呋喃西林代谢物(sem)快速检测试剂盒及其应用的制作方法

专利名称：：呋喃西林代谢物(sem)快速检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种检测分析动物源性食品中兽药残留的技术，特别是检测呋喃西林的酶联免疫试剂及方法。
背景技术：
：硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物(SEM)均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药物禁止在治疗和饲料中使用，呋喃西林在1995年被禁用。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。用来检测呋喃西林代谢物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS，但是这几种方法检测相对繁琐，对仪器要求较高，不适合大量样本的快速检测。酶联免疫方法结合了色谱技术，采用SEM衍生物的特异性抗体，具有很高的准确度和灵敏度，并且操作简便、检测时间短、检测样本量大。
发明内容本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、适用于大量样本筛查的检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒及方法。本发明的检测原理当包被原为呋喃西林代谢物衍生物偶联抗原时是将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白偶联物(SEM-BGG)吸附于固相载体上，加入样本或呋喃西林代谢物衍生物标准品，然后加呋喃西林代谢物特异性抗体，待测样品中残留的呋喃西林代谢物(经前处理衍生化以后)和酶标板上包被的呋喃西林代谢物衍生物抗原竞争呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体。再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中呋喃西林代谢物残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物的浓度。包被原为抗抗体时是将抗抗体吸附于固相载体上，加入呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体，再加入呋喃西林代谢物衍生物酶标记抗原和样本或呋喃西林代谢物衍生物标准品溶液，待测样本中残留的呋喃西林代谢物(经前处理衍生化以后)和酶标记呋喃西林代谢物衍生物抗原竞争呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中呋喃西林代谢物残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出呋喃西林代谢物的浓度，与标准溶液颜色比较则可判断样品中呋喃西林代谢物的浓度范围。本发明提供了一种检测动物源性食品中呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒，它含有(1)包被呋喃西林代谢物衍生物抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；(2)酶标记物；(3)呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体；(4)呋喃西林代谢物衍生物标准品溶液；(5)底物显色液；(6)终止液；(7)浓縮洗涤液；(8)浓縮复溶液。本发明所述试剂盒中呋喃西林代谢物衍生物包被抗原是采用活泼酯法将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到的，抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为pH值9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液;包被呋喃西林代谢物衍生物抗原或抗抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为含有0.1%~0.5%吐温80，0.5%叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；所用的封闭液是含有8%~15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液。本发明所述试剂盒中包被呋喃西林代谢物衍生物抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板的制备步骤为(1)用包被缓冲液将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白(BGG)偶联物或抗抗体以0.02~0.08pg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗抗体稀释液；(2)向酶联板的每孔中加入100^1已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37'C温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次1530s，拍干；(3)向酶联板的每孔中加入150200nl封闭液，37'C温育l2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。本发明所述试剂盒中酵标记物为酶标记抗抗体或酶标记呋喃西林代谢物衍生物抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本发明优选过氧化物酶；酶标记物形式可为冻干粉、浓縮液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液为含有50n/。甘油(可防止放入-2(TC环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生物活性)、1%的叠氮化钠防腐剂(便于保存)的溶液。本发明所述试剂盒中酶标记抗抗体的制备步骤为(1)抗抗体的制备以鼠源性抗体为免疫原对无病原体山羊迸行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；或以兔源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。(2)过氧化物酶标记抗抗体的制备将抗抗体与过氧化物酶(HRP)进行偶联，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗体与辣根过氧化物酶的结合率升高，传统GA—步法偶联反应不易控制，反应速度快的分子易发生自生聚合，且偶联效率不高。为了解决这些问题，我们将一步法进行了改进，克服了一步法的缺点。首先在被偶联的两种分子中，与偶联剂反映较弱的分子先用过量的偶连剂活化，然后去处多余的偶连剂；第二步将一端与某种分子连接的偶连剂，通过改变反应条件而与另一种分子连接起来。二步法虽然操作较繁，但偶连效率提高，而且形成的同分子聚合物减少。本发明所述试剂盒中酶标记抗原是采用活性酯法将标记酶与呋喃西林代谢物半抗原进行偶联得到。本发明所述试剂盒中呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔源多克隆抗体，免疫原是采用活泼酯法将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白进行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓缩液、工作液；抗体稀释液为pH值8.2、0.05mol/L、含有3%小牛血清和596oN，N，-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。本发明所述试剂盒中呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体，其制备方法如下(l)呋喃西林代谢物衍生物单克隆抗体制备的步骤为a.动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(呋喃西林代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为80100pg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2~3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；b.细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按510:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；C.细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成l5xl06个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存，复苏时取出冻存管，立即放入37'C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；d.单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7~14天后腹腔注射杂交瘤细胞5><105~106个/只，7~10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20°<:保存；e.抗体冻干粉可将腹水在37'C环境下烘干，放入-2(TC保存；f.抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02~0.08ng/ml浓度进行稀释。(2)呋喃西林代谢物衍生物多克隆抗体制备的步骤为采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原(呋喃西林代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为lmg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔34周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7~10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。本发明所述试剂盒中当标记酶为过氧化物酶时底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲、底物显色液B液为四甲基联苯胺硫酸盐或氨基水杨酸、终止液为0.1~0.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液浓縮洗涤液为含有0.1%~0.5%吐温80，0.5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；浓縮复溶液为含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。本发明所述试剂盒中呋喃西林代谢物衍生物标准品溶液为六个浓度梯度的呋喃西林代谢物衍生物溶液，呋喃西林代谢物衍生物稀释液为含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。本发明所述试剂盒中试剂的配制具体为a.呋喃西林代谢物衍生物标准溶液呋喃西林代谢物衍生物系列标准溶液6瓶，浓度为0ng/L、0.05ng/L、0.15ng/L、0.45pg/L、1.35ng/L、4.05ng/L，l~3ml/瓶。b.包被缓冲液pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。c.封闭液含有8%~15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液。d.浓縮洗涤液浓缩洗涤液为含有0.1%~0.5%吐温80，0.5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液(0.01M、pH7.4)，为正常使用浓度的1525倍，3050ml/瓶，1瓶。e.酶标记物酶标记抗抗体工作液或酶标记呋喃西林代谢物衍生物抗原工作液，712ml/瓶，l瓶。f.底物显色液A液过氧化氢或过氧化脲；g.底物显色液B液邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB);h.底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液pH8.1、含有MgCl20.01。/。的訓mmolTris-HCl;i.终止液12mol/L硫酸、盐酸或2mol/L氢氧化钠缓冲液，58ml/瓶，1瓶。j.抗体稀释液pH8.2的0.05mol/L、含有3%小牛血清和596oN,N'-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。k.浓縮复溶液含有50%甲醇、P/。小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液，为正常使用浓度的510倍，3050ml/瓶，1瓶。1.抗体溶液抗体工作液本发明所述检测动物源性食品中呋喃西林代谢物的方法，包括了以下步骤(1)样品前处理；(2)用本发明所述的试剂盒进行检测；(3)分析检测结果。本发明中样品前处理方法为样本前处理需配制用去离子水将2x浓縮复溶液按l:l稀释，用于样本提取后的复溶。C液(供奶样用)称12.5g亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。D液(供奶样用)称29.8g硫酸锌用去离子水溶解定溶至100ml。0.1MK2HPO4称22.8gK2HPCV3H20加去离子水溶解定溶至1L。1MHC1取8.6ml浓HC1加水定溶至100ml。1MNaOH称取4gNaOH加水定溶至100ml。a.肉样或鱼虫下取l±0.05g的均质样本(肉样/鱼虾)加入4ml的去离子水，0.5ml1MHC1和100pl衍生化试剂，充分振荡；置于72X:孵育(大约24h);分别加入5ml0.1MK2HP04，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振荡30s;在室温下(20~25°C)4000r/min以上离心lOmin;取出2.5ml的乙酸乙酯到另一洁净容器中于5(TC氮气/空气吹干；用lml正己垸溶解干燥物，用1ml已稀释好的复溶液充分混合；在室温下(20~25'C)4000r/min以上离心lOmin;取50^1下层相用于分析。样本稀释倍数-2本法的优点在于提高了衍生化的温度，使反应时间大大缩短。b.奶样取出5ml的奶样本到玻璃离心管中，分别加入C液和D液各25(^1:用振荡器充分混合样本，用恒温离心机4000r/min以上离心10min(4~12°C)，若没有恒温离心机，则先将样本降温至大约8'C,然后离心；取离心上清液1.1ml(相当lml奶样)，分别加入4ml的去离子水，0.5ml1MHC1和lOOpl衍生化试剂，充分振荡；置于72"孵育(大约2~4h);分别加入5ml0.1MK2HPO4，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振荡30s;在室温下(20~25°C)4000r/min以上离心lOmin;取出2.5ml的乙酸乙酯到另一洁净容器中于5(TC氮气/空气吹干用lml正己烷溶解干燥物，用lml已稀释好的复溶液充分混合；在室温下(20~25°C)4000r/min以上离心lOmin;取50nl下层相用于分析。样本稀释倍数2c.蜂蜜取l士0.05g样本到离心管中；加入4ml的去离子水溶解,再加入0.5ml1MHC1和lOOpl衍生化试剂,充分振荡；2.置于72'C孵育(大约2~4h);分别加入5ml0.1MK2HPO4，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，充分振荡30s;在室温下(20~25°C)4000r/min以上离心lOmin;取出2.5ml的乙酸乙酯到另一洁净容器中于5(TC氮气/空气吹干；用lml正己烷溶解干燥物，用lml已稀释好的复溶液充分混合；在室温下(20~25°C)4000r/min以上离心lOmin。样本稀释倍数2d蛋类称取制备好的鸡蛋样本2g，加入到50ml离心管中，分别加入4ml水，0.5mllMHCl，200^1C液，振荡混匀；加入200jilD液，充分振荡5min，室温(2025。C)3000g以上离心lOmin;取全部上清液，加入200nl衍生化试剂，充分振荡，5(TC水浴2h(中间每半个小时剧烈振荡1~2分钟)；分别加入5ml0.1MK2HPO4,0.4ml1MNaOH5ml乙酸乙酯，剧烈振荡30s，室温(20~25°C)4000r/min以上离心10min;取2.5ml上层有机相于50'C下氮气吹干；加入lml正己烷溶解干燥物；加入2ml稀释后的复溶液，振荡10s，4000r/min以上离心10min(如出现乳化现象，请于6(TC水浴中加热5min，再重复离心)；除去上层有机相；取下层水相50nl用于分析。(2)用本发明所述的试剂盒进行检测1)从^C冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20~25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2)取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于28。C。3)配液将40ml浓縮洗涤液(20倍浓縮)用蒸馏水或去离子水稀释至800ml备用(或按需要量稀释)。4)编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5)加标准品/样本5(Hil/孔到各自的微孔中，然后加抗体50nl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。37r环境中反应30min。6)取出将孔内液体甩干，用洗液250^1/孔洗板4~5次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。7)每孔加入酶标记物IOOW，盖板膜盖板后置37t:环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4~5遍(同上)，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。8)显色每孔加入底物A液50nl，再加底物B液5(HU，轻轻振荡混匀，37"C环境中避光显色15min。9)测定每孔加入终止液50nl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(3)分析检测结果结果判定有两种方法，粗略判定可用第l种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与SEM的含量成负相关。1)定性判定用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含SEM浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.268，样品2的吸光度值为1.230，标准液吸光度值分别是Oppb为1.671;0.05ppb为1.425;0.15ppb为1.103;0.45ppb为0.567;1.35ppb为0.205;4.05ppb为0.104。则样品1的浓度范围是0.45ppb-1.35ppb;样品2的浓度范围是0.05ppb"0.15ppb。(再乘以相应的稀释倍数)2)定量判定所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(Bo)再乘以100%，即百分吸光度值。百分吸光度值(％)=2x100%B^标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B(T"0ng/ml标准溶液的平均吸光度值以标准品百分吸光率为纵坐标，以SEM标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中SEM实际浓度。图1是呋喃西林代谢物的检测标准曲线图，其中横坐标表示呋喃西林代谢物药物标准品浓度(ng/L),纵坐标表示标准品百分吸光率。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明迸行说明，但本发明不局限于以下几种具体实施例。实施例1检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒组分的制备1.抗原的合成a.包被原的合成将呋喃西林代谢物采用衍生物法合成呋喃西林4t谢物衍生物半抗原，再将半抗原通过重氮化反应和牛丙种球蛋白载体蛋白用活泼酯法进行偶联得到。b.免疫原的合成将呋喃西林代谢物采用衍生物法合成呋喃西林代谢物衍生物半抗原，再将半抗原通过重氮化反应和钥孔槭血蓝蛋白载体蛋白用活泼酯法进行偶联得到。2.呋喃西林代谢物衍生物鼠单克隆抗体的制备a.动物免疫采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以呋喃西林代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为300pg/只，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。b.细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。c.细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5xl()S个/rnl的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37。C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。d.单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将8周龄的Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5xl()S个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，2(TC保存。3.呋喃西林代谢物衍生物兔多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔作为免疫动物，以呋喃西林代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为3mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。4.酶标板的制备用包被缓冲液将羊抗兔抗抗体稀释成0.06ng/ml，每孔加入100nl，37'C温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次lmin，拍干，然后在每孔中加入150^1封闭液，37t温育lh，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。实施例2检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒的组建组建检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分(1)包被呋喃西林代谢物衍生物抗原的酶联板；(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；(3)呋喃西林代谢物衍生物鼠单克隆抗体；(4)呋喃西林代谢物标准品溶液6瓶，浓度分别为0pg/L、0.05pg/L、0.15pg/L、0.45pg/L、1.35ng/L、4.05吗/L;(5)底物显色液A液为过氧化氢，底物显色液B液为邻苯二胺；(6)终止液为2mol/L。的硫酸缓冲液；(7)浓縮洗涤液为pH7.4，含有0.1%~0.5°/。吐温80，0.5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液；(8)抗体稀释液为pH值8.2、0.05mol/L、含有3%小牛血清和596。N,N，-二甲基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液；(9)浓縮复溶液为含有50%甲醇、P/。小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。实施例3检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒的的组建组建检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分(1)包被羊抗兔抗抗体的酶联板；(2)用碱性磷酸酯酶标记的呋喃西林代谢物衍生物抗原；(3)呋喃西林代谢物衍生物兔多克隆抗体；(4)呋喃西林代谢物衍生物标准品溶液6瓶，浓度分别为Opg/L、0.05pg/L、0.15pg/L、0.45吗/L、1.35吗/L、4.05ng/L;(5)底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液；(6)终止液为2mol/L的氢氧化钠缓冲液；(7)浓縮洗漆液为PH7.4，含有0.8%吐温20和0.P/。叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；(8)浓缩复溶液为含有50%甲醇、P/。小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。实施例4样品中呋喃西林代谢物残留的检测1.样品前处理取lg鱼虾的均质物，依次加入4ml的蒸馏水，0.5mllM的HC1和100pl10mM的2-硝基苯甲醛，充分振荡。超声振荡1小时后于72'C孵育3小时，分别加入5ml0.1MK2HP04，0.4ml1MNaOH和5ml的乙酸乙酯，剧烈振荡30秒钟在室温下(2025")离心，转速为3000rpm。取出2.5ml的乙酸乙酯层蒸干，用lml的正己垸溶解干燥物，用lml的复溶液适当的混合。在室温(2025-C)、3000rpm离心。用50nl的下层液体进行分析。2.用试剂盒检测向呋喃西林代谢物衍生物偶联抗原包被的96孔酶标板微孔中加系列标准品或样本溶液(各2孔)50pl，再加入呋喃西林代谢物衍生物抗体工作液50nl，用盖板膜封板，37'C恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250W浓缩洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体10(^1，用盖板膜封板，37'C恒温箱中反应30min，重复洗涤工作。加入底物显色液A液过氧化氢50nl，再加B液邻苯二胺50nl，轻轻振荡混匀，37t:恒温箱避光显色15min。每孔加入终止液2mol/L。硫酸50-，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。3.检测结果分析用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光度平均值(B)，除以第一个标准溶液(O标准)的吸光度值(Bo)，再乘以100%，得到百分吸光度值。以呋喃西林代谢物浓度的半对数为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，将样品溶液的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品溶液中呋喃西林代谢物所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品溶液中呋喃西林代谢物的实际浓度。实施例5样品中呋喃西林代谢物残留的检测1.样品前处理取2ml牛奶，将其置5000rpm离心10min，除去上层脂肪，取下层50^1，试剂盒所提供的复溶液按l:40倍稀释。2.用试剂盒检测向羊抗兔抗抗体包被的96孔酶标板微孔中加入呋喃西林代谢物衍生物兔多克隆抗体工作液10(^1，用盖板膜封板，37'C恒温箱中反应30min，倒出孔中液体，每孔加入250nl浓縮洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。每孔加入细菌提取碱性磷酸酯酶标记的呋喃西林代谢物衍生物抗原5(^1，再加入系列标准品或样本溶液50^1，用盖板膜封板，37'C恒温箱中反应30min，重复洗涤过程。加入对硝基磷酸盐缓冲液100nl，轻轻振荡混匀，37。C恒温箱避光显色30min。每孔加入终止液2mol/L。氢氧化钠50^1，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值。3.检测结果分析用所获得的每个浓度的标准溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(O标准)的吸光度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。以呋喃西林代谢物衍生物浓度(Hg/L)的半对数为x轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，将样品溶液的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品溶液所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品溶液中呋喃西林代谢物实际浓度。实验例1标准品精密度试验在鸡肉、虾肉、蜂蜜和牛奶中，将呋喃西林代谢物添加至终浓度为0.5pg/kg，lpg/kg，2ng/kg。每种样品，每个浓度各5个平行。测定3批。计算平均值、添加回收率及批内批间变异系数，结果见表l。表1准确度和精密度的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>从表1可知，测定三批试剂盒，每批试剂盒测定结果取均值计算显示，呋喃64.0—80.0%之间；在虫下样本中添加浓度0.5ng/kg、1(jg/kg和2ng/kg时的回收率均在76.0—102%之间；在蜂蜜样本中添加浓度0.5ng/kg、lpg/kg和2(ig/kg时的回收率均在80.0—100.0%之间；在牛奶样本中添加浓度0.5pg/kg、lng/kg和2pg/kg时的回收率均在70.0—88.0%之间；各添加浓度的批内变异系数为7.5%—16.6%，均低于13%。批间变异系数为9.6~25.2%，均低于20%。结果表明鱼虫下、肌肉添加的回收率在73.4%~92.8%之间，牛奶添加回收率在73.5%~86.1%之间。实验例2样本可重复性试验以0.5pg/L，浓度的呋喃西林代谢物对鱼虾、肌肉和牛奶，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各五个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表2、表3。表2鱼虾、肌肉样品可重复性试_批号实测值pg/L变异系数<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>0.40.30.30.30.416.10.30.30.30.40.416.1060.40.40.30.30.316.10.40.40.40.50.410.6结果表明鱼虾、肌肉样本变异系数均低于20%，牛奶样本的变异系数均低于20%，符合了变异系数小于25%的规定，说明本试剂盒测定样本的精密度达到了标准。实验例3抗体效价实验一、用KLH偶联的免疫原制备出的抗体，经过效价的测定结果如下表表4用间接法测定钥孔书或血蓝蛋白(KLH)制备的抗原抗体效价抗体稀释倍数—抗原稀释倍数1:30001:60001:卯001:120001:3000承承承承3.4122.9562.5411:60003.4113.1152.5422.1241:90003.0122.9422.2201.9561:120002.8562.5322.0421.804表5用间接法测定牛血清白蛋白(BSA)制备的抗原抗体效价抗体稀释倍数-抗原稀释倍数1:30001:60001:90001:120001:30003.0222.9562.6952.1231:60002.5622.4562.3242.1241:90002.1142.0211,9561.6231:120001.8621.4401.3210.975表6用间接法测定卵清蛋白(OVA)制备的抗原抗体效价抗原稀释倍数抗体稀释倍数-1:30001:60001:90001:120001:30002.3422.2852.1452.0021:60002.1401.9561.7421.3421:90001.8561.6521.2440.9541:120001.3421.0240.8530.563~~根据方阵滴定原理，采用间接ELISA法测定三种抗原抗体的效价。效价;称滴度，是在给定的测定条件下有效抗体浓度的量度，一般以最大稀释倍数表示。抗体滴度越高则说明有效抗体浓度越高，质量越好。从表4，表5，表6中可以看出，用钥孔槭血蓝蛋白(KLH)偶联的免疫原，抗原抗体的效价都要好过其他两种，当抗原为1:12000时，KLH的抗体效价为1:12000，而BSA和OVA的则为l:7000和1:4000。因此本发明选用KLH所制备的抗体。二、ICso的测定ICso是指产生50%抑制率(B/BQ=0.5)所需的半抗原量，IC5o是反映抗体对不同半抗原的相对亲和性和半抗原竞争质量的重要参数。IC50越小，方法灵敏度越高，对低浓度样品测定的准确读越高。将KLH偶联、BSA偶联和OVA偶联制备的三种抗体分别做间接竞争性EUSA，分别测定它们的ICs。，结果见表7，表6和表7。用KLH偶联的抗原制备的抗体的IC5Q为0.22ng/ml,而用BSA和OVA偶联的抗原制备的抗体的ICso则分别为0.892ng/ml和5.3ng/ml。表7三种偶联蛋白制备的抗体的IC:偶联的蛋白KLHBSAOVAIC50(ng/ml)0.23-0.470.8-1.15-9三、抗体的特异性是指抗体对待测物的识别能力，强调抗体与待测物间结合反应的专一性和对结构相近或相关物质的区分能力。特异性取决于待测物与其他物质的交叉反应。在竞争分析中，不同物质的交叉反应率可用如下公式计算交叉反应率(％)=IC50(竞争物)/IC5Q(待测物)*100表8用KLH蛋白偶联的抗原制备的抗体的交叉反应率化合物交叉反应率(％)呋喃西林代谢物100呋喃唑酮代谢物0.01呋喃它酮代谢物0.01呋喃妥因代谢物0.01KLH偶联、BSA偶联和OVA偶联制备的三种抗体分别做间接竞争性ELISA，分别测定它们的交叉反应率，结果见表8，用KLH偶联的抗原制备的抗体与呋喃西林代谢物交叉率为100%，与呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃妥因代谢物没有交叉反应性；KLH偶联蛋白制备的抗体的特异性远远好于BSA和OVA。验例4试剂盒的灵敏度按50%抑制法评价结果根据实验要求，测定5次50%抑制浓度，计算平均值和波动范围。结果见表1。表9IC50计算结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>山表9可知，绿诗源试剂盒IC5。平均值为0.367ng/kg，波动范围在0.280.47fig/kg之间。其他试剂盒ICw平均值为0.7ng/kg,波动范围在0.450.8ng/kg之间。(2)按最低检测限评价样品的最低检测限是灵敏度的一个评价指标。根据实验要求，分别测定了鸡肉、蜂蜜、虾、牛奶各20个空白样品，根据标准曲线求出测定值，计算出其平均值，再加上3倍标准差，即为最低检测限，测得检测下限分别为。具体实验鸡肉为43.5ng/kg，蜂蜜为47.1ng/kg，虾为49.8ng/kg，牛奶为47.8ng/kg。结果见表10-13表10空白鸡肉测定结果统计表ng/kg<table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>权利要求1.一种呋喃西林代谢物(SEM)快速检测试剂盒，包括(1)包被有包被原的酶联板；(2)酶标记物；(3)呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体；(4)呋喃西林代谢物衍生物标准品溶液；(5)底物显色液；(6)终止液；(7)浓缩洗涤液；(8)浓缩复溶液；所述酶联板中包被的包被原为呋喃西林代谢物衍生物抗原或包被抗抗体，其特征在于呋喃西林代谢物衍生物包被抗原是采用活泼酯法将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到，所述抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体，多克隆抗体为呋喃西林代谢物衍生物半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物免疫鼠或者兔得到，单克隆抗体采用细胞融合和克隆化得到，抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标记物为嗨标记抗抗体或酶标记呋喃西林代谢物衍生物抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液，酶标记抗原采用活性酯法将标记酶与呋喃西林代谢物半抗原进行偶联得到。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于标记酶为过氧化物酶时底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲、底物显色液B液为四甲基联苯胺硫酸盐或氨基水杨酸、终止液为0.10.5mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为半乳糖甘酶时，底物显色液为0.5mol/L磷酸钾缓冲液，终止液为2mol/L的柠檬酸缓冲液；浓缩洗涤液为含有0.1%~0.5%吐温80，0.5%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液浓縮复溶液为含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于呋喃西林代谢物衍生物标准溶液浓度为0pg/L、0.05ng/L、0.15ng/L、0.45pg/L、1.35pg/L、4.05pg/L。5.—种检测动物源性食品中呋喃西林代谢物的方法，包括了以下步骤(l辨品前处理；(2)用权利要求1-4任一所述的试剂盒的试剂迸行检测；(3)分析检测结果。6.如权利要求5所述的检测动物源性食品中呋喃西林代谢物的方法，其特征是，向呋喃西林代谢物衍生物偶联抗原包被的酶标板微孔中加样本溶液，再加入呋喃西林代谢物衍生物抗体工作液，用盖板膜封板，37'C恒温反应，倒出孔中液体，加入浓縮洗涤液，拍干，加入辣根过氧化物酶标记的抗抗体，用盖板膜封板，37°C恒温反应，加入底物显色液，37"C恒温避光显色，加入终止液，用酶标仪测定每孔吸光度值。全文摘要本发明提供了一种检测呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒，它含有包被有包被原的酶联板；酶标记物；呋喃西林代谢物衍生物特异性抗体；呋喃西林代谢物衍生物标准品溶液；底物显色液；终止液；浓缩洗涤液；浓缩复溶液。呋喃西林代谢物衍生物包被抗原是采用活泼酯法将呋喃西林代谢物衍生物半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到，所述抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明还提供了一种检测动物源性食品中呋喃西林代谢物的方法，包括了以下步骤样品前处理；用试剂盒的试剂进行检测；分析检测结果。本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、适用于大量样本筛查的检测动物源性食品呋喃西林代谢物的酶联免疫试剂盒及检测方法。文档编号G01N33/577GK101349695SQ200810042038公开日2009年1月21日申请日期2008年8月25日优先权日2008年8月25日发明者青吴,俊唐,成李,宏杨,杨宗繁,温俊梅,聂继斌,欣齐申请人:深圳市绿诗源生物技术有限公司