专利名称：：检测原发性胆汁性肝硬化特征蛋白的质谱模型及制备方法
技术领域：
：本发明属于质谱检测
技术领域：
，特别涉及对原发性胆汁性肝硬化血液优化的质谱检测方法。一种通过能与蛋白质结合的磁珠基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测原发性胆汁性肝硬化生物标志。在此提及的此项发明涉及蛋白质检测领域，为一种新的非侵入性的体外质谱检测方法。本发明可以应用到已经脱离人体的体液中的原发性胆汁性肝硬化生物标志组合的检测方法或试剂盒。
背景技术：
：原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种慢性自身免疫性肝脏疾病，该病以肝内细小胆管非化脓性进行性破坏并伴门脉炎症性改变，长期持续性肝内胆汁淤积、最终导致肝纤维化和肝硬化的慢性进展性自身免疫性疾病为主要特征。近年的调査研究表明，PBC在世界范围内已经不再是罕见疾病，特别是在东方人群中，无症状的PBC患者可能远远超过我们现在估计的数量，而且PBC在中国人群中的发病率和死亡率可能都高于其它地方。目前，对于PBC诊断最可靠的方法仍然是肝脏组织病理活解。然而，很多PBC患者不愿意接受这种具有创伤性的侵入检查，很多接受检查的PBC患者肝脏组织病理活解并不能找到特征性的病理改变。除此之外，血清中高滴度的抗线粒体抗体(AMA)目前也作为诊断PBC的一个重要指标，但是该抗体对于PBC的诊断并不特异，在其它疾病状态，如感染性肝病等也经常出现，这对于像我们这样的肝炎大国来说显得非常不利。还有研究发现，1(m左右的PBC患者血清中检测不到AMA。由于现有的检测技术限制导致很多PBC患者到了疾病终末期才被检测，这一现状已经不能满足临床对于疾病早期诊断、早期治疗的要求，在临床医疗中仍然迫切需要诊断PBC的新方法。原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种慢性自身免疫性肝脏疾病，以肝内细小胆管非化脓性进行性破坏并伴门脉炎症性改变，长期持续性肝内胆汁淤积、最终导致肝纤维化和肝硬化为主要特征。由于现有的检测技术限制导致很多PBC患者到了疾病终末期才被检测，在临床医疗中迫切需要检测PBC的新方法。现有的研究表明蛋白指纹图谱技术可用于很多疾病的早期检测，胆汁郁积性疾病在人群中的发生率非常高，因此把PBC患者从这类人群中区分出来在临床诊疗中显得非常重要(KimWR,LudwigJ,LindorKD.Variantformsofcholestaticdiseasesinvolvingsmallbileductsinadults.勘/fe^roe/7"rW2000;95:1130-1138)。目前依靠组织病理活解、生化检查以及血清自身抗体检查仅能发现并诊断50-60y。的PBC患者，这一现状无法很好的满足临床诊疗需求，因此，PBC的诊断仍旧显得并不十分完善(HeXS，AnsariAA，RidgwayWM，C叩pelRL，GershwinME.Newinsightstothei鹏unopathologyandautoimmuneresponsesinprimarybiliarycirrhosis./鹏""o72006;239:1-13.)。蛋白质的分离技术在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。第一、通过将蛋白质的混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物；第二、通过标记的方法可以比较两个蛋白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。其中主要的技术有双向电泳(two_dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)、高效液相层析(high-performanceliquidchromatography,HP1X)、毛细管电泳(capillaryelectrophoresis,CE)、亲禾口层析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmicroarray)、磁性微球(magneticbeads,简称磁珠)和免疫组等。特别是蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术克服了以往技术的缺点，具有高灵敏度、高通量、结果重复性好、可机械化操作和方法灵活等特点。待测样品来源广泛，不需作特殊前处理，可以直接点样检测，如血清、尿液及组织液等；检测快速，一般一例标本的检测时间仅需约5分钟，从标本制备到出结果全过程仅约1小时。蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术有可能在体液中潜在生物标志(biomarker)检测方面创造革命性突破(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床医学中的研究进展，基础医学与临床，2007,27:134-142)。基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-T0F-MS)与蛋白芯片分离技术联合应用即为表面增强激光解析/电离飞行时间质谱(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,SELDI-T0F-MS)。2-DE最先被用于临床蛋白组学研究，但其对疏水性、强酸性和强硷性蛋白的分辩率不够，而且不能检测低丰度蛋白，故实用价值受限。近来，蛋白芯片与质谱技术(SELDI-T0F-MS)的结合，己被成功地用于肿瘤研究；但由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高(刘建栋等，血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007,27:193-197)。磁珠具有优于二维电泳、蛋白芯片和其他质谱方法的特点，已被广泛地用于肿瘤生物标志的筛査等研究(屠世良等，癌胚抗原阴性结直肠癌的检测和结直肠癌预后相关生物标志，基础医学与临床，2007，27:926-931)。该技术具有操作简便、无需离心样品、可直接分析原始生物样本(如血清、尿液等)、样本用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，可以与其他蛋白质组学方法互补，目前已被广泛地用于肿瘤标志的筛査和临床检测，并均己获得很好的结果。但国内迄今尚无采用磁珠与质谱技术获得检测原发性胆汁性肝硬化血清特征蛋白的报道。
发明内容本发明的目的是为克服对目前原发性胆汁性肝硬化血清检测技术的不足之处，建立一种检测原发性胆汁性肝硬化特征蛋白的优化质谱模型及其制备方法和应用，该模型为早期检测提供了新的途径和方法，并为进一步发现新的生物标志提供了基础。本发明提出的检测原发性胆汁性肝硬化血清蛋白质的质谱模型，其特征在于从血清中筛选出69蛋白作为特征蛋白；选取上述69个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M,建立了原发性胆汁性肝硬化患者与正常人相鉴别的患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z二8133，M《9.27;m/z=3445，M《1.67;m/z=16290，M》0.23;m/z=4260，M《2.19;分子量(m/z)误差〈0.01°/。，临界峰值均值M的CV<5亂本发明提出上述的检测原发性胆汁性肝硬化血清蛋白质谱模型的制备方法，包括以下步骤1)4'C条件下2小时内收集经明确诊断的原发性胆汁性肝硬化患者血清及经体检确定为正常健康者的血清作为两组血清标本，进行一80'C低温冷冻备用；病人和血清样本随后被分成两组一组为训练集，另一组为盲测组(表l);表1原发性胆汁性肝硬化患者、其他肝脏疾病患者与健康对照组临床资料分组例数男/女年龄范围平均年龄健康对照组4327/1625-7838.6±10.9PBC组443/4116-7454.1±11.3其他肝病组3217/1518-7550.6±13.12)采用WCX磁珠对所述原发性胆汁性肝硬化患者及正常人的两组血清标本的蛋白进行吸附；3)用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对结合在弱阴离子表面的WCX磁珠上的两组血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为50kDa，优化分子量范围100015000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围2080，激光强度150-180，检测敏感度为7-8，收集总数为130次，由此获得两组蛋白质谱图谱；4)在每次实验数据收集前，用All-in-one标准蛋白及质谱的标准化质控0型血清校正仪器，用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使分子量误差〈0.01%，从而获得的精确的蛋白质谱图谱；5)定量性质谱调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da等强度调至50%信号强度的最大值，使临界峰值均值M的CV〈510%，并收集精确的质谱图谱数据；6)对所得数据进行Mann-WhitneyV检验统计学处理，根据原发性胆汁性肝硬化患者和正常人血清之间蛋白峰值的差异(共得到260个蛋白峰，认定P值小于0.05时具有统计学意义)，检测出2组血清蛋白指纹质谱图谱之间有69个稳定的差异蛋白，见表3:表3原发性胆汁性肝硬化组、其他肝脏疾病组和健康对照组之间存在的69个差异蛋白峰质荷比M/Z,值质荷比M/Z尸值质荷比M/Z尸值30882.70E-09164890.00094236810.01216925431.31E-0833750.001028287900.0123738133A2.20E-0792800.00104577610.01245776282.71E-0728690.0012803445A0.01350086002.95E-07160770.001831250990.01511754771.55E--0558550.00225945280.018915318422.06E--0537740.002416432190.01939639354.21E--0582900.002421240150.02350127594.67E--0543820.00266846760,02356542817.05E-05280260.00267970490.0272957.9犯-0546450.00270833970.02999979670.00013794870.00272238870.03001439550.000150233860.00327396060.033309227980.00015152460.003700325500.035143158740.000196140160.00419852140.038265114850.00021256340.00508653840.04137140680.00022497940.00555375540.04186780710.000280141030.0056224260A0.043380156080.00032574050.006566476330.04407258030.00037953150.00751914980.045245116970.000571439170.01010893990.04633368460.000664466140.01109991160.04741516290A0.00078085540.01144255250.048693m/z表示质荷比P由原发性胆汁性肝硬化(PBC)和原发性胆汁性肝硬化(PBC)的对照产生标志着的峰被选为原发性胆汁性肝硬化(PBC)检验模型的标记峰将上述69个差异蛋白作为原发性胆汁性肝硬化质谱检验模型的特征蛋白；由于多个特征蛋白组合起来才可将原发性胆汁性肝硬化与正常人等完全分开，故选取上述69个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了原发性胆汁性肝硬化患者与正常人两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型(图2)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/^8133，M《9.27;m/z=3445，M《1.67;m/z=16290，M》0.23;m/z=4260，M《2.19。将统计分析得到的69个差异蛋白峰筛选PBC的最佳标志物。结果显示分子量为3445、4260、8133和16290Da的4个蛋白为检验PBC的最佳标志物，如图l。这4个蛋白标志物组成的检验模型能很好的将PBC患者区分出来，其检验模型如图2。该检验模型的敏感性为93.3%,特异性为95.1%，如表4，其检验R0C曲线如图3。表4PBC检测模型的诊断特性及盲法验证结果实验分组临床分组例数检测正确例数检测正确率建模组PBC302893.33%对照413995.12%盲法验证组PBC141392.86%对照342882.35%AMA-M2阳性与AMA-M2阴性PBC患者蛋白指纹图谱比较采用软件对AMA-M2阳性与AMA-M2阴性PBC患者蛋白指纹图谱进行比较，发现分子量为3682、3935、4068、4472和8133的5个蛋白质峰在两组患者之间存在显著性差异(代0.05)，如图4。利用该质谱模型，只要将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于原发性胆汁性肝硬化(PBC)检验。利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠的实验结果一致。本发明的特点及效果本发明与其他原发性胆汁性肝硬化(PBC)的检测方法比较，具有以下优点第一、本发明采用原发性胆汁性肝硬化患者与正常人具有差异的多个特征蛋白组合起来进行对原发性胆汁性肝硬化血清的检测，提供的质谱模型是原发性胆汁性肝硬化早期检测和筛査的新方法和新途径，并为进一步发现新的原发性胆汁性肝硬化生物标志提供了基础；第二、与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异性，是一种在蛋白组学水平上的检测，对原发性胆汁性肝硬化的早期检测提供了新标准；第三、本发明由于磁珠表面的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高而具有了更高的灵敏度，从而优化了质谱模型；第四、本发明采用了定量性质谱调控，CV〈510%，使磁珠的临界峰值均值M比蛋白芯片更可靠及精确；第五、本发明采用了用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于质谱内标定性的2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da标准峰(分子量)质控标准，使分子量误差<0.01%，从而获得的精确的蛋白质谱图谱；第六、本发明质谱模型的构建方法设计精确及合理可行，为降低我国原发性胆汁性肝9硬化的病死率、提高原发性胆汁性肝硬化的临床治愈提供了一种新的筛查评估方法。说明书附图图1建立PBC检验模型的4个蛋白峰在PBC、其它肝脏疾病组(HD)和健康对照组(Nor)之间的典型图谱图2PBC检验模型图图3PBC检验模型的ROC曲线图4AMA-M2阳性与AMA-M2阴性PBC患者5个差异蛋白峰的典型图谱图中m/z表示特异蛋白的质荷比，M代表该特异蛋白的临界峰值均值具体实施例方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例1正常与原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者的区分及质谱的试剂盒制备(1)实验方法119例血清样品，其中包括PBC患者44例(所有病例符合PBC的诊断标准)，其它肝脏疾病患者32例(包括自身免疫性肝炎10例、乙型肝炎10例、肝硬化9例、酒精性肝炎1例、药物性肝炎l例和原发性硬化性胆管炎l例)，健康体检者43例，详细临床资料及分组信息见表l，2:表1PBC患者、其他肝脏疾病患者与健康对照组临床资料<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表2用于建模和盲法验证的血清分组资料临床分组建模组盲法验证组总数健康对照组23iTPBC组301444其他肝病组181432磁珠操作步骤血清样品处理从-8(TC冰箱中取出血清，于4°C，10000rpm离心5min。取10叱血清样品，加20叱U9处理液(9mo1/L尿素，2%CHAPS,1%DTT，50腿ol/LTris-CL,pH9.0),充分混匀，冰浴振荡30min后取出，加入360A结合缓冲液(10Ommol/LNaAc，pH4.0),立即混匀。所有样本在分析前仅被冻溶一次(刘建栋等，血液蛋白质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007,27:193-197)。磁珠上样及洗脱将处理好的样品IOO叱加至已装好WCX磁珠(弱阴离子表面，羧酸基团，捕获正电荷基团蛋白)的PCR管中，置磁性处理器上孵育30rain，除去液体。加IOO叱磁珠结合缓冲液(50mmol/LNaAc，pH4.04.3)至已装好WCX磁珠的PCR管，置磁性处理器上孵育2分钟，除去液体，重复上述操作2次。加10叱ElutionBuffer2min，洗脱标本至上清液。取5叱上清液移至另一个PCR管中，加入5PLSPA饱和溶液充分混匀，取1A混合溶液加样到Au或Steel片上，晾干后上机测量。数据收集将处理好的Au或Steel片置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质谱分析。在读取数据前，用加有aU-in-one标准蛋白质的芯片校正质谱仪，使分子量误差〈0.1%。本研究中阅读仪的主要参数设定为，最高检测分子量为50kDa,优化分子量范围100015000Da，最佳聚集中心8000Da，数据采集参数范围2080，收集总数为130次。软件中设定读片程序，以读取数据。定量性控制及质谱激光能量调控每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50%质谱信号强度的最大值。用2746土1Da、5909土1Da、6634土1Da标准峰为质谱内标定性(分子量)质控标准，使分子量误差〈0.01%，从而获得的精确的蛋白质谱图谱。统计学分析应用软件分析处理所有峰谱，形成蛋白质谱图谱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至4050%信号强度的最大值，并且用最显著的峰进行了校正，而后又进行了"减少基线"，定义蛋白峰(s/n〉5)。分析所有150kDa之间的蛋白峰，并且仔细检査了每个相应的峰，计算出峰的平均值M，标准误差(SD)和变异系数(CV%)。用Mann-Whitney"检验比较配对样本的蛋白峰，计算尸值。原发性胆汁性肝硬化(PBC)检测多肽蛋白筛选用Mann-Whitney〃检验比较配对样本的蛋白峰，CV〈510%;初步分析筛选出尸〈0.05的PBC组与对照组之间蛋白指纹图谱比较对建模组的71例样本检测得到的蛋白指纹图谱进行分析发现69个蛋白质峰存在显著性差异，详见表3。表3PBC组、其他肝脏疾病组和健康对照组之间存在的69个差异蛋白峰<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>16290A0.00078085540.01144255250.048693m/z表示质荷比P由原发性胆汁性肝硬化(PBC)和原发性胆汁性肝硬化(PBC)的对照产生标志着'▲，的峰被选为原发性胆汁性肝硬化(PBC)检验模型的标记峰将上述69个差异蛋白作为原发性胆汁性肝硬化质谱检验模型的特征蛋白；实施例2临床试用及双盲测试由于多个特征蛋白组合起来才可将原发性胆汁性肝硬化与正常人等完全分开，故选取上述69个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了原发性胆汁性肝硬化患者与正常人相鉴别的两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型(图2)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z=8133，M《9.27;m/z=3445，M《1.67;m/z=16290，M>0.23;m/z=4260，M《2.19。PBC患者血清蛋白标志物的筛选及检验模型的建立将统计分析得到的69个差异蛋白峰筛选诊断PBC的最佳标志物。结果显示分子量为3445、4260、8133和16290Da的4个蛋白为检验PBC的最佳标志物，如图l。这4个蛋白标志物组成的检验模型能很好的将PBC患者区分出来，其检验模型如图2。该检验模型的敏感性为93.3%，特异性为95.1%，如表4，其检验R0C曲线如图3。AMA-M2阳性与AMA-M2阴性PBC患者蛋白指纹图谱比较采用软件对AMA-M2阳性与AMA-M2阴性PBC患者蛋白指纹图谱进行比较，发现分子量为3682、3935、4068、4472和8133的5个蛋白质峰在两组患者之间存在显著性差异(代0.05)，如图4。检验模型的盲法验证采用48例样本检测得到的蛋白指纹图谱对己建立的PBC检验模型进行盲法验证。验证结果表明该模型对PBC的检验敏感性为92.9M，特异性为82.4%，如表4。表4PBC检测模型的诊断特性及盲法验证结果实验分组临床分组例数检测正确例数检测正确率建模组PBC302893.33%对照413995.12%盲法验证组PBC141392.86%对照342882.35%利用该质谱模型，只要将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明质谱模型逐一进行对比分析，就可用于原发性胆汁性肝硬化检验。利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与上述WCX阴离子基质磁珠的实验结果一致。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。1权利要求1、一种检测原发性胆汁性肝硬化血清特征蛋白的质谱模型，其特征在于从血清中筛选出69蛋白作为特征蛋白；选取上述69个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了原发性胆汁性肝硬化患者与正常人相鉴别的患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z＝8133，M≤9.27；m/z＝3445，M≤1.67；m/z＝16290，M≥0.23；m/z＝4260，M≤2.19；2、一种检测原发性胆汁性肝硬化血清蛋白质谱模型的制备方法，包括以下步骤1)4'C条件下2小时内收集经明确诊断的原发性胆汁性肝硬化患者血清及经体检确定为正常的健康者的血清作为两组血清标本，进行一8(TC低温冷冻备用；2)采用WCX磁珠对所述原发性胆汁性肝硬化患者及正常人的两组血清标本的蛋白进行吸附；3)用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列，或用电喷雾电离己洗脱的血清蛋白后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对结合在弱阴离子表面的WCX磁珠或C8及C18疏水基质磁珠上的两组血清蛋白进行读取，由此获得两组蛋白质谱图谱；4)在每次实验数据收集前，用标准蛋白及质谱的标准化质控0型血清校正仪器，使蛋白质分子量误差〈0.0W和临界峰值均值M的CV〈510%，并精确地、定量地收集原发性胆汁性肝硬化患者和正常人优化的血清质谱图谱数据；5)对所得数据进行统计学处理，根据原发性胆汁性肝硬化患者和正常人血清之间蛋白峰的差异，检测出2组血清蛋白质谱图谱之间有69个稳定的差异蛋白及其临界峰值；将所述69个差异蛋白作为原发性胆汁性肝硬化蛋白质谱模型的特征蛋白；6)选取所述69个特征蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，以各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M构成用于检测原发性胆汁性肝硬化血清特征蛋白质谱模型；所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z^133，M《9.27;m/z=3445，M《1.67;m/z=16290，M》0.23;m/z=4260，M《2.19;分子量(m/z)误差〈0.01%，临界峰值均值M的CV<510%;3、选取如权利要求1所述的血清69个蛋白中任意两个或两个以上的特征蛋白，利用该质谱模型，将受检者血清中相应蛋白质的质荷比及该蛋白的临界峰值均值M与本发明的质谱模型逐一进行对比分析，就可应用于原发性胆汁性肝硬化的早期检测、筛査。全文摘要本发明涉及一种检测原发性胆汁性肝硬化特征蛋白的优化质谱模型及其制备方法，属于质谱检测
技术领域：
。本发明为进一步发现新的原发性胆汁性肝硬化生物标志提供了基础。本发明对于原发性胆汁性肝硬化的检测优于目前所采用的任何单一检测方法，为原发性胆汁性肝硬化的早期发现、早期治疗提供了一种非侵入性检测技术，从而为降低原发性胆汁性肝硬化的病死率、提高原发性胆汁性肝硬化的治愈率，并进一步为高危人群筛查原发性胆汁性肝硬化提供了一种新方法。文档编号G01N27/64GK101487817SQ20081000051公开日2009年7月22日申请日期2008年1月18日优先权日2008年1月18日发明者宁李,李永哲,胡朝军,洋许申请人:洋许