专利名称：：泌乳素时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及泌乳素(PRL)定量检测试剂盒，属于时间分辨免疫荧光分析法检测领域。
背景技术：
：泌乳素(Prolactin,PRL)是一种由垂体前叶分泌的单链多肽激素，由199个氨基酸构成，分子量约为23Kd，其结构和生物学方面与生长激素、胎盘泌乳素属同类激素，男、女性体内均含有。PRL与GH—样不需要通过靶腺发挥作用。它对机体和乳腺的生长发育、乳汁的分泌、性腺发育、调节水及电解质代谢都起着十分重要的作用。泌乳素的合成及释放受神经内分泌控制，主要通过泌乳素释放因子(PRF)和泌乳素抑制因子(PIF)调控(以PIF为主)。女性的泌乳素基础水平较男性的稍高，并在青春期随雌激素的分泌明显升高，在绝经期相应降低。泌乳素的主要功能是刺激乳房发育并维持泌乳，也会抑制性功能。在孕期泌乳素水平逐渐升高至正常值的10-20倍之间，产后3-4周降至非孕期水平，哺乳期妇女维持高泌乳素水平，血清浓度需经几个月才能降至非孕期水平。目前血清PRL的检测主要有酶联免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受示踪剂性状的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限，IRMA试剂盒受同位素半衰期的影响，有效期短，此外还有一定的放射性污染。时间分辨免疫荧光分析(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)利用具有独特荧光特性的镧系元素，代替酶、同位素等，做为发光免疫分析中的一种重要方法，具有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染等许多优点。
发明内容本发明的目的是提供一种用于PRL检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，主要解决现有技术存在的灵敏度低、稳定性差、操作烦琐及污染环境等技术问题。本发明采用铕标记技术，提供铕标记试剂盒，以提高方法的灵敏度及稳定性。本发明的技术方案是在进行时间分辨免疫荧光分析检测法前需完成下列准备工作首先制备包被板，所用的包被板为特异性抗体包被的板，PRL包被板条的制备包括以下步骤(1)将纯化的PRL单克隆抗体用碳酸盐缓冲液稀释，然后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得PRL单克隆抗体包被板条；(2)将PRL单克隆抗体包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏备用。其次是PRL铕标记的制备，包括以下步骤(1)取待标记抗体加入透析袋中，放入配制好的ra9.5的碳酸盐缓冲液中，室温透析过夜(其间多次换透析液)；(2)次日，取出抗体，稀释至0.2-5/mL，按质量比为2:1的比例(DTTA-Eu:抗体)边振荡边加入DTTA-Eu,室温下在振板机上慢速振荡1小时，然后在黑暗中静置48小时；(3)标记好的抗体与游离DTTA-Eu通过S印hadexG50(8cm)+5印}13『0566B(38cm)色谱柱(1.5X50cm)分离，分离过程用核酸蛋白仪监控；(4)用小试管依次分段接受流出物，用分光光度计，在280nm处测吸光度，同时测荧光强度，计算出Eu标抗体浓度；(5)用0.2um的滤器过滤；(6)加入0.3%优级纯BSA，2-8。C保存。泌乳素时间分辨免疫荧光分析法，包括下列步骤①固相抗体制备将抗泌乳素单克隆抗体用碳酸钠缓冲溶液稀释至1-10ug/mL作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；②镧系元素离子标记抗体制备选用配对抗泌乳素单克隆抗体用常规方法进行镧系元素离子标记；③在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入泌乳素标准品或待测样品，以及用反应缓冲液稀释的标记抗体进行孵育，最后进行荧光测定。步骤①中包被液中单克隆抗体的浓度为1-10ug/mL，步骤②中标记抗体用反应缓冲液以体积比为1:20稀释。步骤②中的镧系元素离子优选为EiT'+。步骤③中的皮应缓冲液为PH7.8的50誦1/LTris-HCl，内含0.9%NaCl，1%BSA，0.05%牛IgG，20uMDTPA，0.08%Tween20和0.l%NaN:,;且该步骤③在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。所用增强液为荧光增强液。泌乳素定量检测试剂盒，其特征是试剂盒包括:包被抗体的缓冲液、封闭液、反应缓冲液、洗液、增强液，以及作为包被抗体的抗泌乳素单克隆抗体，镧系元素离子标记的抗泌乳素单克隆抗体和泌乳素标准品。所述PRL标准品的制备方法为先分别将PRL冻干抗原溶解并稀释至所需的最高浓度，再采用倍比稀释法稀释至所需浓度，获得PRL标准品。标准品为用含6%BSA，4%糖，0.1%NaN3，50誦ol/LTris-HCl缓冲液将泌乳素蛋白配制成标准品。本发明使用双抗体夹心法，反应步骤包括试剂准备、加样反应、洗涤拍干、加增强液、测荧光值。本发明的有益效果是分析灵敏度高(5mlU/L)，检测时间短(65min)，特异性好，与干扰物质的交叉反应小。图1为本发明的反应原理图本发明采用双抗体夹心一步法。抗人PRL单抗包被于96孔荧免板，校准品或样品中的PRL与包被单抗及铕离子(Eu3+)标记的单抗于微孔内表面发生免疫反应，微孔表面的夹心免疫复合物与游离标记单抗通过洗涤分离。微孔表面免疫复合物中的Eir'+被荧光增强液解离后形成稳定的荧光配合物，荧光强度与校准品或样品中的PRL浓度呈正比例，通过剂量一反应曲线可得出样品中PRL浓度。图2为本发明操作流程图第一步复融校准品，第二步稀释铕标记物，第三步加入校准品和待测样品，第四步加入稀释后的铕标记，第五步孵育，第六步洗板，第七步加入增强液，第八步检测。具体实施例方式下面参照图1、2通过实施例对本发明作进一步说明。实施例泌乳素(PRL)测定1、标准品配制用含6%BSA，4%糖，0.1%NaN3，50mmol/LTris-HCl缓冲液将PRL蛋白酉己制成0、3、10、30、100、300mlU/mL标准液，以国家PRL标准品校正。分装，于+2+8'C保存。2、操作步骤1)试剂的准备a)洗涤液将40mL浓縮洗液和960mL去离子水在干净的洗液瓶中混合，作为工作洗涤液备用。b)铕标记使用前一小时内，用分析缓冲液按l:20稀释铕标记物。c)将试剂盒分析缓冲液、待测样品、校准品和和所需数量的微孔反应条平衡至室温(2025°C)。2)吸取25ul的校准品或样品，按顺序加入相应微孔底部。3)在各微孔内加入100ul已稀释的铕标记溶液，室温下于慢档振动60分钟。4)洗板6次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。5)在每个微孔内加入200y1的增强液，室温下于慢档振动5分钟。6)用时间分辨荧光测定仪检测。泌乳素(PRL)测定流程见表1表l泌乳素(PRL)测定流程<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3、特异性见表2表2PRLTRIFMA与TSH、LH、FSH等的交叉反应<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表观PRL浓度为上表所示浓度的交叉反应物质用本试剂检测所得到的PRL浓度。权利要求1、泌乳素时间分辨免疫荧光分析法，其特征是包括下列步骤①固相抗体制备将抗泌乳素单克隆抗体用碳酸钠缓冲溶液稀释至1-10ug/mL作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；②镧系元素离子标记抗体制备选用配对抗泌乳素单克隆抗体用常规方法进行镧系元素离子标记；③在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入泌乳素标准品或待测样品，以及用反应缓冲液稀释的标记抗体进行孵育，最后进行荧光测定。2、根据权利要求1所述泌乳素时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤②中标记抗体用反应缓冲液以体积比为1:20稀释。3、根据权利要求1所述泌乳素时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤②中的镧系元素离子为Eu:i+。4、根据权利要求1所述泌乳素时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤③中的反应缓冲液为PH7.8的50ramol/LTris-HCl,内含0.9%NaCl，1%BSA，0.05%牛IgG,200uMDTPA，0.08%Tween20和0.l%NaN3;且该步骤③在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。5、泌乳素定量检测试剂盒，其特征是试剂盒包括:包被抗体的缓冲液、封闭液、反应缓冲液、洗液、增强液，以及作为包被抗体的抗泌乳素单克隆抗体，镧系元素离子标记的抗泌乳素单克隆抗体和泌乳素标准品。6、根据权利要求5所述的泌乳素定量检测试剂盒，其特征是标准品为用含6%BSA，4%糖，0.1%NaN3，50mmol/LTris-HCl缓冲液将泌乳素蛋白配制成标准品。全文摘要本发明公开了泌乳素的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，其选用抗PRL单克隆抗体作为包被抗体，用碳酸钠缓冲溶液稀释至1-10ug/ml作为包被液；配对抗PRL单克隆抗体用镧系元素离子标记作为标记抗体；实验时用反应缓冲液按1∶20稀释使用；在包被抗体的反应板上，每孔依次加入25ul的PRL的标准品或待测样品、以及稀释的标记抗体，孵育后进行荧光检测。本发明还提供相应的试剂盒。本发明具有较高的灵敏度、特异性及稳定性；且分析系统高度自动化，可提高临床检验结果的速度，可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。文档编号G01N33/74GK101614747SQ20081004354公开日2009年12月30日申请日期2008年6月25日优先权日2008年6月25日发明者吴冯波,君沈申请人:上海新波生物技术有限公司