加入到10 jil PE缀合的抗CD235a (GPA )和10 pi FITC缀合的抗HSP-60单克隆抗体中，终体积为100 pl。
8) 然后将标记反应物在水箱中放置30分钟。
9) 通过用台式离心机将所述细胞以3000 rpm离心沉淀5分钟并且移 除上清液来洗去未结合的抗体。
10) 将细胞用2 ml PBS清洗两次。
11) 最终将细胞重悬于500 pi PBS中并且用FACS机器加以分析。
FL1-H通道=FITC FL2-H通道=PE
阴性对照
1) 未标记细胞
2) 同种型对照-小鼠IgG 1 FITC+小鼠IgG 1 RPE 抗体
FITC-缀合的抗Hsp60 (同种型小鼠IgG 1)
RPE-缀合的抗CD235a (血型糖蛋白A)(同种型小鼠IgGl)
图7示出了三种不同的成人样品，并且图8示出了三种不同的胎儿样品，以及它们的这两种标记的表达百分数(门内的)。成人的双标记(即
具有显著水平的GPA和HSP-60)细胞表现出与阴性同种型对照样品类 似的模式。成人外周血中非红系单核细胞上有显著水平的HSP-60表达， 范围在5.12-26.72%。与阴性同种型对照样品相比，胎儿双标记细胞表现 出显著高水平的表达。这与循环的成红血细胞在胎儿血中的已知较高比 例一致。
图9中，携带GPA的细胞的表ii^溪式在FL2通道中分析，而携带 HSP-60的细胞的表达模式在FL1通道中表达。在图C和D的左上的四 分之一部分中可以见到成人成红血细胞。在图10中，携带GPA的细胞 的表达模式也在FL2通道中分析，而携带HSP-60的细胞的表达模式在 FL1通道中表达。在该图中，在图C和D的左上和右上的四分之一部分 中可以见到胎儿成红血细胞。大量胎儿成红血细胞(如通过它们表达GPA 来定义的)没有表达HSP-60 (参见，左上側的四分之一部分)。这与妊 娠过程中HSP-60在胎儿红系细胞上的强表达一致，但是表达水平在胎儿 脐带红系细胞膜上变小(图6)。
与脐带血相比，在妊娠过程中HSP-60在红系细胞上的表达非常强 (本文中通过流式细胞术分析)，这一发现表明双标记方法为一种从母体 血液中分离胎儿成红血细胞的手段。因此，使用采用血型糖蛋白A和 HSP-60作为配体的细胞分离方案(磁激活细胞分选MACS或流式激活 细胞分选FACS)使得可富集或纯化胎儿成红血细胞。然后，这些细胞可 以被用在下游诊断测定中，以进一步开发使用胎儿细胞作为胎儿材料来 源的非侵入性产前诊断。
红系细胞表面或胞质上的任何红系特异性的表面标记(糖抗原或红 系蛋白)(例如，Rh蛋白、Rh相关糖蛋白、血型糖蛋白B、 C或D; Kell 糖蛋白)均可以替代供选择的与HSP-60偶联的标记。
姿《y卓廢處必雜爿(^￡404 J弄卓麽真^雜5 ^￡405 j力應乂乙## 嫂雜
已经鉴别出编码酶MAOA和MAOB的基因在胎儿成红血细胞中上 调。然后，通过对成人骨髓和胎儿脐带cDNA的定量实时PCR分析确认 了所述酶是胎儿特异性的。
通过使用MAOA-和MAOB-特异引物，扩增来源自血型糖蛋白A+成红血细胞cDNA,并且使用SYBR绿色染料对其进行检测。图11中所 示的结果清楚地表明，MAOA和MAOB mRNA均在分离自胎儿脐带的 成红血细胞中表达，但不在成人来源的成红血细胞中表达。包括了阳性 对照(胎盘cDNA)，已知其会表达高水平的MAOA和MAOB。标准化 对照甘油醛-3-磷酸氢化酶(G3PDH)在三种样品中的表达均没有差异。
这些酶在胎儿细胞中的表达可以产生一种选择或富集胎儿细胞的方 法，所述方法与上文所述的针对胎儿细胞表面标记HSP-60的方法不同但 潜在一致。可以使用选择性培养，所述培养利用被胎儿细胞中的这些酶 以不同方式代谢的良好表征的底物，例如血清素、肾上腺素和去曱肾上 腺素。MAOA选择性地氧化血清素和肾上腺素；MAOB选择性地氧化苯 乙胺、苯曱胺和酪胺；两种单胺氧化酶均氧化多巴胺。或者，可以采用 荧光标记/探针以使得仅在胎儿细胞中产生的底物代谢产物可见。这些底 物将被胎儿细胞中的单胺氧化酶转化为荧光产物。这些探针最近已经在 文献中有所描述(Chen " (2005) J. Am. Chem. Soc. 127 4544-4545 )。 该技术将使得可以在分离胎儿细胞和母体细胞时采用基于FACS的方法， 籍此可以从母体成红血细胞中分离出表达单胺氧化酶并且产生荧光底物 的胎儿成红血细胞，达致同质。
与孝谬^^^^^^y^X勿^ *2錄^##标记^#身 图2中所示的三张凝胶图像的PDQuest分析在图12中示出。几种蛋 白被鉴别为在胎儿膜中的表达远高于在母体膜中的表达。除上文所讨论 的HSP誦60夕卜，其他的蛋白被鉴别为GRP78、 HSP-7C、 MYL4和EF1A1 (圏出的)。
^入和應X的经潜祟^^iz:j6勿龙^^糜蛋冷^浙 最早的造血祖细胞具有细胞表面标记CD34。该标记被用于分离干细 胞，并且通过与特定细胞因子混合物接触，所述细胞分化至红系谱系。
脐带血或成人外周血血沉棕黄层均被铺于Histopaque上。在离心之 后，所述样品已经分为上部的血浆层、含有有核细胞的界面层和下部的 红细胞层。移出所述界面层、清洗并且裂解任何剩余的红细胞。然后， 将样品用抗CD34的生物素化抗体以磁学方式进行标记，并JU吏用 MiniMACS系统(Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit, MiltenyiBiotec)在磁场中过柱。经标记的CD34+细胞被保留在所述磁柱中，而 未标记的细胞自由流过。然后将所述MiniMACS柱^^磁场中移出并且将 所述CD34+细胞洗脱过柱。将所述CD34+细胞在无血清培养基 (StemSpan， Stem Cell Technologies )中培养，所述培养基添加有红细胞 生成素(3U/ml)、干细胞因子(IO ng/ml)、 IL-3 (1 ng/ml )、低密度脂蛋 白(40 fig/ml)和FK506/Prograf ( 0.1 ng/ml )。将它们维持在1 x 105细 胞/ml的浓度，并且使它们通过红系途径从未定型干细胞分化至成红血细 胞阶段。
使用质膜蛋白试剂盒(QIAGEN),按照生产商的说明书，从lx107 的胎儿和成人的经培养的成红血细胞中分级分离质膜蛋白。然后通过 TCA沉淀浓缩被分离的蛋白并且进行2D凝胶电泳。图13示出了所得的 SyproRuby染色的凝胶的放大区域。
分离自胎儿和成人样品的蛋白的表达数量和水平之间的清楚差异是 显而易见的。质谱分析使得可以鉴别胎儿成红血细胞特异性蛋白粘着斑 蛋白(登记号P18206,圆圏A)和DnaJ同系物亚家族B成员14 (登记 号Q8TBM8,圆圏B )。已证明蛋白桥粒斑蛋白(登记号P15924,圆圈C ) 和AMMECRl-样蛋白(登记号Q6DCA0，圆圈D )在胎儿细胞中上调。 还鉴别出了胞外基质蛋白2前体蛋白(登记号094769,圆圈E),证明 其在成人细胞中上调。
炎^i/5P-60 #为标记灰##//7^^尹为SC^乂乙^iz:j&勿^ 胎儿细胞特异性标记(例如HSP-60)可以被用于从母体外周血中分 离胎儿成红血细胞，如下文举例概括列出的
1. 采集母体外周血样品(10-20 mL)。
2. 使用1^1(^39肌@或Ficolf密度分离培养基，实行密度离心/红细 胞裂解来将有核细胞从母体外周血样品中分离出来。或者，使用一步细 胞分离操作利用本发明的标记直接从外周血样品分离，不需要有核血细 胞富集操作。
3. 使用抗HSP-60包被的珠子实行胎儿成红血细胞的免疫亲和分离。 3a.任选地，^使用(例如)抗血型糖蛋白A的珠子对成红血细胞进
行预分离，然后使用抗HSP-60,以将成红血细胞(胎儿的和母体的)从 母体外周血样品中分离出来。3b.作为步骤3a的备选方案，在使用抗HSP-60后，可以利用例如 抗血型糖蛋白A的珠子将胎儿成红血细胞从在其细胞膜上表达HSP-60 的非成红血细胞中分离出来。
4. 洗脱胎儿成红血细胞。
5. 使用基于去污剂的一步方法，裂解该细胞，并且立即使用热循环方 案进行单细胞基因组DNA扩增，使用通用扩增方案对DNA进行预富集 或未进行预富集。
6. 使用该遗传物质进行例如遗传疾病标记的多重连接依赖性探针分 析(MLPA)、定量荧光PCR分析、PCR扩增操作、基因芯片、DNA序 列分析。
炎^AW04成'M^405 #为>^记双##//7^^ ^力、/C^乂乙^irj&勿^ 胎儿细胞特异性标记(例如MAOA或MAOB)可以被用于从母体 外周血中分离胎儿成红血细胞，如下文举例概括地列出的
1. 采集母体外周血样品(10-20 ml )。
2. 实行密度离心/红细胞裂解以分离有核细胞。
3. 任选地，可以实行使用(例如)抗-血型糖蛋白A磁林的成红血细 胞的预分离或富集。
4. 将成红血细胞与染料共同孵育，所述染料将会^L转运到细胞内部并 且在适当时可通过MAOA或MAOB的作用^皮转化为荧光产物。
5. 使用流式激活细胞分选仪(或其他分离细胞的工具)将胎儿成红血 细胞从成人成红血细胞中分选出来。
6. 使用基于去污剂的一步方法，裂解该细胞并且立即使用热循环方案 进行单细胞基因组DNA扩增。
7. 使用该遗传物质进行例如遗传疾病标记的MLPA分析、PCR扩增 操作、基因芯片、DNA序列分析。
权利要求
1. 一种从母体血液样品中分离胎儿细胞的方法，所述方法包括鉴别具有至少一种胎儿标记的表达模式不同于所述标记在等价母体细胞中的表达模式的细胞，并且筛选所鉴别的细胞，其特征在于所述至少一种胎儿标记的每一种均选自HSP-60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-1蛋白、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECR1-样蛋白、胞外基质蛋白2前体蛋白、非典型蛋白Cxorf57、过氧化物还原酶1、过氧化物还原酶2。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述方法包括鉴别在其细胞表面上 表达至少一种胎儿标记的细胞并且筛选那些细胞。
3. ^L据权利要求1或2的方法，其中所述方法包括筛选在其细胞表 面上表达一种胎儿标记的细胞。
4. 根据权利要求2或3的方法，还包括将所鉴别的细胞从未在其细 胞表面上表达所述胎儿标记的细胞中分离出来。
5. 才艮据权利要求2、 3或4的方法，其中所述胎儿标记为HSP-60。
6. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法包括鉴别表达至 少一种胎儿标记的细胞并且筛选那些细胞，其中所述至少一种胎儿标记 的每一种均选自单胺氧化酶。
7. 根据权利要求6的方法，还包括将所鉴别的细胞从未表达所述胎 儿标记的细胞中分离出来。
8. 根据权利要求2-7任一项的方法，还包括将所筛选的胎儿细胞从 具有所述至少一种胎儿标记的表达模式与所迷所筛选的胎儿标记细胞 相同的非等价母体细胞中分离出来。
9. 根据前述权利要求任一项的方法，其中鉴别了这样的细胞，即所 述细胞在其细胞表面上表达HSP-60以及量增加的至少一种其他胎儿标记，所述至少一种其他胎儿标记选 自单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1 蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家 族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、非典型 蛋白Cxorf57;或量减少的至少一种其他胎儿标记，所述至少一种其他胎儿标记选自胞外基质蛋白2前体蛋白、过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。
10. 根据前述权利要求任一项的方法，其中鉴别了这样的细胞，即 所述细胞表达单胺氧化酶以及量增加的至少一种其他胎儿标记，所述至少一种其他胎儿标记选 自谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、 粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、非典型蛋白Cxorf57; 或量减少的至少一种其他胎儿标记，所述至少一种其他胎儿标记选 自胞外基质蛋白2前体蛋白、过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。
11. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为单胺氧化酶。
12. 根据权利要求11的方法，其中所述单胺氧化酶为MAOA。
13. 根据权利要求11的方法，其中所述单胺氧化酶为MAOB。
14. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为谷氨酰胺合酶。
15. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标i己为Ara-70。
16. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为Ara-54。
17. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为FLJ20202。
18. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为DCN-1蛋白。
19. 根据权利要求1-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为RAB5A。
20. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为HSP-7C。
21. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为EF1A1。
22. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎儿标记为GRP78。
23. 根据权利要求1-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为MYL4。
24. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标"^己为DnaJ同系物亚家族B成员14。
25. 根据权利要求1-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为粘着斑蛋白。
26. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为桥粒斑蛋白。
27 根据权利要求1-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎儿 标记为AMMECRl-样蛋白。
28. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为胞外基质蛋白2前体蛋白。
29. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为非典型蛋白Cxorf57。
30. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为过氧化物还原酶1。
31. 根据权利要求l-10任一项的方法，其中所述胎儿标记或其他胎 儿标记为过氧化物还原酶2。
32. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述母体血液的形式为 分离的样品。
33. 根据权利要求l-32任一项的方法，其中所述母体血液适合于被 输回到受试者体内，所述母体血液获取自所述受试者。
34. —种从母体血液中分离胎儿细胞的方法，所述方法包括鉴别具 有至少一种胎儿标记的表达模式不同于所述标记在等价母体细胞中的 表达模式的细胞，并且筛选所鉴别的细胞，其特征在于所述胎儿标记选 自HSP-60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP國7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同 系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、 胞外基质蛋白2前体蛋白、非典型蛋白Cxorf57、过氧化物还原酶1、 过氧化物还原酶2。
35. —种培养胎儿细胞的方法，所述方法包括富集具有至少一种胎儿标记的表达模式不同于所述标记在等价母体细胞中的表达模式的细胞，所述胎儿标记选自HSP-60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、 AMMECRl-样蛋白、胞外基质蛋白2前体蛋白、非典型蛋白Cxorf57、 过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。
36. 根据权利要求35的方法，其中所述胎儿细胞是使用一种包括根 据权利要求l-34任一项的方法的方法分离的。
37. —种细胞样品，所述细胞样品包含可通过一种包括根据权利要 求l-34任一项的方法的方法获得的分离细胞。
38. —种细胞样品，所述细胞样品包含通过一种包括根据权利要求 l-34任一项的方法的方法获得的分离细胞。
39. 根据权利要求37或38的细胞样品，包含通过权利要求35或 36的方法培养的细胞。
40. 根据权利要求1-36任一项的方法或根据权利要求37-39任一项 的细胞样品，其中所述细胞为成红血细胞。
41. 一种胎儿细胞分离试剂盒，包括用于检测一种细胞所具有的至 少一种胎儿标记的表达模式是否不同于所述标记在等价母体细胞中的 表达模式的工具，以及用于将具有所述至少一种胎儿标记的不同表达模 式的细胞从不具有所述至少一种胎儿标记的不同表达模式的细胞中分 离出来的工具，其特征在于所述胎儿标记选自HSP-60、单胺氧化酶、 谷氨酰胺合酶、Ara國70、 Ara画54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、 粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、胞外基质蛋白2前体 蛋白、非典型蛋白Cxorf57、过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。
42. —种产前疾病诊断的方法，所述方法包括利用根据权利要求 l-34任一项的方法获得分离的胎儿细胞的步骤。
43. 根据权利要求42的方法，还包括确定所述分离的胎儿细胞是否 含有疾病标识的步骤。
44. 用于根据权利要求l-34任一项的方法的装置，所述装置包括用 于检测 一种细胞所具有的至少 一种胎儿标记的表达模式是否不同于在 等价母体细胞中的表达模式的工具，以及用于将具有所述至少一种胎儿标记的不同表达模式的细胞从不具有所述至少一种胎儿标记的不同表达模式的细胞中分离出来的工具，其特征在于所述胎儿标记选自 HSP曙60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara画70、 Ara-54、 FLJ20202、 DCN-1蛋白、RAB5A、 HSP-7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同 系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECRl-样蛋白、 胞外基质蛋白2前体蛋白、非典型蛋白Cxorf57、过氧化物还原酶1、 过氧化物还原酶2。
45. —种确定细胞为胎儿细胞的方法，所述方法包括在所述细胞中 检测至少一种胎儿标记，所述胎儿标记具有与在等价母体细胞中的表达 模式不同的表达模式，其特征在于所述胎儿标记选自HSP-60、单胺氧 化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、 Ara-54、人假定蛋MGC10526或 MGC10233、 FLJ20202、 DCN國1蛋白、RAB5A、 HSP國7C、 EF1A1、 GRP78、 MYL4、 DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑 蛋白、AMMECRl-样蛋白、胞外基质蛋白2前体蛋白、非典型蛋白 Cxorf57、过氧化物还原酶l、过氧化物还原酶2。
全文摘要
本发明提供了一种从分离的母体血液样品中分离胎儿细胞的方法，所述方法包括鉴别具有至少一种胎儿标记的表达模式不同于所述标记在等价母体细胞中的表达模式的细胞，并且筛选所鉴别的细胞，其特征在于所述胎儿标记选自HSP-60、单胺氧化酶、谷氨酰胺合酶、Ara-70、Ara-54、FLJ20202、DCN-I蛋白、RAB5A、HSP-7C、EF1A1、GRP78、MYL4、DnaJ同系物亚家族B成员14、粘着斑蛋白、桥粒斑蛋白、AMMECR1-样蛋白、胞外基质蛋白2前体蛋白、非典型蛋白Cxorf57、过氧化物还原酶1、过氧化物还原酶2。本发明还提供了一种培养胎儿细胞的方法和胎儿细胞分离试剂盒。
文档编号G01N33/50GK101523211SQ200780036868
公开日2009年9月2日 申请日期2007年8月10日 优先权日2006年8月11日
发明者D·J·黑德, N·D·埃文特, Z·E·普卢默 申请人:英国西英格兰大学，布里斯托尔