专利名称：：一种蜂蜜中溶菌酶的检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种蜂蜜中溶菌酶的检测方法，属于紫外可见分光光度分析
技术领域：
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背景技术：
：蜂蜜是用植物花蜜或植物生长部分的分泌物、或在植物生长部分上的抽吸植物的昆虫的排泄物制造。蜜蜂营养丰富且成分复杂，含有单糖，双糖，多糖，多种蛋白质氨基酸及酚酸类物质和微量元素。蜂蜜除具营养作用还具有促迸消化吸收，镇静安眠，提高机体的免疫力等保健作用。经市场调査发现，全国有近50%的蜂产品不合格，个别地区甚至达到了70%左右。假蜂蜜是用蜂蜜香精、糖浆、白糖、水配制而成。既无营养成分又无功效成分。假蜂蜜不仅损害了消费者利益，而且严重影响了行业的发展。因此真假蜂蜜的鉴别技术是控制蜂蜜质量的有效方法。文献报道，目前应用的真假蜂蜜的鉴别方法有还原糖的测定、水分的测定、羟甲基糠醛的测定。这些鉴别方法早已被造假者掌握。因此目前还没有最有效的鉴别真假蜂蜜的方法。
发明内容本发明的目的在于提供一种蜂蜜中溶菌酶的检测方法，溶菌酶是蜂蜜中的特有成分，具有溶细菌作用，而人工蜂蜜中不含溶菌酶。本发明利用溶菌酶的理化性质建立蜂蜜中溶菌酶的检测方法，用于真假蜂蜜的鉴别。本发明的技术方案是这样实现的这种蜂蜜中溶菌酶的检测方法，其特征包括如下步骤A、建立溶菌酶标准曲线以溶菌酶标准试剤为标准品，通过紫外分光分析在290nm下测定其吸光值，建立溶菌酶标准曲线；B、检测样品取待检测的蜂蜜样品分别与标准品相同的条件分析，得出检测样品的吸光值，与标准曲线对照作为溶菌酶定性或定量依据。所述的蜂蜜中溶菌酶的检测方法，其特征包括如下步骤A、标准品溶菌酶测定A-l、称取溶菌酶标准品125mg溶于250mL0.85%NaC1溶液中，配成500ug/nl的使用液，分别取使用液1mL、2mL、3mL、4nl、5mL于10mL容量瓶中，用0.85%NaCl定容至刻度，配制成系列应用液。A-2、扫描波长，取使用液于紫外可见分光光度廿220nm-400nm进行光谱扫描，扫描结果为溶菌酶在290nm有最大吸收峰；A-3、标准曲线制备将系列应用液分别在紫外可见分光光度廿290nm下测定，做标准曲线，其相关系数R^0.9999;B、蜂蜜样品测定B-1、取样品蜂蜜5g加5mLO.OlmoLpH6.5的磷酸盐缓冲液充分溶解；B-2、取分子量截留范围6000-8000的10cm透析袋，在蒸馏水中煮沸10分钟，冷却至室温，溶解的蜂蜜全部装入已煮过的透析袋中，在0.01moLpH6.5的磷酸盐缓冲液透析5天，每天更換透析液；B-3、将透析袋取出，埋入聚乙二醇20000中浓縮6h，将蜂蜜透析液移至离心管5000rpn/m1n离心分离10m1n,将沉淀去除，取上清液定溶至5nl;B-4、将步骤B-3的蜂蜜样品提取物置紫外可见分光光度计，以0.85。ZNaCl作对照，290nm下测样品浓度，与标准曲线比较得出样品的溶菌酶浓度作为定性或定量依据。本发明与现有蜂蜜检测技术相比，其优点和积极效果表现在(1)蜂蜜呈酸性，溶菌酶在酸性条件下稳定且耐热，因此溶菌酶在蜂蜜贮藏过程不易损失，选择溶菌酶作为蜂蜜鉴别的一个指标是可行的。(2)方法精密准确，重现性好对6份同样的样品各取5g用同样的方法进行提取，用紫外可见分光光度廿逬行检测。RSD值为2.10%。(3)平均加标回收率为96.0%(4)本发明选用11种蜂蜜共119份样品作为研究对象，计算出正常蜂蜜中溶菌酶含量范围，并依据此范围作为判定真假蜂蜜的标准，操作简单，耗时短，具有回收率高、准确度高等优点。图1是溶菌酶的紫外可见分光光度廿的光谱扫描图图2是溶菌酶的标准曲线图具体实施例方式A、标准品溶菌酶测定A-1、称取溶菌酶标准品125mg溶于250mL0.85%NaCl溶液中，配成500ug/mL的使用液，分别取使用液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于10mL容量瓶中，用0.85%NaCl定容至刻度,配制成系列应用液。A-2、扫描波长，取使用液于紫外可见分光光度廿220nm-400nm进行光谱扫描，扫描结果为溶菌酶在290nm有最大吸收峰，如图l所示；A-3、标准曲线制备将系列应用液分别在紫外可见分光光度i十290nm下测定，做标准曲线，其相关系数R2^.9999，如图2所示;B、蜂蜜样品测定B-1、取样品蜂蜜5g加5mLO.OlmoLpH6.5的磷酸盐缓冲液充分溶解；B-2、取分子量截留范围6000-8000的10cm透析袋，在蒸馏水中煮沸IO分钟，冷却至室温，溶解的蜂蜜全部装入已煮过的透析袋中，在0.01moU)H6.5的磷酸盐缓冲液透析5天，每天更換透析液；B-3、将透析袋取出，埋入聚乙二醇20000中浓缩6h，将蜂蜜透析液移至离心管5000rpn/m1n离心分离10m1n，将沉淀去除，取上清液定溶至5nl;B-4、将步骤B-3的蜂蜜样品提取物置紫外可见分光光度廿，以0.850《NaCl作对照，290nm下测样品浓度，与标准曲线比较得出样品的溶菌酶浓度作为定性或定量依据。B-5、按照上述方法分别对36种枣花蜜、32种洋槐蜜、12种枇杷蜜、16种荊花蜜和23种其它花的花蜜(荔枝、枸杞、沙棘、益母草、桂花、柑桔、油菜等)提取物置紫外可见分光光度廿，0.85%NaCl作对照，290nm下测样品浓度(mg/mL)。结果见表1表1各种蜂蜜中溶菌酶的含量(mg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>对表中5组数据进行方差分析，各组间P>0.05。说明各组间无差异。提示不同种蜂蜜的溶菌酶含量无显著差异。因此对五大类共109份蜂蜜样品进行统廿处理，其溶菌酶含量为0.722土0.204。按正态分布X±1.96s，确定蜂蜜中溶菌酶正常值范围0.322—1.122mg/mL。方法准确度对6份同样的蜂蜜样品各取5g用同样的方法迸行提取，用紫外可见分光光度廿进行检测。RSD值为2.10X。分别取6份蜂蜜样品各5g，每份添加4.5mg溶菌酶标准品，按样品提取方法提取，分别测溶菌酶含量，廿算样品的回收率。回收率=(加标样品浓度一未加标浓度)/标样浓度X100X,其平均回收率为96.0%，结果见表2:表2紫外可见分光光度廿测蜂蜜中溶菌酶的加收率样品编号加标样品浓度(mg/mL)未加标样品浓度(mg/mL)回收率％<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本发明列举的实施例旨在更进一步地阐明蜂蜜中溶菌酶的检测方法具体操作和应用方向，而不对本发明的范围构成任何限制。权利要求1、一种蜂蜜中溶菌酶的检测方法，其特征包括如下步骤A、建立溶菌酶标准曲线以溶菌酶标准试剂为标准品，通过紫外分光分析在290nm下测定其吸光值，建立溶菌酶标准曲线；B、检测样品取待检测的蜂蜜样品分别与标准品相同的条件分析，得出检测样品的吸光值，与标准曲线对照作为溶菌酶定量依据。2、根据权利要求l所述的蜂蜜中溶菌酶的检测方法，其特征包括如下步骤A、标准品溶菌酶测定A-l、称取溶菌酶标准品125mg溶于250mL0.85%NaCl溶液中，配成500ug/mL的使用液，分别取使用液1mL、2mL、3mL、4irl、5mL于10mL容量瓶中，用0.85Q《NaCl定容至刻度，配制成系列应用液。A-2、扫描波长，取使用液于紫外可见分光光度廿220nm-400nm进行光谱扫描，扫描结果为溶菌酶在290nm有最大吸收峰；A-3、标准曲线制备将系列应用液分别在紫外可见分光光度廿290nm下测定，做标准曲线，其相关系数f^0.9999;B、蜂蜜样品测定B-l、取样品蜂蜜5g加5mLO.OlmoLpH6.5的磷酸盐缓冲液充分溶解；B-2、取分子量截留范围6000-8000的10cm透析袋，在蒸馏水中煮沸10分钟，冷却至室温，溶解的蜂蜜全部装入已煮过的透析袋中，在0.01moL。H6.5的磷酸盐缓冲液透析5天，每天更換透析液；B-3、将透析袋取出，埋入聚乙二醇20000中浓缩6h，将蜂蜜透析液移至离心管5000r口n/nrin离心分离10m1n，将沉淀去除，取上清液定溶至5mL;B-4、将步骤B-3的蜂蜜样品提取物置紫外可见分光光度计，以0.85%NaCl作对照，290nm下测样品浓度，与标准曲线比较得出样品的溶菌酶浓度作为定性或定量依据。全文摘要本发明提供一种这种蜂蜜中溶菌酶的检测方法，包括如下步骤A.建立溶菌酶标准曲线以溶菌酶标准试剂为标准品，通过紫外分光分析在290nm下测定其吸光值，建立溶菌酶标准曲线；B.检测样品取待检测的蜂蜜样品分别与标准品相同的条件分析，得出检测样品的吸光值，与标准曲线对照作为溶菌酶定性或定量依据。因溶菌酶在蜂蜜贮藏过程不易损失，选择溶菌酶作为蜂蜜鉴别方法精密准确，重现性好对6份同样的样品各取5g用同样的方法进行提取，用紫外可见分光光度计进行检测。RSD值为2.10％。本发明选用11种蜂蜜共109份样品作为研究对象，计算出正常蜂蜜中溶菌酶含量范围，并依据此范围作为判定真假蜂蜜的标准，操作简单，耗时短，具有回收率高、准确度高等优点。文档编号G01N21/33GK101419162SQ20081007979公开日2009年4月29日申请日期2008年11月19日优先权日2008年11月19日发明者刘峥颢,吴广臣,夏立娅,庞艳苹,张荣霞,李小亭,王庭欣,赵志磊,齐广恩申请人:河北大学