专利名称：一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联免疫检测 方法，属于免疫分析领域。
背景技术：
头孢类抗生素属于P -内酰胺类抗生素。在畜类动物饲养中，P -内酰胺类抗 生素广泛用于控制奶牛的乳房炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但 由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残 留，给人类健康带来严重危害，如产生过敏反应、破坏胃肠道菌群平衡和增强 细菌耐药性等。因此其在乳制品中的残留也越来越引起了国内外的重视。其中 头孢类抗生素由于具有抗菌谱广等优点被广泛用于人畜疾病的防治。且头孢类 抗生素种类繁多，现有的微生物检测法和仪器检测法很难实现对所有头孢类抗 生素进行快速、准确的检测，有必要研究快速、便携的多残留免疫检测技术。
其中酶联免疫检测技术(ELISA)是目前能够满足上述检测要求的用于定量的免 疫检测技术，且有望用本实验室所获得的具有簇特异性的抗头孢类抗生素的多 克隆抗体实现对至少三种头孢类抗生素的多残留检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联 免疫检测方法，在于克服现有技术的不足，满足对多种抗生素进行快速筛选的 要求，提供一种快速，灵敏度高，检测成本低廉的检测动物源食品中头孢类抗 生素的酶联免疫检测方法。
本发明的技术方案 一种检测动物源食品中头孢类抗生素的酶联免疫试剂 盒，由试剂组和包被板构成； 试剂组的组成为
(1) 缓冲液为pH7.4磷酸盐缓冲液，使用时用蒸馏水按l : IO稀释；
(2) 显色液A:柠檬酸0.933g，磷酸氢二钠3.68g， 18pL双氧水，用蒸馏 水定容至lOOmL;
(3) 显色液B: 60mg3,3，，5,5，-四甲基对二氨基联苯TMB溶于100mL乙二 醇溶液；
(4) 洗涤液为含有5%吐温-20的磷酸盐缓冲液，使用时用蒸馏水按l:
IO稀释；
(5) 终止液为2mol/L的硫酸；(6) 冻干封闭液Tris溶于双蒸水中，盐酸调节pH7.4，加入0.2%的明胶；
(7) 头孢氨苄标准液头孢氨苄标准溶液浓度为10mg/mL，使用时用磷酸 盐缓冲液稀释至100ng/mL，再稀释至40ng/mL， 10ng/mL， 2ng/mL， 0.1 ng/mL， 0.01ng/mL五个梯度；
(8) 酶标记抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体，使用时按照 1 : 5000倍稀释；
(9) 基质掩蔽剂含0.5%酪蛋白、pH9.0-9.5、 0.01M的磷酸盐缓冲液；
包被板的构成为
包被板为96孔或48孔酶标板，采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲 液，用包被缓冲液将头孢氨苄-BSA偶联物稀释至1/6400mg/mL作为包被液，在 酶标板的每孔中加入100pL包被液，37"C烘箱放置2h或4'C过夜，用稀释后的 洗涤液洗涤三次，每次在吸水纸上拍干，然后加入冻干封闭液37'C烘箱放置2h， 取出用稀释后的洗涤液洗涤四次后，冻干，4"C保存。
所述定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的试剂盒的检测方法，其特 征在于检测步骤为
(1) 用3-5匸低温离心进行样品前处理，得到样品提取液；
(2) 分别将各种浓度的头孢氨苄标准溶液和样品提取液加入到包被板各自 的微孔中，要双孔平行加样，然后在各微孔中加入酶标记的羊抗兔抗体即酶标 二抗，混匀后37。C反应l-2h;
(3) 酶标板取出后用稀释后的洗涤液洗涤3-5次，最后一次洗涤后将酶标 板在吸水纸上拍干，加入显色液A与显色液B的混合液，37'C反应20-40min; 混合液中显色液A与显色液B的体积比为5:1;
(4) 取出后向各微孔中加入100^iL终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光 度值，根据不同浓度头孢氨苄标准液的吸光值绘制头孢氨苄的浓度-吸光值标准 曲线图，对照该标准曲线图计算得到样品中头孢类抗生素的含量。
通过实验确定其他种头孢类抗生素的含量与头孢氨苄标准品的含量的对应 值，给出校准因子，从而实现对于其他种头孢类抗生素的检测。
所述的样品前处理样品为动物组织，将样品用匀浆器捣碎，均质，取适 量均质后样品加入萃取液，3-5。C低温离心，取上清液用基质掩蔽剂稀释；牛奶
样品脱脂牛奶直接检测，对于全酯牛奶则离心出去脂肪后进行检测。
所用的萃取液为pH 7-8的磷酸盐缓冲液。
检测动物源食品中头孢氨类抗生素含量的试剂盒所用的酶联免疫检测方法 采用间接竞争酶联免疫检测法。
检测动物源食品中头孢类抗生素含量的试剂盒，酶标板中包被的包被原为 新霉素与BSA的偶联物;头孢氨苄与BSA的偶联物是将头孢氨苄与载体蛋白用戊二醛法偶联得到；
检测动物源食品中头孢氨类抗生素含量的试剂盒，所用的抗头孢类抗生素
的具有簇特异性的多克隆抗体是用戊二醛两步法将头孢氨苄与KLH偶联的偶联 物作为免疫原，免疫纯种新西兰大白兔得到的抗体。四次加强后的效价达到最 好，同时对头孢氨苄、头孢羟氨苄等头孢类药物都有强的抑制作用，与多种头 孢类抗生素有交叉反应。四次加强10天后进行心脏采血，经离心处理后收集全 部血清，用proteinG蛋白亲和柱进行纯化，所得抗体加入0.1%的叠氮钠后4°C 保存备用。
本发明的有益效果本发明采用假间接竞争酶联免疫技术(ELISA)制备检 测头孢类抗生素的试剂盒，具有前处理简单，灵敏度高，精确度高等优点。且 通过使用具有簇特异性的多克隆抗体，并通过实验得出各药物与标准品的校正 因子，有望实现对头孢类药物的多残留检测。为实现酶联免疫检测技术的多残 留检测提供了一种思路，从而满足当前对多批量药物的筛选的需要。
图1所采用多克隆抗体对头孢氨苄的抑制率曲线。 图2头孢氨节标准曲线。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例来进一步阐明本发明，应理解，这些实施例仅用于 说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
实施例1: 一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的试剂盒的制备步 骤如下-
(1) 制备头孢氨苄-KLH免疫原；
(2) 制备抗头孢类抗生素的多克隆抗体；
(3) 制备头孢氨苄-BSA包被原；
(4) 制备包被板；
(5) 配制试剂组。
其中(l)制备头孢氨苄-KLH免疫原
称取36.5mg的头孢氮苄溶于8mL 0.01mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS) 中，搅拌下缓慢加入4(HiL 25%的戊二醛溶液，室温下搅拌反应30min，然后将 15mgKLH的PBS溶液逐滴加入，室温下搅拌反应3h，然后4'C、在PBS中透 析72h。然后用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。4'C保存备用。
(2) 制备抗头孢类抗生素的多克隆抗体 免疫新西兰大白兔制备抗头孢类抗生素的多克隆抗体。
(3) 制备头孢氨苄-BSA包被原
头孢氨苄-BSA包被原的合成采用上述戊二醛法合成，将KLH换成BSA即可。
(4) 包被板的制备
包被板为96孔或48孔酶标板并在微孔中包被头孢氨苄-BSA偶联物，采用 pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液稀释头孢氨苄-BSA偶联物，然后加入包被板 的每个孔中，37'C烘箱放置2h或4'C过夜，用洗涤液洗涤，每次在吸水纸上拍 干，重复三次。然后加入冻干封闭液37。C烘箱放置2h，取出用上述洗涤液洗涤 四次后，冻干，4'C保存。
(5) 试剂组的组成
a) 缓冲液为磷酸盐缓冲液，pH7.4，使用时用蒸馏水按l : IO稀释；
b) 底物A:为含有双氧水的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；
c) 底物B:为含有3， 3'，5，5，-四甲基对二氨基联苯(TMB)的乙二醇溶液；
d) 洗涤液为含有5%吐温-20的磷酸盐缓冲液，使用时用蒸馏水按l : 10 稀释；
e) 终止液为2mol/L的硫酸；
f) 冻干液Tris溶于双蒸水中，盐酸调节PH7.4，加入蔗糖、乳糖、牛血 清蛋白及抗坏血酸；
g) 头孢氨苄标准液其头孢氨苄标准溶液浓度为10mg/ml,使用时用磷酸盐 缓冲液稀释至100ng/ml，再稀释至40ng/ml， 10ng/ml， 2ng/ml， 0.1 ng/ml， 0.01 ng/ml五个梯度；
h) 酶标记抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体，使用时按照1
:5000倍稀释。
定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的试剂盒的检测方法的步骤是
(1) 用3-5。C低温离心进行样品前处理，得到样品提取液；
(2) 分别将各种浓度的头孢氨苄标准溶液和样品提取液加入到包被板各自 的微孔中，要双孔平行加样，然后在各微孔中加入酶标记的羊抗兔抗体即酶标 二抗，混匀后37'C反应l-2h;
(3) 酶标板取出后用洗涤液洗涤3-5次，最后一次洗涤后将酶标板在吸水 纸上拍干，加入底物A与底物B (5 : 1V/V)的混合液，37。C反应20-40min;
(4) 取出后向各微孔中加入终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光度值， 根据不同浓度头孢氨苄标准液的吸光值绘制头孢氨苄的浓度-吸光值标准曲线 图，对照该标准曲线图计算得到样品中头孢类抗生素的含量。
实施例2:下面通过一具体实例，进一步说明本发明的具体应用。 检测牛奶中头孢类抗生素的含量，以头孢氨节为例 (1)样品前处理对于脱脂奶直接可以用于检测，对于全脂牛奶则要离心
后出去脂肪层后进行检测。(2) 取出包被板，分别将lOOul头孢氨苄梯度稀释的标准溶液和100ul处 理后的牛奶样品双孔平行加样加入到包被板各自的微孔中，然后再在头孢氨苄 标准液和样品提取液各自的微孔中各加入lOOull:lO万倍稀释的多克隆抗体， 37。C放置lh;
(3) 用稀释后的洗涤液洗板3次，然后在头孢氨苄标准液和样品提取液各 自的微孔中加入100ul显色液A与显色液B以1:5混合的显色液，37'C放置0.5h;
(4) 然后向头孢氨苄标准液和样品提取液各自的微孔中加入100ul终止液， 终止反应，用酶标仪测定450nm处各微孔的吸光度值，绘制头孢氨苄的标准曲 线图，对照头孢氨苄的标准曲线图得到样品中头孢氨苄的含量。
(5) 结果计算
a. 计算抑制率值
按公式(1)计算不同浓度头孢氨苄对抗原抗体结合反应的抑制率
IC%= (1— ~品—4白〕X100........................... (1)
A对照—A空白
式中
IC%——头孢氨苄对抗原抗体结合反应的抑制率； A样品——牛奶样本的平均吸光值；
A m——不加酶标羊抗兔及头孢氨苄标准品或样品的平均吸光值； A自——只加酶标羊抗兔不加头孢氨苄标准液的平均吸光值。
b. 绘制标准曲线
以抑制率为纵坐标，头孢氨苄浓度对数值为横坐标绘制标准曲线，每次实 验均应重新绘制标准曲线，见图2。
c. 结果计算
从图2绘制的标准曲线上读取样液抑制率所对应的头孢氨苄浓度。根据公 式以下公式(2)计算样本中头孢氨苄的残留量
Y=0.2199x+0.511.......................................... (2)
加标试验
在加标试验中，分别向样品中添加0.1ng/mL、 lng/mL、 5ng/mL之间不同浓 度的头孢氨苄标准溶液，将加标样品充分混匀，在对牛奶样品的检测中,在 0.1ng/mL、 lng/mL、 5ng/mL三个水平的加标回收试验，其回收率分别为75%、 80%、 85%。
权利要求
1.一种检测动物源食品中头孢类抗生素的酶联免疫试剂盒，由试剂组和包被板构成，其特征在于试剂组的组成为(1)缓冲液为pH 7.4磷酸盐缓冲液，使用时用蒸馏水按1∶10稀释；(2)显色液A柠檬酸0.933g，磷酸氢二钠3.68g，18μL双氧水，用蒸馏水定容至100mL；(3)显色液B60mg 3，3’，5，5’-四甲基对二氨基联苯TMB溶于100mL乙二醇溶液；(4)洗涤液为含有5％吐温-20的磷酸盐缓冲液，使用时用蒸馏水按1∶10稀释；(5)终止液为2mol/L的硫酸；(6)冻干封闭液Tris溶于双蒸水中，盐酸调节pH7.4，加入0.2％的明胶；(7)头孢氨苄标准液头孢氨苄标准溶液浓度为10mg/mL，使用时用磷酸盐缓冲液稀释至100ng/mL，再稀释至40ng/mL，10ng/mL，2ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL五个梯度；(8)酶标记抗抗体为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体，使用时按照1∶5000倍稀释；(9)基质掩蔽剂含0.5％酪蛋白、pH 9.0-9.5、0.01M的磷酸盐缓冲液；包被板的构成为包被板为96孔或48孔酶标板，采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，用包被缓冲液将头孢氨苄-BSA偶联物稀释至1/6400mg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL包被液，37℃烘箱放置2h或4℃过夜，用稀释后的洗涤液洗涤三次，每次在吸水纸上拍干，然后加入冻干封闭液37℃烘箱放置2h，取出用稀释后的洗涤液洗涤四次后，冻干，4℃保存。
2、 用权利要求1所述定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的试剂盒的 检测方法，其特征在于检测步骤为(1) 用3-5i:低温离心进行样品前处理，得到样品提取液；(2) 分别将各种浓度的头孢氨节标准溶液和样品提取液加入到包被板各自 的微孔中，要双孔平行加样，然后在各微孔中加入酶标记的羊抗兔抗体即酶标 二抗，混匀后37"C反应l-2h;(3) 酶标板取出后用稀释后的洗涤液洗涤3-5次，最后一次洗涤后将酶标 板在吸水纸上拍干，加入显色液A与显色液B的混合液，37。C反应20-40min; 混合液中显色液A与显色液B的体积比为5:1;(4)取出后向各微孔中加入10(^L终止液以终止反应，用酶标仪读取吸光 度值，根据不同浓度头孢氨苄标准液的吸光值绘制头孢氨苄的浓度-吸光值标准 曲线图，对照该标准曲线图计算得到样品中头孢类抗生素的含量。
3、 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于通过实验确定其他种头孢类抗生素的含量与头孢氨苄标准品的含量的对应值，给出校准因子，从而实 现对于其他种头孢类抗生素的检测。
4、 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述的样品前处理样 品为动物组织，将样品用匀浆器捣碎，均质，取适量均质后样品加入萃取液， 3-5t:低温离心，取上清液用基质掩蔽剂稀释；牛奶样品脱脂牛奶直接检测， 对于全酯牛奶则离心出去脂肪后进行检测。
5、 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所用的萃取液为pH7-8的磷酸盐缓冲液。
全文摘要
一种定量检测动物源食品中头孢类抗生素含量的酶联免疫检测方法，属于免疫分析领域。本发明采用具有簇特异性的抗头孢类抗生素的多克隆抗体作为检测试剂，制备酶联免疫检测试剂盒，以头孢氨苄为标准品，通过实验测定不同种头孢类抗生素浓度与头孢氨苄标准品的相对值，给出测定校正因子，有望实现酶联免疫检测试剂盒的多残留检测。本发明具有前处理简单，灵敏度高，精确度高等优点。
文档编号G01N33/543GK101315372SQ20081002203
公开日2008年12月3日 申请日期2008年6月23日 优先权日2008年6月23日
发明者胡拥明, 胥传来, 媛 袁, 谢会玲, 赵金山 申请人:江南大学