专利名称：Vm23和Vm24，两种以高选择性阻断人类T淋巴细胞钾通道(Kv1.3亚型)并降低大鼠的体内 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及从墨西哥蝎子V. mexica皿s的毒液中分离的新型肽Vm23、 Vm24及其 功能等同类似物的鉴定和用途，所述新型肽Vm23、 Vm24及其功能等同类似物能够通过阻断 特异性离子电导而以高亲和性和特异性抑制人类淋巴细胞hKvl. 3通道的功能。在本发明 的其它具体实施方式
中，本发明人公开了包含Vm23、 Vm24及其功能等同类似物的药物组合 物，其用于阻断Kvl. 3钾通道的方法，治疗各种免疫病症的的方法和诊断性应用，以及其化 学合成和正确的折叠方法。这些肽通过常规高效液相色谱分离，根据Edman降解和质谱确 定其初级氨基酸序列，在SEQID NO:l和SEQ ID NO :2中显示了其一级结构。Vm24含有36 个氨基酸，分子量为3863. 5道尔顿。它是由四个二硫桥维持的紧凑的分子，根据质谱证明 二硫桥存在于位置C6和C26之间、C12和C31之间、C16和C33之间以及C21和C36之间的 半胱氨酸对之间，其中字母C代表半胱氨酸残基的縮写，数目对应于其在氨基酸序列中的 相对位置。肽羧基末端的氨基酸是酰胺化的。全长肽是使用Merrifield的固相方法进行 化学合成，并通过化学和功能学分析获得并确认合成肽的正确的折叠。当以相对高的浓度 (测试了达到200微克/20克体重的小鼠，即10， 000微克/千克小鼠体重)注射时Vm24对 小鼠没有毒性。当在体外向人类淋巴细胞施用时，其表现出对hKvl. 3通道的非常高的亲和 性(通过膜片钳技术测定)。其几乎以不可逆的方式与这些通道结合，显示出较低皮摩尔 范围(小于3皮摩尔-3pM)的Kd值。其不改变以下离子通道的钾电流hKvl. 4、 hKvl. 5、 rKv2. 1、 hBK和hERG-通道，当以10纳摩尔(10nM)的浓度检测时，其不改变电压门控的心 脏Na+通道(hNavl. 5)的电流。在10nM浓度时对通道hIKCal、 mKvl. 1和hKvl. 2的电流抑 制是大约20至50X，这与对hKv1. 3通道的100%阻断相反。在低至3pM的浓度，毒素阻断 超过50X的hKv1. 3的电流，因此相对于所测试的其它任何通道，在此通道大约更有效1500 倍。 以Vm24进行的致死性研究在使用达到200微克/20克小鼠体重时没有引起可观 测到的中毒症状。用于迟发型超敏反应(DTH)的大鼠模型的Vm24保护了实验动物。以二 硝基氟苯(DNFB)进行实验大鼠的皮肤致敏引起了相当大的免疫应答(耳朵的发红和总的 发炎)。在开始处理6天后接受单一的10微克Vm24注射的大鼠组表现出相当大的免疫应 答的减轻；与只接受溶剂处理的对照大鼠相比，治疗耳朵的炎症显著减少(至少少60%炎 症)。 还从相同的毒液中分离了一种相关的肽，命名为Vm23，其被完全测序，显示于SEQ ID NO :2。此肽与Vm24为83%同一，具有35个氨基酸残基，由四个二硫桥包装而成，显示 出3665道尔顿的分子量。Vm23显示出与Vm24同样的功能对hKvl. 3通道的高亲和性和 特异性。在10nM的浓度时对通道hKvl. 3、hlKCal、mKv1. 1和hKvl. 2的电流的阻断大约分 别为95%、1%、3%和9%。
利用超过125中其它已知对钾通道特异性的蝎子肽[Bagdany等人，2005]对这两 种肽进行的系统发生学分析表明Vm23和Vm24不属于已经描述的蝎子毒素结构的20个亚 家族中的任何一个。它们是一个新的结构亚家族的头两个例子，新的结构亚家族在这里被 建议命名为a-KTx 21。因此Vm24和Vm23应该分别被命名为a-KTx 21. l和a-KTx 21.2。 根据设立现今使用的系统命名法的国际科学家委员会(参见[Tytgat等人，1999])，用于定 义对钾通道特异性的蝎子毒素的新的亚家族的标准为，一级结构需要与其它的毒素具有至 少50%的差异。事实上，V23和Vm24均显示出相对于其它已知的毒素少于大约50X的序 列相似性。 基于本领域的现有知识，这些特征使Vm23、 Vm24及其功能等同类似物成为完美的 免疫抑制和诊断及治疗免疫性疾病的候选物。
本公开中所包括的附图形成本说明书的一部分，在这里进一步说明本发明的一些
方面。可通过结合这些附图中的一个或两个以及本文描述的特定具体实施方式
的详细描述
特别是下面的实施例部分而更好的理解本发明的全部。 图1 :通过HPLC从蝎子V. mexica皿s中分离lmg的可溶性毒液 通过将可溶性毒液加入以溶液A(O. 10% TFA中的水)平衡的C18反相柱(来自
Vydac， Hisperia， CA ;目录号218TP54)，使用从0%至60%的梯度的溶液B (0. 12% TFA中
的乙腈)超过60分钟，分别获得了80种以上的不同成分。在保留时间23和24分钟时的
数字1和2分别指明了 Vm23和Vm24的洗脱位置。在相同的系统中对这两种色谱部分中的
每一个进行附加的分离，但是使用从溶液A至40%溶液B的线性梯度，两种肽均为60分钟。
结果作为图的插入图显示。插入图中的星号指示高度纯化肽的洗脱位置。 图2 :Vm23、 Vm24的氨基酸序列及其共有序列 通过对天然肽和还原的和烷基化的样品进行直接Edman降解并结合通过特异性 酶(内切蛋白酶Arg-C和Lys-C)对纯肽进行酶切得到的肽的质谱分析得到的Vm23和Vm24 的序列，如在对应序列下所标示。通过质谱分析(MS/MS，意思是通过电喷雾离子化质谱的片 段化)鉴定进行酶水解和HPLC分离后的纯化的肽的氨基酸序列。在每个序列下面标示了 通过所使用的各种方法鉴定的片段。Direct的意思是Edman降解；Arg-C和Lys-C是酶消 化后纯化的片段。单独的MS表示基于缺失的氨基酸而确定的分子质量。共有序列含有与 Vm23或Vm24的氨基酸残基相同的30个氨基酸残基。标记为"x"的位置可以是x、任何氨 基酸，只要其不破坏蛋白的三维折叠，或甚至更好为K或P ;x2，任何氨基酸，只要其不破坏 蛋白的三维折叠，或甚至更好为L或P ;x3，任何氨基酸，只要其不破坏蛋白的三维折叠，或
甚至更好为K或R ;X4，任何氨基酸，只要其不破坏蛋白的三维折叠，或甚至更好为S或N ;X5，
任何氨基酸，只要其不破坏蛋白的三维折叠，或甚至更好为K或R，和；x6，任何氨基酸，只要 其不破坏蛋白的三维折叠，或甚至更好为Y或不存在。
图3 :Vm24具有酰胺化的C末端 在m/z 909. 4a. m. u.(单一同位素分子量)进行的C末端[M+H]+离子的碰撞引起 的解离(CID)显示出比预期的[M+H] +理论值910. 5a.m. u.小1个单位。对应于酰胺化C末 端序列的y离子系列(斜体)显示于插入的标记1)。自由羧基末端肽(TV-COOH)的理论y离子系列值、酰胺化C末端(TV-NH2)的理论y离子系列值和实验y离子系列值(EXP.)在
插入的表格中进行比较(插入标记2)。 图4 :Vm24异二聚体的二硫化合物分配 数字1和2显示了在p朋.5使用胰蛋白酶和糜蛋白酶对Vm24进行同时的溶蛋白 性裂解而产生的异二聚体的分子质量和示例结构。在m/z 788.0a.m.u.的[M+H] +离子对应 于含有胱氨酸半对C4-C8 (数字1)的异二聚体的分子质量；在m/z 560. 4a. m. u.的[M+H] + 离子对应于含有胱氨酸半对C3-C7 (数字2)的异二聚体的分子质量。
图5 :Vm24胱氨酸半对 A)对应于含有胱氨酸半对Cl-C4和C2-C6的复杂核心的结构的质谱，具有在m/z 1099. 7a.m. u.的[M+2Hr离子。其被片段化以产生图4B所示的MS/MS图谱。从1137至 1507a. m. u.的b离子系列值明确地代表标签GSPE，确认了最后两个胱氨酸半对的分配。B) 显示了 Vm24的全部二硫桥排列，按照本图A部分所描述的质谱分析确定。
图6 :合成的Vm24的HPLC纯化在C18反相制备柱上分离合成制备的Vm24(50毫克蛋白)。数字1指明合成正确
折叠的Vm24的洗脱位置，而2和3指明不正确折叠或截尾的序列。在相同的系统中进行了
这种色谱组分的另外的分离，但是使用从溶液A至40X溶液B的线性梯度进行的分析柱，在
60分钟内。结果作为图的插入图显示。 图7 :合成和天然Vm24肽的HPLC比较 A)将10微克的天然Vm24加入在图1所描述的HPLC系统中的分析C18柱子(来 自Vydac，Hisperia，CA;目录号218TP54)，显示当以线性梯度(溶液A至40X溶液B)在 60分钟内进行时，纯的肽在32. 67分钟洗脱。B)在相同的系统和条件下15微克的合成制 备的和折叠的Vm24的色谱图。C)共注射合成和天然Vm24的1 : 1混合物(共8微克)显 示它们在相同的保留时间共洗脱。值得提及的是为了字母B和C，图的X轴向右移动，以 便使三个图可以进行对比性观察，但却是分开的，不然的话三个独立HPLC运行的洗脱时间 将落入相同的峰，从而变得不可分辨。
图8 :Vm23和Vm24的序列和系统发生分析 A) Vm24和Vm23与其最接近的a -KTxs的多重序列比对。使用CLUSTAL_ X [Thompson等人，1997]软件进行比对，以BioEdit计算与Vm24的序列同一性(％ I，最后一 栏)。B)以MrBayes 3. 0b4[Huelsenbeck and Ronquist， 2001 ;Ronquist andHuelsenbeck， 2003]计算简化的系统发生树。Vm23和Vm24聚集在一起，与亚家族a -KTx 6的成员具有 实质区别。 图9 :Vm24对淋巴细胞离子通道的选择性阻断 A)从人类T细胞对去极化脉冲至+50mV (来自每15秒_120mV的保持电位)的反 应激发通过hKvl. 3通道的全细胞钾电流。当通过灌注细胞外介质向细胞施用InM的Vm24 时，几乎完全阻断了 Vm24(对照，箭头标示)缺乏时的电流。箭头标示Vm24中的第一次脉 冲。B)显示了使用lnM(实心圈)或0. 3nM(空心圈)的Vm24之后标准化的电流峰值作为 时间的函数。箭头标示开始施用毒素。C)显示当3pM Vm24被施用到细胞然后从细胞外介 质除去(洗掉)时淋巴细胞的标准化电流峰值作为时间的函数。以不含毒素的介质灌注引 起从阻断的非常慢的部分恢复，时间常数为 3800秒。脉冲以每30秒传送。D)通过将剩余的电流部分(RCF = 1/1。)相对于毒素浓度作图而获得Vm24的剂量依赖性关系，其中I和 10分别为在毒素存在和不存在时测定的电流峰值，将数据点带入函数RCF二Kd7(Kdn+[Tx] ，，其中[Tx]指明毒素的浓度，Kd是解离常数。误差条表示SEM(n二3-6)。按照这种方式 建立的剂量反应函数产生Kd = 2.9pM和Hil1系数n 1。 E)Ca2+激活的T淋巴细胞的钾 通道(hIKCal)在Cos-7细胞中表达，通过-120至+50mV的电压起伏(来自每10秒-120mV 的保持电位)引起电流。显示了在施用毒素前(对照)、以10nM的Vm24阻断平衡4. 5分钟 后和洗掉(洗涤)毒素2. 5分钟后所记录的电流痕迹。F)在lnM和10nM的Vm24存在时 hIKCal电流的剩余部分用于计算s/s。，其中s和s。分别是Vm24存在和不存在时由电压起 伏所激发的I-V关系的斜率。误差条表明SEM(n = 3)。
图10 :Vm24在Shaker家族(Kvl. x)通道中对hKvl. 3是选择性的 [OO59] 显示了在施用毒素前(对照)、以10nM的Vm24阻断平衡后和洗掉(洗涤)毒素 后所记录的电流痕迹。A)mKvl. l通道在L929细胞中表达，升至+50mV的电压(来自每30 秒-120mV的保持电位)激发电流。平衡阻断进行6分钟，洗掉期持续的时间为5分钟。B) hKvl. 2通道在Cos-7细胞中表达，升至+50mV的电压(来自每30秒_120mV的保持电位) 激发电流。平衡阻断进行5.5分钟，洗掉期持续的时间为7分钟。C)hKvl.3通道在外周血 淋巴细胞中内源表达，升至+50mV的电压(来自每15秒-120mV的保持电位)激发电流。 平衡阻断进行3. 5分钟，洗掉期持续的时间为4. 5分钟。D)快速失活除去的hKvl. 4通道 (Kvl.4AN)在Cos-7细胞中表达，升至+50mV的电压(来自每30秒_120mV的保持电位) 激发电流。施用Vm24和洗掉期持续的时间分别为5分钟和4. 5分钟。E)hKvl. 5通道在MEL 细胞中表达，升至+50mV的电压(来自每15秒-120mV的保持电位)激发电流。施用Vm24 和洗掉期持续的时间分别为6分钟和3. 5分钟。
图11 :Vm24不阻断或抑制众多生物学上重要的离子通道显示了在施用毒素前(对照)、以10nM的Vm24阻断平衡后和洗掉(洗涤)毒素 后所记录的电流痕迹。A)rKv2. l通道在Cos-7细胞中表达，升至+50mV的电压(来自每30 秒-120mV的保持电位)激发电流。施用Vm24和洗掉期持续的时间分别为7分钟和3分 钟。B) hERG通道在HEK细胞中表达，升至+20mV的电压然后降至_40mV的电压激发电流，其 中测定电流峰值。保持电位是-80mV，脉冲以每30秒传送。施用Vm24和洗掉期持续的时 间分别为5分钟和2. 5分钟。C)hBK(KCal. 1)通道在tsA-201细胞中表达，以10-ms超极化 至-120mV然后升至+50mV的电压(来自OmV的保持电位)激发电流。脉冲以每5秒传送。 施用Vm24和洗掉期持续的时间分别为4分钟和1分钟。D)Navl. 5通道在Cos_7细胞中表 达，升至OmV的电压(来自每15秒-120mV的保持电位)激发电流。施用Vm24和洗掉期持 续的时间分别为1分钟和再1分钟。
图12 :Vm24的选择性图谱 条形图指明了以lnM(A)或10nM(B)的浓度施用Vm24对所标示的通道的平衡阻断 的剩余电流分数。数据以平均值士SEM表示，n > 3独立实验。对于表达系统和RCF的计 算以及其它条件，参见图9-11的详细说明。
图13 :合成的Vm24的对hKvl. 3通道的高亲和性阻断 A)从人类T细胞对去极化脉冲至+50mV (来自每30秒_120mV的保持电位)的反 应激发通过hKvl.3通道的全细胞钾电流。当通过灌注细胞外介质向细胞施用100pM的合成Vm24(sVm24)时，实质上阻断了 ( > 90% )不存在肽(对照，箭头标示)时所记录的电 流。箭头标示sVm24中的第一次脉冲。B)显示了施用lOOpM的sVm24之后标准化的电流峰 值作为时间的函数。箭头标示开始施用毒素。当以不含sVm24的溶液灌注细胞时没有达到 从阻断的显著性恢复(箭头标示开始洗掉的时期)。C)条形图显示以100pM浓度的sVm24 和Vm24平衡阻断hKvl. 3的剩余电流分数。数据以平均值士SEM表示，n > 3独立实验。对 于表达系统和RCF的计算以及其它条件，参见图9-11的详细说明。
图14 :Vm23对hKvl. 3是选择性的 显示了在施用毒素前(对照)、以10nM的Vm23阻断平衡后和洗掉(洗涤)毒素 后所记录的电流痕迹。选择被10nM浓度的Vm24显著性阻断的离子通道用于Vm23的药理 学图谱。A)hKvl.3通道内源性的在外周血淋巴细胞中表达，升至+50mV的电压(来自每15 秒-120mV的保持电位)激发电流。平衡阻断进行3. 5分钟，洗掉期持续的时间为2分钟。 B)Ca"激活的T淋巴细胞的钾通道(hIKCal)在Cos_7细胞中表达，通过-120至+50mV的 电压起伏(来自每15秒_120mV的保持电位)激发电流。施用Vm23和洗掉期持续的时间 分别为3. 5分钟和2分钟。C)mKvl. 1通道在L929细胞中表达，升至+50mV的电压(来自 每15秒-120mV的保持电位)激发电流。施用Vm23和洗掉持续的时间分别为3. 5分钟和 l分钟。D)hKvl.2通道在Cos-7细胞中表达，升至+50mV的电压(来自每15秒_120mV的 保持电位)激发电流。平衡阻断进行3. 5分钟，洗掉期持续的时间为2分钟。
图15 :Vm23的选择性图谱 条形图指明了以10nM的浓度施用Vm23对所标示的通道的平衡阻断的剩余电流分 数。数据以平均值士SEM表示，n > 3独立实验。对于表达系统和RCF的计算以及其它条 件，参见图9和14的详细说明。
图16 :大鼠中的迟发型超敏反应(DTH) 通过施用DNFB将每组3只大鼠共两组中每只致敏并剌激。 一组只接受PBS注射 (对照，数字l)，另一组接受10微克Vm24的单一注射(组2)。在这个处理后24小时测定 耳朵。对照组条形图显示以DNFB剌激后对照组大鼠的耳朵的厚度，而对应于处理组(组2) 的条形图显示以Vm24处理的大鼠的耳朵的厚度。与对照组大鼠相比，在接受Vm24的大鼠 中观察到大约60%的炎症消逝。
具体实施方式
定义 除非另有指明，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通 技术人员通常所理解的意思。除非另有指明，本文所用的下列术语具有归于它们的意思。虽 然与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明，但是 描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下定义了下列术语。 在本发明中，术语"肽"、"多肽"和"蛋白质"不加区分地使用，其是指本发明的肽 分子。 术语"Kvl. 3钾通道阻断活性"通常是指由Kvl. 3钾通道抑制剂所引起的流过所述 Kvl. 3通道的钟离子流的抑制程度的实际评估。 术语"Kvl. 3钾通道阻断剂"通常是指这样的物质其通过直接阻碍离子导电途径而抑制流过含有所述通道的细胞膜的Kvl. 3通道的钾离子流。 术语"类似物"通常是指与SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所列的36
个比对位置具有至少83%的配对序列同一性的任何多肽链(36个位置有30个匹配)。其 可以包括但不限于，达到6个氨基酸的改变， 一个或多个非天然氨基酸残基， 一个或多个残 基的化学衍生，通过其它氨基酸残基或其它有机半体对N-末端和/或C-末端的延伸。
术语"配对序列同一性百分率"通常是指当比对两个蛋白序列时，在两个比对序 列的全部位置上面具有相同氨基酸的氨基酸残基位置间的系数。 术语"功能等同"通常是指显示出与SEQ ID NO:l或SEQ ID NO :2相似的对于 Kvl. 3的亲和性和选择性的任何分子结构，只要其具有赋予这些序列对Kvl. 3通道的高亲 和性和选择性的相同的亲和性和/或特异性结构决定簇。其可以是类似物或拟肽。
术语"亲和性和/或特异性结构决定簇"通常是指多肽结构中那些赋予SEQ IDNO : 1和SEQ ID NO :2对于hKv1. 3通道的高亲和性和选择性的所有的官能团及其三维位置。这 些亲和性和特异性结构决定簇可以与相同的、部分重叠的或不同的氨基酸残基相关。
术语"官能团"通常是指SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3内的给定的 化学半体，不管是主要多肽链中的或其氨基酸残基侧链中的，这些半体与hKvl. 3通道特异 性并强烈作用，从而确定SEQ ID NO :1， SEQ IDNO :2对于hKvl. 3通道的亲和性和选择性。
术语"功能等同类似物"通常是指与SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2和SEQ IDNO :3的 36个比对位置具有至少83%的配对序列同一性的任何多肽链(36个位置有30个匹配)。 其可以包括但不限于，一个或多个非天然氨基酸残基，一个或多个残基的化学衍生，通过其 它氨基酸残基或其它有机半体对N-末端和/或C-末端的延伸，其显示出与SEQ ID NO :1 或SEQ ID NO :2相似的对于hKvl. 3的亲和性和选择性。 术语"拟肽"通常是指在与SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的相似三 维位置显示出相同官能团的任何化合物，从而模拟SEQ ID N0:1、SEQ IDNO :2与hKvl. 3通 道的特异性接触。 术语"本发明的肽"通常是指具有SEQ ID N0:3的肽，其具有由四个二硫桥保持 的三级结构，所述四个二硫桥位于位置C6和C26、 C12和C31、 C16和C33、和C21和C36之 间的半胱氨酸对之间，其中字母C代表半胱氨酸残基的縮写，数目对应于其相对于比对的 氨基酸序列的相对位置。示例性优选肽是那些具有SEQID N0:1的序列(Vm23)和SEQ ID N0:2的序列(Vm24)肽。所述肽能够以高亲和性和特异性阻断钾通道Kvl. 3。包括SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2或SEQ IDNO :3的功能等同类似物，即与SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2禾口 SEQ ID NO :3的36个比对位置具有至少83%的配对序列同一性(36个位置有30个匹配)， 它们通过四个二硫桥保持三级结构且显示出与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2相似的对于 hKvl.3的亲和性和选择性。 术语"药学上可接受的载体"包括任何标准的药学载体、缓冲剂和赋形剂，包括磷 酸盐缓冲液、水和乳剂(例如油/水或水/油乳剂)，和各种类型的润湿剂和/或佐剂。在 REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Publishing Co. ， Eaton，19th ed. 1995) 中描述了合适的药学载体及其制剂。优选的药学载体取决于想要的活性物质的施用途径。 下面描述了典型的施用途径。 术语"药学上可接受的盐"非毒性酸加成盐，包括与无机酸例如盐酸、氢溴酸、磷
13酸、硫酸和高氯酸形成的盐，以及与有机酸例如乙酸、草酸、马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬
酸、琥珀酸或丙二酸形成的盐。其它的药学上可接受的盐包括无机硝酸盐、硫酸盐、乙酸盐、
苹果酸盐、甲酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、拧檬酸盐、对甲苯磺酸盐等，包括但不限
于，基于碱金属和碱土金属例如钠、锂、钾、钙、镁等的阳离子，以及非毒性铵、季铵和胺阳离
子，包括但不限于，铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。 术语"药物组合物"是指适合用于个体的药学用途的组合物，所述个体包括哺乳动
物个体或人类个体。药物组合物通常包含有效量的活性物质和药学上可接受的载体。 术语"有效量"是指特定活性物质(在本案中是指具有Kvl. 3钾通道阻断活性的
肽)的剂量，该剂量足以产生所需要的效果，例如抑制哺乳动物免疫应答、治疗有需要的个
体的自身免疫性疾病、抑制哺乳动物的免疫系统的T细胞激活过程、减弱T淋巴细胞中的钙
信号途径。需要的效果可能包含接受剂量的个体(包括细胞)的主观或客观改善。 术语"个体"是指哺乳动物，包括人。接受治疗的非人哺乳动物包括例如母牛、绵
羊、猪、马、狗和猫。 术语"自身免疫性疾病"通常是指由影响所述生物的稳态的生物的免疫细胞所驱 动的病理状况。 术语"与淋巴细胞TEM相关的自身免疫性疾病"是指任何这样的自身免疫性疾病， 其中攻击生物的细胞为淋巴细胞TEM细胞。这样的疾病包括但不限于，多发性硬化症、类风 湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性牛皮癣、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、交感性眼炎和骨吸 收牙周病。"预防性治疗"是指向不表现疾病的征兆或仅表现疾病的早期征兆的个体施以的 治疗，其中治疗是为了减轻发展病理性状况(特别是自身免疫性疾病，更特别是与淋巴细 胞TEM相关的自身免疫性疾病)的风险的目的。"治疗性治疗"是指向表现出病理学征兆的个体施以的治疗，其中治疗是为了消除 或消灭那些病理学征兆(特别是自身免疫性疾病，更特别是与淋巴细胞lM相关的自身免疫 性疾病)的目的。 术语"器官"是指身体系统例如心、肝、肺、肾、脑、肾上腺、血管_内皮系统、免疫系统等。 术语"分子探针"通常是指可特异性用于鉴定靶细胞、细胞结构、受体或任何分子 的任何化学或生物学物质，探针可以以高亲和性和特异性结合至所述靶细胞、细胞结构、受 体或任何分子。 术语"非必需氨基酸"通常是指SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3内可 以被其它任何氨基酸改变(而不改变所得的类似物对Kvl.3通道的亲和性或特异性)的任
何氨基酸。 主要发现 本发明的主要主题是两种新型肽(Vm23和Vm24)，其氨基酸序列(SEQ IDN0 :1和 SEQ ID N0:2)，以及可能的功能等同类似物，以及它们用作特异性免疫抑制剂的潜在用途。 Vm23和Vm24是亚型Kv1. 3特别是人类淋巴细胞(hKvl. 3)的钾离子通道的高度选择性阻断 剂，其被显示在体内在降低大鼠中对迟发型超敏反应的炎症应答，因此这两种肽及其功能 等同类似物是用于治疗一些与非正常T细胞反应相关的免疫性疾病的先导化合物。在进入
14这些免疫抑制剂及其对hKvl. 3通道的效应的细节之前，回顾一些该领域的基础知识是重 要的。 对所有细胞的膜电位的调节是通过对钾离子可通透的离子通道(简称钾通道)的 存在而维持的。个体细胞可以表达几种不同的钾通道，这些钾通道可以因电压、细胞内牵丐 水平或特异性配体的变化而开启或关闭，虽然电压门控的通道是最普遍的[Gutman等人， 2005]。调节钾通道功能的天然配体是来自蜜蜂、蝎子、蛇和海葵的毒液的毒素[Castle等 人，1989 ;Jouirou等人，2004 ;Rodriguez de la Vega andPossani， 2004]。这样的毒素 的例子有来自蝎子中美毒蝎(Centruroides noxius)的诺克休斯毒素[Carbone等人， 1982]、来自蝎子以色列杀人蝎(Lei訓squi卿estriatus)的北非蝎毒素[Miller等人， 1985]、来自蝎子A皿rocto皿sphayodactilu的A皿roctoxin[Bagd6ny等人，2005]、来自海 葵B皿dosoma gra皿lifera的BgK[Aneiros等人，1993]禾口来自Stichodactyla helianthus 的ShK[Castaneda等人，1995]。已经表明这些毒素以不同的亲和性和特异性阻断众多不同 类型和亚型的K+通道，包括Kvl. 3 [见综述Panyi等人，2006] 。 Kvl. 3通道被暗示参与T淋 巴细胞增殖和淋巴因子的产生，Kvl. 3的阻断剂是人们感兴趣的潜在的免疫抑制剂[Panyi 等人，2006]。 这些钾通道特异性毒素中有几个已经被确定了三维结构[见综述Mouhat等人， 2004]。由于一些电压依赖性钾通道(其含有六个跨膜部分)的解决方案[Lee等人，2005 : Long等人，2005]和几个小组以双突变(毒素和通道)进行的实验[Goldstein等人，1994 ; Stampe等人，1994 ;Aiyar等人，1995 ;Hidalgo and Mackinnon， 1995]，鉴定了这些配体中 的几个与钾通道的接触表面。就目前已知的蝎子毒素，研究了 125种以上的不同的肽，报道 了其氨基酸序列[Rodriguez de la Vega and Possani， 2004]。这些肽被分成20个不同的 亚家族，这主要是基于三个标准初级序列相似性、二硫桥的位置和功能的特异性。为了本 发明的目的，分离、纯化、测序并检测了两个肽(Vm23和Vm24)。所获得重要的原创性和专有 性信息是它们的初级结构和高度特异性功能的独特性，这不是通过简单观察其结构特征而 证明的，而是需要体外和体内的功能实验证据，如本发明所要求保护的那些。
本工作开始于在田野中收集蝎子品种墨西哥蝎子(V. mexicanus)并通过电剌激 而提取其毒液。蝎子在墨西哥的Morelos州收集。作者持有此目的的官方许可(由墨西哥 政府的Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales于2005年3月18日颁发， 文件号为SGPA/DGVS/02483)。通常在以二氧化碳(C02)麻醉以后从30只蝎子中挤出。粗
提的毒液被立即处理或冻存于-2(rc直至使用。 然后通过HPLC分离可溶性毒液。然后使用小鼠作为体内模型动物进行纯化的肽 (本发明的目标)的可能的毒性效应的测试(致死性测试)，并通过Edman降解和质谱分析 确定其一级结构。这些实验的细节在以下实施例1中描述。 由于这些肽在毒液中的数量相对较少，为了进一步鉴定其对hKvl.3通道作用的 功能性和特异性，通过化学合成了丰富数量的Vm24 。
Vm24的化学合成 通过固相方法合成肽包括使用固相树脂，包括但不限于聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、一 些纤维或其它稳定的聚合物。固相树脂的衍生可使用合适的处理例如氯三苯甲基氯、2_氯 三苯甲基氯、hydroxymethylphenil、 Sasrin功能性的产生C末端酸，或可以使用树脂连接子(例如但不限于4- (2' ， 4'- 二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基甲基基团)通过蛋 白水解稳定化而制备。 链的组装通常包括任何保护性基团的策略，其中氨基保护基团为叔丁氧羰基 (Boc)或9-氟芴基甲氧羰(fmoc)。用于合成肽的各种氨基酸的活性侧链通常被保护 起来。普遍使用的保护性基团包括叔丁基、节基、三苯甲基、甲基三苯甲基、节基_甲基 苄基、甲苯磺酰基、苄氧基甲基、叔丁氧羰基、2_氯苄基、2_溴苄基、甲氧基苄基、甲酸基、 acetomidomethyl、五甲基苯并二氢吡喃磺酰、五甲基苯并二氢吡喃磺酰、侧链胺的硝基、 胍、苯酚、醇、酸、咪唑、硫醇和吲哚。可以发明完成同样的目标即消除初级链组装过程中不 想要的侧链反应的其它的保护性基团。 向正在生成中的肽添加新氨基酸的过程中的酰胺键的合成可通过使用任何酸激 活的方法完成，所述酸激活方法包括但不限于，对称酐(碳二亚胺)；H0BT酯；酰基氟化物；
脲阳离子激活剂，例如但不限于TBTU、 HATU或HBTU ;膦激活剂，例如但不限于BP、 PyB0P、 PyBr0P。这些均是激活羧基基团的方法，肽合成领域的技术人员应该知道。
包括序列SEQ ID NO :l(Vm23)、SEQ ID N0:2(Vm24)或SEQ ID NO :3 (Vm23禾P Vm24 共有序列)中非天然氨基酸取代的类似物结构的合成也可能对于本发明的一些具体实施 方式是有用的。收敛法(其中肽片段以最终产物为Vm23、Vm24或其类似物的方式进行组装) 的使用也是广为人知的，可由本领域技术人员所使用。在合成程序的结尾将合成肽从固体 支持物上切割下来的方法以及正确折叠二硫桥以获得SEQ NO. 1和2或其类似物的方法也 是已知的，可由本发明主题的技术领域的技术人员所重复。毒素的最终的切割和去保护以 及折叠可以是但不限于HF或TFA，这取决于用于合成的策略。二硫键的形成包括任何直角 的方法，其中不同的Cys保护可用于在正确形式中定位二硫键对于Vm24来说是C6_C26、 C12-C31、 C16-C33和C21-C36连接。但是，二硫桥的形成也可通过空气氧化或正反混合反 应(由不同比例的还原性和氧化性谷胱甘肽的存在所帮助)而获得。 按照这个基本的方法学，来自蛇、蝎子和海葵的各种天然存在的毒素被合成产 生，以1125标记并用作研究钾通道结构和功能的分子探针[Strong, 1990 ;Moczydlowski 等人，1998 ;Garcia等人，2001， Kem等人，美国专利US6， 077， 680]。这些毒素中很多对 于特定的钾通道亚型是选择性的[Auguste等人，1990 ;Galvez等人，1990 ;Crest等人， 1992 ;Garcia-Calvo等人，1993 ;Garcia等人，1994， Kem等人，美国专利US6， 077， 680]。 其中最经常使用的例子为来自蛇黑曼巴(Dendroaspispolyl印sis)的绿窄头眼镜蛇毒 素(dendrotoxin)[Harvey，1997];来自海葵Bunodosomagranulifera的BgK[Aneiros 等人，1993 ;Alessandri Haber等人，1999]和来自海葵Stichodactyla helianthus的 ShK[Castaneda等人，1995 ;Pennington等人，1995]，以及几种蝎子毒素，例如中美毒蝎的 诺克休斯毒素[Drakopoulou等人，1995]和来自以色列杀人蝎的北非蝎毒素[Sugg等人， 1990]，这只是提及一些。这些毒素中的一些，例如ShK以非常低的浓度(<lnM)阻断 Jurkat T淋巴细胞中的Kvl.3型钾通道。但是，它们中很多具有缺少特异性的缺点。即，在 10-100nM的数量级的浓度范围内，它们也能够阻断其它亚型的通道。由于Vm23和Vm24对 于hKvl.3通道是非常特异性的(如以下描述的实施例所证明)且具有与目前文献中描述 的其它肽不相同的初级结构，我们决定合成性制备Vm24。Vm24的共价结构通过根据Merrifield的固相系统[Merrifield， 1964]而化学合
16成，其中使用如我们组以前所描述的fmoc-氨基酸[Drakopoulou等人，1995]。 使用其它修饰的氨基酸取代SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的初级
结构的一些氨基酸以获得具有更长的体内半衰期的肽类似物从而减少天然肽的蛋白酶易
感性的可能性落在本发明的范围内。这可包括使用保守性电子等排替换物取代或替换非必
需氨基酸；例如，在某些位置赖氨酸被替换为谷氨酰胺或酰基赖氨酸，或中性氨基酸例如丙
氨酸或Na-甲基化氨基酸替换，从而降低生物活性肽的蛋白水解降解。同样，通过删除某些
对功能来说为非必需的氨基酸而对初级序列截尾，或者添加额外的残基可为类似物结构提
供更高的体内稳定性。通过比对SEQ ID NO:l和SEQ ID NO :2而鉴定的本发明的一些非必
需肽残基包括但不限于比对的SEQ ID NO:l和SEQ ID N0:2或者比对的SEQ ID NO :1、
SEQ ID NO :2和SEQ IDNO :3的位置编号10、 13、 17、23、29和35的那些残基。 可通过加入所选的D-氨基酸或通过化学合成逆反类似物而产生功能等同类似物
肽，其中所有的残基为D-氨基酸且氨基酸序列为反的[Jameson等人，1994 ;Juvvadi等人，
1996]。这些修饰可以增加产物的稳定性。 另一种主要的方法是开发基于SEQ ID NO :1、 SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3的亲 和性和特异性的结构决定簇的低分子量化合物，从而产生非肽(拟肽)。在这些研究中，设 计并合成了非肽骨架，其包含来自母体多肽的钾通道结合表面的主要官能团。有很多天然 发生的低分子量、非肽化合物的例子，其被表明模拟或对抗多肽或蛋白配体的效应。已经为 了一些治疗性相关的肽设计并合成了拟肽化合物。设计并合成性获得了存在于CD4受体上 的环，其与HIV gpl20蛋白结合[Chen等人，1992]，其被表明是以低微摩尔浓度阻断gp120 与CD4受体结合的有效阻断剂。FTI-276是Ras蛋白的C-末端区域的模拟物的另一个例 子，其为癌基因Ras信号的有力阻断剂[Lerner等人，1995]。 如由以上描述可推出的，有很多制备这两种肽即Vm23和Vm24的功能等同类似物 (其可用作控制T淋巴细胞非正常功能的引导药物)的方法。已知T淋巴细胞的不正确激 活引起自身免疫性疾病(例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性牛 皮癣、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、交感性眼炎和骨吸收牙周病)，其它的还有移植排斥。
为了测试可能的新的免疫抑制药物的功效，有很多动物模型，这些动物模型提供 了足够的体内实验用于测试新型未知化合物的功效和可能的副作用，例如在大鼠中被称为 的迟发型超敏反应(DTH-反应)的例子，其已经被用于本发明。如以下将表明和讨论的，为 了测定本发明的肽的保护性效应，测试了小剂量的Vm24以控制发生于事先用二硝基氟苯 (DNFB)致敏的大鼠耳朵中的炎性反应。该试验被广泛使用并且被接受为本发明目的的足够 的模型[Pha皿phak等人，1974]。 [one] 免疫抑制剂 免疫抑制剂例如环孢霉素和FK506表现出严重的副作用，这限制了其治疗性应 用。以这两种化合物进行的研究能够鉴定至少一些引起施用这些药物而产生的不想要的副 作用的分子机理。环孢霉素与存在于很多不同组织中的蛋白环孢素相互作用，而FK506则 是由于其靶向作用于在很多不同组织中存在的FK结合蛋白而引起毒性。因此为了鉴定新 型的无严重副作用的免疫抑制剂作出了主要的努力。 一个主要的目标是鉴定主要在T淋巴 细胞中表达的新型靶标，例如Kvl. 3离子通道。T淋巴细胞中表达的Kvl. 3钾通道对于一 些细胞功能是非常重要的，虽然此蛋白的RNA编码也存在于其它细胞(B淋巴细胞、小神经胶质、巨噬细胞、破骨细胞、血小板和一些脑细胞)中。但是，只有在T淋巴细胞中，Kvl.3 决定膜电位并且其阻断具有显著性的功能性结果。由于Kvl. 3阻断剂作用的不同的机理和 Kvl. 3通道的相对限制性的组织分布，人们期望Kvl. 3的特异性和高亲和性阻断剂比环孢 霉素和FK506表现出更低毒性副作用，从而其可被证明用于治疗自身免疫性疾病以及用于 移植性治疗。 Merck Sharpe和Dohme的科学家已经证明玛格斑蝎毒素(另一种蝎子毒素肽)具 有作为Kvl.3通道阻断剂的有力的效应，其能够抑制动物模型(猪)中的免疫应答。但是， 玛格斑蝎毒素对于Kvl. 3通道不是特异性的，其也以类似的力度影响Kvl. 2通道。由于心 脏和脑组织也表达Kvl.2通道，其阻断可能具有严重的有害作用。从海葵中分离的另一个 肽，ShK是Kvl. 3的有力的阻断剂(参见Kem等人，2000，美国专利6， 077， 680)，其也影响其 它的相关的Kvl通道，但是对于类似的阻断需要高100倍以上的浓度。这意味着当与Kv1.3 相比时，相关的通道对其应用的敏感性要低至超过100倍。本发明的目标，肽Vm23和Vm24， 来自于不同的生物来源，具有与ShK明显不同的初级结构，对hKvl. 3通道比shK具有更大 的特异性。如将在以下实施例(实施例7至10)中所表明和所讨论的，当以阻断相同比例 的hKvl. 3通道所需浓度高3000倍以上的浓度施用时，Vm23和Vm24阻断《50%的其它几 个钾通道。本发明还包括通过固相方法生产Vm23、Vm24及其功能等同类似物。用于化学合成 的程序包括本领域技术人员熟知的一连串方法，如在实施例3中详细描述的。
电生理学鉴定 针对外源或自体抗原的有效的免疫应答的发展需要对给定抗原特异的淋巴细胞 的激活和增殖。这需要免疫系统的不同细胞成分的组织良好的相互影响。这个过程的第 一个步骤是通过专业的抗原呈递细胞将处理过的抗原呈递给淋巴细胞[Janeway等人， 2001]。通过对电压门控钾通道Kvl.3特异的阻断剂而调节T淋巴细胞介导的免疫应答(例 如迟发型超敏反应)在本发明的目标内。因此我们限定钾通道参与的淋巴细胞激活为T细 胞的详尽的细节。但是，我们应该提及，B淋巴细胞的一些亚群的增殖也取决于Kvl. 3通道 的活性[Wulff等人，2004]。 T细胞的抗原受体对呈递的抗原的识别引起细胞的激活、增殖和终末分化 [Sallusto等人，2004]。抗原识别激发的跨膜信号通路包括几个蛋白激酶的激活以及由此 激活磷酯酶C-Y (PLC-Y)。通过PLC-Y介导的膜磷脂磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PiP2)的水 解而产生的1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)启动了 T细胞增殖所需的双相性的Ca"信号[Lewis, 2001]。 IP3分散并与内质网(ER)上的它的受体结合，这引起&2+向胞浆的释放以及胞浆 中游离钙浓度([Ca2+]i)的显著升高。从ER释放后的([Ca2+]i)的瞬间升高不足以完成信 号转导级联，需要持续的Ca2+信号。这通过Ca2+从细胞外空间经由细胞膜上的钙释放激活 的Ca2+通道(CRAC通道)流入而实现[Zweifach and Lewis, 1993]。 虽然CRAC通道本身就是电压非依赖性的，但是Ca2+电流对于Ca2+电化学梯度是 敏感性的，其被细胞的膜电位所影响[Panyi等人，2004]。去极化的Ca2+内流需要被钾通 道的激活所平衡，从而将膜电位控制在负值，因此提供对于更多的&2+进入所需的足够的 驱动力[Fanger等人，2001]。选择性的、调控性的K+流出是人类T淋巴细胞膜电位的主要 决定因素，其为约-50至-60mV。在这些细胞中在生理条件下有两种类型的钾通道进行K+向外流出。人类T淋巴细胞中的主要电压门控钾通道Kvl.3在膜去极化后开启，其激活阈 值接近于细胞的静息电位[Matteson andDeutsch， 1984]。人类T细胞的Ca2+激活的钾通 道IKCal (或KCa3. 1)，只是当胞浆中游离钙浓度超过 200nM时被激活，不依赖于膜电位 [Grissmer等人，1993]。 Kvl. 3和IKCal通道对于T细胞的膜电位控制的贡献取决于细胞的激活状态(静 息状态还是激活状态)，它们在免疫系统中的功能性角色由T细胞的终末分化程度所决定 [Wulff等人，2003]，如在本发明的背景部分所详细描述的。从Kvl. 3阻断剂在自身免疫性 疾病中的治疗性应用的角度来看，重要的是强调对于Kvl. 3通道而非IKCal通道的选择性 是至关重要的[Wulff等人，2003]。效应记忆T细胞(TEM)介导在例如多发性硬化症、类风湿 性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性牛皮癣、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、交感性眼炎和骨吸收 牙周病中的组织损伤，在激活后选择性地上调Kvl. 3通道，因此对这些细胞的膜电位的控 制仅由Kvl. 3通道所掌控[Beeton等人，2006]。因此，这些细胞的增殖可被选择性的Kvl. 3 抑制剂有效且持久性抑制[Wulff等人，2003 ;Vennekamp等人，2004 ;Beeton等人，2005]。 相反地，通过IKCal的转录上调，原态和中心记忆T细胞(TeM)逃脱Kvl. 3阻断介导的增殖 抑制[Ghanshani等人，2000]。这些预先激活的细胞的增殖变得对于IKCal抑制剂敏感，但 对Kvl.3抑制剂不敏感。因此，抑制TEM细胞激活的基于Kvl.3的治疗(但不显著破坏原态 和TcM细胞的增殖)可能在治疗自身免疫性疾病中是有用的，特别是那些与淋巴细胞T皿相 关的自身免疫性疾病，例如I型糖尿病[Viglietta等人，2002 ;Beeton等人，2006]、类风湿 性关节炎[Beeton等人，2006]、多发性硬化症、实验性牙周疾病中的炎性骨吸收[Valverde 等人，2004]，以及与器官排斥相关的状况，例如被建议由慢性激活的TEM细胞所维持的慢性 移植排斥和移植物抗宿主病[Yamashita等人，2004]。
测定选择性 Kvl. 3的几个高亲和性肽阻断剂对于Kvl. 3而非IKCal是选择性的，这与Vm24 类似。这些包括蝎子毒素，例如玛格斑蝎毒素(MgTx)、诺克休斯毒素(Ntx)、短肤蝎毒素、 Anuroctoxin和分离自海葵的ShK毒素。但是，这些毒素还以纳摩尔_皮摩尔的亲和性抑制 在神经元和肌肉兴奋性中重要的离子通道，例如Kvl. l被ShK[Kalman等人，1998]和短肤蝎 毒素[Grissmer等人，1994]所抑制，而Kvl. 2被MgTx[Koch等人，1997] 、 Ntx [Grissmer等 人，1994]和A皿roctoxin[Bagdany等人，2005]所阻断。 毒素特异性的缺乏影响显著性生物学效应的可能。Kv家族的离子通道广泛分布 于经典的可兴奋性和不可兴奋性细胞(参见[Gutman等人，2005]的深度综述)。在神经 元、骨骼肌和心肌细胞中，这些通道是电兴奋性的重要决定者。它们通过影响复极化的速 率而对静息电位的维持和动作电位的形状起作用，并且决定棘波频率和超极化后的神经元 (参见[Gutman等人，2005]的深度综述)。中枢神经系统中表达的离子通道由于血脑屏障 的存在在免受全身施用毒素时能得到更好的保护，但是，在多发性硬化症中(其为Kvl.3 抑制剂的潜在应用领域)，该屏障被损害，这引起MS动物模型中的神经毒性[Beeton等人， 2005]。由于细胞与血流的直接接触，心肌细胞更容易受非选择性Kvl. 3抑制剂的潜在副 作用的影响。在人类心房肌细胞中Kvl. 5[Feng等人，1997]，在心室肌细胞中Kvl. 4[Patel and Campbell, 2005]禾口hERG(参见[Sanguinetti and Tristani-Fi丽zi， 2006]的综述) 通道关键性地决定动作电位的复极化相，而Navl. 5负责去极化相[Rogart等人，1989] 。 BK&2+-激活的钾通道在人体内(脑、骨骼肌、平滑肌、胰岛细胞等，见[Wei等人，2005]的综 述)广泛分布并调节众多生理性功能，包括神经元和骨骼肌细胞的兴奋性和平滑肌中的钙 瞬变。BK通道被a-KTxl.x家族中的毒素所阻断(例如北非蝎毒素[Miller等人，1985])。
细菌的X-射线晶体图像结构[Doyle等人，1998]和人类电压门控钾通道的获得 [Long等人，2005]显著扩展了我们过去10年中对于那些对不同的离子通道特异的a-KTx 的分子机理的理解[Giangiacomo等人，2004]，但是，到目前为止，仍然不可能基于一级结 构而预测给定肽毒素的选择性图谱。这证实了对于针对那些具有生物学意义并且已知易于 被动物毒素所阻断的离子通道的Vm24选择性的实验确定。 分子生物学的发展和离子通道基因的克隆允许在重组离子通道上进行药理学研 究。在合适的细胞系中表达重组通道提供了药理学实验的几个优点，例如干扰性电流的强 度可以忽略，电流的振幅适合于药理学测定。此外，表达的重组通道保持了原态细胞中表达 的通道的药理学特性。 [ono] 药物组合物 本发明提供了包含本发明的肽的药物组合物。如已经提及的，这些肽可用于抑制 哺乳动物中的免疫应答，其中T细胞的特异性亚群被激活。特别地，包含本发明的肽的药物 组合物可用于治疗或预防这样的状况即其中免疫应答是异源器官(例如心脏、肺、肝脏、 肾脏或胰腺)排斥的结果或者是与淋巴细胞TEM相关的自身免疫性疾病的结果。
在本发明的优选方面，药物组合物包含本发明的肽或其药学上可接受的盐，还包 括药学上可接受的载体。这些药物组合物的优选形式和药学上可接受的载体的选择取决于 需要的施药途径和治疗应用。药物组合物包括(取决于所需的制剂)药学上可接受的、非毒 性的载体或稀释剂，其被定义为通常所使用的用于动物和人类施用的制成药物组合物的媒 介物。另外或可选地，药物组合物还可包含至少一种额外的免疫抑制剂，其可在治疗中具有 补充效应。 一些示例性免疫抑制剂为环孢霉素、雷帕霉素、硫唑嘌呤、波尼松、ShK毒素、ShK 衍生物和去氧精胍啉，其衍生物或其盐。本发明的药物组合物可以以下所述的方式施用。
治疗和预防方法 本发明提供了治疗或预防状况(其中哺乳动物中的免疫应答需要被抑制，特别是 当需要这种治疗的个体中T细胞被激活时)的方法，其中所述的状况包括异源器官排斥 (例如心脏、肺、肝脏、肾脏或胰腺)或自身免疫性疾病(例如多发性硬化症、类风湿性关 节炎、I型糖尿病、自身免疫性牛皮癣、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、交感性眼炎和骨吸收牙周 病)。这些个体可包括人类和其它哺乳动物，例如狗、猫、山羊、母牛、马、猪、绵羊，这只是提 及它们中的一些。在一个方面，本发明提供了预防性或治疗性治疗状况的方法，所述状况可 通过抑制需要这种治疗的个体的T细胞的细胞膜上的Kvl. 3钾通道的抑制而被治疗，或者 所述状况对于需要这种治疗的个体的T细胞的细胞膜上的Kvl. 3钾通道是反应性的或敏感 性的。这些方法包括向有需要的个体包括人类施用有效量的如上所述的本发明的肽。通常， 这种肽包括SEQ ID NO :1的Vm24、 SEQ ID NO :2的Vm23或具有SEQ IDN0 :3的序列的肽， 或其功能等同类似物或其药学上可接受的盐。 在优选的具体实施方式
中，本发明提供了特异性针对治疗和预防与T细胞激活相 关的自身免疫性疾病或对Kvl. 3钾通道的抑制反应性的自身免疫性疾病的方法。这样的自 身免疫性疾病包括但不限于多发性硬化症、类风湿性关节炎、I型糖尿病、自身免疫性牛皮癣、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、交感性眼炎和骨吸收牙周病。这些方法包括向有需要的个体 包括人类施用有效量的如上所述的本发明的肽。 在另一个优选的具体实施方式
中，本发明提供了特异性针对治疗和预防异源器官 (例如心脏、肺、肝脏、肾脏或胰腺)排斥的方法。这些方法包括向有需要的个体(例如即将 接受或已经接受器官移植的个体)包括人类施用有效量的如上所述的本发明的肽。
施药的剂量和方法 在治疗性应用中，本发明的肽可以足以治疗、治愈、部分阻止疾病及其并发症或可 检测地减慢疾病及其并发症进展的量向已经患有疾病或不想要的状况(例如自身免疫性 疾病或异源器官排斥，分别地)的个体施用。有效用于治疗性应用的本发明的肽的量取决 于状况的严重性、个体的一般状态和施药途径。治疗应用中肽的有效量将大体在每剂肽 (或其药学上可接受的盐)为约0. 1微克每千克至约10微克每千克的范围内。
在预防性应用中，向具有患疾病或不想要的状况风险但是还没患上疾病或不想要 的状况的个体施用本发明的肽或药物组合物。施用的肽的有效的量将取决于个体的健康状 态和免疫系统的一般状态。预防性应用中肽的有效量将大体在每剂肽为约O. l微克每千克
至约io微克每千克的范围内。 本发明的肽和药物组合物的施用途径由疾病或临床指示和所需的治疗位点所决 定。对于一些类型的疾病，限定于身体的限定区域，可能需要在局部位点施用肽或其组合物 (局部施用)。或者，随着疾病的进展或与局部施用同时进行，可能需要全身施用肽或其组 合物。 对于其它指示，本发明的肽和药物组合物可通过静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鼻 内和真皮内注射来输送，以及通过支气管内滴注(例如通过使用喷雾器)和跨粘膜、全身、 跨真皮(例如使用皮肤贴剂中的液体可溶性载体)、经口腔和胃肠道输送(例如使用胶囊或 药片)。 —个或多个本发明的肽可以联合治疗施用。例如，可将一个或多个本发明的肽与 另一个免疫抑制剂(例如以上提到的那些)联合施用于有治疗需要的个体。有一些先天性 自身免疫性疾病，例如免疫性血小板减少性紫癜[Cooper and Bussel， 2006]或自身免疫性 淋巴细胞增殖性综合征
，其中治疗需要多目标方法，因此需要一种以上 的免疫抑制物质。 本发明的肽可单独施用或与如上面在"药物组合物"部分所述的药学上可接受的 载体联合使用。肽可以单一剂量或多剂量施用。合适的药学载体包括但不限于惰性固体稀 释剂或填充剂、无菌水溶液和各种无毒有机溶剂。通过将本发明的肽与药学上可接受的载 体组合而形成的药物组合物可以众多剂型，例如片剂、锭剂、糖浆剂、可注射溶液等容易地 施用。如果需要，药物组合物可含有额外的成分例如调味剂、粘合剂、赋形剂等。
对于口服施用，含有各种赋形剂(例如柠檬酸钠、碳酸钠和磷酸钙)的片剂可与各 种分解质(例如淀粉，优选马铃薯或木薯淀粉；褐藻酸和一些复杂的硅酸盐)以及粘合试剂 (例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、白明胶和阿拉伯树胶) 一起使用。对于制成片剂的目的，也 需要润滑剂例如硬脂酸镁、十二烷硫酸钠和云母。相似类型的固体组合物也可用作盐和硬 填充白明胶胶囊中的填充剂。为此目的的优选的材料包括乳糖或牛奶和高分子量的聚乙二 醇。当需要用于口服的水性悬浮液时，其中的主要活性肽成分可与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料组合以及，如果需要的话，与乳化剂或悬浮试剂组合，并结合稀释剂例如水、 乙醇、丙二醇、甘油及其组合。 对于非肠道施用，可使用芝麻或花生油中的或水性聚丙二醇中的本发明的肽的溶 液，以及对应的前述的可溶于水的药学上可接受的金属盐的无菌的水性盐溶液。如果必要， 这样的水溶液应该进行合适的缓冲，首先以足够的盐或葡萄糖赋予液体稀释剂等渗性。这 些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射。所用的无菌水性介质可通 过本领域技术人员熟知的标准技术获得。另外，前述化合物可通过使用适合于特定目的的 合适的溶液局部施用(例如通过安置的导管)。
Vm23、 Vm24和功能等同类似物作为分子探针 除了本发明的肽的治疗性用途，这些肽还可用于检测并鉴定众多细胞(不论是从 动物组织还是稳定的培养物获得的)中的Kvl.3通道表达的水平。在本文中已经强调了 鉴定T细胞中Kvl. 3表达的重要性，因此本发明还涉及本发明的肽用作分子探针以生理性 地鉴定Kvl. 3通道表达细胞的用途。Kvl. 3的表达的检测和鉴定可通过使用经过方便的 标记的本发明的肽通过几种检测技术来进行，包括但不限于流式细胞术、共焦和常规荧光 显微镜、全荧光发射、放射性结合和置换技术以及免疫性pull-down测定。给定细胞中表 达的Kvl.3通道的定量确定可通过定量检测技术来进行，包括但不限于共聚焦激光扫描 显微镜的通道计数、免疫金检测和放射性结合和置换技术。此外，多肽链或几个非必需氨 基酸侧链的化学修饰可提供标记的功能等同类似物，其可用于Kvl. 3通道的检测和定量。 反过来，这些功能等同类似物可用作搜索特异性配体的分子探针，只要这些新配体具有与 Vm23、 Vm24及其功能等同类似物相同的Kvl. 3上的结合位点。任何这样的化学修饰应该 保持Vm23、 Vm24及其功能等同类似物的结构决定簇不被改变，这些结构决定簇赋予它们对 Kvl. 3的高亲和性和特异性。多肽链的化学修饰对于获得有用的分子探针是普通的程序； 其可通过几个可广泛获得的方法实现且由本领域技术人员常规使用。通过修饰提供的标记 可以包括但不限于，放射性同位素、荧光、化学发光或发色半体，以及以标记蛋白(抗体、生 物素、绿色荧光蛋白或其衍生物)交联或融合。 在以下的实施例中，详细描述了这些本发明的肽如何被分离、纯化和化学鉴定。描 述了示例性肽Vm24的合成，详细描述了本发明的两个示例性肽(Vm23和Vm24)对人类T淋 巴细胞的Kvl. 3通道的选择性作用。最后，还描述了体内检验中低浓度的Vm24对大鼠中 DTH-反应的保护性作用。
实施例 包括了以下实施例用于证明本发明的典型的优选的具体实施方式
。本领域技术人 员可对所报道的实施例的特定具体实施方式
中进行很多的变化且仍然获得相似或类似的 结果而不偏离本发明的实质和范围。如果最终的产物包含这里所显示的序列(SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO :2、 SEQ ID NO :3)或其功能等同类似物，其必定重复与这里描述的相同的结 果，因此被期待可很好的实施本文所要求保护的本发明。 实施例1. Vm23和Vm24的分离、小鼠中的致死测试以及其一级结构的确定 所用的所有的溶剂和化学物质均为分析级的，如前所述，在所有的程序中使用双
蒸水[Batista等人，2007]。
22
分离程序 用于分离以上所提及的各种天然配体的程序使用色谱技术。将毒液溶于水中并在 10， 000xg离心5分钟。收集上清液并通过高效液相色谱(HPLC)分离。将含有1. 0毫克的 可溶性毒液蛋白的100微升加入到分析型C18反相柱(直径10x250mm，产品编号238TP)， 所述柱从Vydac(Hisperia， CA， USA)获得，是HPLC系统(Millenium Millipore， Milford， MA)的柱。使用从溶液A(水中的O. 12X三氟乙酸-TFA)至60%溶液B(乙腈中的0. 10% TFA)的线性梯度纯化成分，运行60分钟。通过230nm处的吸收监视检测，以lml/分的流速 洗脱。人工收集组分并使用SavantSpeed-Vac干燥器进行干燥。如图1所示，从此HPLC分 离收集了 80种以上的不同组分。从20至35分钟的保留时间洗脱的组分通常对应于所研 究的其它蝎子毒液的大多钾通道蝎子特异性毒素[Batista等人，2007]。由于这个原因，特 别注意了在那些时间所洗脱的毒液成分。特别地，有两个组分一个在23分钟另一个在24 分钟洗脱，对其进行进一步分析，因为对来自这个洗脱时间的肽所作的质谱确定与其它已 知钾通道特异性毒素所发现的值十分相近，例如，它们具有约4000道尔顿的分子质量。由 于这些成分仍然是不匀质的，因此使用相同的HPLC系统进行了第二次色谱分离，但是使用 不同的梯度进行洗脱(溶剂A至40%溶剂B， 60分钟，使用C18柱，产品编号218TP54,来自 Vydac， Hisperia CA)。如图1中插入图所示，从这些最初组分中每一个中分离了主要成分
(以星号标示)。左侧的插入图对应于在23分钟时洗脱的组分，右侧的对应于在24分钟时 洗脱的组分。经过质谱确定分析和自动化Edman降解测序，发现两个肽均为匀质的。在我 们的实验条件中首先分析了在24分钟时洗脱的那个。其是纯的并显示出3864原子质量单 位(a.m.u.)的分子质量。在本文中我们将不加区别地使用a.m.u.或道尔顿(縮写为Da) 来表示一单位的分子质量。由于这个原因，该肽被命名为Vm24，意思是在我们的实验条件中 在24分钟时洗脱的从墨西哥蝎子(V. mexicanus)毒液中分离的肽。左侧的插入图(图1) 显示的色谱图对应于命名为Vm23的肽的分离。其代表在23分钟时洗脱的来自墨西哥蝎子
(V. mexicanus)毒液的肽。此成分的实验分子质量被确定为3665Da。 来自墨西哥蝎子(V. mexicanus)的全毒液的体内毒性测定和纯化的Vm23及Vm24 的致死性测定 通常在实验室中使用至少三个生物模型来研究毒液和纯肽的效应哺乳动物、蟋 蟀和甲壳类，因为已经知道蝎子毒液含有毒素物种特性。存在对于哺乳动物特异性的毒素 或对于不同类型的节肢动物特异性的毒素(参见综述[Possani等人，1999])。为了本发 明的这个目的，我们使用小鼠作为动物模型进行实验，因为结果将作为与毒液或纯化的毒 素接触的人类中将发生的可信赖的指征。以各种数量的墨西哥蝎子(V.mexica皿s)可溶 性毒液(每20克体重的小鼠50至200微克)注射的小鼠没有显示出中毒症状。通常，如
果毒液含有对人类有毒的毒素的话，这些数量的材料将显示出明显的中度症状，例如兴奋 性、分泌唾液、呼吸急促(呼吸困难)、后肢瘫痪、痢疾、痉挛、甚至是死亡[Possani el al.， 1985]。如果经注射的动物呈现出任何以上症状，但是在施用肽后24小时内恢复，则称该肽 为"毒性的"，然而，如果小鼠死亡，则称其为"致死的"。非毒性成分是那些不诱导中度症状 且产生与注射pH为7. 2的PBS-盐溶液的小鼠表现的行为相似的那些成分[Possani等人， 1985]。最终，在相对低的剂量时全毒液是非毒性的，但是类似剂量的纯化的肽可诱导中度 症状，因为在纯化过程中样品以该特定成分被富集。由于这个原因并且考虑到墨西哥蝎子(V. mexicanus)的可溶性毒液在200微克/20克小鼠体重时是非毒性的，以各种浓度将纯化 的肽Vm24注射入小鼠。所用的最高剂量是200微克/20克，S卩10， 000毫克/千克小鼠体 重，没有观测到中度症状。 这当然与致死成分相反，例如从另 一 种墨西哥蝎子中美毒蝎 (Centruroidesnoxius)中纯化的毒素Cn2。 Cn2在小鼠中的50%致死量(0)5。，意思是引起 所检测动物组中50%死亡率的剂量)为0. 25微克/20克小鼠体重[Zamudio等人，1992]。 意思是Vm24在高800倍的蛋白浓度时对小鼠是无毒的，而Cn2杀死半数群体。
Vm23和Vm24的氨基酸序列的确定 使用了两项技术自动化Edman降解和质谱(MS)分析。使用Beckman LF 3000Protein Sequencer (Palo Alto， CA， USA)按照公司提供的化学物质和程序进 行了纯毒素的直接的氨基酸序列确定。按照以前描述的与其它蝎子成分相似的程序 [Valdez等人，2004 ;Batista等人，2007 ;Diego-Garcia等人，2007]，以Arg-C内肽酶 (RocheDiagnostics， Basel, Switzerland)对还原的并且烷基化的纯肽样品进行酶切。对 应的肽用HPLC纯化并测序。对于质谱，使用Surveyor MS注射器泵输送系统将样品直接 力口入Finnigan LCQ腦ion trap mass spectrometer (San Jose， CA)。将10微升/分钟的 洗脱分开从而允许只有5%的样品进入毫微喷雾源(0.5微升/分钟)。喷雾电压设定为 1.7kV，毛细管温度为130°C。对于MS/MS实验，以25V的碰撞能量、35-45% (人工单位) 的标准化碰撞能量和具有宽带激活的扫描操作片段化源。所有的广谱均在正离子模式获 得。以Xcalibur软件在Windows NT PC系统进行数据获得和数据的去巻积。人工分析并 用Sequest软件分析来自酶切产生的来自于肽的MS/MS光谱[Batista等人，2007]。
确定了 Vm23和Vm24的一级结构(见图2)，并将肽用于如下所述的电生理学实验 (见本发明随附的实施例7至10)。从23分钟时洗脱的组分重新纯化得到的天然肽(见图 1左侧插入图)进行了完全鉴定。其实验分子质量为3665Da。将1纳摩尔此种肽加入测序 仪，首34个氨基酸通过Edman降解直接鉴定(下划线Direct)。使用公司(Beckman)提供 的方法学，通过还原和烷基化确定半胱氨酸残基。Vm23的位置35的最后一个残基通过质谱 确定。期望的基于所确定的序列的理论平均分子质量为3665.51Da，从而确定了全序列的不 含糊的确定。实验确定的和预期理论分子质量是相同的，在所使用的仪器(Fi皿igan ion tr即1XQD加massspectrometer)的误差范围内。 类似地，将l纳摩尔的匀质的肽Vm24(如图l右侧插入图所示的进行重新纯化)进 行自动化Edman降解，其允许鉴定首28个氨基酸残基(图2，标记为Vm24)。将以各种等份 的还原的和烷基化的肽进行的分析用于确定半胱氨酸残基并用于内肽酶消化。以ArgC-内 肽酶消化Vm24产生三个亚肽， 一个被确定为残基Alal至Argl7 (未在图中标明因为其包含 分析天然肽时已经确定的N-末端序列-下标为"direct")的序列；另一个为确定Ala18 至Arg29的序列，标记为下标"Arg-Cl";最后一个为确定Lys30至Cys36 (下划线Arg-C2) 的序列。这些序列是通过Edman降解联合MS/MS片段化获得的(见图2，Vm24)。由于最后 的残基是通过CID(碰撞诱导的片段化)，位置30和32的氨基酸可以是赖氨酸或谷氨酰胺 (相同的分子质量)。为了解决不确定性，使用胰蛋白酶对此最后的亚肽进行另外的酶切。 通过HPLC分离三个小的肽，通过CID确定的其氨基酸序列被鉴定为从Cys26至Lys30 (下 划线Trpl)， Cys26至Lys32(未标明，为了符号简单)和Cys33至Cys36 (也未标明)。由于胰蛋白酶在c-末端的赖氨酸切割肽键，因此这两个位置被分配为赖氨酸残基，毫无疑问 地确定全长序列。还通过以Lys-C内蛋白酶(下标为Lys-C)水解后分离的肽的MS/MS的 片段化确定了 c-末端的最后四个氨基酸。假设酰胺化的C-末端氨基酸，期望的肽的理论 平均分子质量是3863. 64Da，实验值为3864. 0Da，这确认了全长序列。由于对于1， OOODa以 下的肽三维离子阱捕获的精确度在lOOppm的范围内，因此0. 36单位的小差异在期望值的 范围内(对于精确的仪器的参考，参见[Aebersold and Goodlett， 2001])。
关于本发明，着重指出Vm23和Vm24的五个特点 1)与所有的目前为止所知道的其它蝎子毒素相比，它们的一级结构具有50%以 上的差异(见以下实施例6)。这个事实证实了存在一个新的亚家族(至今未知的)，这里 建立为数字a-KTx 21 ;例如a-KTx 21. 1和a-KTx 21.2。这是最初的公开，并且确切地 表明这两个肽均与其它任何这样的配体在结构上是不同的，包括那些来自海葵、蜜蜂和蛇 毒的肽。 2)两个序列直至位置10的N-末端片段是相同的，保持二硫桥的8个半胱氨酸中 的7个位于一级结构的相同位置。Vm23的第八个半胱氨酸(C8)位于位置35，在C_末端的 极端，与Vm24的相比提前了 一个氨基酸。由于这个原因，Vm24具有36个残基而Vm23具有 35个氨基酸残基。Vm23的最后的半胱氨酸不是酰胺化的，但是我们设想其结构折叠与Vm24 是相同的。由于Vm23和Vm24的生理学效应均是相当的，我们期望N_末端区域的氨基酸序 列对于活性是重要的。当比较Vm23和Vm24的一级结构时，在位置10、13、17、23和29发 现了五个差异，以及在最后一个氨基酸和其前面一个之间的一个插入删除(indel)(对于 Vm23是Y34，对于Vm24是Y35)。最可变的区域是两个肽的中心部分(残基10至30，其中 6个差异中的5个位于此)，这建议这些残基对于每个肽的功能不是特别重要。值得提及的 是，位置17的替换(R/K)、位置23的替换(N/S)和位置29的替换(R/K)是保守性修饰，因 为精氨酸(R)和赖氨酸(K)均为带电荷的碱性氨基酸，而天冬酰胺(N)和丝氨酸(S)为不 带电的亲水性氨基酸残基。与Vm24相比，在位置35缺少酪氨酸(在Vm23中被半胱氨酸取 代)，这建议仅仅一个酪氨酸对于两个肽的正确的折叠和功能是足够的。
3)因此最可变区域位于中心部分，这允许保守性替换。本领域技术人员可容易地 设计，在比对的位置以具有相似的理化性质的氨基酸修饰或取代(具有至少83%配对序列 同一性，如此处所示的Vm23和Vm24的情况)被期望产生具有相似性质的功能等同类似物， 因此应该落入本发明的范围内。 4)但是，最重要的特征(如在以下实施例7-10中所示和讨论)是，当与其它亚型 的钾通道相比时，Vm23和Vm24均对于hKvl. 3通道具有高亲和性。相对于其它已知的阻断 剂例如北非蝎毒素、诺克休斯毒素、BgK、ShK等，Vm23和Vm24对于hKvl. 3具有更高的亲和 性[Panyi等人，2006]。上面提及的其它的阻断剂具有高度不同的氨基酸序列和/或二硫 对，或显示出不同的对于Kvl. 3通道的作用特异性和结合亲和性。从Vm23和Vm24的一级 结构的简单分析来看，它们应该以与其它蝎子或海葵毒素所显示的方式类似的方式来影响 Kvl. 3通道不是显而易见的。这样，这里要求保护序列的专有信息和用途，因为Vm23和Vm24 不能从影响Kvl. 3通道的其它肽的知识明显得到。本发明报道了完全不同的和新型的氨基 酸序列(SEQ ID NO:l和SEQ ID NO :2)。进一步的证据表明表明所确定的序列是正确的 进一步证据来自于合成制备的Vm24获得的结果。天然的Vm24和合成制备的Vm24具有完
25全相同的生理学作用，如下所示(实施例9)。 5)最后，在这两种肽中发现的另一个重要的事实为，当以相对高的浓度(达到 10，000微克每20克小鼠体重)注射入实验动物时，它们是非毒性的。当与其它已知蝎子毒 液毒素(例如来自中美毒蝎(Centruroides noxius)的Cn2)相比时，这是非常显著的，如 前所述[Zamudio等人，1992]。比Vm24低约800倍的剂量注射Cn2入小鼠引起50%的死亡率。 实施例2 :墨西哥蝎子(V. mexica皿s)毒液中存在的成分的质量指纹分析
蝎子毒液是高度复杂的成分的混合物，包含对离子通道有活性的短链和长链的肽 (见综述[Possani and Rodriguez de la Vega， 2006])、自由胺、核苷酸、碳水化合物、脂 (见综述Possani等人，1999)、酶例如磷脂酶[Za咖dio等人，1997 :Valdez等人，2004]，透 明质酸酶和溶菌酶[Batista等人，2007]和很多其它功能未知的蛋白成分[Diego-Garcia 等人，2007]。另外，蝎子是非常古老的动物，在地球表面具有3亿年以上的进化，其具有时 间选择猎获其食饵或保护其自身免受猎食的特定工具。由于这些原因，搜寻其毒液中生物 活性成分的存在是吸引人的且明智的。由于质谱方法学和仪器的最新进展，现在可以获得 全毒液的质量指纹分析。由于这些原因，以墨西哥蝎子(V.mexica皿s)的可溶性毒液进行 的第一个研究中的一个是鉴定所有成分的分子质量，其可通过Fi皿igan LCQDU°(San Jose， CA)离子阱质谱仪(EIS/MS)和基质辅助激光解离飞行时间质谱(MALDI-TOF)(型号为 Ettan亂DI-TOF/Pro，来自Amersham Biosciences (Uppsala, Sweden)的仪器)而鉴定。所 用的策略是通过HPLC分离纯肽或相关成分的家族(从C18反相柱洗脱的混合物，图1)进 行预选择，然后通过质谱分析其分子质量。在表l中列出了从HPLC系统收集的组分的保留 时间，其后列出了每个组分中发现的成分的分子质量。确定了 340种以上的不同分子质量 的成分。值得提及的是，一些成分在HPLC分离系统中的两个连续亚组分中出现，在每种情 况下只计算一个。同样，有一些组分没有被鉴定(标记为ND)。
表l:
及r灯乎爆着
2.92222.334, 260.168,372.81527.121340.203, 1642.177, 2620.029
5.06272.05528.242084.938， 2883.506, 3770.697
B5.06429.128.72222.295, 373.089, 4037.264,
4062.469， 4860.475
7.40-ND29.122028.249, 4044.625， 4743.102
9.841235.349S 29.821989.272， 2117.962, 3770.356,
3828.061， 4048.342, 5125.488
10.78994.899, 1047.829, 1234.05629.822368.289, 2514.764， 3772.141,
4131.437， 4196.231, 5612.061,
5684.0
11.28117.063， 1234.34930.62"79.7， 2029.978, 2756.56,
4051.043, 5487.234
B 11.28-ND31.201894.409, 2288.761,
3695.567, 4053.615，
4623.314， 5309.113, 5468.43,
8340.499
13.07300.70331.712526.804, 4053.34, 4256.777，
4623.389, 8184.727
141466.168, 1960.937, 2363.969,32.222610.12, 3068.716， 4050.544,14.96 15
16.22 16.70
17.34 17.66
18.35 19.10
B 19.10 20.14.
20.14.2
20.23 20.96
2441.293,3091.036 -ND
272.091, 334.602, 427.197, 1086.902,
32.78
33.47
ND
34.11
324.238， 418.72, 5fl/.4' S3", SI 35.79 1049.296,1877.397 261.344， 1205.752， 1274.737 1876.767,1886.725 261.283, 1243.892
208.卯9, 223.509, 373.827, 1436.27， 1652.505
1148.738， 2096.296, 2297.193，
2318.577,2353.524 i
2377.208, 2593.419, 2610.334 2593.88
52 35.72
53 35.79 35.79 36.19
36.72 46.53
1464.42， 2610.477
2098.654, 2594.163， 46.86
-ND
1866.081,3777.92
47.82 48.70
4251.603, 4616.633, 8157.368 1727.988, 3115.418, 3838.78， 6231,008
1288.661, 1630.123, 1856.102, 2076.866, 2116.85, 2306.616, 3302.189， 4160.467， 4322.925， 5434.357, 6514.206, 7937.084, 8364.316, 9125.702, 15373.608
1811.589, 2792.828, 2890.806, 3272.21, 4008.728， 4044.677 3032.485, 3862.668， 7469.49
2558.149, 3032.024, 4232,375， 8260.244 3037.876， 3058.507, 4027.624
3038.075, 3738.649, 8269.386
2814.497, 3038.868, 3721.56, 3807.978， 4027.936， 13944.696
3588.529, 3610.297, 3983.521,4020.726, 3915.145， 4051.546, 4710.326, 4782.406, 5107.706， 13435.689
3920.472, 4236.709,
5182.747，
11459.022， 13358.3， 4298.5， 4700.818， 12469.982
2166.644, 2304.621，
2768.228, 3819.497, 4292.422
3278.62, 3916.217,
3987.629, 3738.686,
4027.696,
3564.677， 3878.666, 8267.094，
3625.895，
4223.762
4319.845,
4868.122,
7067.905,
5044.021,
8246.293,
16209.23
5272.777,
2569.271, 3424.448， 4265.672,
21.987". 7, 1259.696，495953.928,11315.991
3777.049
22.407狄5, 2286.744,49.6-ND
4024.456，4980.605
23.391014.47,"".S， 1390.042,50.75-ND
1527.099,1902.299， 2111.018，
2228.143,2311.79T, 3665，
4025.1
S 24.111048.604,1657.949, 2310.80951.66-ND
S 24.111048.604，1657.949, 2310.80952.34-ND
24.111952.328,2166.86, 3864,53.313460.978, 3807.741, 5673.486,
5338.22910978.726， 16185.602，
24611.234B24.ll253.04,875.42,1398.661，53.843548.378， 3591.69,:
1948.124,2436.139,2679.346,
5336.308
25.101511.315,54.27-ND
2529.512,3864.577
25.10.2253.073,遵4,1194.739，55.20-ND
1511.312，1985.92， 2075.691
25.521485.399,1728.229，2258.489,56.271603.661, 1640.656
2387.001
26.101327.008，58.92-ND
1495.436,2258.772,2620.03,
3870.226,3917.489
26.51 1234.369, 2621.099, 3871.574_ 以粗体数字标记的成分意思是它们在毒液中以高浓度存在，而那些斜体数字表示 该成分仅在EIS/MS质谱仪中被鉴定。当保留时间前面冠以字母S时，意思是色谱峰为非对 称的，所收集的组分对应于曲线的上升片段，而如果是字母B，则表示曲线的下降片段。斜体 数字意思是对应的分子质量只是由EIS/MS获得。 一些值没有被确定(ND)。
分析了表1中所列的各种成分并且根据1000的分子量增量将其人为地分组， 以那些分子量在500Da以下的开始，然后是500-1000， 1000-2000以此类推， 一直到 9000-10000Da(每组相差1000)。所鉴定的成分中90%以上具有10， OOODa分子量以下的分 子量。三个小组具有至少60种不同成分。其落入1000-2000 ;2000-3000和3000至4000Da 的范围内。40种以上的成分具有4000至5000Da的分子量。 这些结果对于选择合适的肽进行功能分析是重要的。在我们组最近的一篇使用 巴西金幽灵(Tityus stigmurus)蝎子的论文中讨论并发表了所用的理论[Batista等人， 2007]，其中考虑到不同种的蝎子(不包括墨西哥蝎子)的各种质量指纹分析进行了比较分 析。通常发现具有4000Da数量级分子量的肽对于识别对钾离子通透的离子通道是特异性 的。由于这个原因，我们选择了这个范围分子质量的肽进行生理学研究，如下所述。按照这 个策略，选择了两个肽即Vm23和Vm24进行一级结构确定(图2)和进一步的生理学测定 (见下面的实施例7-10)。 实施例3 :Vm23和Vm24的C-末端氨基酸序列的鉴定 关于Vm23的C-末端氨基酸序列的最后一个残基，结果是清楚的。本公开实施例1 中所描述的序列分析(其序列如图2所示)毫无疑问地确定最后的残基不是酰胺化的，一 级结构以自由羧基半胱氨酸残基结尾。 但是，对于Vm24，质谱结果建议C-末端残基可以是酰胺化的。文献报道了这样的 例子，其中给定肽的最后一个氨基酸的酰胺化对于确定其生物学功能是重要的。 一个这样 的例子为蝎子亚洲雨林蝎(Heterometrus spinnifer)的毒素HsTxl [Leb進等人，1997]。 电生理学实验已经证明该毒素的酰胺化形式比其自由羧基末端形式强5倍，在结合实验中 以高300倍的活性结合至大鼠脑突触体[Lebrun等人，1997]。由于这个原因，确切知道Vm24 的最后一个残基的化学形式是非常重要的。如实施例1中所讨论的，Vm24的实验分子质 量为3864Da，从图2所示的氨基酸序列预期的理论分子量为3864. 6Da。两个值存在0. 6a. m.u.的差异，该差异可以是由Vm24的酰胺化C-末端造成的。以Arg-C切割产生的C-末端 肽(909.4a.m.u.单一同位素质量)进行的碰撞诱导的解离(CID)实验显示所有的y离子系列值均比那些自由羧基末端肽的理论预期值和b离子系列的精确值低1. 0a. m. u，这确定 了该毒素的C-末端是酰胺化的(图3)。 对于这个实验，使用如上面实施例1所描述相同的程序以酶Arg-C对Vm24的25 微克蛋白等份进行酶切[Valdez等人，2004 ;Batista等人，2007]。使用图1中描述的相 同系统通过HPLC分离经酶水解的产物。通过MS系统性分析所有的匀质形式的肽，将具有 909. 5a.m. u.分子质量的肽进行MS/MS分析。质谱仪的毫微喷雾离子化来源的实验程序设 定为加热毛细管为13(TC，喷雾电压为1.65kV。以线性模式使用50%乙腈(AcCN)以0. 6 微升/分钟操作测量器溶剂输送系统。MS/MS扫描定义为200扫描/毫秒的注射时间，宽 带激活，25V碰撞能量，1.0(m/z)分离宽度和40%标准化碰撞能量。人工分析数据并且以 University of California-SanFrancisco Mass Spectrometry Facility开发的Protein Prospector(http://prospector, ucsf. edu/)的MS-产品工具自动分析数据。MS-产品 工具允许使用单一同位素质量、未经修饰的半胱氨酸和未封闭的N-末端残基评估为了肽 KCKCYYC产生的可能的离子片段。对自由羧基酸末端和酰胺化C-末端肽均进行计算。为了 这个评估选择了ESI Ion Tr即仪器。使用Protein Prospector进行酰胺化C_末端肽的 理论片段化，其显示与那些通过实验为b(232. 11、360. 21、463. 22、626. 28和789. 34)和y 离子(782. 27、679. 26、551. 16、448. 15、285. 09和122. 03)所获得的完全相同的值。因此， Vm24肽具有酰胺化C-末端，即半胱氨酸酰胺残基。
实施例4 :Vm24的二硫桥的确定 由于尺寸小，Vm24毒素是研究结构_功能关系的理想分子。该肽含有8个半胱氨 酸残基，位于位置6、 12、 16、 21 、 26、 31 、 33和36，形成4个分子内二硫键。这个实施例描述了 使用Edman降解确定Vm24的二硫结合图谱和通过质谱确定蛋白酶水解切割后经RP-HPLC 柱纯化的肽。 通过经内肽酶切割的纯毒素并经过HPLC分离而获得的肽片段的质谱分析而确 定二硫对。在37°C以pH为6. 8的150mMTris-HCl中的糜蛋白酶和胰蛋白酶(Boehring Manheim， Germany)的等量混合物(每个0. 5微克)孵育含有25微克蛋白的毒素样品12小 时。使用C18反相柱(产品编号218TP54，来自Vydac， Hisperia， CA)通过HPLC分离所产 生肽。将溶液A(水中的0. 12%的TFA)至60X溶液B(乙腈中的0. 10% TFA)的线性梯度 应用于柱子并运行60分钟。收集洗脱峰并立即冻干。通过质谱片段化(MS/MS)分析个体 肽，从中获得氨基酸序列。由于一级结构是已知的，因此可以推断二硫桥的排列。
经过对比还原形式和氧化形式的Vm24的分子质量显示出精确的8a. m. u.的差 异；天然肽的实验分子质量为3864. 0a. m. u，对于完全还原的肽是3872a. m. u.，这确认了 所有的半胱氨酸均参与了二硫桥的形成。从糜蛋白酶和胰蛋白酶的在PH6.8(稍酸性的 pH，为了防止混合二硫键重排)同时消化所获得了三个主要肽片段，显示了 [M+H]+788.0， [M+H]+560. 4禾口 [M+2H]2+1099. 7a. m.u.的单一同位素分子质量(图4_1、4_2和5A)。具 有[M+H]+788. 0的肽恰好对应于异二聚体氨基酸序列AQGCK-CY的半胱氨酸对(C4-C8)的 期望分子量(图4-l)。确定的第二个二硫桥是C3-C6，其具有560.4a.m.u.的相同的理论 和实验值(图4-2)。通过CID实验进一步分析了两个肽，显示出预期的氨基酸序列。m/ Z[M+2H]2+1099.7a.m.U. (2197. 4去巻积质谱)的信号来自含有最后两个半胱氨酸半对(图 5A)的异二聚体核心。该片段被直接分析。来自m/z[M+2H"+1099.7信号的CID离子系列显示出满足完全确定最后两个半胱氨酸对的条件的两个离子值。1507. 4的b离子和691. 3 的y离子(其为来自谷氨酸(Ell)和半胱氨酸(C12)之间的相同酰胺切割键的产物)清晰 地分配Cl-C5和C2-C7半对。此外，b-离子1710. 5至b-离子1137. 3的一前一后的片段 化值以不含糊的质量值鉴定了内部标签(GSPEC-C)，确认了图5B中图示的二硫桥排列。
实施例5 :Vm24的化学合成 在这个实施例中，在描述Vm24的化学合成之前，重要的是覆盖肽化学主题中的一 些基础概念和通过化学合成产生配体(而不是通过天然提取已经存在的产物)的原理。
已经从毒液来源纯化了很多毒性多肽，显示其为研究细胞交流的有价值的工具， 因为它们通过与受体结合(对于蝎子毒素的情况多数为离子通道)而影响生物膜上的离子 分布，它们引起细胞去极化或调节跨膜的电位，以这种方式控释细胞功能。由于这些原因， 发现那些能够区分不同类型或亚型的离子通道的特异性毒素肽是治疗实验动物的一系列 生理或异常状况并最终用于治疗人类疾病的有价值的治疗性先导。已知的肽多数为短的、 良好折叠的和包装的结构，呈现出相对于其它有机分子的一系列优点，例如强度高、耙标特 异性高、溶解性高和作用开始得快。此外，它们通常是由几个二硫桥交联的小蛋白。这些结 构特征赋予这些肽高度稳定性，虽然合成制备的衍生物的正确折叠具有正确合成方面的一 些其它的问题。但是，存在于毒液来源中的这些多肽的量通常是非常少的。实际上，由于它 们在生理学作用上如此特异性和有效，因此产生这些肽的动物不需要产生很大数量用于有 效方式的使用，无论是为了捕获它们的食饵还是保护它们自己对抗猎食者。虽然直接从来 源中分离的这些各种肽的量通常足够鉴定作用的一般机理并且允许(在过去)进行肽的结 构特征鉴定(主要通过核磁共振技术)，但是通常需要通过合成生产相同的肽或其衍生物， 取决于研究或临床应用追寻的范围。肽的三维结构的确定和参与识别受体面(离子通道) 的表面的鉴定是设计最初模型的修饰版本或合成拟肽的基础。 这里我们描述了 Vm24的化学合成。从历史上说Vm24先于Vm23被鉴定。由于这 个原因，本发明的多数详细工作和主题是以Vm24为例子进行并加以描述的，然后确定对于 两个肽均为正确的。 在Rink Amide MBHA树脂(Calbiochem-Novabiochem Corp)上通过固相方法学合 成了 Vm24的线性类似物。Fmoc-氨基酸(Calbiochem-Novabiochem Corp)和以下侧链保 护一起使用Arg (Pbf) 、 Asn (Trt) 、 Cys (Trt) 、 Gln (Trt) 、 Glu (0tBu) 、 Lys (Boc) 、 Ser (tBu)和 Tyr (tBu)。 通过二甲基甲酰胺(DMF)中的20%的哌啶处理20分钟然后以DMF洗涤而除去 Fmoc基团。Fmoc-氨基酸(0. 5mmo1)作为活性酯在DMF中进行偶联，以HBTU(2-(1_H-苯并 三唑-1-基)-1 ， 1 ， 3， 3-四甲基-脲六氟化磷)/DIEA (二异丙基乙胺)(0. 45,1/0. 75,1 ， 2分钟激活)作为激活试剂。偶联时间为30分钟。在肽合成的每个循环中通过茚三酮测试 (Sarin等人，1981)监视未反应的或解封闭(deblock)的自由胺。在整个合成过程中，在偶 联下一个氨基酸前，通过乙酰化反应封闭不需要的残余自由胺。所有的操作在50ml的玻璃 反应容器(带有Teflon-lined螺帽)中人工进行。在N a -去保护和偶联步骤中通过轻轻 倒置而摇动肽树脂。 在最终除去Fmoc-基团后，从树脂上切下肽树脂(1. 7克)，同时使用试剂K在室温 进行去保护2个小时[Drakopoulou等人，1995]。切割后，沉淀粗肽并以冰冷的叔丁基醚洗涤，然后溶于20%的水性乙酸中。低压冻干产物并在-2(TC保存干粉直至使用。
制造分子的对应二硫桥的环化反应在O. 1M NaCl、5mM还原的谷胱甘肽、0. 5mM氧 化的谷胱甘肽、20mM的Na2HP04(pH 7. 8)禾P 30 y M的未折叠合成Vm24中进行。以HPLC通 过两个步骤纯化粗制的环化产物。第一个使用(:18制备型柱(238TP1022Vydac)，使用溶液 A(水中的0. 12% TFA)至溶液B(乙腈中的0. 10% TFA)的线性梯度在60分钟内运行直至 60% B。所获得的色谱的图谱显示于图6。主要的成分(在图6中以数字1标记)最终通过 C18分析型柱(218TP54Vydac)在60分钟内以溶液A至40% B的线性梯度运行(图6的插 入图)。通过分析型HPLC、氨基酸序列和质谱分析确定合成毒素的结构和纯度。在Beckman LF3000 ProteinSequencer(Fullerton， CA)上进行氨基酸序列测定，在FinniganLCQDu° spectrometer (San Jose，CA.USA)上进行质谱分析。通过直接Edman降解至残基数目30进 行氨基酸序列正确性的验证。从HPLC柱的洗脱时间恰好与从相同柱在相同条件下洗脱的 天然肽的时间一致。在图7中显示了以天然Vm24(图7A)、这里描述的合成的Vm24(图7B) 以及天然和合成的Vm24的等摩尔混合物所获得的洗脱式样的例子(图7c)。质谱所确定的 分子质量是3864Da，这显示其恰好对应于期望的序列。值得注意的是，所用的树脂是为了产 生C-末端酰胺化肽所设计的，正如Vm24的例子那样。 从约1.7克的含有合成制备的肽(其具有期望的Vm24的初级序列)的树脂中，获 得了约300毫克正确折叠的肽，这代表30%的理论预期产率值(从起始树脂)。
实施例6 :氨基酸序列的比较 SEQ NO :1和SEQ NO :2的序列与其它的被分到a -KTx家族的短链蝎子毒素具有 一定的相似性[Tytgat等人，1999]，例如短的肽链、富含碱性氨基酸残基以及相似的半胱 氨酸式样。此家族的所有成员均为结构上相关的且具有相似的钾通道阻断剂功能；但是， 它们显示出对于特定类型和亚型的钾通道的可变的选择性[Rodriguez de la Vega and Possani，2004 ;Panyi等人，2006]。国际专家组建议的分类的原理是给定亚家族可以通 过其成员之间的高百分率的相似性并且与其它亚家族的成员的低同一性而被鉴别[Tytgat 等人，1999]。后来证明此区别在一定程度上反映出多数亚家族的药理学谱[Rodriguez de la Vega等人，2003 ;Zhu等人，2004]。因此，考虑到家族的相对受限的可变性_由于其 减小的尺寸-重要的是鉴定赋予给定功能谱的分子和结构特征。这种类型的分析通常通过 序列对比和系统发生推论来进行。这些对比后面的想法依赖于以下假设那些属于相同的 世系的蛋白应该通过祖先基因的复制和发散之后的物种形成或伴随祖先基因的复制和发 散的物种形成的事件而相关，使得可能通过生物信息学分析重新构建它们的进化史并且帮 助清洁给定序列空间内的适合度景观(fitness landsc即e) [Thornton和DeSalle， 2000 ; 0rengo禾口 Thornton,2005]。 使用在本地比对中进行启发式搜索的程序(BLAST[Altschul等人，1990]和FASTA 3[Pearson and Lipman， 1988])用于鉴定Vm24和Vm23的序列相似性，鉴定出极少的亲戚， 期望值非常低(E-value > 10_5)。对至今所报道的所有短链毒素进行更近的调查发现Vm24 和Vm23可能是a -KTx亚家族6的新成员(按照[Tytgat等人，1999]的建议)。但是，成 对对比揭示出其与该亚家族的其它成员的低同一性(图8) 。 a -KTx家族的广泛序列变化 使得非常难以解决Vm24和Vm23是否属于任何以前所鉴定的20个a -KTx亚家族的问题。 为了明确与a-KTx家族的关系，按照以前的描述，使用MrBayes 3. 04b[Huelsenbeck andRo卿ist，2001 ;Ronquist andHuelsenbeck， 2003]，使用属于a-KTx家族的92个序列的多 重序列比对，进行了 Bayesian系统发生推论分析[Bagdany等人，2005] 。 Bayesian系统发 生推论评估给定的树拓扑学(通过基于Markov chain Monte Carlo (MCMC)的取样程序) 相对于n-1推测性地产生的树的较晚的概率。 一个Markov链保持在树拓扑学内以最佳较 晚概率以给定的取样程序的步骤启发式地搜索；在特定氨基酸替代模型下被评估(总体过 程被称作Metropolis coupling Markov chain Monte Carlo或MC3)。为了进行这个分析， 具有250， 000个树的四个链中的每个均在JTT氨基酸取代模型下产生并且每第250次反复 取样。在约175， 000个反复获得合并，将剩余的具有最佳较晚概率的250个树合并以计算 50%多数规则一致性树(majority rule consensustree)。该树清晰地显示出a-KTx亚 家族的6个分离系，在最终的树系列的92%，作为包括其所有成员和来自亚家族7的两个 紧密相关毒素的单源性组。分析也将Vm24和Vm23置于该进化枝(特异性分割占最终树的 81%，见图8)的姐妹组内；这强烈支持Vm24和Vm23构成一个新的a-KTx亚家族。基于这 些分析并且考虑到国际专家组所建议对钾通道特异性蝎子毒素的分类规则[Tytgat等人， 1999]，可以确定的是Vm23和Vm24构成识别钾通道的蝎子毒素的新的亚家族。像其它的钾 通道阻断剂亚家族一样，这些毒素之间的最高的序列同一性位于C-末端部分。N-末端区段 是该亚家族的最可变的区域，只有Vm24和Vm23在序列的开头呈现出不寻常的连续性三元 组丙氨酸区段。 实施例7 :Vm24选择性阻断T细胞的电压门控hKvl. 3通道而非(^2+激活的钾通道 hIKCal Vm24对hKvl. 3通道的高度亲和性阻断 在人类外周血T细胞上内源性表达的通道[Peter等人，2001 ;Bagdany等人， 2005]中鉴定了 Vm24对hKvl.3通道的阻断。获得T细胞以用于电生理学实验的程序的简 单描述如下。从健康志愿者中获取肝素化人类外周静脉血。通过Ficoll-Hypaque密度梯 度离心分离单核细胞。以不含Ca2+和Mg2+的Hank溶液(其含有25mM HEPES的缓冲液，pH 为7.4)洗涤收集的细胞两次。在37°。，在5% C02孵箱中，在24孔培养板中，在RPMI-1640 培养基(其补充了 10% FCS/Hyclone， Logan， Utah, USA ;100ii g/ml青霉素；100ii g/ml链 霉素和2mM L-谷氨酰胺)中，以0. 5X106/ml的密度培养细胞3_4天。培养基还含有6或 g/ml植物血球凝集素A(PHA-P， Sigma-Aldrich Kft， Hungary)以增强钾通道的表达 [Deutsch等人，1986]。按照Matteson和Deutsch (Matteson等人，1984)的描述，通过以小 鼠抗人CD2(Becton-Dickinson， San Jose， CA， USA)温育T淋巴细胞然后选择性粘附至包 被了山羊抗小鼠IgG抗体(Biosource， Camarilo， CA， USA)的皮氏培养皿而选择用于电流 记录的T淋巴细胞。以lml正常的细胞外电解液介质(见下)轻轻洗涤培养皿5次以用于 膜片钳实验。 使用与个人电脑相连的Axopatch 200A或Multiclamp 700B扩增器，使用 AxonDigidata 1200或Digidata 1322A数据获取硬件在电压-钳T细胞中测定全细胞电 流。使用达85%的系列电阻补偿以使电压误差最小化并达到良好的电压-钳条件。为了 数据获取禾口分析使用pClamp8或pClamp9软件包(Molecular Devices Inc. ， Su皿yvale， CA)。在分析全细胞电流之前，痕迹进行欧姆泄露的校正并进行数位过滤(3点波串光滑处 理)(3point boxcar smoothing)。高程度电流阻断时的电流峰值的确定通过以下进行将上升的四次方指数函数拟合为数据痕迹[Hodgkin-Huxley model]，时间常数固定于在不存 在毒素时所确定的那个，从而分离上升成分的振幅。 从Clark GC 150F-15硼硅酸盐玻璃毛细管在五个阶段拉出移液管，磨光的发热 引起电解液中2-3兆欧姆的电阻。电解液由以下组成(以mM计)145NaCl、5KCl、lMgCl2、 2. 5CaCl2，5. 5葡萄糖、10HEPES(pH 7. 35)，补充了 0. lmg/ml牛血清白蛋白(Sigma)。所测的 外部溶液的渗透压浓度为302至308毫渗量(m0sm)。移液管填充溶液(内部溶液)由以下 组成(mM) :140KF、2MgCl2、lCaCl2、10HEPES、llEGTA(pH 7.22)。所测的内部溶液的渗透压浓 度为约295m0sm。使用引力-流灌注(以6个输入线设定)和PE10聚丙二醇管输出端(带 凸缘的缝隙)实现所测细胞(具有不同测试溶液)周围的电解液灌注，以减少水流的紊乱。 持续除去多余的液体。 激发T细胞中的电压钾电流的标准电压方案由一系列的来自-120!1^保持电位的 14-ms-长去极化至+50mV组成。电压脉冲间的时间设定为15秒以避免hKvl. 3通道的累 积性灭活。在图9A(对照)中显示了正常电解液中的代表性电流痕迹。在所应用的实验条 件(移液管填充溶液中缺少Ca2+和电压方案的本质)下，全细胞电流完全由hKvl.3通道传 导[Peter等人，2001]。图9A显示在通过灌注向外部溶液加入lnM的Vm24之前(对照痕 迹)和之后，在相同细胞中依次记录的通过hKvl.3通道的巨观钾电流。在lnM的Vm24存 在时，Kvl. 3电流在第12次脉冲时(对应于3分钟)完全消失。 在图9B中显示了以lnM(实心圆)和0. 3nM(空心圆)浓度的Vm24的阻断的发展 动力学。在对照溶液中的第4次脉冲之后，细胞外灌注转换为含有毒素的溶液，去极化脉冲 每15秒持续。确定电流峰值并以对照溶液中的电流峰值标准化，并且作为时间的函数。图 显示在更高的毒素浓度时，阻断的发展的动力学较快，如从毒素和通道之间的拟一级反应 所期望那样，但是，两种毒素浓度均达到了全细胞Kv1.3电流的完全阻断。lnM浓度的Vm24 的数据来自如图9A所示的实验。以不含毒素的对照溶液灌注记录腔引起在首8分钟内的 非常小的阻断的减轻(未显示)。以3pM的浓度在10. 5分钟时间内施用毒素(图9C)的 过程中，电流的减少似乎饱和于对照溶液中所记录的峰值的 36%。这个阶段之后进行30 分钟的清除期(箭头标明以不含毒素的溶液的灌注的开始)，其中所阻断电流的三分之一 以非常缓慢的动力学恢复(清除的估计时间常数为 3800秒，对应于 2. 6X 10—4s—1的断 开速率)。 蝎子毒素阻断钾通道的一般机理是当其结合至通道的细胞外前庭时，堵塞离子 传导途径[Goldstein and Miller, 1993]。但是，在Vm24存在时电流减少的缓慢和不完全 可逆性可能指示该肽对于膜而非阻断hKVl. 3的非特异性效应。我们对此情况的反驳如下 1)电流减少的发展速率(在高毒素浓度时)取决于Vm24的浓度，在较高毒素浓度时更快 (图9B) ;2)在毒素存在时泄露电流不增加，这表明不存在Vm2对膜的一般性破坏；3)Vm24 不抑制其它几个钾离子电流或迅速且可逆地抑制它们(参见后面的毒素的选择性图谱)， 这强烈地驳斥了毒素对细胞膜结构的非特异性作用或者是毒素诱导的一般的膜蛋白功能 的丧失；4)同时使用ChTx ( —种广为人知的Kvl. 3孔阻断剂)和Vm24显示出两种毒素对相 同结合位点的竞争，这由以下所证明Vm24的阻断动力学随着渐增浓度的ChTx而减慢(数 据未显示)。 在图9图板D中显示了毒素的非常缓慢的开启和闭合速率对于剂量-反应性
34关系的产生所施加的限制。总体上说，对于以不同浓度肽对通道的平衡阻断，剩余电 流分数(RCF)按照1/1。计算，其中I和1。分别是在毒素存在和不存在时所记录的电 流峰值。由于在低浓度肽时非常低的开启速率，I的确定是有问题的，因为事件至事件 (印isode-to-印isode)的电流峰值的下降如此之小以致在数据收集期间观察到明显的饱 和，虽然阻断可能还未达到平衡值。较长毒素的应用被全细胞膜片钳所记录的电流峰值的 稳定性所限制。此外，由于肽的极长的排药时间间隔，峰值的裁减不能独立被确定。因此， 图9D中显示的数据代表不同浓度毒素时的1/1。值的上限，因此，从剂量_反应性关系所估 计的Kd也是真实Kd的过高估计。图9D中的剂量-反应性关系拟合于RCF = Kd7(Kdn+[Tx] n)函数，其中[Tx]代表毒素浓度，Kd是解离常数，n是Hill系数。重叠的实线显示了以参 数Kd二 2.9pM和Hill系数 1的最佳拟合。误差条代表SEM(n = 3-6)。 Hill系数的n l值代表与通道相互作用的单一毒素分子(1 : l化学计量)。据我们所知，在电生理学测 定中Vm24作为hKvl. 3的阻断剂具有最高的亲和性。
Vm24是hIKCal通道的低亲和性阻断剂 如在实施例7的介绍中所指明的，肽作为选择性免疫抑制剂的一个最重要的要求 是其对于Kvl. 3而非IKCal的选择性。IKCal通过也在T细胞中内源表达[Grissmer等人， 1993]。可使用含有lyM游离Ca"浓度的移液管填充溶液(其足以完全激活这些通道)测 定IKCal通道的电流[Grissmer等人，1993]。但是，在相同的细胞同时存在Kvl. 3通道， 这使得IKCal通道的药理学鉴定变得困难且限制了 Kvl. 3通道不被激活的膜电位的研究 [Grissmer等人，1993 ;Bagdany等人，2005]。这种情况以及甚至在受剌激的T细胞中的相 对少数量的IKCal通道促使我们使用重组通道来研究IKCal药理学。 使用脂质体2000试剂根据生产商(Invitrogen， Carlsbad， CA， USA)的指示将 EGFP-标记的人类IKCal基因(AF033021)转染入Cos_7细胞。以前已经表明EGFP-标记的 hKCal克隆具有和T细胞中的天然IKCal相同的生物物理学和药理学性质，因此，已经被广 泛应用于药理学研究[Wulff等人，2001]。 Cos-7细胞保持于标准细胞培养条件[Bagdany at al，2005]。在转染后2_3天记录电流。使用Nikon TE2000U荧光显微镜鉴别GFP阳性 转染子并用于电流记录。正常的细胞外溶液与上述的相同。移液管填充溶液的组成为(以 mM计):150K-天冬氨酸盐、5HEPES、10EGTA、8. 7CaCl2、2MgCl2， (pH 7.2)。此溶液含有1 P M 游离Ca"浓度以完全激活hlKCal电流。所有的其它记录条件(数据获取，灌注等)与上述 Kvl.3通道所描述的相同。 使用-120mV保持电位的从_120mV至+50mV的200毫秒长的电压起伏激发Cos-7 细胞中的hIKCal电流(起伏速度为0.85mV/ms)。每10秒允许电压起伏。在图9E中显 示了不存在Vm24时(对照)所记录的电流痕迹，通过使用电压方法而激发非电压门控的 hIKCal电流。电流的逆转电位是-75mV，其为基于记录溶液的离子组成的钾电导的特性。对 于IKCal电流，可使用线性电流-电压关系的斜率来鉴定电流阻断[Grissmer等人，1993]。 在图9E所示的实验中，在存在10nM的Vm24时，s值降至对照的 52% ，在4. 5分钟(27个 事件)内达到平衡阻断。在将灌注液转为不含毒素的细胞外溶液时，在2.5分钟内电流阻 断完全逆转(图9E，洗涤)。在lnM和10nM浓度的Vm24时的剩余电流分数按照s/s。计算， 其中s和s。分别是存在和不存在Vm24时由电压起伏所激发的I-V关系的斜率，其显示于 图9F。误差条代表了 n = 3独立实验的SEM。在lnM的浓度时，Vm24实际上不阻断hIKCal
35通道(图9F)而在相同浓度时肽完全阻断hKvl.3通道(图9D)。可以从模型(其中l个 毒素分子干扰1个通道)中评估Vm24对于hIKCal的Kd，给出的Kd 14nM。考虑到对于 hKvl. 3所确定的Kd(2. 9pM) ， Vm24对于hKvl. 3的选择性相对于对于hIKCal的选择性为至 少 4500倍。 实施例8 :Vm24的选择性图谱 在本研究中所使用的所有通道构建体为药理学和生物物理学测定中常规使用的， 其应用在所列的参考文献中得到证实。 瞬时转染使用Cos-7细胞表汰大鼠Kv2. 1 (rKv2. 1,由U. of Connecticut的 Dr. S. Korn惠赠)[Immke等人，1999];人类Kvl. 2(hKvl. 2，包含Kvl. 2全长编码序列的 pcDNA3/Hygro载体，由U. of Ulm， Germany的Dr. S. Grissmer惠赠)[Visan等人，2004];人 类Kvl. 4 (hKvl. 4 A N :Kvl. 4的灭活球缺失型突变体，由Universityof British Columbia, Vancouver, Canada的D. Fedida惠贝曾)[Kurata等人，2004];禾口人类Navl. 5 (由Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA， USA的R. Horn,惠贝曾)
通道。使用tsA-201细胞用于表达hBK通道(hSlol基因(U11058)，在 pCI-neo质茅立中，由University of Pennsylvania, Philadelphia, PA的Toshinori Hoshi 惠赠)[Avdonin等人，2003]。使用脂质体2000试剂根据生产商(Invitrogen， Carlsbad, CA， USA)的指示，以l : 5的摩尔比率，使用编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒所有这些通道克隆 进行瞬时共转染，并在标准条件下培养。在转染后2-3天记录电流。使用Nikon TE2000U 荧光显微镜鉴别GFP阳性转染子并用于电流记录(共转染> 70%的成功率)。
稳定的细胞系以前已经描述了稳定表达mKv 1. 1的L929细胞和稳定表达hKvl. 5 通道的MEL细胞，其由Dr. Heike Wulff(UC Davis， CA， USA)惠赠。在HEK-293细胞系中以 稳定方式表达hERG通道。 按照如实施例7中所述记录全细胞电流。在所有的情况下使用标准的细胞外和移 液管填充溶液(见实施例7)，除了记录hBK电流以夕卜，记录hBK电流时的移液管填充溶液组 成为(以mM计):140KC1、10EGTA、9. 69CaCl2、5HEPES(pH7. 2)。后者溶液中的游离Ca2+浓度 为[Ca2+]int = 5iiM，其允许在中度去极化电位记录BK电流[Avdonin等人，2003]。所有的 其它实验条件(数据获取、分析原理、灌注)与实施例7中描述的相同。
在图IOA至10E中显示了在标准细胞外溶液(对照)中所获得的Kvl家族成员 (mKvl. 1、 hKvl. 2、 hKvl. 3、 hKvl. 4 A N、 hKvl. 5)的电流痕迹。在所用的情况下，细胞保持 于-120mV的保持电位，并反复去极化至+50mV以激发电流。去极化脉冲持续的时间(在图 10的每个图板中单独标明)设定为允许完全激活电流并使失活最小化。在所有情况中，在 保持电位(-120mV)在脉冲之间允许足够的时间以使通道从任何残余失活中完全恢复(脉 冲间间隔为15至30秒)。在本研究中使用迅速(N型)失活移除版本的hKv 1 4 (hKv 1. 4 A N， N-末端的147个氨基酸被删除)。在不存在N型失活时确定电流阻断是较容易且更精确的， 因为该克隆中的电流峰值不受非常迅速的失活过程影响(时间常数15-20ms， [Kurata等 人，2004])。在野生型通道中，由于时间依赖性电流激活和失活的竞争，电流峰值被低估，这 使电流阻断的分析变得复杂。 图10显示在施用毒素前(对照)、经10nM的Vm24平衡阻断后和洗脱毒素后 (wash)所记录的电流痕迹。图板分析显示hKvl. 4和hKvl. 5通道实际上对于Vm24是不敏感的(还参见图12B中的条形图)。但是，在10nM浓度(这是对于hKvl. 3的Kd的 3500 倍)时Vm24显著性阻断mKvl. 1通道(RCF = 0. 80±0. 02， n = 3)禾口 hKvl. 2通道(RCF = 0. 54±0.08， n = 3)。此外，hKvl. 2的阻断不是完全可逆的。为了更容易比较Vm24作为 Kvl通道阻断剂的力度(RCF = 0.01 ±0.01， n = 3)，在图10C中显示了 10nM浓度的Vm24 对hKvl. 3电流的阻断(在人类T细胞中记录)。由于对mKvl. 1和hKvl. 2电流的显著性阻 断，也在较低浓度(InM)时测试了 Vm24(图12A)。在InM的浓度时，对于mKvl. 1和hKvl. 2 电流，RCF值分别为O. 97±0. 02(n = 3)和0. 81 ±0. 015 (n = 3)。从RCF值中可以从模型 (其中1个毒素分子干扰1个通道)中评估Vm24对这些通道的亲和性，给出对于mKvl. 1 为30-40nM的Kd值，对于hKvl. 2为5_10nM的Kd值。考虑到对于hKvl. 3所确定的的Kd值 (2. 9pM) ，Vm24对于hKv1. 3的选择性相对于mKvl. 1和hKvl. 2的选择性分别为至少 10000 倍和1500倍。 还确定了 Vm24抑制其它的具有显著生物学效应和易于被动物毒素阻断的离子 通道活性的能力。这些包括rKv2. 1和hERG(Kvll. 1)电压门控钾通道、Ca"激活的钾通道 hBK(Kcal. 1)和心脏电压门控钠通道N 1. 5。图11显示了在标准细胞外溶液(对照)中 使用对于给定通道合适的电压方案激发的代表性的全细胞电流。从来自保持电位_120mV 的分别对+50mV和OmV去极化反应所获得的记录确定Kv2. 1和Navl. 5的电流峰值(图11A 和11D)。表达hERG通道的HEK293细胞保持在_80mV，去极化至+20mV 2. 5秒以激活和灭 活通道(图11B)。然后进行-40mV的，其中灭活的通道迅速恢复，可以确定hERG电流峰值。 这个复杂的电压方法对于记录hERG电流是标准的。BK通道通过膜的去极化被激活(图 11B)，但是，开启概率的电压依赖性取决于细胞内游离Ca2+浓度。在本实验中施用5iiM浓 度的游离[Ca2+]时，50X以上的通道在+50mV被激活，因此，可能比较Vm24在与那些用于其 它Kv通道的膜电位相同的膜电位时的效应。在+50mV时BK通道的完全激活需要与稳定的 全细胞记录不相容的[C^+]，相反，在5iiM游离[Ca2+]时BK通道的完全激活需要去极化至
> +100mV。因此，5 ii M游离[Ca2+]和+50mV测试电位的组合是合理的用以研究Vm24效应 的妥协。测试脉冲前至-120mV的脉冲用于检测非特异性泄露。脉冲方案之间的保持电位 是OmV，即所有的Kv通道完全失活，从而减少在tsA-201细胞中零星发现的内源性Kv电流 对于记录的污染。在该膜电位时BK通道已经是激活的，如在脉冲开始时显著性的保持电流 所证明。 为了测定Vm24对图11中显示的不同通道的效应，细胞被反复去极化以在不同细 胞外溶液中激发电流。图11显示在施用毒素前(对照)、施用10nM的Vm244-7分钟后和洗 脱毒素后(wash)所记录的代表性的电流痕迹。图11的所有图板显示在存在Vm24时记录 的电流与对照溶液中记录的和洗脱后记录的电流是不可辨别的，这表明缺少对这些通道的 阻断。在图12B中显示了统计学分析，其中显示在存在lOnM的Vm24时的剩余电流分数的 平均数和SEM(n > 3)。 图12中显示的数据表明Vm24对于各种钾通道的阻断力度的顺序为hKvl. 3 >
> > hKvl. 2 > hIKCal > mKvl. 1 > > > hKvl. 4 " hKvl. 5 " rKv2. 1 " hERG " hBK " hNavl. 5。基于从剂量_反应关系获得的对于hKvl. 3的Kd值和对其它通道的Kd值的单点估计(即， 从lOnM的Vm24的数据和假设1 : 1毒素_通道化学计量时的电流剩余部分计算)，Vm24 对于hKvl. 3的选择性相对于对于本研究中检验的其它通道而言> 1500倍。这个值远远超过了广为接受的选择性标准[Giangiacomo等人，2004]，即定义为在对于结合至两个不同 的钾通道(A AGchl;ch2 > 2. 72kcal/mo1的Chi和Ch2)的a -KTx，其平衡解离常数或结合 自由能中的100倍的差异。 实施例9 :合成的Vm24是与天然毒素同样有力的hKvl. 3阻断剂
如实施例5中所述，理论上和实际中的考虑引起Vm24的化学合成。如所描述的， 通过分析型HPLC，氨基酸序列和质谱测定确认了合成毒素的结构和纯度。所有这些方法表 明合成Vm24(sVm24)的初级序列与天然肽的初级序列相同。此外，用于产生sVm24的方案 使用了不同的硫醇保护基团，设计为确保折叠被限定为与天然肽中的二硫对相同。但是，这 些数据不保证肽的生物学活性被保持。调节高亲和性阻断的通道和肽的互补性表面是非常 复杂的，相对于天然肽结构的最小化偏差可能破坏sVm24阻断Kvl. 3的功效[Giangiacomo 等人，2004]。 在人类T细胞的Kvl. 3通道上测试了 sVm24的生物学活性。该研究的实验条件与 实施例7中描述的是完全相同的。在存在不同溶液时，从-120mV的保持电位将全细胞膜 片钳化T淋巴细胞每30秒反复去极化至+50mV(图13A)。当通过灌注仪器施用100pM的 sVm24时，不存在sVm24时(对照)所测的hKvl. 3电流逐渐地且几乎完全消失。在第16 次脉冲后以不含毒素的细胞外溶液灌注记录腔。从灌注溶液中除去毒素没有引起在5分钟 内的hKvl. 3阻断的显著缓解。在图13B中对此进行了更清晰的证明，其中峰电流(以施用 sVm24前对照溶液中所记录的电流进行标准化)(标准化峰)作为时间的函数显示。箭头标 明开始以sVm24(100pMsVm24)灌注以及转为以不含毒素的溶液灌注(洗脱)。在图13B中 比较了以100pM的sVm24或Vm24阻断平衡后所测的剩余电流分数(RCF) (n分别等于6和 4，条代表SEM)。统计学比较(t-检验)表明两组的RCF之间无统计学差异(p = 0. 57)。我 们的结论是sVm24对hKvl. 3通道的阻断与天然毒素一样有力。
实施例10 :Vm23对不同离子通道的生物学活性的分析 蝎子毒液包含过剩的生物学活性肽。给定物种的毒液通常含有高度序列同一性 的肽，如墨西哥蝎子(V. mexicanus)中的Vm23和Vm24的例子(见实施例1)。肽的高度序 列同一性通常赋予各个分子相同的生物学活性。这来源于以下事实肽毒素与位于离子通 道的外侧前庭的毒素受体的相互作用是由多种机制决定的，包括远程静电、短程静电和近 接触相互作用，这些因素的净效应决定结合的亲和性和选择性[Park and Miller, 1992; Peter等人，2001 ;Giangiacomo等人，2004]。以前已经表明同一种蝎子的两种肽(帝王蝎 (P. imperator)的Pi2和Pi3)，其只差一个氨基酸，均以亚纳摩尔的浓度阻断Kvl. 3[Peter 等人，2001]。 Miller和合作者的先行性研究[Goldstein等人，1994]也证明，甚至是北非 蝎毒素中几个位置的非保守氨基酸替换也是良好耐受的且毒素保持其对于Shaker钾通道 (例如T9K和N22K)的亲和性。为了证实Vm23和Vm24之间的差异对它们对于Kvl. 3的亲 和性和特异性的改变不是显著的，也详细检验了 Vm23的药理学谱，如下所述。
检验了 Vm23对于人类T细胞的Kvl. 3通道和对于mKvl. 1、 hKvl. 2和hIKCal通 道的离子通道阻断力度。基于这些通过相关肽即Vm24(Vm24与Vm23具有83%的序列同一 性)的低亲和性(mKvl. 1、 hKvl. 2和hIKCal)或高亲和性(hKvl. 3)阻断，在本研究中包括 了这些通道。实验条件与实施例7和实施例8中的对应通道所描述的完全一样。
在存在不同溶液时，从_120mV的保持电位将全细胞膜片钳化T淋巴细胞每15秒反复去极化至+50mV(图14A)。当通过灌注仪器施用10nM的Vm23时，不存在Vm23时(对 照)所测的hKvl. 3电流在3. 5分钟内几乎完全消失。标记为"10nM Vm23"的痕迹是在阻 断平衡后所记录的。在第19次脉冲后以不含毒素的细胞外溶液灌注记录腔(洗脱)。从 灌注溶液中除去毒素没有引起在2分钟内的hKvl. 3阻断的显著缓解。在图15中显示了以 10nM的Vm23阻断平衡后所测的剩余电流分数(RCF) (n = 3，条代表SEM)。这些结果表明 Vm23介导的hKvl. 3通道的阻断的特征与Vm24介导的阻断是非常相似的阻断是高亲和性 的，毒素的关闭状态是非常缓慢的，超过了本检验所用的时间限。Vm23的有限数量(毒液的 0. 5%以下的毒液是Vm23)排除了对hKvl. 3阻断的剂量-反应关系的确定和相对于Vm24 的解离常数的正确的统计学比较。 在加入10nM的Vm23前记录的电流(对照)、加入10nM的Vm23后3. 5分钟记录 的电流和洗脱毒素后记录的电流(2分钟)显示10nM的Vm23实际上既不阻断hIKCal通 道(图14B)也不阻断mKvl. 1通道(图14C)(参见实施例7和实施例8对应部分的实验细 节)。Vm23完全不阻断hlKCal，这与Vm24的效应是不同的，Vm24在相同的浓度时阻断 40%的该通道(参见图9F)。另一方面，10nM的Vm23轻微阻断hKvl.2通道(图14D)，给出 的RCF值为0.91士0.02(n二 3，SEM，图15)，在2分钟内阻断不容易反转。同样浓度的Vm24 阻断 46%的该通道(参见实施例8)。将存在10nM的Vm23时hKvl. 3、 hIKCal、 mKvl. 1和hKvl. 2的剩余电流分数(图 15)与Vm24所获得的数据(图12A和B)相比较后表明对于所测的通道，Vm23对hKvl. 3 的选择性谱稍好。还可从比较中得出结论虽然Vm23和Vm24存在一级结构上的差异，但是 保持了以显著性的选择性对hKvl. 3的高亲和性阻断。
实施例11 :Vm24的体内免疫学效应 世界上数以百万的人被自身免疫性疾病所影响，例如但不限于，其中有，多发性硬 化症、类风湿性关节炎、1型糖尿病、自身免疫性牛皮癣、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、交感性眼 炎、骨吸收牙周病、免疫性血小板减少性紫癜和自身免疫性淋巴增生综合征。现在人们认 为这些疾病的发生包括静止的疾病特异性自身反应性T细胞的激活，其被转化为效应记 忆T细胞(TEM)。由于反复的自身抗原剌激，自身反应性T细胞可从原始状态分化为持续激 活的记忆T细胞，并且通过迁移进入组织、分泌炎性细胞因子和表现瞬时效应子功能从而 促进炎性损伤[Sallusto等人，1999]。迟发型超敏反应(DTH)中包含的机理是T皿细胞引起 的皮肤损伤的另一个例子[Soler等人，2003]。很多自身免疫性疾病的病理学也可能是由 于记忆B细胞，特别是那些属于类别转换的CD27+IgD—亚群[Iglesias等人，2001 ;0'Connor 等人，2001 ;Corcione等人，2004]。由于这些原因，需要开发能够选择性地靶向TEM和类别 转换的记忆B细胞的治疗性试剂而不破坏其它淋巴细胞亚群细胞的活性，从而以这种方式 避免破坏急性免疫应答。如本发明的上面实施例7至10中所提到的，电压门控Kvl. 3通 道是用于lEM和类别转换的记忆B细胞的免疫调节新的治疗性靶标。T^细胞在激活后上调 Kvl. 3并且其抗原驱动增殖对于已知的阻断Kvl. 3通道的物质是非常敏感的[Wulff等人， 2003]。相反，原态和la对Kvl. 3阻断剂敏感性差很多，通过上调钙激活的钾通道K^3. 1而 迅速变成对Kvl. 3阻断有抵抗性[Wulf f等人，2003 ;Chandy等人，2004]。在分化过程中，B 细胞和T细胞的钾通道依赖性由KCa3. 1改变为Kvl. 3[Wullf等人，2004]。由于这个事实， Kvl. 3通道阻断剂抑制这些细胞的增殖，而不影响原态和CD27+IgD+记忆T细胞。因此，使
39用对Kvl.3通道特异性的阻断剂可优先影响1^和类别转换的记忆B细胞，而不破坏大量的 免疫应答，但是改善由于自身免疫性疾病而发展的健康状况。Kvl.3通道的阻断减轻动物模 型中的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)、牙周病中的骨吸收和DTH反应，而不引起显而易 见的副作用[Koo等人，1997 ;Beeton等人，2001 ;Valverde等人，2004]。由于通过肽阻断 Kvl. 3通道是迅速可逆的，因此允许控制治疗的过程，而当使用化疗试剂或单克隆抗体时， 情况不是这样，使用化疗试剂或单克隆抗体需要几个月平息。显而易见地，主要问题是找到 对这种治疗性处理高度选择性的肽[Chandy等人，2004]。 如前面描述的实施例7至10所示，本发明的目标的两个肽(Vm23和Vm24)均为体 外Kvl. 3通道的有力的和特异性的阻断剂。使用培养的人类T细胞和其它的表达电压依赖 性钾通道的细胞直接进行实验，以证实作用的选择性。为了 "概念证明"的目的，使用经二 硝基氟苯(DNFB)(作为能够引发重要的DTH反应的试剂)致敏的大鼠进行了体内实验。
为了进行这种实验，我们建立了研究大鼠中的DTH反应的方案。所用的系统基本 上是如Pha皿phak等人1974年所描述的。简单来说，在连续两天内(第1天和第2天)，在 轻轻对动物脊背后区域刮毛后，使用40微升0.7X的DNFB(在4 : 1比例的丙酮橄榄油 溶液中)将两组大鼠(每组3或5只)致敏。在第二次施用致敏溶液7天后，通过单一施 用20微升0. 4X的DNFB(溶于上述的丙酮橄榄油溶液中)剌激动物。将该溶液涂敷于右 耳的脊背表面并让其干燥，而左耳只以介质溶液(丙酮橄榄油)涂敷。在方案的第8天， 向用作对照的每只动物通过皮下注射100微升pH7. 8的磷酸盐缓冲液(PBS)，而向实验组大 鼠通过皮下施用溶解于100微升PBS中的10微克纯的Vm24。在施用Vm24后24小时测定 所有动物的两只耳朵的厚度。 实验的结果显示于图16。可以清晰地看出，没有接受Vm24注射的对照动物具有 0. 32mm数量级的平均炎性值(标记为对照)，而那些以一剂10微克Vm24处理的大鼠具有 减少的炎性，不超过O. 10mm的厚度。这些数值对应于真实的发炎过程，因为已经减掉了未 剌激的耳朵(左耳)的厚度。这代表发炎过程净较少超过60%。结论是，这些结果支持以 下设想Vm24是大鼠中DTH反应的重要的免疫抑制剂。因此，其当然是值得测试作为依赖 于T和B淋巴细胞激活的免疫性疾病(其中Kvl. 3通道的作用对于引起或保持疾病是重要 的)的抑制剂的先导性成分。
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s，p，萨拉斯-卡斯蒂略
C*V*费雷拉巴蒂斯塔
Z S 巴尔加
G'保尼
R 加斯帕尔
〈120>Vm23和Vm24，两种以高选择性阻断人类T淋巴细胞钾通道(Kvl. 3亚型)并降低 大鼠的体内
DTH反应的蝎子肽
〈130>Vm
〈160>3
〈170>PatentIn version 3.3
〈210>1
〈211>35
〈212>PRT
〈213>墨西哥蝎子(Vaejovis mexica皿s smithi) 〈400>1
Ala Ala Ala lie Ser 1 5 Lys Ala Gin Gly Cys 20
Cys Tyr Cys 35
〈210>2 〈211>36 〈212>PRT 〈213〉墨西哥蝎子 〈400>2
Ala Ala Ala lie Ser 1 5 Arg Ala Gin Gly Cys 20
Cys Tyr Tyr Cys 35
50
Cys Val Gly Ser Lys Glu Cys Leu Pro Lys Cys
10 15 Lys Ser Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys Cys Lys 25 30
Cys Val Gly Ser Pro Glu Cys Pro Pro Lys Cys
10 15 Lys Asn Gly Lys Cys Met Asn Arg Lys Cys Lys 25 30
权利要求
一种分离和纯化的肽，所述肽由SEQ ID NO3或其功能等同类似物组成的，其中所述肽能够以高亲和性和特异性阻断钾通道Kv1.3。
2.根据权利要求l所述的分离和纯化的肽，其由SEQ工D N。l组成。
3.根据权利要求l所述的分离和纯化的肽，其由SEQ工D N。2组成。
4.一种抑制哺乳动物细胞中KVl.3钾通道活性的方法，包括将所述哺乳动物细胞与有效量的肽接触以阻断所述细胞中的所述通道的活性，其中所述肽具有选自SEQ工D N。l、SEQ工D N。2或SEQ工D N。3的氨基酸序列或其功能等同类似物，或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类淋巴细胞。
6.一种减弱T淋巴细胞中钙信号途径的方法，包括将所述T淋巴细胞与有效量的具有KVl.3钾通道阻断活性的肽接触，其中所述肽具有选自SEQ工D N。人SEQ工D N。2、SEQ工D N。3的氨基酸序列或其功能等同类似物。
7.一种抑制哺乳动物免疫系统中T细胞激活过程的方法，包括将所述T细胞群体与有效量的具有KVl.3钾通道阻断活性的肽接触，其中所述肽具有选自SEQ工D N。人SEQ工DN。2、SEQ工D N。3的氨基酸序列或其功能等同类似物，或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述T细胞激活是由所述哺乳动物中的免疫应答引起的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述免疫应答是异源器官排斥的结果。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述免疫应答是自身免疫性疾病的结果。
12.一种抑制哺乳动物免疫应答的方法，包括向所述哺乳动物施用有效量的包含具有KVl.3钾通道阻断活性的肽的组合物以抑制所述哺乳动物中的所述应答，其中所述肽具有选自SEQ工D N。人SEQ工D N。2、SEQ工D N。3的氨基酸序列或其功能等同类似物，或其药学上可接受的盐。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫应答是异源器官排斥的结果。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫应答是自身免疫性疾病的结果。
15.一种预防性或治疗性处理有需要个体中的异源器官排斥的方法，包括向所述个体施用有效量的包含具有KVl.3钾通道阻断活性的肽的组合物，其中所述肽具有选自SEQ工D N。人SEQ工D N。2、SEQ工D N。3的氨基酸序列或其功能等同类似物，或其药学上可接受的盐。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述排斥的器官是心脏、肺、肝脏、肾脏或胰腺。
17.根据权利要求15所述的方法，其中需要所述处理的个体是人。
18.一种预防性或治疗性处理有需要个体中的与淋巴细胞TEu相关的自身免疫性疾病的方法，包括向所述个体施用有效量的包含具有KVl.3钾通道阻断活性的肽的组合物，其中所述肽具有选自SEQ工D N。人SEQ工D N。2、SEQ工D N。3的氨基酸序列或其功能等同类似物，或其药学上可接受的盐。
19.根据权利要求18所述的方法，其中需要所述处理的个体是人。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述与淋巴细胞T。.相关的自身免疫性疾病选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、工型糖尿病、自身免疫性牛皮癣、红斑狼疮、溃疡性结肠炎、交感性眼炎、骨吸收牙周病、免疫性血小板减少性紫癜或自身免疫性淋巴增生综合征。
21. 根据权利要求18所述的方法，还包括向所述个体中施用至少一种其它的免疫抑制剂。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中其它的免疫抑制剂选自环孢霉素、雷帕霉素、硫 唑嘌呤、波尼松、ShK毒素、ShK衍生物或去氧精胍啉，其衍生物，或其盐。
23. —种药物组合物，其包含至少一种具有Kvl. 3钾通道阻断活性的肽和药学上可接 受的载体，可选地包含至少一种其它的免疫抑制剂，其中所述肽具有选自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3的氨基酸序列或其功能等同类似物，或其药学上可接受的盐。
24. 根据权利要求23所述的药物组合物，其中可选的其它的免疫抑制剂选自环孢霉 素、雷帕霉素、硫唑嘌呤、波尼松、ShK毒素、ShK衍生物或去氧精胍啉，其衍生物或其盐。
25. 根据权利要求15所述的方法，其中组合物通过局部、全身、静脉内、腹膜内、肌肉 内、皮下、鼻内和经皮、口服施用或通过皮内注射、支气管内滴注、胃肠道输送或跨粘膜输 送。
26. 根据权利要求18所述的方法，其中组合物通过局部、全身、静脉内、腹膜内、肌肉 内、皮下、鼻内和经皮、口服施用或通过皮内注射、支气管内滴注、胃肠道输送或跨粘膜输 送。
27. —种以高亲和性和特异性与Kvl. 3钾通道结合的标记的肽，其中所述肽具有选自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3的氨基酸序列或其功能等同类似物。
28. 根据权利要求27所述的标记的肽，其中标记半体选自放射性同位素、荧光半体、化 学发光半体，发色团或蛋白。
29. 根据权利要求28所述的标记的肽，其中所述标记蛋白是抗体。
30. 根据权利要求28所述的标记的肽，其中所述标记蛋白是生物素。
31. 根据权利要求28所述的标记的肽，其中所述标记蛋白是绿色荧光蛋白。
32. 根据权利要求28所述的标记的肽，其中所述标记蛋白是源自绿色荧光蛋白的具有 不同发射光谱的蛋白。
33. —种鉴定表达Kvl.3通道的细胞的方法，包括以下步骤a)将靶细胞群体与以高 亲和性和特异性与Kvl.3钾通道结合的标记的肽接触，其中所述标记的肽具有选自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3的氨基酸序列或其功能等同类似物，经方便地标记；和b) 通过检测技术检测在所述靶细胞群体中存在的Kvl. 3钾通道结合的标记的肽。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞是人类淋巴细胞。
35. —种对给定细胞中表达的Kvl. 3通道的数目进行定量的方法，包括以下步骤a)将 所述细胞与以高亲和性和特异性与Kvl. 3钾通道结合的标记的肽接触，其中所述标记的肽 具有选自SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3的氨基酸序列或其功能等同类似物，经 方便地标记；和b)通过定量检测技术检测并定量与所述耙细胞群体中存在的Kvl. 3钾通道 结合的标记的肽。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞是人类淋巴细胞。
全文摘要
已知钾通道Kv1.3参与免疫性疾病和移植排斥。本发明公开了能够以高亲和性和特异性阻断钾通道Kv1.3的肽，其药物组合物以及将其用于阻断Kv1.3钾通道从而治疗各种免疫状况和诊断性应用的方法。还公开了其化学合成和正确折叠的方法。示例性肽对应于从墨西哥蝎子Vaejovis mexicanus smithi的毒液中分离的蛋白成分(Vm23和Vm24)。当施用于体外培养的人类淋巴细胞时，Vm23和Vm24以几乎不可逆的方式与hKv1.3通道结合，显示出3皮摩尔范围数量级的Kd值。化学合成了Vm24并用于体内实验以成功处理致敏大鼠(迟发型超敏反应)。在相对高浓度(测试了直至10,000微克每千克小鼠体重)注射时Vm24和合成的Vm24对小鼠均无毒性。这些肽(Vm23和Vm24)及其具有至少83％序列同一性的功能等同类似物是先导化合物，是用于治疗各种免疫状况和诊断性应用的候选者。
文档编号G01N33/94GK101796069SQ200780053305
公开日2010年8月4日 申请日期2007年5月14日 优先权日2007年5月14日
发明者C·V·费雷拉巴蒂斯塔, G·保尼, G·古罗拉-布里奥内斯, L·D·波萨尼波斯蒂, R·加斯帕尔, S·P·萨拉斯-卡斯蒂略, Z·S·巴尔加 申请人:墨西哥国立自治大学