一种氟苯尼考类药物快速检测试剂盒及其应用的制作方法

专利名称：：一种氟苯尼考类药物快速检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测分析动物源性食品中兽药残留的技术，特别是快速检测氟苯尼考类药物的酶联免疫试剂及方法。
背景技术：
：氟苯尼考又称氟甲砜霉素(Florfenicol,FF)，是甲砜霉素(TAP)的衍生物。由于其对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及支原体等作用明显且价格低廉，因此被广泛应用于各类家禽、家畜、水产养殖业及蜂产品的各种传染性疾病的治疗，但研究发现其对鱼类的免疫活性有抑制作用，对哺乳动物具有胚胎毒性，氟苯尼考代谢物还与氯霉素存在交叉反应。因此联合国食品法典委员会(CAC)和许多国家规定食品中氟苯尼考(FF)的残留量不得超过0.1ppm，欧洲经济区规定检测限为lppm，日本限量检出限为O.lppm,我国限量检出lppm。氟苯尼考目前一般采用HPLC或LC/MS，但这类方法样本前处理及测定操作烦琐，检测所需时间较长，检测费用高，推广使用受到限制。因此加强对氟苯尼考药物残留检测技术的研究势在必行。
发明内容本发明的检测原理当包被原为氟苯尼考偶联抗原时是将氟苯尼考半抗原与鸡卵清白蛋白偶联物(FF-OVA)吸附于固相载体上，加入样本或氟苯尼考标准品，然后加氟苯尼考特异性抗体，待测样品中残留的氟苯尼考和酶标板上包被的氟苯尼考抗原竞争氟苯尼考特异性抗体。再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中氟苯尼考残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出氟苯尼考的浓度。包被原为抗抗体时是将抗抗体吸附于固相载体上，加入氟苯尼考特异性抗体，再加入氟苯尼考酶标记抗原和样本或氟苯尼考标准品溶液，待测样本中残留的氟苯尼考和酶标记氟苯尼考抗原竞争氟苯尼考特异性抗体，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中氟苯尼考残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出氟苯尼考的浓度，与标准溶液颜色比较则可判断样品中氟苯尼考的浓度范围。本发明提供了一种检测动物源性食品中氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，它含有(1)包被氟苯尼考抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；(2)酶标记物；(3)氟苯尼考特异性抗体；(4)氟苯尼考标准品溶液；(5)底物显色液；(6)终止液；(7)浓縮洗涤液；(8)浓缩复溶液。本发明所述试剂盒中氟苯尼考包被抗原是采用混合酸酐法将氟苯尼考半抗原与鸡卵清白蛋白(OVA)进行偶联得到的，抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为批pH值9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；包被氟苯尼考抗原或抗抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为含有0.1%~0.5°/。吐温80,0.5%叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；所用的封闭液是含有8%15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液。本发明所述试剂盒中包被氟苯尼考抗原的酶联板或包被抗氟苯尼考抗体的酶联板的制备步骤为.(l)用包被缓冲液将氟苯尼考半抗原与鸡卵清白蛋白(OVA)偶联物或抗抗体以0.020.08pg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗抗体稀释液；(2)向酶联板的每孔中加入10(^1已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37。C温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15~30s，拍干；(3)向酶联板的每孔中加入150200pl封闭液，37°〇温育l~2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。本发明所述试剂盒中酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记氟苯尼考抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本发明优选过氧化物酶；酶标记物形式可为冻干粉、浓縮液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液为含有50%甘油(可防止放入-20°。环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生物活性)、1%的叠氮化钠防腐剂(便于保存)的溶液。本发明所述试剂盒中酶标记抗抗体的制备步骤为(1)抗抗体的制备以鼠源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；或以兔源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。(2)过氧化物酶标记抗抗体的制备将抗抗体与过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗体与辣根过氧化物酶的结合率升高，传统GA—步法偶联反应不易控制，反应速度快的分子易发生自生聚合，且偶联效率不高。为了解决这些问题，我们将一步法进行了改进，克服了一步法的缺点。首先在被偶联的两种分子中，与偶联剂反映较弱的分子先用过量的偶连剂活化，然后去处多余的偶连剂；第二步将一端与某种分子连接的偶连剂，通过改变反应条件而与另一种分子连接起来。二步法虽然操作较繁，但偶连效率提高，而且形成的同分子聚合物减少。本发明所述试剂盒中酶标记抗原是采用活性酯法将标记酶与氟苯尼考半抗原进行偶联得到。本发明所述试剂盒中氟苯尼考特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体，免疫原是采用混合酸酑法将氟苯尼考半抗原与钥孔槭血蓝蛋白进行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓縮液、工作液;抗体稀释液为pH值8.2、0.05mol/L、含有3%小牛血清和5%。N,N，-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。本发明所述试剂盒中氟苯尼考特异性抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体，其制备方法如下(1)氟苯尼考单克隆抗体制备的步骤为a.动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(氟苯尼考半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为80~100|igAR，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；b.细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按510:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；C.细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l5xl(^个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37。C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；d.单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7~14天后腹腔注射杂交瘤细胞5xl()Sl(^个/只，710天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-2(rc保存；e.抗体冻干粉可将腹水在37-C环境下烘干，放入-2(TC保存；f.抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02~0.08ng/ml浓度进行稀释。(2)氟苯尼考多克隆抗体制备的步骤为采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原(氟苯尼考半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为lmg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3~4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫710天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。本发明所述试剂盒中当标记酶为过氧化物酶时底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲、底物显色液B液为四甲基联苯胺硫酸盐或氨基水杨酸、终止液为0.10.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液；浓縮洗涤液为含有0.1%~0.5%吐温80，0.5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；浓縮复溶液为含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。本发明所述试剂盒中氟苯尼考标准品溶液为六个浓度梯度的氟苯尼考溶液，氟苯尼考稀释液为含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。本发明所述试剂盒中试剂的配制具体为a.氟苯尼考标准溶液氟苯尼考系列标准溶液6瓶，浓度为Opg/L、0.5pg/L、1.5fig/L、4.5pg/L、13.5pg/L、40.5pg/L，13ml/瓶。b.包被缓冲液pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。C.封闭液含有8%15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液。d.浓縮洗涤液浓缩洗涤液为含有0.1%~0.5%吐温80，0.5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液(0.01M、pH7.4)，为正常使用浓度的15~25倍，3050ml/瓶，l瓶。e.酶标记物酶标记抗抗体工作液或酶标记氟苯尼考抗原工作液，7-12ml/瓶，l瓶。f.底物显色液A液过氧化氢或过氧化脲；g.底物显色液B液邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB);h.底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液pH8.1、含有MgCl20.0P/。的100mmolTris-HCl;i.终止液12mol/L硫酸、盐酸或2mol/L氢氧化钠缓冲液，5~8ml/瓶，l瓶。j.抗体稀释液pH8.2的0.05mol/L、含有3%小牛血清和5%oN,N，-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。k.浓缩复溶液含有50%甲醇、P/。小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的510倍，3050ml/瓶，1瓶。本发明所述检测动物源性食品中氟苯尼考的方法，包括了以下步骤(1)样品前处理；(2)用本发明所述的试剂盒进行检测；(3)分析检测结果。(l)本发明中样品前处理方法为样本前处理需配制-配液l:将2X浓縮复溶液用去离子水按1:l稀释。(用于样本提取后的复溶)(a)组织(鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)前处理方法1、用均质器均质组织样本；2、称3士0.05g样本于离心管中，加入6ml乙酸乙酯，振荡10min，室温4000r/min以上，离心10min;3、取出2ml上层液体在50-60'C下氮气/空气吹干或旋转蒸发仪蒸干4、加入lml正己垸溶解干燥的残留物，再加lml稀释后的复溶液强烈振荡lmin，室温4000r/min以上离心15min。5、取50pl下层相用于分析。样本稀释倍数1(b)蜂蜜1、取2士0.05g蜂蜜，放入离心管中，用4ml去离子水溶解；2、加入4ml乙酸乙酯上下振荡10min;3、室温4000r/min以上离心10min;4、移取lml上层乙酸乙酯(相当于0.5g样本)到另一离心管中，50-60'C氮气流下干燥；5、用0.5ml稀释后的复溶液溶解；6、取50pl用于分析。样本稀释倍数1检测下限0.5ppb定量下限1.5ppb(2)用本发明所述的试剂盒进行检测1、从4。C冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20-25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8'C。3、配液将40ml浓縮洗涤液(20倍浓缩)用蒸馏水或去离子水稀释至800ml备用(或按需要量稀释)。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本50^1/孔到各自的微孔中，然后加抗体50pl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。37"C环境中反应30min。6、取出将孔内液体甩干，用洗液25(Hil/孔洗板4-5次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头剌破)。7、每孔加入酶标记物10(^1，盖板膜盖板后置37"C环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗4-5遍(同上)，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。8、显色每孔加入底物A液50|iil，再加底物B液50pl，轻轻振荡混匀，37'C环境中避光显色15min。9、测定每孔加入终止液50nl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值(3)分析检测结果结果判定有两种方法，粗略判定可用第l种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含氟苯尼考成反比。1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.250，样本2的吸光度值为0.720，标准液吸光度值分别是0ppb为1.610;0.5ppb为1.380;1.5ppb为1.100;4.5ppb为0.620;13.5ppb为0.289;40.5ppb为0.108。则样本l的浓度范围是13.5ppb-40.5ppb;样本2的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb。2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(％)=-1~xlOO%BoB—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值Bo—Ong/ml标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以氟苯尼考标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氟苯尼考实际浓度。1免疫原的合成与鉴定(1)载体蛋白(BSA)与半抗原(氟苯尼考)进行偶联，形成完全抗原。(2)采用离心、透析或层析法纯化免疫原。(3)在紫外可见分光光度计上扫描测定半抗原、BSA和联接物的紫外可见吸收光谱，验证半抗原是否与BSA联接上，并计算偶联比率。(4)冷冻保存免疫原。2包被抗原的制备包被抗原的联接方法与免疫抗原制备方法基本上相同，只是把载体蛋白BSA改为OVA。3多克隆抗体的制备与纯化(1)动物免疫免疫动物用健康的新西兰大耳白兔，首次免疫时用完全弗氏佐剂与等量的合成免疫原混合，加强免疫用不完全弗氏佐剂与等量的合成免疫原混合；定期在免疫后约10天采少量血液，以监视抗体效价，以便确定加强免疫次数。(2)血液收集当抗体效价达到最高或所需水平时，颈动脉采血制备抗体。(3)抗体效价测定将待测血清进行梯度稀释，直至用酶标仪不能检测出酶促反应(即无色)为此。取最后一个呈现颜色反应的稀释度作为抗体的效价，即滴度。(4)抗体的纯化与保存抗血清先用50%饱和硫酸铰沉淀，再用DEAE-52分离IgG。纯化后的抗体或制备Fc片段，或加等量甘油后-20。C或-7(TC保存备用。4单克隆抗体的制备(1)脾细胞和骨髓瘤细胞的融合；(2)抗体检测；(3)杂交瘤细胞的克隆化；(4)单克隆抗体的生产。5免疫测定条件的筛选及标准曲线的建立。用方阵法筛选最佳温育时间、温度及包被抗原、抗体浓度等条件，建立标准曲线，确定最小检测极限以及与其它物质的交叉反应。6样品实地测定与验证在不含待测物的食品中加入一定量的标准残留物，放置一段时间后从中提取待测物，用所建立的ELISA方法检测待测物的残留量，记录数据，并将ELISA测定与GLC测定结果比较，验证该检测方法的可信度。图1为本发明生产的工艺流程图。图2为氟苯尼考检测标准曲线图。具体实施例方式实施例1检测氟苯尼考的酶联免疫试剂盒组分的制备1.抗原的合成a.包被原的合成将氟苯尼考半抗原通过重氮化反应和鸡卵清白蛋白(OVA)载体蛋白用活泼酯法进行偶联得到。b.免疫原的合成将氟苯尼考半抗原通过重氮化反应和钥孔槭血蓝蛋白载体蛋白用活泼酯法进行偶联得到。2.氟苯尼考鼠单克隆抗体的制备a.动物免疫采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以氟苯尼考半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为300pg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。b.细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。c.细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5><106个/1111的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37'C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。d.单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5><106个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，2(TC保存。3.氟苯尼考兔多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以氟苯尼考半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为3mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。4.酶标板的制备用包被缓冲液将羊抗兔抗抗体稀释成0.06|ig/ml，每孔加入IOOW，37。C温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次lmin，拍干，然后在每孔中加入150pl封闭液，37"C温育lh，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。实施例2检测氟苯尼考的酶联免疫试剂盒的组建组建检测氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分(1)包被氟苯尼考抗原的酶联板；(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；(3)氟苯尼考鼠单克隆抗体；(4)氟苯尼考标准品溶液6瓶，浓度分别为0吗/L、0.5吗/L、1.5pg/L、4.5pg/L、13.5pg/L、40.5pg/L;(5)底物显色液A液为过氧化氢，底物显色液B液为邻苯二胺；(6)终止液为2mol/L的硫酸缓冲液；(7)浓缩洗涤液为pH7.4，含有0.1%~0.5%吐温80，0.5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；(8)抗体稀释液为pH值8.2、0.05mol/L、含有3%小牛血清和5MoN,N-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液；(9)浓縮复溶液为含有50%甲醇、"/。小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。实施例3检测氟苯尼考的酶联免疫试剂盒的的组建组建检测氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分(1)包被羊抗兔抗抗体的酶联板；(2)用碱性磷酸酯酶标记的氟苯尼考抗原；(3)氟苯尼考兔多克隆抗体；(4)氟苯尼考标准品溶液6瓶，浓度分别为Opg/L、0.5pg/L、1.5|ig/L、4.5^g/L、13.5pg/L、40.5|ig/L;(5)底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液；(6)终止液为2mol/L的氢氧化钠缓冲液；(7)浓縮洗涤液为PH7.4,含有0.8%吐温20和0.1%叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；(8)浓縮复溶液为含有50%甲醇、P/c小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。实施例4样品中氟苯尼考残留的检测1.样品前处理用均质器均质组织样本,称3士0.05g样本于离心管中，加入6ml乙酸乙酯，振荡10min，室温4000r/min以上，离心10min;取出2ml上层液体在50-60。C下氮气/空气吹干或旋转蒸发仪蒸干,加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，再加lml稀释后的复溶液强烈振荡lmin，室温4000r/min以上离心15min。取50pl下层相用于分析。2.用试剂盒检测向氟苯尼考偶联抗原包被的96孔酶标板微孔中加系列标准品或样本溶液(各2孔)50pl，再加入氟苯尼考抗体工作液5(^1，用盖板膜封板，37'C恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250W稀释好的洗涤液，10秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体10(Hi1，用盖板膜封板，37'C恒温箱中反应30min，重复洗涤工作。加入底物显色液A液过氧化氢50pl，再加B液邻苯二胺5(^1，轻轻振荡混匀，37'C恒温箱避光显色30min。每孔加入终止液2mol/L硫酸50|li1，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。3.检测结果分析用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光度平均值(B)，除以第一个标准溶液(O标准)的吸光度值(Bo)，再乘以100%，得到百分吸光度值。以氟苯尼考浓度的半对数为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，将样品溶液的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品溶液中氟苯尼考所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品溶液中氟苯尼考的实际浓度。实施例5样品中氟苯尼考残留的检测1.样品前处理取2土0.05g蜂蜜，放入离心管中，用4ml去离子水溶解；加入4ml乙酸乙酯上下振荡10min;室温4000r/min以上离心10min;移取lml上层乙酸乙酯(相当于0.5g样本)到另一离心管中，50-60'C氮气流下干燥；用0.5ml稀释后的复溶液溶解；取50pl用于分析。2.用试剂盒检测向羊抗兔抗抗体包被的96孔酶标板微孔中加入氟苯尼考兔多克隆抗体工作液100nl，用盖板膜封板，2025'C恒温箱中反应60min，倒出孔中液体，每孔加入250]La浓缩洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。每孔加入细菌提取碱性磷酸酯酶标记的氟苯尼考抗原50pl，再加入系列标准品或样本溶液5(Hd，用盖板膜封板，2025nC恒温箱中反应30min，重复洗涤过程。加入对硝基磷酸盐缓冲液100^1，轻轻振荡混匀，2025'C恒温箱避光显色30min。每孔加入终止液2mol/L氢氧化钠溶液50^1，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。3.检测结果分析用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(O标准)的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。以氟苯尼考浓度Oig/L)的半对数为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，将样品溶液的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品溶液所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品溶液中氟苯尼考实际浓度。实验例1标准品精密度试验从每批按照实施例1(4)中的方法制备的酶联板中，各抽出10个微孔，测定4.5^g/L。标准溶液的吸光度值(OD值)，重复3次，计算变异系数CVe/。，结果见表l。表1标准可重复性试验(CW。)<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>结果表明变异系数范围在3.5%9.4%之间，符合了变异系数小于20%的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了标准。实验例2样本可重复性试验以5pg/L，浓度的氟苯尼考对鱼虾、肌肉和蜂蜜，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各五个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表2、表3。_表2鱼虫下、肌肉样品可重复性试_批号_实测值牆1_变异系数CV%<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3结果表明鱼虾、肌肉样本变异系数均低于20%，蜂蜜样本的变异系数均低于20%，符合了变异系数小于25%的规定，说明本试剂盒测定样本的精密度达到了标准。实验例3试剂盒的准确度试验取两个浓度的氟苯尼考标准品溶液，分别为0.5ng/kg(L)和lHg/kg(L)，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。表4试剂盒的准确度样本鱼虾、肌肉蜂蜜<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>结果表明鱼虾、肌肉添加的回收率在73.4%~92.8%之间，蜂蜜添加回收率在73.5%86.1%之间。实验例4试剂盒保存条件为28'C，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50%抑制浓度、氟苯尼考添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37'C保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-2(TC冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒在28"可以保存6个月以上。权利要求1.一种检测动物源性食品中氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，它含有(1)包被氟苯尼考抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；(2)酶标记物；(3)氟苯尼考特异性抗体；(4)氟苯尼考标准品溶液；(5)底物显色液；(6)终止液；(7)浓缩洗涤液；(8)浓缩复溶液。2.如权利要求1所述的检测动物源性食品中氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，其特征是试剂盒中氟苯尼考包被抗原是采用混合酸酐法将氟苯尼考半抗原与鸡卵清白蛋白(OVA)进行偶联得到的，抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。3.如权利要求2所述的检测动物源性食品中氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，其特征是试剂盒中酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记氟苯尼考抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本发明优选过氧化物酶；酶标记物形式可为冻干粉、浓縮液和工作液。4.如权利要求3所述的检测动物源性食品中氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，其特征是试剂盒中酶标记抗原是采用活性酯法将标记酶与氟苯尼考半抗原进行偶联得到，试剂盒中氟苯尼考特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体，免疫原是采用混合酸酐法将氟苯尼考半抗原与钥孔槭血蓝蛋白进行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓缩液、工作液。5.如权利要求4所述的检测动物源性食品中氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，其特征是制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为批pH值9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；包被氟苯尼考抗原或抗抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；洗涤液为含有0.1%0.5%吐温80，0.5y。叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；封闭液是含有8%~15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液。6.如权利要求1-5所述的任一检测动物源性食品中氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，其特征是试剂盒中氟苯尼考标准品溶液为六个浓度梯度的氟苯尼考溶液，浓度为(Hig/L、0.5ng/L、1.5ng/L、4.5吗/L、13.5pg/L、40.5pg/L，13ml/瓶。7.—种检测动物源性食品中氟苯尼考的方法，包括了以下步骤:(1)样品前处理；(2)用权利要求1-5任一所述的试剂盒的试剂进行检测；(3)分析检测结果。全文摘要本发明提供了一种检测氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，它含有包被有包被原的酶联板；酶标记物；氟苯尼考特异性抗体；氟苯尼考标准品溶液；底物显色液；终止液；浓缩洗涤液；浓缩复溶液。本发明还提供了一种检测动物源性食品中氟苯尼考的方法，包括了以下步骤样品前处理；用试剂盒的试剂进行检测；分析检测结果。本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、适用于大量样本筛查的检测动物源性食品氟苯尼考的酶联免疫试剂盒及检测方法。文档编号G01N33/577GK101349693SQ20081004203公开日2009年1月21日申请日期2008年8月25日优先权日2008年8月25日发明者青吴,俊唐,成李,宏杨,杨宗繁,温俊梅,聂继斌,欣齐申请人:深圳市绿诗源生物技术有限公司