人神经突起生长素在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

专利名称：人神经突起生长素在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和医药领域，具体地，本发明涉及人蛋白神经突起生长素 在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
神经突起生长素(Neuritin, NRN1)是1997年发现的一个神经营养因子，全长 142aa，分子量15.3KD。主要表达于脑、肝脏、骨骼肌的卫星细胞，心脏和肺也有 少量表达。以磷酯酰肌醇锚定位点(GPI)，锚定于细胞膜上，可通过磷脂酶C(PLC) 的作用，从膜上脱离并以可溶的形式分布于体液中。作为一种细胞因子起作用。神 经突起生长素具有很强的促进神经突起生长，突触连接及成熟的作用，用重组表达 的神经突起生长素蛋白刺激原代培养的海马神经元和大脑皮质细胞，可引起神经轴 突和树突明显增多延长，在爪蟾和哺乳动物视神经元突起生长的研究中，神经突起 生长素也表现出了相同的作用。在我们的前期研究中同样证实了神经突起生长素可 以促进PC12细胞突起的生长。神经突起生长素是一个进化上非常保守的蛋白，人 与大鼠的蛋白质序列100%同源，而且其表达谱也并不局限于神经系统，证明它是一 个生物学功能非常重要的蛋白。特别是近两年，神经突起生长素在神经系统之外的 作用逐渐被人们所认识。神经突起生长素在与骨骼肌再生密切相关的卫星细胞中呈 高表达，有助于骨骼肌的损伤后修复，证明神经突起生长素能够调节细胞骨架的运 动，在神经系统外也具有引导功能。
肿瘤疾病现己上升为世界第2号"杀手"，其死亡人数仅次于心血管病。几年来， 国外医学界对于肿瘤疾病的发病机理在细胞基础上又有了新的认识。基于对肿瘤发 病机制的进一步理解，人们利用各种途径来研制和开发能够特异，有效地杀伤肿瘤 细胞而对正常细胞无毒性的药物。目前，对于癌症的治疗仍以化疗及放疗为首选， 两者虽对肿瘤的治疗取得了相当的疗效，但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性因而具有 较大的毒副作用以及某些肿瘤细胞对化疗和放疗处理的不敏感，因此在很大程度上 限制了它们在临床中的应用。肿瘤血管的形成在肿瘤生长和演进过程中是至关重要的。许多肿瘤开始形成时,并无血管生成活性，它的生长一般也不超过2 3mm3; 只有在开启肿瘤血管生成表型之后,肿瘤才得以恶性生长和转移。肿瘤生长和转移是 抗癌治疗失败的主要原因之一。血管生成领域的权威学者Folkman曾提出在治疗和研 究肿瘤的过程中应当把肿瘤看作是血管内皮细胞群和肿瘤细胞群相互促进，共同参 与肿瘤发生发展和转移的过程。尽管两者都是快速增殖的细胞群，但肿瘤细胞遗传 背景复杂多变，基因表达谱千差万别，细胞生理习性也相当不稳定，而内皮细胞从 各方面来讲都相对稳定得多。相比之下，针对内皮细胞的抗血管生成药物可以不用 计较肿瘤细胞内各种细节上的差别，而直接作用于性质稳定的肿瘤血管。因此，他 认为将基于血管生成的治疗手段和传统的基于肿瘤细胞的治疗手段的结合加以完善 将给肿瘤治疗带去新的希望。

发明内容
本发明的目的是提供人蛋白神经突起生长素(即人Neuritin， NCBI登录号为 NP—057672)的新用途。
本发明提供了人蛋白神经突起生长素在制备抗肿瘤药物中的应用。 所述的肿瘤包括肝脏、肺、消化道或者乳腺等部位的良性或者恶性肿瘤。 本发明提供了人蛋白神经突起生长素在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。本 发明的人蛋白神经突起生长素在体外可以促进血管内皮细胞迁移、粘附；利用小鼠 角膜血管生成模型发现重组表达的神经突起生长素蛋白可以诱导新生血管。神经突 起生长素蛋白可以受缺氧诱导，而且在肺癌、肝癌、卡波氏肉瘤、消化道腺瘤等恶 性肿瘤中呈现明显上调表达。
可见，神经突起生长素可以促进肿瘤血管生成从而促进肿瘤生长，因此，抑制 神经突起生长素的表达就意味着抑制肿瘤生长。
本发明的人蛋白神经突起生长素可以作为筛选和制备抗肿瘤药物中的药耙。 本发明中，术语"神经突起生长素蛋白(NRN1)"指可促进肿瘤生长的、序 列与(NCBI登陆号NP 057672)所示多肽序列至少70%同源性的NRN1多肽及其 变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30 个，更佳地l-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端 和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常 不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常 也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人NRN1蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变 体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人NRN1DNA杂交的DNA所编码 的蛋白、以及利用抗人NRN1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其 他多肽，如包含人NRN1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发 明还包括了人NRN1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人NRN1多肽序列的至 少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基 酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约IOO个连续氨基酸。
本发明还提供人NRN1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人NRN1多 肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种 技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其 他己知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨 基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、 Y-氨基酸)的类似物。 应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的具有代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步 骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的 酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸 残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其 抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的NRN1蛋白可以采用各种常规的制备方法制备。如基因工程方法或 者人工合成方法等。例如，可将NRN1基因表达为蛋白而得。
本发明的NRN1基因可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的NRN1基 因序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法， 可根据本发明的NRN1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售 的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增 而得有关序列。在本发明中，术语"NRN1基因"指编码具有NRN1蛋白活性的多肽的核苷 酸序列，如核苷酸的序列号为(NCBI登陆号NM—016588)的序列及其简并序列。 该简并序列是指该核酸序列开放阅读框中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸 的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与该核酸序列开 放阅读框序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出神经元分化相关基因NRN1 的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与 NM_016588开放阅读框序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与NM_016588开放 阅读框序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。
该术语还包括能编码序列号为NP—057672氨基酸序列的核苷酸序列变异形 式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-90个，较佳地l-60个，更佳 地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添 加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为IO个以内，最佳地为5 个以内)核苷酸。
获得了 NRN1基因序列后，就可以将NRN1基因序列插入适当的表达载体， 以获得重组表达质粒。 一旦获得了含有NRN1基因序列的重组表达质粒，就可将其 转化到相应宿主中进行蛋白表达。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售 的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形 成蛋白表达载体。
如本文所用，"可操作地连于"指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部 分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体 表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽 DNA;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体 结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。 一般，"可 操作地连于"意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细 胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细 胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞 等。目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物) 的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞 中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽 而加以生产(Stewart等人,(1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J. (1963) J. Am Chem. Soc 85: 2149-2154)。在体外合成蛋白质可 以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City, CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法 加以连接以产生全长的分子。
本发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术 (FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。 该技术可以使用短至约500bp的cDNA;也可以使用长至约2000bp或者更长的 cDNA。对于该技术，可参见Verma等人，Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)。
一旦序列被定位于染色体上的某个精确位置，将可以将序列在染色体上的物理 位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔 (Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins University Welch Medical Library在 网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间 的相关性。
接着，有必要确定患病个体和健康个体之间的cDNA或基因组序列方面的差 异。如果某一突变存在于部分或全部患病个体但不存在于正常个体，那么该突变可 能就是该疾病的致病因素。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与NRN1发生相互作用的 物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。
作为耙标的除了NRN1蛋白，还可以是NRN1基因、NRN1的mRNA、 NRN1 的表达产物及其前述三者的特异性片断。所述"特异性片断"是指可以区别本发明的 NRN1与其它基因的片断。
本发明中，所述的抗肿瘤药物是将NRN1蛋白抵制剂与药学上的载体或者赋 形剂组成的药物组合物。本发明中，所述的药物是片剂、针剂、粉剂、口服液或者注射剂。 本发明中，所述的药物中NRN1蛋白抵制剂的用量可以是每天1微克/千克至 10毫克/千克体重。
本发明蛋白，抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提 供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性 载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制 物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径 进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的人NRN1蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。 这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载 体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制
剂应与给药方式相匹配。本发明的人NRN1蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理 盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之 类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶 囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克 体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的人NRN1蛋白多肽抑制剂被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多 肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大 多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫 克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是 熟练医师技能范围之内的。
本发明还提供了一种用于筛选抗肿瘤药物的试剂盒，该试剂盒中包括NRN1 蛋白。该试剂盒还可含有使用说明、分子标记、缓冲液等。
本发明的试剂盒在使用时，可以将抑制NRN1蛋白表达量或者活性的候选化 合物作为抗肿瘤的候选药物。
本发明还提供了一种生物芯片，该生物芯片的载体上含有NRN1蛋白。可以 将抑制NRN1蛋白的表达量或者活性的候选化合物即作为抗肿瘤的候选药物。该生 物芯片在制备的时候，可以将NRN1蛋白直接点样在适当的生物芯片载体上，例如硝酸纤维膜。然后，检测候选化合物是否可以与NRN1蛋白互作并影响NRN1蛋白 的活性。
本发明的NRN1可以作为靶标，筛选抑制NRN1活力的物质或者方法。筛选 方法包括以下步骤A选择候选化合物；B提供检测NRN1表达量或者活性的体 系；C NRN1的检测体系选择候选化合物；D确定NRN1表达量或者活性在候选化 合物的影响下的改变。
本发明中，可将候选化合物的计算机模拟三维结构与NRN1蛋白的计算机模 拟三维结构结合，候选化合物的计算机模拟三维结构与NRN1蛋白的活性部位(N 端)紧密结合的，该候选化合物即为抗肿瘤药物的活性成分。
本发明中，将得到的候选化合物加入细胞培养液中检测该化合物对细胞内 NRN1蛋白表达的影响。或者将得到的候选化合物加入含有NRN1蛋白的溶液中， 然后，检测NRN1蛋白与其受体的结合活性。NRN1蛋白的表达量或者与受体结合 活性下降的候选化合物为抗肿瘤药物的活性成分。
本发明中，计算机模拟三维结构结合后，可以将得到的候选化合物转入肿瘤 中，导致肿瘤生长减慢的候选化合物为抗肿瘤药物的活性成分。
所述候选化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。其中，核酸包括DNA、 RNA等，可以是siRNA、反义寡核苷酸、核酶或者与NRN1核苷酸序列互补的其它核 酸分子；氨基酸包括肽、抗体、互作蛋白等；小分子化合物则包括天然和人工的合成 的。
本发明提供了人蛋白神经突起生长素的新用途，即其在制备抗肿瘤药物中的应 用。本发明的人蛋白神经突起生长素在肺癌、肝癌、卡波氏肉瘤、消化道腺癌等恶 性肿瘤中呈现明显上调表达，可以促进小鼠成瘤。因此，削减神经突起生长素的活 性就意味着抑制肿瘤生长。本发明的人蛋白神经突起生长素可以用于肿瘤的早期诊 断，可以用作药靶筛选治疗和抑制肿瘤生长的药物。本发明的蛋白神经突起生长素 的单抗可以用于阻断肿瘤血管生长以抑制肿瘤发生发展。


图1是多种肿瘤细胞株中分泌的NRN1检测图。多种肿瘤细胞株能够分泌神 经突起素，其中Huh-7， QGY， SK-H印1， HepG2等细胞株分泌量比较高，Focus,YY等细胞株分泌量较低。QGY， YY， Focus， Huh-7细胞株可从中科院细胞所购得。 SK-Hepl， HepG2均从ATCC购得，其货号分别为HTB-52和HB-8065。
图2是NRN1蛋白的表达与纯化图。左图箭头指向纯化后得NRN1-HIS，右图 箭头指向用神经突起生长素特异性抗体确定我们纯化得所得蛋白确实是NRN1蛋白。
图3是神经突起素对血管内皮细胞增殖能力结果图。其中，Blank为空白对照， PBS为磷酸盐缓冲液，FT为蛋白透析时通过透析膜的液体(滤过液)，保留在透析 膜上的为神经突起素蛋白(NRNl-his) ， FBS为胎牛血清，作为阳性对照。由此图 可见，神经突起生长素对血管内皮细胞增殖没有作用。
图4为神经突起素促进内皮细胞的迁移数据图。为检测神经突起素对血管内皮 细胞迁移能力的影响，将纯化的神经突起素蛋白加入ECV细胞培养基中，通过划 痕实验检测血管内皮细胞迁移能力的变化。其中FBS (胎牛血清)作为阳性对照， FT(滤过液)作为阴性对照。划痕后23h， FBS组几乎全部愈合，NRN1组次之，而FT 组仍然存在很大的空白区域。提示神经突起素能够促进内皮细胞的迁移。
图5是上述实验实验数据分析图。如图所示，100nm的NRNl蛋白组比FT组 迁移速率较快，在划痕后4小时，已经出现显著性差异，并随着随着时间的增加， 二者迁移面积的差距逐渐增大。划痕后23h， FBS组几乎全部愈合，NRN1组次之， 而FT组仍然存在很大的空白区域。提示神经突起素能够促进内皮细胞的迁移。
图6是NRN1蛋白迁移实验柱状图。其中，bFGF(成纤维细胞生长因子，100ng) 是阳性对照。神经突起素蛋白剂量梯度的划痕实验结果显示，随着神经突起素蛋白 浓度的增加(100ng/ml， 250ng/ml， 500ng/ml),血管内皮细胞迁移的面积逐渐增大， 迁移速率逐渐提高。
图7是神经突起素蛋白对细胞粘附作用的影响数据图。
图8是NRN1在QGY、 Fucos、 L-02、 Huh-7、 HepG2、 Hep3B、 YY、 SK-Hepl
不同癌症细胞株中的表达情况图，可见神经突起生长素在多种癌症细胞株中均高量 表达。
图9是利用DFO缺氧诱导肿瘤内的NRN1表达水平增加结果图。 图10是利用CoCl2缺氧诱导肿瘤内的NRNl表达水平增加结果图。 图11是NRN1促进小鼠角膜血管生成结果柱状图。其中PBS作为阳性对照， bFGF作为阳性对照。可见，NRN1可以明显促进小鼠角膜血管生成。
图12为免疫组化实验检测神经突起素在消化道腺癌组织中的表达图。红褐色标出处为NRN1。结果显示，NRN1在上述正常组织中低量表达，而在癌组织中超咼量表达。图13是小鼠角膜实验检测NRN1的体内促血管生成作用结果图。其中PBS作 为阳性对照，bFGF作为阳性对照。可见，NRN1可以明显促进小鼠角膜血管生成。图14是NRN1在各种正常组织与肿瘤组织中的表达图。其中，A为正常肺组 织，B为肺癌组织，C为正常肝组织，D为肝癌组织，E为正常乳腺组织，F为乳腺 癌组织，G为正常皮肤组织，H为卡波氏肉瘤组织。红褐色标出处为NRN1。结果显 示，NRN1在上述正常组织中几乎不表达或者低量表达，而在癌组织中高量表达。
具体实施方式
实施例l.细胞上清收集1) 取培养至对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离 心。取所需数量细胞种于60mm培养皿内。2) 24小时后，换无血清培养基3) 24后收集无血清培养基，3,000rpm离心10min收集上清4) 取200微升细胞培养上清加入2X的loading buffer, 98。C变性5分钟，变 性后样品与细胞样一起上样电泳检测。结果显示，多种肿瘤细胞株能够分泌神经突起素，其中Huh-7， QGY， SK-Hepl， HepG2等细胞株分泌量比较高，Focus， YY等细胞株分泌量较低。实施例2. NRN1全长蛋白在毕赤酵母中的表达 2. 1转化1 )大量抽提装有NRN-HIS的PIC9K质粒，用Sac I单酶切质粒，回收纯化.2) YPD培养基中接种GS115,30度培养箱振荡培养至OD600值1.3-1.5.3) 1,500rpm离心5min,弃上清,加入30毫升冰预冷的水重悬，4) 1,500rpm离心5min,弃上清,加入10毫升冰预冷的水重悬5) 1,500rpm离心5min,弃上清,加入2.5毫升冰预冷山梨醇重悬6) 1,500rpm离心5min,弃上清,加入0.5毫升冰预冷的山梨醇重悬,此时OD600 值为50-607) 取80微升酵母感受态细胞,加入5-20微克线性化DNA(溶解在5-10微升TE中)8) 混合后,转移至电转杯中,冰浴30min.9) 选择电转仪中毕赤酵母电转程序,电击细胞.10) 立刻向电转杯中加入l毫升冰预冷的山梨醇11) 吸取300微升菌液涂布在MD板上，30度培养至菌落出现. 2. 2多拷贝体外筛选1) 取96孔板,加入200微升YPD/孔,挑单菌落至每孔,30度培养两天，2) 取新的96孔板,加入190微升YPD/孔,吸取10微升第一批96孔板中培养的 菌液加入到新板中,一一对应,30度培养过夜，3) 取新的96孔板,加入190微升YPD/孔,吸取10微升第二批96孔板中培养的 菌液加入到新板中,一一对应，30度培养过夜，4) 用移液枪将第三批96孔板中菌液吹打均匀,各吸取10微升培养液加到含有 0.25， 0,5 ，1.0, 1.5, 2.0 ,3.0 ,4.0毫克/毫升G418YPD板上,并编号.5) 30度培养,2或3天观察菌落是否出现. 2. 3蛋白小量表达1) 挑取G4I8板上菌落至10毫升BMGY培养基中,30度培养至OD600值2-6.2) 5000rpm,离心5min,去上清,加入BMMY培养基重悬,使OD600值等于1.3) 取样100微升,其余30度诱导培养.每隔24小时，加入甲醇,使其终浓度为0.5% 6h,12h,24h,36h，48h,60h和72h各取样100微升.4) 将收集样品5000rpm,离心5min,分别收集上清和沉淀. 2. 4上清处理1) 向上清中加入硫酸铵,至终浓度55%.2) 冰上放置2h,使蛋白充分沉淀3) 10000rpm，离心30min去上清，加入SDS-PAGE上样缓冲液,98度煮8min4) 12%SDS-PAGE电泳 2. 5蛋白大量表达.1) 挑取G4I8板上菌落至50毫升BMGY培养基中,30度培养至OD600值2-6.2) 5000rpm,离心5min,去上清，加入BMMY培养基重悬,使OD600值等于1.3) 30度诱导培养.每隔24小时,加入甲醇,使其终浓度为0.5M36h后收菌. 2. 6蛋白纯化1) 5000rpm，离心5min,取上清.2) 向上清中加入硫酸铵,至终浓度55%.3) 冰上放置2h，使蛋白充分沉淀4) 10000rpm,离心30min去上清， 5 )加入Binding Buffer溶解蛋白，6) 10000rpm,离心30min去沉淀，7) 将上清转移至镍柱2000rpm,离心，2min8) 弃滤液,加入600微升Wash Buffer2000rpm，离心,2min，洗两遍9) 加入200微升Elution Buffer洗脱.2000rpm,离心，2min10) 将所得蛋白溶液加入PBS透析用透析柱透析去咪唑,并浓縮，其中保留在 透析膜上的液体为纯化的目的蛋白，从透析膜滤过的液体为滤出液。11)蛋白定量。 结果详见图2。实施例3.细胞增殖实验 通过MTS法测定细胞增殖情况。细胞消化重悬后种在96孔中(3X103细胞/孔)，静置5个小时， 待细胞贴壁后，去除培养基，用PBS洗两遍，然后加入无血清培养基培养24 个小时。向培养孔中加入终浓度分别lnM， 10nM， 100nM的神经突起素蛋白溶液(蛋 白用DMEM无血清稀释)，最终每孔培养液体积为100|al。只加DMEM无血清培 养孔为空白对照，加入PBS和滤过液的孔为阴性对照，含有P/。FBS为阳性对照。培养48h小时后，去除培养基，加入100plDMEM无血清培养基。每孔加20 u 1 MTS/PMS混合液，继续培养3小时显色。检测前摇晃培养板IO秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长4卯nm处检测 各孔的光吸收值(OD)。结果显示，NRN1具有对血管内皮细胞增殖能力没有影响。实施例4.划痕实验1)将ECV304细胞重悬在DMEM+10% FBS培养基中，然后接种在35mm皿里，密度为4X105细胞/ L，静置8个小时。2) 待细胞贴壁后，用PBS洗两遍细胞，然后加入DMEM无血清培养基。3) 细胞饥饿24小时后，用Tip头在铺满细胞的皿中划一条痕迹，然后用PBS 洗两遍，去除细胞碎片。4) 加入含有不同刺激条件的培养液，包括P/。FBS,神经突起素蛋白，滤过液。5) Oh， 4h， 8h， 12h， 23h用相差显微镜拍摄细胞迁移情况，每个时刻每皿选 取12个区域，追踪观察。6) 数据分析迁移面积二AO-AT 。其中A0为0h时空白区域的面积，AT为 拍照时刻空白区域的面积。如图4-图6所示，100nm的NRN1蛋白组比FT组迁移速率较快，在划痕后4 小时，己经出现显著性差异，并随着时间的增加，二者迁移面积的差距逐渐增大。 划痕后23h， FBS组几乎全部愈合，NRN1组次之，而FT组仍然存在很大的空白区 域。提示神经突起素能够促进内皮细胞的迁移。实施例5.细胞粘附实验1) 第一天向一块新的96孔板中加入不同浓度的蛋白溶液，4度包被过夜。2) 第二天吸去多于蛋白溶液，加入100pl 1MBSA溶液，37度封闭1小时。3) 消化重悬ECV304细胞，向每孔中加入1X1()S个细胞，贴壁1小时。4) 小心吸取上层溶液，并用PBS冲洗每个孔，共两遍，5) 以下步骤是MTS法测粘附细胞数，具体步骤见细胞增殖实验。 结果提示，NRN1能够显著促进血管内皮细胞粘附。实施例6.小鼠角膜实验1) 实验动物为5到6周龄的昆明小白鼠2) 盐酸氯氨酮和地西泮按2:1的比例配置麻醉剂，腹腔注射麻醉小鼠。3) 小鼠麻醉后，用透明胶将其颈部固定在桌面，剪掉胡须。4) 用带齿的眼科镊轻轻夹住眼球固定。以细注射器针头沿切面向眼球轴向中 心挑，针头斜面向上，稍微向下压，戳一个小口达到角膜基质一半处。5) 用眼科镊的齿夹起开口，以粗针头沿眼球切向扩大开口，针头斜面朝向眼 球，可轻微转动针头。口袋直径约lmm。6) 缺口打开后，用无齿眼科镊将带有样品的Hydron颗粒塞入口袋内。7) —周后在体视显微镜下观察拍照。8) 测量新生血管从角膜边缘延伸到口袋的最长长度和钟点数(新血管连续区域 的角度，每30度为一个钟点数)，血管的面积计算公式为面积二0.2X Tt X最长血管长度X时钟数 结果显示，NRN1可以明显促进小鼠角膜血管生成。实施例7.缺氧诱导实验1) 消化重悬细胞，以8乂104细胞/孔接种于24孔板。2) 待细胞贴壁后，加入含有DFO(去铁胺，Deferoxamine)或者氯化钴(CoC12) 的培养基，浓度分别为0^M， 20pM， 50pM， 100pM， 200pM。3) 24小时后，PBS清洗一遍，加入裂解缓冲液裂解细胞，Western检测目的 蛋白的表达。结果显示，缺氧条件可以促进NRN1的表达。实施例8.组织组化分析1) 石蜡切片用PBS洗3遍5min/time2) 用封闭液(封闭液5% BSA, 5% house serum)封闭，室温一小时3) 用PBS洗1遍4) 一抗稀释在1XBSA中(12000gX20min去除杂质)，加到切片上，室孵 育二小时5) 用PBS洗3遍5min/time6) 二抗稀释在1XBSA (12000gX 10min去除杂质)，加到切片上，室温孵 育1.5小时7) 用PBS洗3遍5min/time，用ECL进行显色8) 用80%的甘油封片显微镜检测结果显示，NRN1在上述正常组织中几乎不表达或者低表达，仅在癌组织中表达。
权利要求
1.神经突起生长素在制备抗肿瘤药物中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征是，所述的抗肿瘤药物是抗肿瘤血管 生成药物。
3. 如权利要求l所述的应用，其特征是，神经突起生长素是筛选和制备抗 肿瘤药物的药耙。
4. 如权利要求l所述的应用，其特征是，所述的抗肿瘤药物是将神经突起 生长素抑制剂与药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。
5. 如权利要求l所述的应用，其特征是，所述的肿瘤是肝脏、肺、消化道 或者乳腺部位的恶性肿瘤。
6. —种用于筛选抗肿瘤药物的试剂盒，其特征是，该试剂盒中包括神经突起 生长素。
7. —种生物芯片，其特征是，该生物芯片的载体上连接有神经突起生长素。
8. 如权利要求l所述的应用方法，其特征是，将候选化合物的计算机模拟 三维结构与神经突起生长素蛋白的计算机模拟三维结构结合，候选化合物的计算机模拟三维结构与神经突起生长素蛋白的活性部位紧密结合的，该候选化合物即 为抗肿瘤药物的活性成分。
9. 如权利要求8所述的应用方法，其特征是，将得到的候选化合物加入含 有神经突起生长素蛋白的溶液中，然后，检测神经突起生长素蛋白的表达量或者 活性，神经突起生长素蛋白的表达量或者活性下降的候选化合物为抗肿瘤药物的 活性成分。
10. 如权利要求8所述的应用方法，其特征是，计算机模拟三维结构结 合后，再将得到的候选化合物转入癌细胞中，导致癌细胞数量减少的候选化合 物为抗肿瘤药物的活性成分。
全文摘要
本发明属于生物医药领域。本发明提供了人蛋白神经突起生长素的新用途，即其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的人蛋白神经突起生长素在肺癌、肝癌、乳腺癌、消化道腺癌等恶性肿瘤中呈现明显上调表达，可以促进小鼠成瘤。因此，削减神经突起生长素的表达就意味着抑制肿瘤生长。本发明的人蛋白神经突起生长素可以用于肿瘤的早期诊断，可以用作药靶筛选治疗和抑制肿瘤生长的药物。本发明的蛋白神经突起生长素的单抗可以用于阻断肿瘤血管生长以抑制肿瘤发生发展。本发明还提供了筛选抗肿瘤药物的试剂盒和生物芯片。
文档编号G01N33/15GK101306192SQ20081003744
公开日2008年11月19日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者仙玲玲, 龙 余, 磊 杨, 波 秦, 韩丁丁 申请人:复旦大学