专利名称：水稻根尖染色体制片方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种水稻根尖染色体制片 方法。
背景技术：
水稻作为一种重要的粮食作物和模式植物，其遗传育种方面的研究发展迅 速。然而由于水稻的小染色体的局限，有关水稻染色体的制片在操作上比其他植 物困难。经对现有技术的文献检索发现，谢国生等在《中国农学通报》1998年，第14 巻，第3期，27-28页发表的《水稻染色体制片技术的比较研究》 一文中比较了水 稻根尖染色体压片法与涂片法2种制片技术压片法解离处理方便，镜检容易， 制片简单但背景较浓，染色体难分开、难计数；涂片法背景很浅，染色体易分开， 但视野中细胞少，镜检较难，制片程序繁锁。两种方法都存在一定的缺陷。因此， 需要一种操作简便、镜检效果好的根尖染色体制片法以满足水稻研究的快速发 展。发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种同时具有操作方便、镜检 容易和背景浅、易于观察计数染色体两种优点的水稻根尖染色体制片方法。本发明是通过以下技术方案来实现的，本发明采用冰水预处理，纤维素酶和 果胶酶进行解离，改良苯酚品红染色，改良CarnoyI固定液固定，压片法进行制 片。本发明不仅在操作上简便易行，而且镜检容易，视野中细胞多、背景浅、染 色体分散，观察效果好。本发明包括如下步骤第一步，取水稻植株上1.5 2cm长的白色新根；所述白色新根，其长度为1.5 cm 2cm，于8:00 11:00时或20:00 22:00时选取。第二步，将第一步白色新根冰水预处理，采用混合酶液进行酶解；所述冰水预处理，其时间为12h 24h。所述酶解，其温度为29。C 3rC，时间为2. 5h 3h。所述混合酶液质量百分比浓度为6%，其组成成分为6g纤维素酶、6g果胶酶 和88mL蒸馏水，pH4. 5 5. 0。第三步，将经第二步处理后的白色新根用蒸馏水清洗，吸水纸吸干，浸入 Carnoyl固定液中固定；所述蒸馏水清洗，其时间为15s。所述CarnoyI固定液，其组成为70%酒精冰醋酸=3 : 1， V/V，可同时用于 固定及长期保存。所述固定，其时间为30min以上。第四步，将经第三步处理后的白色新根用蒸馏水清洗，醋酸软化； 所述蒸馏水清洗，其时间为5s。所述醋酸软化，是指用体积浓度为45。/。的醋酸软化10min。第五步，将第四步处理好的水稻根尖置于载玻片上，切取酶解后出现的缢縮 痕之前的根尖部分，用苯酚品红染色；所述苯酚品红，其含有O. 246g/L品红，3.69g/L苯酚，0.978%醋酸(v/v)， 0.896%福尔马林(v/v) ， 18g/L山梨醇。所述染色，其时间为lmin。第六步，压片法进行制片将双面刀片平放于载玻片上，使双面刀片的边缘 与根尖靠近，将盖玻片同时覆盖于根尖与刀片之上，用一端修整成圆形的一次性 筷子在盖玻片之上轻轻敲击根尖，使其迅速分散，然后一边敲击， 一边在不移动 盖玻片的前提下小心撤出双面刀片；第六步的压片是在现有技术上的改进，现有的压片技术是使用带橡皮头或者 无橡皮头的铅笔敲击盖玻片，但是橡皮头材质太软，敲击力度不够，不能使根尖 迅速分散，并且橡皮本身容易粘连盖玻片，造成盖玻片移位；无橡皮头的铅笔太 硬，极易敲碎盖玻片。本发明用修整成圆形后的一次性筷子材质，既有一定的力 度，又不易敲碎盖玻片。另外，现有压片技术中对双面刀片的使用方法不明确， 实践中发现，双面刀片摆放位置至关重要，距离材料过远无效果，过近易造成盖玻片破裂，因此本发明把刀片至材料的距离限制在lcm左右。第七步，镜检直接用光学显微镜进行观察，也可用Eupara胶在盖玻片四 周进行封固，制成半永久封片(室温下能保存1 2周)后观察。现有的显微制片技术是制片后立刻观察，无法保存，本发明中"用Eupara 胶在盖玻片四周进行封固，制成半永久封片(室温下能保存1 2周)后观察"， 这样可以把原有技术中制片的保存时间延长1 2周。本发明具有实质性特点和显著进步，本发明克服了以往的水稻根尖染色体制 片法中，操作繁琐、视野中细胞少、镜检困难与背景浓、染色体分散不良等不能 同时解决的难题，釆用纤维素酶和果胶酶进行解离，用压片法进行制片，相对于 传统的涂片法具有操作方便镜检容易的优点，相对于传统的压片法具有背景浅， 染色体分散的优点。本发明同时解决了目前水稻根尖染色体制片技术操作复杂和 染色体难于观察计数的缺点，使高效、易观察的水稻根尖染色体的制片技术更加 简便易行。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过#呈，但本发明的保护范围不限 于下述的实施例。实施例1水稻品种"台北309"花药培养获得的植株9株。于20:00时取水稻植株上 2cm长的白色新根；冰水预处理12h， 6%混合酶液，30'C酶解2.5h;蒸馏水清洗 15s，吸水纸吸干，浸入修改后的Carnoyl固定液(70%酒精冰醋酸=3 : 1， V/V) 固定30min;蒸馏水清洗5s, 45%醋酸软化10min;将处理好的水稻根尖置于载 玻片上，切取酶解后出现的缢縮痕之前的根尖部分，改良苯酚品红(含有 0. 246g/L品红，3. 69g/L苯酚，18g/L山梨醇，0. 978°/。醋酸，0. 896%福尔马林) 染色lrnin，压片后在光学显微镜下观察。镜检效果在放大1000倍(10倍目镜X100倍物镜)的情况下，有超过85% 的根尖分裂相细胞背景浅、染色体分散良好且容易计数。并且这些细胞分布位置 相对集中，平均每个视野中的细胞数目为5个。经过染色体计数分析，9株植株 中有单倍体2株，二倍体7株。6实施例2水稻品种"日本晴"花药培养获得的植株18株。于11:00时取水稻植株上 2cm长的白色新根；冰水预处理24h， 6%混合酶液，29'C酶解3h;蒸馏水清洗15s， 吸水纸吸干，浸入修改后的Carnoyl固定液(70%酒精冰醋酸=3 : 1， V/V)固 定45min;蒸馏水清洗5s， 45%醋酸软化10min;将处理好的水稻根尖置于载玻 片上，切取酶解后出现的缢縮痕之前的根尖部分，改良苯酚品红(含有0.246g/L 品红，3.69g/L苯酚，18g/L山梨醇，0.978%醋酸，0. 896%福尔马林)染色lmin， 压片；用Eupara胶在盖玻片四周进行封固，1天后，在光学显微镜下观察。镜检效果在放大1000倍(IO倍目镜XIOO倍物镜)的情况下，大于80% 的根尖分裂相细胞背景浅、染色体分散良好、易于计数。这些细胞分布位置较为 集中，平均每个视野中的细胞数目为4-6个。经过染色体计数分析，18株花培 植株中有单倍体l株，二倍体17株。实施例3水稻品种"中花11"花药培养获得的植株1株。于21:00时取水稻植株上 1.5cm长的白色新根；冰水预处理18h， 6%混合酶液，29'C酶解3h;蒸馏水清洗 15s，吸水纸吸干，浸入修改后的Carnoyl固定液(70%酒精冰醋酸=3 : 1， V/V) 固定l天；蒸馏水清洗5s， 45%醋酸软化10min;将处理好的水稻根尖置于载玻 片上，切取酶解后出现的缢縮痕之前的根尖部分，改良苯酚品红(含有0.246g/L 品红，3.69g/L苯酚，18g/L山梨醇，0.978%醋酸，0. 896°/。福尔马林)染色lmin， 压片；用E叩ara胶在盖玻片四周进行封固，1周后，在光学显微镜下观察。镜检效果在放大1000倍(10倍目镜X100倍物镜)的情况下，85%左右 的根尖细胞分布位置集中，每个视野中的细胞数目为6个左右，并且细胞背景浅、 染色体分散好、适合计数。经过染色体计数分析，此植株为单倍体植株。
权利要求
1. 一种水稻根尖染色体制片方法，其特征在于，包括如下步骤第一步，取水稻植株上白色新根；第二步，将第一步白色新根冰水预处理，采用混合酶液进行酶解；第三步，将经第二步处理后的白色新根用蒸馏水清洗，吸水纸吸干，浸入CarnoyI固定液中固定；第四步，将经第三步处理后的白色新根用蒸馏水清洗，醋酸软化；第五步，将第四步处理好的水稻根尖置于载玻片上，切取酶解后出现的缢缩痕之前的根尖部分，用苯酚品红染色；第六步，压片法进行制片将双面刀片平放于载玻片上，使双面刀片的边缘与根尖靠近，将盖玻片同时覆盖于根尖与刀片之上，用一端修整成圆形的一次性筷子在盖玻片之上轻轻敲击根尖，使其迅速分散，然后一边敲击，一边在不移动盖玻片的前提下小心撤出双面刀片；第七步，镜检直接用光学显微镜进行观察，或用Eupara胶在盖玻片四周进行封固，制成半永久封片后观察。
2、 根据权利要求l所述的水稻根尖染色体制片方法，其特征是，第一步中， 所述白色新根，其长度为1. 5 cm 2cm，于8:00 11:00时或20:00 22:OO时选取。
3、 根据权利要求l所述的水稻根尖染色体制片方法，其特征是，第二步中， 所述冰水预处理，其时间为12h 24h。
4、 根据权利要求1或3所述的水稻根尖染色体制片方法，其特征是，第二步 中，所述酶解，其温度为29。C 3rC，时间为2.5h 3h。
5、 根据权利要求1或3所述的水稻根尖染色体制片方法，其特征是，第二步 中，所述混合酶液质量百分比浓度为6%，其组成成分为6g纤维素酶、6g果胶酶 和88mL蒸馏水，pH4. 5 5. 0。
6、 根据权利要求l所述的水稻根尖染色体制片方法，其特征是，第三步中， 所述CarnoyI固定液，其组成为70%酒精冰醋酸=3 : 1， V/V;所述固定，其时 间为30min以上。
7、 根据权利要求l所述的水稻根尖染色体制片方法，其特征是，第三步中，所述蒸馏水清洗，其时间为15s;第四步中，所述蒸馏水清洗，其时间为5s。
8、 根据权利要求l所述的水稻根尖染色体制片方法，其特征是，第四步中，所述醋酸软化，是指用体积浓度为45。/。的醋酸软化10min。
9、 根据权利要求l所述的水稻根尖染色体制片方法，其特征是，第五步中， 所述苯酚品红，其含有O. 246g/L品红，3.69g/L苯酚，0. 978%醋酸，0. 896%福尔 马林，18g/L山梨醇；所述染色，其时间为lmin。
10、 根据权利要求l所述的水稻根尖染色体制片方法，其特征是，第六步中， 所述双面刀片的边缘距离根尖lcm。
全文摘要
一种水稻根尖染色体制片方法，属于生物技术领域。本发明采用冰水预处理，纤维素酶和果胶酶进行解离，用苯酚品红染色、CarnoyI固定液固定，压片法进行制片。本发明采用纤维素酶和果胶酶进行解离，用压片法进行制片，相对于传统的涂片法具有操作方便镜检容易的优点，相对于传统的压片法具有背景浅，染色体分散的优点。本发明同时解决了目前水稻根尖染色体制片技术操作复杂和染色体难于观察计数的缺点。
文档编号G01N1/30GK101266200SQ20081003654
公开日2008年9月17日 申请日期2008年4月24日 优先权日2008年4月24日
发明者何欢乐, 潘俊松, 苏 蒋, 润 蔡 申请人:上海交通大学